專利名稱：新型淀粉酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有高抗螯合劑性能并且可用作去污劑成分的堿性溶解α-淀粉酶。
背景技術(shù)：
α-淀粉酶已廣泛用于各種工業(yè)領(lǐng)域如淀粉、釀造、纖維、制藥和食品工業(yè)。因?yàn)橐阎?淀粉酶適合用作去污劑成分，所以它們甚至作為去污增效成分摻入到自動(dòng)洗碗去污劑或洗衣去污劑中(Enzymes inDetergency，203頁(yè)，Marcel Dekker Inc.，New York(1995))。
關(guān)于可用于去污劑并且在堿性范圍具有最佳效應(yīng)的溶解α-淀粉酶，本發(fā)明人先前發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于芽孢桿菌屬種類菌株KSM-1378(FERMBP-3048)的那些淀粉酶是已知的。最近，具有8-9.5附近的最佳pH的α-淀粉酶已經(jīng)公開(kāi)(WO95/2639)，它們?cè)谔卣骱徒Y(jié)構(gòu)方面與那些來(lái)自菌株KSM-1378的淀粉酶非常相似。
在去污劑中摻入螯合劑如磷酸、檸檬酸或沸石等以從洗滌液除去洗滌干擾離子如鈣離子。長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為溶解α-淀粉酶需要鈣離子來(lái)發(fā)揮酶活性，但是鈣離子會(huì)被上述螯合劑或更強(qiáng)的螯合劑EDTA鈍化(淀粉酶和相關(guān)酶手冊(cè)，43頁(yè)，日本淀粉酶研究會(huì)(1988))。最近有報(bào)道，目前已知的溶解α-淀粉酶的X射線晶體分析揭示三個(gè)鈣原子存在其分子中，并且13個(gè)氨基酸殘基以明顯高頻率保守[結(jié)構(gòu)，6，281(1998)]。
螯合劑對(duì)酶活性的抑制在上述來(lái)源于芽孢桿菌屬種類菌株KSM-1378(FERM BP-3048)的堿性溶解α-淀粉酶中發(fā)現(xiàn)，而且當(dāng)將α-淀粉酶摻入自動(dòng)洗碗去污劑或洗衣去污劑時(shí)，這種α-淀粉酶并不總是表現(xiàn)足夠的效應(yīng)。來(lái)源于地衣芽孢桿菌的溶解α-淀粉酶(透阿米爾和Duramyl，Novo Nordisk A/S的產(chǎn)品)，經(jīng)常用作自動(dòng)洗碗去污劑或洗衣去污劑的一種成分，在抗螯合劑的性能方面也是不夠的。
目前已知的溶解淀粉酶中，來(lái)自屬于熱球菌屬種類的菌株的溶解α-淀粉酶(WO90/11352)和來(lái)自屬于硫化葉菌種類的菌株并在淀粉溶解步驟中有效的α-淀粉酶(WO96/02633)不受螯合劑的影響。然而，這些酶的最佳作用pH值分別在4-6和2.5-4.5范圍內(nèi)，而不在堿性范圍起作用，因此它們不適于作為去污劑的成分。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有比用于去污劑的傳統(tǒng)淀粉酶更高的抗螯合劑性能并且可用作去污劑成分的堿性溶解α-淀粉酶以及其中摻入了此堿性溶解α-淀粉酶的去污劑組合物。
發(fā)明公開(kāi)在本發(fā)明的一方面，提供一種堿性溶解淀粉酶，當(dāng)在1-100mMEDTA或EGTA存在的情況下于pH10和45℃處理30分鐘時(shí)，具有不低于70％的剩余活性。
在本發(fā)明的另一方面，提供編碼所述堿性溶解淀粉酶的DNA片段。
在本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，提供含有所述堿性溶解淀粉酶的去污劑組合物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是說(shuō)明EDTA處理濃度與根據(jù)本發(fā)明所述的每一種堿性溶解淀粉酶(K36和K38)和已知的用于去污劑的淀粉酶的剩余活性之間的關(guān)系的圖；圖2是說(shuō)明EGTA處理濃度與根據(jù)本發(fā)明所述的每一種堿性溶解淀粉酶(K36和K38)和已知的用于去污劑的淀粉酶的剩余活性之間的關(guān)系的圖；圖3是說(shuō)明沸石處理濃度與根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶K36的剩余活性之間的關(guān)系的圖；圖4是說(shuō)明檸檬酸處理濃度與根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶K36的剩余活性之間的關(guān)系的圖；圖5是說(shuō)明沸石處理濃度與根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶K38的剩余活性之間的關(guān)系的圖；圖6是說(shuō)明檸檬酸處理濃度與根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶K38的剩余活性之間的關(guān)系的圖；圖7是說(shuō)明反應(yīng)pH與根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶K36的相對(duì)活性之間的關(guān)系的圖；圖8是說(shuō)明反應(yīng)pH與根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶K38的相對(duì)活性之間的關(guān)系的圖；圖9是說(shuō)明用H2O2處理時(shí)間與根據(jù)本發(fā)明所述的每一種堿性溶解淀粉酶(K36和K38)和已知的用于去污劑的淀粉酶的剩余活性之間的關(guān)系的圖；實(shí)施本發(fā)明的最佳方案此處所用的術(shù)語(yǔ)“堿性α-淀粉酶”是指具有堿性范圍內(nèi)的最佳pH值的α-淀粉酶。此處所用的術(shù)語(yǔ)“中性”是指pH值范圍6-8之間，而術(shù)語(yǔ)“堿性”是指pH值范圍高于中性。如淀粉酶和相關(guān)酶手冊(cè)中所述的[40-41頁(yè)，日本淀粉酶研究會(huì)(1988)]，術(shù)語(yǔ)“溶解α-淀粉酶”是指高度隨機(jī)地降解淀粉或淀粉多糖的α-淀粉酶。
根據(jù)本發(fā)明所述的酶是一種堿性溶解淀粉酶，當(dāng)在1-100mM EDTA或EGTA存在的情況下于PH10和45℃處理30分鐘時(shí)，具有不低于70％的剩余活性，優(yōu)選的是不低于80％的剩余活性，更優(yōu)選的是不低于90％的剩余活性。
本發(fā)明的酶必須具有上述螯合劑抗性，但優(yōu)選的是具有下述特征1)和2)，更優(yōu)選的是具有特征1)到5)。
1)最佳作用pH它具有超過(guò)8.0的最佳作用pH(結(jié)果來(lái)自用可溶性淀粉為底物于50℃ 15分鐘的反應(yīng))。
2)作用它水解淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉以及直鏈淀粉和支鏈淀粉的部分降解產(chǎn)物中的α-1，4-糖苷鍵，形成葡萄糖(G1)、麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、麥芽四糖(G4)、麥芽五糖(G5)、麥芽六糖(G6)、麥芽七糖(G7)。然而它并不作用于出芽短梗霉聚糖。
3)pH穩(wěn)定性(Britton-Ronbinson緩沖液)在6.5-11.0的pH范圍內(nèi)、于40℃處理30分鐘時(shí)，它表現(xiàn)不低于70％的剩余活性。
4)作用溫度范圍和最佳作用溫度它在20-80℃的較寬溫度范圍內(nèi)起作用，最佳作用溫度為50-60℃。
5)溫度穩(wěn)定性于40℃在50mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(PH10)中處理30分鐘，它表現(xiàn)不低于80％的剩余活性，而且它即使在45℃也表現(xiàn)約60％的剩余活性。
另外，更優(yōu)選的是具有下述特征6)的本發(fā)明的酶。
6)氧化劑抗性當(dāng)在2％過(guò)氧化氫存在的情況下于pH10和30℃處理60分鐘時(shí)，它表現(xiàn)不低于70％的剩余活性。
盡管對(duì)本發(fā)明酶的比活性沒(méi)有特別的限制，但具有下面7)中所述的比活性是特別優(yōu)選的。
7)比活性從于pH10和50℃反應(yīng)15分鐘(以可溶性淀粉作為底物)的酶活性和用蛋白分析試劑盒(Bio-rad laboratories的產(chǎn)品)測(cè)定的蛋白濃度計(jì)算出的比活性為3000U/mg或更高。
本發(fā)明酶的實(shí)例包括那些具有本文隨后描述的序列表No.1或2中所示的氨基酸序列的酶以及那些具有上述氨基酸序列但在其部分有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或增加的酶。關(guān)于替換、缺失或增加，優(yōu)選的是至少80％的同源性，特別優(yōu)選的是至少90％的同源性。另外，同源性用Lipman-Pearson方法加以計(jì)算(科學(xué)，227，1435(1985))。
本發(fā)明酶的氨基酸序列的一個(gè)不同于在鈣結(jié)合位點(diǎn)具有高度保守的13個(gè)氨基酸殘基的目前已知溶解α-淀粉酶的特征是，本發(fā)明酶具有低保守率。具體地，與傳統(tǒng)溶解α-淀粉酶中具有羧基側(cè)鏈的天冬氨酸相對(duì)應(yīng)，本發(fā)明酶中八個(gè)殘基中的五個(gè)是無(wú)羧基側(cè)鏈的天冬酰胺或絲氨酸，羧基側(cè)鏈在結(jié)合鈣離子方面起重要作用，這表明分子中不含有鈣。換言之，因?yàn)楸景l(fā)明酶不需要鈣來(lái)發(fā)揮酶活性，所以推測(cè)本發(fā)明酶具有高抗螯合劑性能。象這樣在鈣結(jié)合位點(diǎn)具有低氨基酸殘基保守率因而不那么依賴鈣的溶解α-淀粉酶，只有來(lái)自熱球菌屬種類的酶已知[應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，63，3569(1997)]。然而這種酶不適于用作去污劑成分，因?yàn)樗亲罴炎饔胮H值在5.5-6附近的酸性淀粉酶，而且其活性在溫度不足50℃時(shí)大大降低。這種酶的氨基酸序列與本發(fā)明酶的氨基酸序列的同源性只有30％，表明本發(fā)明的堿性溶解α-淀粉酶完全不同于這種酶。因此，根據(jù)本發(fā)明所述的溶解堿性α-淀粉酶是明顯不同于目前已知的溶解α-淀粉酶的新型酶。
例如通過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生靶酶的屬于芽孢桿菌屬種類的細(xì)菌并從培養(yǎng)物收集酶來(lái)制備本發(fā)明的酶。這類產(chǎn)生靶酶的細(xì)菌實(shí)例包括具有下述微生物學(xué)特征的菌株KSM-K36和KSM-K38。
表1


作為基于上述微生物學(xué)特征的研究的結(jié)果，同時(shí)參照“Bergey氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)”〔Williams&wilkins，美國(guó)(1986)〕和“芽孢桿菌屬”〔Agricultural Research Service，Washington，D.C.(1973)〕，認(rèn)為這些菌株是屬于芽孢桿菌屬種類的產(chǎn)內(nèi)生孢子芽孢桿菌。因?yàn)樗鼈儾荒茉谥行苑秶鷥?nèi)生長(zhǎng)，而在高堿性范圍表現(xiàn)良好生長(zhǎng)，所以它們屬于嗜堿性微生物并可區(qū)別于表現(xiàn)中性范圍內(nèi)生長(zhǎng)的屬于芽孢桿菌屬種類的傳統(tǒng)細(xì)菌。另外，將它們的微生物學(xué)和生理學(xué)特征與已知的嗜堿性芽孢桿菌(微生物學(xué)，141，1745(1995))的微生物學(xué)和生理學(xué)特征比較。結(jié)果，菌株KSM-K36和KSM-K38與已知的任何嗜堿性芽孢桿菌不同。因此菌株KSM-K36和KSM-K38中的任意一個(gè)都被判斷為新型菌株，并以FERMBP-6945和FERM BP-6946的名稱于1998年5月20日保藏于國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(NIBH)，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)社，工業(yè)貿(mào)易和技術(shù)部。
根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶可以通過(guò)在培養(yǎng)基上接種上述微生物接著按常規(guī)方法培養(yǎng)而獲得。因?yàn)榇宋⑸锸鞘葔A性的，所以優(yōu)選的是堿性培養(yǎng)基。可以從如此獲得的培養(yǎng)物收集目的堿性溶解淀粉酶。也可以這樣使用上清。選擇性地，在將其去鹽、沉淀或超濾以得到所需的粗制酶接著以常規(guī)方法純化和結(jié)晶之后，它可以作為純化酶使用。
本發(fā)明堿性溶解淀粉酶的純化方法的一個(gè)實(shí)例將在下文提及。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)物上清進(jìn)行(1)硫酸銨沉淀、(2)DEAE-Toyopearl(TOSOHCorporation)柱層析或(3)凝膠過(guò)濾，可以獲得在聚丙烯酰胺凝膠電泳(凝膠濃度10％)和十二烷基硫酸鈉(SDS)電泳上表現(xiàn)單一條帶的純化酶。
也可以通過(guò)獲得編碼本發(fā)明堿性溶解淀粉酶的基因和含有這一基因的載體質(zhì)粒，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適當(dāng)微生物、優(yōu)選屬于芽孢桿菌屬種類的細(xì)菌，然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物或細(xì)菌制備根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶。
編碼本發(fā)明堿性溶解淀粉酶的基因?qū)嵗切┚哂性诒疚碾S后描述的序列表No.3和4中所示的核苷酸序列的基因。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶具有堿性范圍內(nèi)的最佳pH并具有高抗螯合劑性能，因此它尤其可用作摻入去污劑的酶。本發(fā)明的堿性溶解淀粉酶具有如上所述的強(qiáng)氧化劑抗性，因此可以將它加入摻有氧化劑如漂白劑的去污劑中。加入去污劑的本發(fā)明酶的量?jī)?yōu)選的是0.001-5％(重量比)。
除了上述堿性溶解淀粉酶，也可將已知去污劑成分加入本發(fā)明的去污劑組合物中。已知去污劑成分的實(shí)例包括WO94/26881第五頁(yè)右上部分14行至相同頁(yè)右下部分29行中所述的那些，例如表面活性劑、螯合劑、堿性劑、無(wú)機(jī)鹽、漂白劑和熒光試劑。
以0.5-60％(重量比)的量(此后將只簡(jiǎn)單標(biāo)記為“％”)將表面活性劑加入去污劑組合物中，更具體地在粉末狀去污劑組合物中加入10-45％以及在液體去污劑組合物中加入20-50％。當(dāng)本發(fā)明的去污劑組合物是漂白去污劑或自動(dòng)洗碗去污劑時(shí)，通常以1-10％、優(yōu)選地1-5％的量加入表面活性劑，以0.01-50％、優(yōu)選地5-40％的量加入二價(jià)金屬離子清除劑，以0.01-80％、優(yōu)選地1-40％的量加入堿性劑和無(wú)機(jī)鹽，。
以0.001-10％、優(yōu)選地1-5％的量加入再污染防腐劑。
除了本發(fā)明的淀粉酶，還可以使用蛋白水解酶、纖維素酶、原果膠酶、果膠酶、脂肪酶、半纖維素酶、糖苷酶、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶等。這些酶可以以0.001-5％、優(yōu)選地0.1-3％的量加入。優(yōu)選地，漂白劑(如過(guò)氧化氫、過(guò)碳酸鹽等)以1-10％的量加入。一旦使用漂白劑，可以以0.01-10％的量加入漂白激活劑。熒光試劑的實(shí)例包括聯(lián)苯類熒光試劑(如“Chinopearl CBS-X”，商品名)和1.2二苯乙烯類熒光試劑(如DM類熒光染料)。優(yōu)選的是以0.001-2％的量加入熒光試劑。
上述去污劑組合物可以以液體、粉末、顆粒等形式提供。去污劑組合物可用于洗衣去污劑、自動(dòng)洗碗去污劑、管道去污劑、人工牙齒清潔劑或漂白劑。
實(shí)施例通過(guò)使用以下緩沖液，按照下述方法檢測(cè)酶活性pH4.5-6.0醋酸緩沖液pH6.0-8.0磷酸鉀緩沖液pH9.0-10.5 甘氨酸氫氧化鈉緩沖液pH10.0-12.0 碳酸鹽緩沖液pH4.0-12.0Britton-Robison緩沖液〔淀粉酶活性的檢測(cè)方法〕1.試劑配制的方法(1％可溶性淀粉水溶液的配制)將5g可溶性淀粉(來(lái)源于土豆的淀粉，Sigma化學(xué)有限公司的產(chǎn)品)懸浮于400mL去離子水中。在沸水中攪拌，加熱約10分鐘使懸浮液溶解，接著加入去離子水至500mL總體積。
(250mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)的配制)將9.38g甘氨酸〔保證級(jí)(guaranteed class)，Wako PureChemical Industri es，Ltd.的產(chǎn)品〕溶于約300mL去離子水中，接著用pH計(jì)，以約5N氫氧化鈉水溶液將所得到的溶液調(diào)節(jié)至pH10。向已調(diào)pH的溶液加入去離子水至500mL總體積。
(DNS試劑的配制)將8g氫氧化鈉(保證級(jí)，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的產(chǎn)品)溶于300mL去離子水中。向所得到的溶液中分步加入2.5g 3，5-二硝基水楊酸(DNS，保證級(jí)，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的產(chǎn)品)，使后者溶于前者。DNS完全溶解后，加入150g酒石酸鈉鉀(保證級(jí)，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的產(chǎn)品)。完全溶解后，向所得溶液加入去離子水至500mL總體積。
(用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的葡萄糖溶液的配制)使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(用于光電應(yīng)用，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.的產(chǎn)品)和去離子水分別配制0、1、2、3、4和5μmol/0.1ml的葡萄糖溶液。
2.淀粉酶活性的檢測(cè)方法(酶溶液的稀釋)用10mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)稀釋純化的酶以使δ-吸光度〔＝(樣品的吸光度)-(空白的吸光度)〕不大于0.6。
(樣品的測(cè)量)在試管中加入0.5mL 1％可溶性淀粉水溶液、0.2mL 250mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)、0.2mL去離子水(此后該混合物將稱為“底物溶液”)，接著在50℃水浴中預(yù)熱約5分鐘。預(yù)熱后，將0.1mL適當(dāng)稀釋的酶溶液加入反應(yīng)混合物，接著于50℃反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將1.0mL DNS試劑加入反應(yīng)混合物，接著在沸水中加熱5分鐘顯色。緊接著，使溶液在冰水浴中冷卻。冷卻后，向所得到的溶液中加入4.0mL去離子水，接著混合。于535nm測(cè)定溶液的吸光度。
(空白檢測(cè))在試管中加入0.9mL底物溶液，接著加入1.0mL DNS試劑和0.1mL酶溶液。將得到的混合物在沸水中加熱5分鐘以使之顯色。緊接著，使反應(yīng)混合物在冰水中冷卻。冷卻后，向反應(yīng)混合物中加入4.0mL去離子水，接著進(jìn)行混合。于535nm測(cè)定溶液的吸光度。
(標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制)在試管中加入0.9mL底物溶液，接著加入1.0mL DNS試劑，然后加入0.1mL具有各種濃度的用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的葡萄糖溶液。將得到的混合物在沸水中加熱5分鐘以使之顯色。緊接著，使溶液在冰水中冷卻。冷卻后，向所得到的溶液加入4.0mL去離子水，接著混合。然后于535nm測(cè)定溶液的吸光度。在圖上，葡萄糖濃度(μmol/0.1ml)標(biāo)為橫坐標(biāo)而吸光度作為縱坐標(biāo)，那些線性圖的斜率用最小二乘方法來(lái)確定。換算系數(shù)(F)根據(jù)以下公式計(jì)算換算系數(shù)(F)＝〔1/(斜率)〕×〔1/15〕×〔1000/0.1〕另外，測(cè)定活性時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(活性的計(jì)算)
一分鐘內(nèi)形成相當(dāng)于1μmol葡萄糖的還原糖所用的酶量定義為一個(gè)單位(1U)，酶的效價(jià)根據(jù)以下公式計(jì)算〔δ-吸光度〕×〔換算系數(shù)(F)〕×〔稀釋率〕〔抗螯合劑性能的測(cè)試方法〕(EDTA溶液的配制)將9.3g EDTA(Sigma化學(xué)有限公司的產(chǎn)品)溶于約80mL去離子水中，用pH計(jì)以約5N氫氧化鈉水溶液將所得到的溶液調(diào)節(jié)至pH8。將去離子水加入已調(diào)pH的溶液中至100mL總體積，由此250mM EDTA溶液得到配制。得到的溶液用去離子水稀釋以配制10-100mM EDTA溶液。
將9.5g EGTA(Sigma化學(xué)有限公司的產(chǎn)品)溶于約80mL去離子水中，用pH計(jì)以約5N氫氧化鈉水溶液將所得到的溶液調(diào)節(jié)至pH8。將去離子水加入pH值調(diào)節(jié)過(guò)的溶液至總體積100mL，由此配制了250mM的EGTA溶液。得到的溶液用去離子水稀釋而配制出10-100mM的EGTA溶液。
(抗螯合劑性能的測(cè)試方法)用1mM EDTA于45℃處理30分鐘的情況在試管中加入0.1mL 10mM的EDTA溶液、0.2mL 250mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)和0.1mL去離子水，接著在45℃水浴中預(yù)熱約5分鐘。預(yù)熱后，將用10mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)適當(dāng)稀釋的0.1mL酶溶液加入反應(yīng)混合物。得到的混合物在45℃溫度下放置30分鐘。30分鐘后，將0.1mL部分所得溶液加入0.9mL在50℃水浴中預(yù)熱的底物溶液中并根據(jù)淀粉酶活性測(cè)試方法測(cè)定剩余酶活性。
〔抗氧化劑性能的測(cè)試方法〕在試管中加入0.067mL過(guò)氧化氫(30％過(guò)氧化氫水溶液，Wako PureChemical Industries，Ltd.的產(chǎn)品)，0.2mL 250mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)和0.633mL去離子水，接著在30℃水浴中預(yù)熱約5分鐘。預(yù)熱后，將用10mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)適當(dāng)稀釋的0.1mL酶溶液加入反應(yīng)混合物。得到的混合物在30℃放置60分鐘。60分鐘后，將所0.2mL部分所得溶液加入預(yù)先置于冰水中的含有1μL過(guò)氧化氫酶(來(lái)源于牛肝，product of Boehringer Mannheim GmbH)的試管中，由此使過(guò)氧化氫失活并終止反應(yīng)。然后，將0.1mL部分反應(yīng)終止的溶液加入0.9mL在50℃水浴中預(yù)熱的底物溶液中并根據(jù)淀粉酶活性測(cè)試方法測(cè)定剩余酶活性。
〔蛋白的定量分析〕用附帶試劑盒中的牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，按照蛋白分析試劑盒II(目錄號(hào)500-0002，Bio-rad Laboratories的產(chǎn)品)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行蛋白的定量分析。
實(shí)施例1具有抗螯合劑性能的堿性溶解淀粉酶的篩選將約0.5g土壤懸浮于無(wú)菌水中，接著于80℃加熱15分鐘。熱處理后用無(wú)菌水適當(dāng)稀釋上清，然后將其噴灑在瓊脂培養(yǎng)基A上以分離以產(chǎn)生淀粉酶的微生物。于30℃培養(yǎng)兩天后形成菌落。選擇在邊緣具有由于淀粉水解而形成的透明暈環(huán)的菌落，并將其分離為產(chǎn)生淀粉酶的細(xì)菌。將分離的細(xì)菌接種于培養(yǎng)基B上，接著于30℃振蕩有氧培養(yǎng)兩天。將所得到的培養(yǎng)物離心分離后，測(cè)定所得到的上清中粗提淀粉酶的抗螯合劑性能。另外，測(cè)定粗提酶的最佳pH，由此篩選出本發(fā)明的產(chǎn)生堿性溶解淀粉酶的細(xì)菌。
根據(jù)上述方法，獲得了屬于芽孢桿菌屬種類的菌株KSM-K36和KSM-K38。
培養(yǎng)基A胰蛋白胨 1.5％豆胨 0.5％氯化鈉0.5％有色淀粉 0.5％瓊脂 1.5％碳酸鈉0.5％(pH10)培養(yǎng)基B胰蛋白胨 1.5％豆胨 0.5％氯化鈉0.5％可溶性淀粉1.0％
碳酸鈉 0.5％(pH10)實(shí)施例2菌株KSM-K36和KSM-K38的培養(yǎng)將菌株KSM-K36和KSM-K38分別接種在實(shí)施例1中所述的液體培養(yǎng)基B上，接著于30℃振蕩有氧培養(yǎng)兩天。測(cè)定通過(guò)離心分離得到的上清的淀粉酶活性(pH8.5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物溶液分別具有1177U/L和557U/L的活性。
實(shí)施例3本發(fā)明堿性溶解淀粉酶的純化將硫酸銨加入芽孢桿菌屬種類菌株KSM-K36的培養(yǎng)物上清以達(dá)到80％飽和，接著攪拌。收集這樣形成的沉淀并將其溶于含有2mM氯化鈣的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)，接著逆著此緩沖液透析過(guò)夜。此后將內(nèi)透析液加樣于已用相同緩沖液平衡的DEAE-TOYOPEARL 650M柱上，然后用相同緩沖液中的氯化鈉線性濃度梯度(OM-1M)洗脫蛋白。逆著上述緩沖液透析活性成分后，通過(guò)凝膠過(guò)濾柱層析進(jìn)行進(jìn)一步的純化。將這樣得到的活性成分逆著相同緩沖液透析，由此可以獲得在聚丙烯酰胺凝膠電泳(凝膠濃度10％)和十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)單一條帶的純化酶。用相似方法，從芽孢桿菌屬種類菌株KSM-K38的培養(yǎng)物上清中獲得另一種純化酶。
實(shí)施例4本發(fā)明的堿性溶解淀粉酶的抗螯合劑性能使用分別從實(shí)施例3中的菌株KSM-K36和KSM-K38得到兩種本發(fā)明的純化堿性溶解淀粉酶(以后分別簡(jiǎn)稱為“K36”和“K38”)，測(cè)定抗各種螯合劑的性能。
1)抗EDTA或EGTA的性能在含有0-100mM終濃度EDTA或EGTA(都是Sigma化學(xué)有限公司的產(chǎn)品)的50mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)中，加入用10mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)適當(dāng)稀釋的純化酶，接著在預(yù)先確定的溫度(30℃、40℃或50℃)下處理30分鐘。按照淀粉酶活性測(cè)定方法〔用50mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)〕測(cè)定反應(yīng)混合物的剩余酶活性。作為對(duì)照，使用來(lái)源于地衣芽孢桿菌的淀粉酶透阿米爾和Duramyl(分別從Novo Industry A/S的顆粒型產(chǎn)品純化而來(lái))的純化產(chǎn)品。
如圖1和圖2中所示，已經(jīng)證實(shí)與透阿米爾和Duramyl相比，K36和K38都具有高抗螯合劑性能，不受高濃度EDTA和EGTA的影響。
2)抗檸檬酸或沸石的性能在含有各具有0-0.5％終濃度的二水合檸檬酸三鈉(保證級(jí)，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的產(chǎn)品)或合成的沸石A-3(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的產(chǎn)品)的50mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)中，加入用10mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)適當(dāng)稀釋的純化酶，接著分別在預(yù)先確定的溫度(40℃和45℃)下處理30分鐘。按照淀粉酶活性測(cè)定方法〔用50mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)〕測(cè)定反應(yīng)混合物的剩余酶活性。結(jié)果，已經(jīng)證實(shí)K36和K38都不受檸檬酸或沸石的影響(如圖3-6中所示)。
實(shí)施例5本發(fā)明堿性溶解淀粉酶的作用pH和最佳作用pH使用具有50mM終濃度的不同緩沖液〔醋酸緩沖液(pH4.5-6.0)、磷酸鉀緩沖液(pH6.0-8.0)、甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH9.0-10.5)和碳酸鹽緩沖液(pH10.0-12.0)〕，按照淀粉酶活性測(cè)定方法分別測(cè)定K36和K38的作用pH和最佳作用pH，并且將它們以相對(duì)活性表示，最大活性為100％。
結(jié)果(如圖7和8中所示)，已經(jīng)證實(shí)K36和K38都在pH6.0-10.0范圍內(nèi)起作用，并且最佳作用pH為8.0-9.0。另外，所示的pH值是反應(yīng)混合物的實(shí)際測(cè)值量。
實(shí)施例6本發(fā)明堿性溶解淀粉酶的抗氧化劑性能和相對(duì)酶活性將用10mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)適當(dāng)稀釋的酶(K36、K38、Tarmamyl或Duramyl)加入含有2％終濃度(580mM)過(guò)氧化氫的50mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)中，接著于30℃處理60分鐘。按照淀粉酶活性測(cè)定方法〔用50mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)〕以適當(dāng)間隔測(cè)定剩余活性。
以處理前的活性為100％，用剩余活性來(lái)表示抗氧化劑性能。
結(jié)果(圖9)，即使在2％過(guò)氧化氫存在的情況下于pH10、30℃處理60分鐘后，仍觀察到K36和K38都保留不低于70％的剩余活性，尤其不低于94％，因此具有足夠的抗氧化劑活性。
從于pH10和50℃反應(yīng)15分鐘時(shí)的酶活性數(shù)值和用蛋白分析試劑盒(Bio-rad Laboratories的產(chǎn)品)測(cè)定的蛋白濃度計(jì)算而來(lái)的K36和K38的比活性分別是4300U/mg和3600U/mg(表2)。這表明每種酶都具有不低于3000U/mg的比活性，與通過(guò)蛋白工程制成的抗氧化劑酶(LAMY·M202T(WO98/44126)和Duramyl)相比具有明顯高的比活性。因此，本發(fā)明的堿性溶解淀粉酶在向去污劑添加的量、工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)等方面是有利的。
表2比活性的比較

*LAMY來(lái)源于芽孢桿菌屬種類菌株KSM-1378。
**LAMY·M202T具有Met202Thr替換的上述酶。
酶活性用甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)，于50℃反應(yīng)15分鐘(以可溶性淀粉為底物)的活性。
蛋白量用蛋白分析試劑盒(Bio-rad Laboratories的產(chǎn)品)測(cè)定實(shí)施例7本發(fā)明堿性溶解淀粉酶(K36和K38)的其它酶特征這兩種純化酶經(jīng)分析具有以下特征(1)作用它們都水解淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉以及直鏈和支鏈淀粉的部分降解產(chǎn)物中的α-1，4-糖苷鍵，形成葡萄糖(G1)、麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、麥芽四糖(G4)、麥芽五糖(G5)、麥芽六糖(G6)、麥芽七糖(G7)。然而它并不作用于出芽短梗霉聚糖。
(2)pH穩(wěn)定性(Britton-Ronbinson緩沖液)它們都在6.5-11.0的pH范圍內(nèi)、于40℃處理30分鐘時(shí)表明不低于70％的剩余活性。
(3)作用溫度范圍和最佳作用溫度它們都在20-80℃的較寬溫度范圍內(nèi)起作用，最佳作用溫度為50-60℃。
(4)溫度穩(wěn)定性作為在不同溫度條件下在50mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH10)中處理30分鐘的結(jié)果，它們于40℃表現(xiàn)不低于80％的剩余活性，并且即使在45℃也表現(xiàn)約60％的剩余活性。
(5)分子量根據(jù)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳的測(cè)定，它們都具有55,000±5,000的分子量。
(6)等電點(diǎn)用等電聚焦電泳的測(cè)定時(shí)，它們都具有pH4.2左右的等電點(diǎn)。
(7)表面活性劑的影響當(dāng)于pH10和30℃在表面活性劑溶液中處理30分鐘時(shí)，它們都基本上無(wú)活性抑制(活性保留率不低于90％)。表面活性劑溶液是例如直鏈烷基苯磺酸鈉、烷基硫酸酯鈉、聚氧乙烯烷基硫酸酯鈉、α-烯磺酸酯鈉、α-磺酸脂肪酸酯鈉、烷基磺酸鈉、DSD、肥皂或softanol。
(8)金屬鹽的影響將它們于pH10、30℃在各種金屬鹽存在的情況下處理30分鐘，由此研究它們的影響。結(jié)果，1mM Mn2+抑制K36(抑制率約95％)，1mM的Hg2+、Be2+或Cd2+輕度抑制K36(抑制率30-40％)。1mM Mn2+抑制K38(抑制率約75％)，1mM的Sr2+或Cd2+輕度抑制K38(抑制率約30％)。
(9)N-端氨基酸序列用蛋白測(cè)序儀(ABI公司生產(chǎn)的477A型)通過(guò)Edman降解法〔Edman，P.，Acta Chem.Scand.，4，283(1948)〕測(cè)定每種本發(fā)明淀粉酶的N-端氨基酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)具有順序Asp-Gly-Leu-Asn-Gly-Thr-Met-Met-Gln-Tyr-Tyr-Glu-Trp-His-Leu。
實(shí)施例8含有本發(fā)明任意一種堿性溶解淀粉酶的自動(dòng)洗碗去污劑的去污力評(píng)估含有本發(fā)明任意一種堿性溶解淀粉酶(K36和K38)的自動(dòng)洗碗去污劑的去污力在下述條件下進(jìn)行評(píng)估。作為對(duì)照，使用不含本發(fā)明酶的去污劑。
1)臟碗的制備將在沸騰的自來(lái)水中煮過(guò)的1ml燕麥(Quaker公司)加到瓷碗中，然后加入自來(lái)水在其中溶解。將碗在室溫下干燥三小時(shí)后，儲(chǔ)存于5℃(半密封條件)直至使用。用這種方法性制備三次臟碗用于一次清洗。
2)清洗條件.使用的洗碗機(jī)全自動(dòng)洗碗機(jī)“NP-810”，商品名；由MatsushitaElectric Industries Co.，Ltd生產(chǎn)。
.清洗溫度水溫逐漸增至55℃左右。
.清洗用水自來(lái)水.去污劑濃度0.2％(重量比).清洗時(shí)間洗滌約20分鐘→沖洗約20分鐘(標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程).清洗時(shí)循環(huán)水的量3.5L3)去污劑的組成(％是指重量百分比)2.2％的Pullulonic L-61、24.7％碳酸鈉、24.7％碳酸氫鈉、10.0％過(guò)碳酸鈉、12.0％NO.1硅酸鈉、20.0％檸檬酸三鈉、2.2％“丙二醇3000”、0.2％硅氧烷“KST-04”(商品名；BASF AG的產(chǎn)品)4)加入的酶量實(shí)施例3中所獲得的每種純化酶的活性值通過(guò)使用甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(PH10)根據(jù)上述淀粉酶活性測(cè)定方法得到測(cè)定。
根據(jù)此結(jié)果，加入去污劑的酶量是150U。
5)去污力的評(píng)估方法將碘溶液加到洗過(guò)的碟子上，肉眼判斷由于碘-淀粉反應(yīng)產(chǎn)生的顏色。
結(jié)果，含有任一種本發(fā)明酶的去污劑完全去除了污跡，因此，與不含該酶的去污劑相比表現(xiàn)很高的去污力。
實(shí)施例9以用Saito-Miura方法[(Biochim.Biophy.Acta，72，619(1961))]分別提取的菌株KSM-K36和KSM-K38的染色體DNA為模板，使用兩個(gè)寡聚核苷酸引物，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，這兩個(gè)引物根據(jù)在來(lái)自屬于芽孢桿菌屬種類的細(xì)菌的已知溶解淀粉酶中高度保守Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp和Trp-Phe-Lys-Pro-Leu-Tyr序列設(shè)計(jì)。每種情況中，都得到約1.0kb的DNA片段。對(duì)此DNA片段進(jìn)行核苷酸序列分析之后，對(duì)用反義PCR方法〔T.Triglia等，核酸研究，16，81(1988)〕和體外PCR克隆試劑盒(Boehringer Mannheim GmbH的產(chǎn)品)得到的上游和下游DNA片段的核苷酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在每個(gè)菌株的約1.7kb基因區(qū)域中只有一個(gè)開(kāi)放讀碼框，編碼序列表No.1和2中所示的501個(gè)氨基酸殘基。已經(jīng)闡明，氨基末端的序列(氨基酸數(shù)Asp1-Leu15)與從菌株KSM-K36和KSM-K38培養(yǎng)液純化的淀粉酶K36和K38的氨基末端序列(15個(gè)氨基酸殘基)完全一致。發(fā)現(xiàn)如此確定的淀粉酶K36和K38基因分別具有序列表No.3和No.4中所示的序列。
實(shí)施例10分別用兩個(gè)菌株的染色體DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增到1.7kb的DNA片段，從起始密碼子上游0.7kb到終止密碼子下游0.1kb，接著通過(guò)使用穿梭載體PHY300PLK(商品名；Yakult Honsha Co.，Ltd的產(chǎn)品)將其導(dǎo)入枯草芽孢桿菌菌株ISW1214。將如此得到的重組枯草桿菌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由此在培養(yǎng)液中產(chǎn)生淀粉酶。作為按實(shí)施例3中所述的方法對(duì)從所得培養(yǎng)物上清純化的淀粉酶進(jìn)行特征分析的結(jié)果，表明它們與那些分別從菌株KSM-K36和KSM-K38的培養(yǎng)液純化的淀粉酶具有很好的一致性。具體地說(shuō)，發(fā)現(xiàn)最佳作用pH值在8-9范圍內(nèi)，于pH10的比活性為約4000U/mg，而且對(duì)螯合劑和氧化劑的抗性高。
工業(yè)中開(kāi)發(fā)的可能性與已知用于去污劑的傳統(tǒng)淀粉酶相比，本發(fā)明的堿性溶解淀粉酶具有高抗螯合劑性能。它們的最佳pH值超過(guò)8。因此根據(jù)本發(fā)明所述的堿性溶解淀粉酶可用于明顯廣泛的工業(yè)領(lǐng)域，例如用于在堿性范圍內(nèi)加工淀粉的步驟。具體地在將它們摻入含有螯合劑的自動(dòng)洗碗去污劑、洗衣去污劑、漂白劑等的時(shí)候，它們具有優(yōu)勢(shì)，因此具有巨大的工業(yè)重要性。
序列表<110>KAO CORPORATION<120>新型淀粉酶<130>P05631012<160>4<210>1<211>501<212>PRT<213>芽孢桿菌屬種類<400>1Met Lys Arg Trp Val Val Ala Met Leu Ala Val Leu Phe Leu Phe Pro5 10 15Ser Val Val Val Ala Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr20 25 30Glu Trp His Leu Glu Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp35 40 45Asp Ala Glu Ala Leu Ser Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro50 55 60Pro Ala Tyr Lys Gly Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr65 70 75 80Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr
85 90 95Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys100 105 110Ser Asn Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Leu115 120 125Gly Ala Asp Phe Thr Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Ser130 135 140Asn Arg Trp Gln Asp Ile Ser Gly Val Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr145 150 155 160Gly Phe Asp Phe Pro Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp165 170 175Arg Trp Phe His Phe Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu180 185 190Asn His Leu Phe Arg Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp195 200 205Glu Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe210 215 220Ser His Pro Glu Val Gln Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe225 230 235 240Thr Asp Glu Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His245 250 255lle Pro Phe Trp Tyr Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Ser Glu260 265 270Ala Asp Gln Asp Leu Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val275 280 285Gly Ala Leu Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu
290 295 300Phe Asp Val Pro Leu Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Lys Gln Gly305 310 315 320Gly Ser Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala325 330 335His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro340 345 350Gly Glu Ser Leu Glu Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala355 360 365Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr370 375 380Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp385 390 395 400Met Ile Asp Glu Leu Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr405 410 415Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu420 425 430Gly Thr Ser Ser Arg Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn435 440 445Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Gln His Ala Gly450 455 460Gln Thr Trp Thr Asp Leu Thr Gly Asn His Ala Ala Ser Val Thr Ile465 470 475 480Asn Gly Asp Gly Trp Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser485 490 495Val Tyr Val Asn Gln
500<210>2<211>501<212>PRT<213>芽孢桿菌屬種類<400>2Met Arg Arg Trp Val Val Ala Met Leu Ala Val Leu Phe Leu Phe Pro5 10 15Ser Val Val Val Ala Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr20 25 30Glu Trp His Leu Glu Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp35 40 45Asp Ala Ala Ala Leu Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro50 55 60Pro Ala Tyr Lys Gly Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr65 70 75 80Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr85 90 95Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys100 105 110Ser Asn Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met115 120 125Gly Ala Asp Phe Thr Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr130 135 140
Asn Arg Trp Gln Asp Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr145 150 155 160Gly Phe Asp Phe Ser Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp165 170 175Arg Trp Phe His Phe Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu180 185 190Asn His Ile Phe Arg Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp195 200 205Glu Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe210 215 220Ser His Pro Glu Val Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe225 230 235 240Thr Asp Glu Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His245 250 255Ile Pro Phe Trp Tyr Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu260 265 270Ala Asp Gln Asp Leu Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val275 280 285Gly Ala Leu Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu290 295 300Phe Asp Val Pro Leu Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly305 310 315 320Gly Ser Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala325 330 335His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro340 345 350
Gly Glu Ser Leu Glu Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala355 360 365Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr370 375 380Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp385 390 395 400Met Ile Asp Glu Leu Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr405 410 415Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu420 425 430Gly Ser Ser Ser Arg Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn435 440 445Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly450 455 460Gln Thr Trp Thr Asp Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile465 470 475 480Asn Gly Asp Gly Trp Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser485 490 495Val Tyr Val Asn Gln500<210>3<211>1650<212>DNA<213>芽孢桿菌屬種類<400>3
cttgaatcat tatttaaagc tggttatgat atatgtaagc gttatcatta aaaggaggta 60tttg atg aaa aga tgg gta gta gca atg ctg gca gtg tta ttt tta ttt 109Met Lys Arg Trp Val Val Ala Met Leu Ala Val Leu Phe Leu Phe5 10 15cct tcg gta gta gtt gca gat ggc ttg aat gga acg atg atg cag tat 157Pro Ser Val Val Val Ala Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr20 25 30tat gag tgg cat cta gag aat gat ggg caa cac tgg aat cgg ttg cat 205Tyr Glu Trp His Leu Glu Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His35 40 45gat gat gcc gaa gct tta agt aat gcg ggt att aca gct att tgg ata 253Asp Asp Ala Glu Ala Leu Ser Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile50 55 60ccc cca gcc tac aaa gga aat agt cag gct gat gtt ggg tat ggt gca 301Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala65 70 75tac gac ctt tat gat tta ggg gag ttt aat caa aaa ggt acc gtt cga 349Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg80 85 90 95acg aaa tac ggg aca aag gct cag ctt gag cga gct ata ggg tcc cta 397Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu100 105 110aag tcg aat gat atc aat gtt tat ggg gat gtc gta atg aat cat aaa 445Lys Ser Asn Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys115 120 125tta gga gct gat ttc acg gag gca gtg caa gct gtt caa gta aat cct 493
Leu Gly Ala Asp Phe Thr Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro130 135 140tcg aac cgt tgg cag gat att tca ggt gtc tac acg att gat gca tgg 541Ser Asn Arg Trp Gln Asp Ile Ser Gly Val Tyr Thr Ile Asp Ala Trp145 150 155acg gga ttt gac ttt cca ggg cgc aac aat gcc tat tcc gat ttt aaa 589Thr Gly Phe Asp Phe Pro Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys160 165 170 175tgg aga tgg ttc cat ttt aat ggc gtt gac tgg gat caa cgc tat caa 637Trp Arg Trp Phe His Phe Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln180 185 190gaa aac cat ctt ttt cgc ttt gca aat acg aac tgg aac tgg cga gtg 685Glu Asn His Leu Phe Arg Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val195 200 205gat gaa gag aat ggt aat tat gac tat tta tta gga tcg aac att gac 733Asp Glu Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp210 215 220ttt agc cac cca gag gtt caa gag gaa tta aag gat tgg ggg agc tgg 781Phe Ser His Pro Glu Val Gln Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp225 230 235ttt acg gat gag cta gat tta gat ggg tat cga ttg gat gct att aag 829Phe Thr Asp Glu Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys240 245 250 255cat att cca ttc tgg tat acg tca gat tgg gtt agg cat cag cga agt 877His Ile Pro Phe Trp Tyr Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Ser260 265 270
gaa gca gac caa gat tta ttt gtc gta ggg gag tat tgg aag gat gac 925Glu Ala Asp Gln Asp Leu Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp275 280 285gta ggt gct ctc gaa ttt tat tta gat gaa atg aat tgg gag atg tct 973Val Gly Ala Leu Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser290 295 300cta ttc gat gtt ccg ctc aat tat aat ttt tac cgg get tea aag caa 1021Leu Phe Asp Val Pro Leu Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Lys Gln305 310 315ggc gga agc tat gat atg cgt aat att tta cga gga tct tta gta gaa 1069Gly Gly Ser Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu320 325 330 335gca cat ccg att cat gca gtt acg ttt gtt gat aat cat gat act cag 1117Ala His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln340 345 350cca gga gag tca tta gaa tca tgg gtc gct gat tgg ttt aag cca ctt 1165Pro Gly Glu Ser Leu Glu Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu355 360 365gct tat gcg aca atc ttg acg cgt gaa ggt ggt tat cca aat gta ttt 1213Ala Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe370 375 380tac ggt gac tac tat ggg att cct aac gat aac att tca gct aag aag 1261Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys385 390 395gat atg att gat gag ttg ctt gat gca cgt caa aat tac gca tat ggc 1309Asp Met Ile Asp Glu Leu Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly
400 405 410 415aca caa cat gac tat ttt gat cat tgg gat atc gtt gga tgg aca aga 1357Thr Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg420 425 430gaa ggt aca tcc tca cgt cct aat tcg ggt ctt gct act att atg tcc 1405Glu Gly Thr Ser Ser Arg Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser435 440 445aat ggt cct gga gga tca aaa tgg atg tac gta gga cag caa cat gca 1455Asn Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Gln His Ala450 455 460gga caa acg tgg aca gat tta act ggc aat cac gcg gcg tcg gtt acg 1501Gly Gln Thr Trp Thr Asp Leu Thr Gly Asn His Ala Ala Ser Val Thr465 470 475att aat ggt gat ggc tgg ggc gaa ttc ttt aca aat gga gga tct gta 1549Ile Asn Gly Asp Gly Trp Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val480 485 490 495tcc gtg tat gtg aac caa taataaaaag ccttgagaag ggattcctcc ctaactca 1605Ser Val Tyr Val Asn Gln500aggctttctt tatgtcgttt agctcaacgc ttctacgaag cttta 1650<210>4<211>1745<212>DNA<213>芽孢桿菌屬種類<400>4
aactaagtaa catcgattca ggataaaagt atgcgaaacg atgcgcaaaa ctgcgcaact 60actagcactc ttcagggact aaaccacctt ttttccaaaa atgacatcat ataaacaaat 120ttgtctacca atcactattt aaagctgttt atgatatatg taagcgttat cattaaaagg 180aggtatttg atg aga aga tgg gta gta gca atg ttg gca gtg tta ttt tta 231Met Arg Arg Trp Val Val Ala Met Leu Ala Val Leu Phe Leu5 10ttt cct tcg gta gta gtt gca gat gga ttg aac ggt acg atg atg cag279Phe Pro Ser Val Val Val Ala Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln15 20 25 30tat tat gag tgg cat ttg gaa aac gac ggg cag cat tgg aat cgg ttg327Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu35 40 45cac gat gat gcc gca gct ttg agt gat gct ggt att aca gct att tgg375His Asp Asp Ala Ala Ala Leu Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp50 55 60att ccg cca gcc tac aaa ggt aat agt cag gcg gat gtt ggg tac ggt423Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly65 70 75gca tac gat ctt tat gat tta gga gag ttc aat caa aag ggt act gtt471Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val80 85 90cga acg aaa tac gga act aag gca cag ctt gaa cga gct att ggg tcc519Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser95 100 105 110ctt aaa tct aat gat atc aat gta tac gga gat gtc gtg atg aat cat567Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His
115 120 125aaa atg gga gct gat ttt acg gag gca gtg caa gct gtt caa gta aat 615Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn130 135 140cca acg aat cgt tgg cag gat att tca ggt gcc tac acg att gat gcg 663Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala145 150 155tgg acg ggt ttc gac ttt tca ggg cgt aac aac gcc tat tca gat ttt 711Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe160 165 170aag tgg aga tgg ttc cat ttt aat ggt gtt gac tgg gat cag cgc tat 759Lys Trp Arg Trp Phe His Phe Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr175 180 185 190caa gaa aat cat att ttc cgc ttt gca aat acg aac tgg aac tgg cga 807Gln Glu Asn His Ile Phe Arg Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg195 200 205gtg gat gaa gag aac ggt aat tat gat tac ctg tta gga tcg aat atc 855Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile210 215 220gac ttt agt cat cca gaa gta caa gat gag ttg aag gat tgg ggt agc 903Asp Phe Ser His Pro Glu Val Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser225 230 235tgg ttt acc gat gag tta gat ttg gat ggt tat cgt tta gat gct att 951Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile240 245 250aaa cat att cca ttc tgg tat aca tct gat tgg gtt cgg cat cag cgc 999
Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg255 260 265 270aac gaa gca gat caa gat tta ttt gtc gta ggg gaa tat tgg aag gat 1047Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp275 280 285gac gta ggt gct ctc gaa ttt tat tta gat gaa atg aat tgg gag atg 1095Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met290 295 300tct cta ttc gat gtt cca ctt aat tat aat ttt tac cgg gct tca caa 1143Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln305 310 315caa ggt gga agc tat gat atg cgt aat att tta cga gga tct tta gta 1191Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val320 325 330gaa gcg cat ccg atg cat gca gtt acg ttt gtt gat aat cat gat act 1239Glu Ala His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr335 340 345 350cag cca ggg gag tca tta gag tca tgg gtt gct gat tgg ttt aag cca 1287Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro355 360 365ctt gct tat gcg aca att ttg acg cgt gaa ggt ggt tat cca aat gta 1335Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val370 375 380ttt tac ggt gat tac tat ggg att cct aac gat aac att tca gct aaa 1383Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys385 390 395
aaa gat atg att gat gag ctg ctt gat gca cgt caa aat tac gca tat 1431Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr400 405 410ggc acg cag cat gac tat ttt gat cat tgg gat gtt gta gga tgg act 1479Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr415 420 425 430agg gaa gga tct tcc tcc aga cct aat tca ggc ctt gcg act att atg 1527Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met435 440 445tcg aat gga cct ggt ggt tcc aag tgg atg tat gta gga cgt cag aat 1575Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn450 455 460gca gga caa aca tgg aca gat tta act ggt aat aac gga gcg tcc gtt 1623Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val465 470 475aca att aat ggc gat gga tgg ggc gaa ttc ttt acg aat gga gga tct 1671Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser480 485 490gta tcc gtg tac gtg aac caa taacaaaaag ccttgagaag ggattcctcc ctaa 1726Val Ser Val Tyr Val Asn Gln495 500ctcaaggctt tctttatgt 174權(quán)利要求
1.一種堿性溶解淀粉酶，當(dāng)在1-100mM EDTA或EGTA存在的情況下于pH10和45℃處理30分鐘時(shí)，其具有不低于70％的剩余淀粉酶水解活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的堿性溶解淀粉酶，進(jìn)一步具有以下酶特征1)最佳作用pH用可溶性淀粉為底物，于50℃反應(yīng)15分鐘時(shí)，所述堿性溶解淀粉酶具有超過(guò)8.0的最佳作用pH；2)作用所述堿性溶解淀粉酶水解淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉以及直鏈淀粉和支鏈淀粉的部分降解產(chǎn)物中的α-1，4-糖苷鍵，形成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖，然而所述堿性溶解淀粉酶并不作用于出芽短梗霉聚糖；3)在Britton-Robinson緩沖液中的pH穩(wěn)定性在6.5-11.0的pH范圍內(nèi)、于40℃處理30分鐘時(shí)，所述堿性溶解淀粉酶表現(xiàn)不低于70％的剩余淀粉酶水解活性；4)作用溫度范圍和最佳作用溫度所述堿性溶解淀粉酶在20-80℃的較寬溫度范圍內(nèi)起作用，最佳作用溫度為50-60℃；5)溫度穩(wěn)定性于40℃在pH10的50mM甘氨酸氫氧化鈉緩沖液中處理30分鐘，所述堿性溶解淀粉酶表現(xiàn)不低于80％的剩余淀粉酶水解活性，即使于45℃也表現(xiàn)約60％的剩余淀粉酶水解活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的堿性溶解淀粉酶，進(jìn)一步具有以下酶特征6)氧化劑抗性當(dāng)在2％過(guò)氧化氫存在的情況下于pH10和30℃處理60分鐘時(shí)，所述堿性溶解淀粉酶表現(xiàn)不低于70％的剩余淀粉酶水解活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的堿性溶解淀粉酶，其具有與序列表No.1或No.2所示序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。
5.編碼根據(jù)權(quán)利要求1到4中的任意一項(xiàng)所述的堿性溶解淀粉酶的核苷酸序列。
6.包含根據(jù)權(quán)利要求1到4中的任意一項(xiàng)所述的堿性溶解淀粉酶的去污劑組合物。
全文摘要
描述的是一種堿性溶解淀粉酶，當(dāng)在1－100mM的EDTA或EGTA存在的情況下于pH10和45℃處理30分鐘時(shí)，具有不低于70％的剩余活性；以及包含相同酶的去污劑。與用于去污劑的傳統(tǒng)淀粉酶相比，它們具有高抗螯合劑性能。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1552852SQ20041005929
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期1999年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月21日
發(fā)明者萩原浩, 北山香織, 林康弘, 五十嵐一曉, 遠(yuǎn)藤圭二, 尾崎克也, 一曉, 也, 二, 原浩, 織 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社