專利名稱：：白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶和在顆粒淀粉水解中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來(lái)自白曲霉(Aspergilluskawachi)菌株的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(asAA))，其具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在絲狀真菌宿主細(xì)胞中尤其是木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)的細(xì)胞中異源表達(dá)具有GSH活性的asAA以及具有GSH活性的asAA在組合物中的用途，所述組合物中任選地包括葡糖淀粉酶，以便增強(qiáng)淀粉水解(starchhydrolysis)和醇生產(chǎn)(alcoholproduction)。
背景技術(shù)：
：葡糖淀粉酶，尤其是具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性的葡糖淀粉酶是重要的工業(yè)酶，用于生產(chǎn)產(chǎn)品例如有機(jī)酸類(即乳酸類)；氨基酸類(即谷氨酸類)；醇類(即乙醇)；以及來(lái)自源自植物型底物如谷物(grains)和谷類(cereals)的淀粉底物的其它化合物。在微生物發(fā)酵期間，尤其是在同步糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandfermentation(SSF))期間，當(dāng)顆粒淀粉底物被用作碳源(carbonfeed)時(shí)，降低發(fā)酵中殘留淀粉的量將是有利的。本發(fā)明通過(guò)提供具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(asAA))響應(yīng)這種需求，所述酸穩(wěn)定性α淀粉酶可以與葡糖淀粉酶結(jié)合使用，以增強(qiáng)淀粉水解和醇產(chǎn)量。此外，本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)組合物和方法的益處包括下列中的一個(gè)或更多個(gè)a)在淀粉水解和終產(chǎn)物生產(chǎn)期間對(duì)熱能使用的減少；b)對(duì)高酶劑量的要求降低；c)利用葡萄糖從淀粉的連續(xù)釋放，以飼養(yǎng)酵母；d)在發(fā)酵罐中維持相對(duì)低的葡萄糖水平，其顯著降低微生物污染的高風(fēng)險(xiǎn)和消除由于高濃度游離葡萄糖所導(dǎo)致的酵母降解物阻遏；e)褐變反應(yīng)產(chǎn)物形成的減少；f)降低或免除鈣添加，這在現(xiàn)有技術(shù)噴煮工藝(jetcookingprocess)期間是必須的；g)降低在發(fā)酵工藝期間的水使用；h)在發(fā)酵中使用較高的固形物含量，其可以導(dǎo)致較高的終產(chǎn)物形成和降低的能量成本；i)降低某些副產(chǎn)物的產(chǎn)量水平，例如甘油；和j)含可溶物干酒糟(distillersdrygrainsplussolubles)中降低的殘留淀粉含量和增加的蛋白質(zhì)含量。發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)醇的方法，其包括將顆粒淀粉底物(granularstarchsubstrate)與具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(asAA))和葡糖淀粉酶(glucoamylase(GA))在發(fā)酵步驟中接觸以及在該發(fā)酵步驟中產(chǎn)生醇，所述發(fā)酵步驟進(jìn)一步包括產(chǎn)乙醇微生物(ethanologenicmicroorganisms)。在一些實(shí)施方式中，顆粒淀粉底物得自玉米或小麥。在其它實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA得自真菌宿主細(xì)胞中的異源多核苷酸的表達(dá)，所述異源多核苷酸編碼與序列SEQIDNO3具有至少85％、90％或95％的序列同一性的asAA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵步驟包括表達(dá)asAA的真菌細(xì)胞，以及在其它實(shí)施方式中發(fā)酵步驟包括無(wú)細(xì)胞asAA提取物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，由所述方法產(chǎn)生的醇是乙醇，產(chǎn)乙醇的微生物是酵母。在另外的實(shí)施方式中，從真菌宿主中的異源多核苷酸的表達(dá)生產(chǎn)GA。仍然在其它實(shí)施方式中，從發(fā)酵中回收醇。在第二方面，本發(fā)明涉及真菌宿主細(xì)胞，其包含有編碼具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的異源多核苷酸，該異源多核苷酸與序列SEQIDNO3具有至少85％或至少90％的序列同一性；并且在一些實(shí)施方式中，異源多核苷酸編碼與序列SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性的具有GSH活性的asAA；以及在一些實(shí)施方式中，從真菌宿主中表達(dá)的具有GSH活性的asAA，相比從天然宿主中獲得的具有GSH活性的asAA，具有較低的最適pH。在一個(gè)實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，木霉屬宿主細(xì)胞是里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞。在第三方面，本發(fā)明涉及顆粒淀粉水解酶組合物，其包括具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(asAA))，其中所述具有GSH活性的asAA與序列SEQIDNO3具有至少85％、90％或95％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，酶組合物包括具有GSH活性的截短型asAA(truncatedasAA)，所述酶與SEQIDNO9具有至少97％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，asAA來(lái)自真菌宿主細(xì)胞中的異源多核苷酸的表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是木霉屬或曲霉屬宿主細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，組合物進(jìn)一步包含葡糖淀粉酶(glucoamylaseenzyme)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶將從曲霉屬(Aspergillus)或根霉屬(Rhizopus)的菌株中獲得。在其它實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶將是具有GSH活性的葡糖淀粉酶以及從曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、根霉屬(Rhizopus)或腐質(zhì)霉屬(Humicola)的菌株獲得。在其它實(shí)施方式中，asAA和葡糖淀粉酶都將在真菌宿主中被表達(dá)，所述真菌宿主含有表達(dá)具有GSH活性的asAA和葡糖淀粉酶的異源多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，真菌宿主菌株將是相同的；以及，在其它實(shí)施方式中，真菌宿主菌株將是不同的。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及使用本方面的酶組合物水解顆粒淀粉的方法。在第四方面，本方明涉及提高含葡糖淀粉酶的組合物的顆粒淀粉水解活性的方法，其包括將具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(asAA))加入到包含顆粒淀粉底物和葡糖淀粉酶的組合物中，以產(chǎn)生可溶性淀粉水解產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，擁有GSH活性的asAA具有與SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；以及在其它實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA是截短型asAA。在一些實(shí)施方式中，截短型asAA包含與SEQIDNO9有至少97％的序列同一性的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，增溶淀粉的量大于缺乏具有GSH活性的asAA的相應(yīng)組合物。在第五方面，本發(fā)明涉及從谷物底物產(chǎn)生醇優(yōu)選乙醇的一步法，包括在合適的發(fā)酵條件下于發(fā)酵介質(zhì)中混合(i)來(lái)自谷物的顆粒淀粉底物、(ii)具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(asAA))和(iii)產(chǎn)乙醇微生物，以獲得包括醇的已發(fā)酵組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA與序列SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA從木霉屬宿主中的表達(dá)獲得。在另一個(gè)實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA是截短型asAA。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶(glucoamylase)被加入該步驟。仍然是另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明涉及根據(jù)這個(gè)方法獲得的發(fā)酵組合物(fermentedcomposition)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明所包含的方法所產(chǎn)生的乙醇被回收。在其它實(shí)施方式中，從玉米、小麥、大麥、黑麥、馬鈴薯、水稻、高梁或木薯中得到谷物。在第六方面，本發(fā)明涉及減少含固體干酒糟(distiller’sdriedgrainsplussolids(DDGS))中的殘留淀粉量的方法，包括通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生醇、蒸餾該醇以獲得發(fā)酵殘留物、處理發(fā)酵殘留物以獲得含可溶物的干酒糟(distaller’sdriedgrainwithsolubles)。在一些實(shí)施方式中，殘留的淀粉量將在20％以下，以及還在15％以下。附圖簡(jiǎn)述圖1A-B提供了編碼天然白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(nativeAspergilluskawachiacid-stablealpha-amylase)的基因組DNA序列(genomicDNAsequence)，其被稱為asaA(SEQIDNO1)。在八個(gè)推定的內(nèi)含子處加注下劃線。圖2提供了白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(A.kawachiacid-stablealpha-amylase)(SEQIDNO4)的信號(hào)序列(SEQIDNO2)和成熟氨基酸序列(SEQIDNO3)(AsaA)。推定的信號(hào)序列(signalsequence)(氨基酸1-21)加下劃線并標(biāo)記為粗體。推定的接頭(linker)是TTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTT(SEQIDNO8)。接頭上游的氨基酸，其沒(méi)有下劃線，包括催化結(jié)構(gòu)域(catalyticdomain)(SEQIDNO9)；接頭下游的氨基酸包括淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(starchbindingdomain(SBD))(SEQIDNO10)。SBD包含圖2的多肽的最后102個(gè)氨基酸。圖3A-D提供了質(zhì)粒pTrex3g_Akalpha(圖4)的完整的核苷酸序列(SEQIDNO5)，10990bp。圖4提供了pTrex3g_Akalpha的圖譜，其被用于編碼AsaA(白曲霉asAA)的核酸的表達(dá)，并且其含有位于真菌表達(dá)載體兩側(cè)上的EcoRI位點(diǎn)(EcoRIsites)，其中a)cbhI啟動(dòng)子是里氏木霉纖維二糖水解酶啟動(dòng)子(Trichodermareeseicellobiohydrolasepromoter)；b)asaA是編碼SEQIDNO4所示酸穩(wěn)定性α淀粉酶的白曲霉多核苷酸(Aspergilluskawachipolynucleotide)；c)cbhI終止子是里氏木霉纖維二糖水解酶終止子(Trichodermareeseicellobiohydrolaseterminator)；d)amdS是構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因(Aspergillusnidulansacetamidasenutritionalmarkergene)；和e)attB是用于重組的Gateway克隆系統(tǒng)(Invitrogen)λ噬菌體位點(diǎn)。圖5A和B提供了SDS-PAGE凝膠，顯示了在里氏木霉克隆的代表性發(fā)酵試驗(yàn)中來(lái)自里氏木霉的asaA表達(dá)，如實(shí)施例5所描述。在圖5A中，泳道1代表標(biāo)準(zhǔn)SeeBlue+2標(biāo)志物；泳道2代表在80小時(shí)后里氏木霉表達(dá)的AsaA；泳道3代表在162小時(shí)后里氏木霉表達(dá)的AsaA以及泳道4代表在162小時(shí)時(shí)的里氏木霉宿主細(xì)胞對(duì)照，其中未用asaA轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞對(duì)照。AsaA蛋白質(zhì)條帶在約90kDa被清楚地觀察到，并且該條帶在宿主菌株對(duì)照中不存在。在圖5B中，泳道1代表里氏木霉在210小時(shí)后表達(dá)的AsaA，泳道2代表在200小時(shí)后里氏木霉以完整型和截短型形式所表達(dá)的AsaA的3條帶，以及泳道3代表分子量標(biāo)志物。圖6以殘留活性百分率說(shuō)明了天然白曲霉(nAk-AsaA)和在里氏木霉宿主中表達(dá)的白曲霉(rAk-AsaA)(SEQIDNO3)的pH穩(wěn)定性，如實(shí)施例6中所述。圖7說(shuō)明了在pH5.0下，隨著時(shí)間的過(guò)去，從采用葡糖淀粉酶(0.5GAU/gDISTILLASE)和α淀粉酶發(fā)酵玉米面粉醪液得到的乙醇(EtOH)產(chǎn)量百分?jǐn)?shù)(v/v)，其中AkAA表示Tr-AsaA(在里氏木霉中表達(dá)的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(A.kawachiacidstablealphaamylaseexpressedinTrichodermareesei)；LT75表示SPEZYMELT75α淀粉酶；FRED表示SPEZYMEFRED；ETHYL表示SPEZYMEETHYL；FA表示CLARASE以及DISTILLASE是對(duì)照。參考實(shí)施例8。圖8說(shuō)明了在pH5.0下，在與純化的DISTILLASE(GA)、純化的AkAA(在里氏木霉中表達(dá)的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶)以及與AkAA和GA的組合溫育4小時(shí)之后，顆粒淀粉降解成葡萄糖釋放出來(lái)。參考實(shí)施例11。圖9圖示了與圖8所描述酶溫育的顆粒玉米淀粉的SEMs(掃描電子顯微鏡圖)純化的DISTILLASE(GA)、純化的AkAA(在里氏木霉中表達(dá)的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶)以及AkAA和GA的組合。圖10A概括了在發(fā)酵72小時(shí)時(shí)所測(cè)量的、在不同玉米面粉固體(％ds)下的以％(v/v)表示的最終乙醇水平。圖10B說(shuō)明了對(duì)于每一玉米醪液固體(cornmashsolids)(％ds)，采用AkAA的乙醇增加百分率，以相對(duì)于醪液固體(％ds)進(jìn)行作圖。圖11說(shuō)明了在采用0.5GAU/g和AkAA(0.0SSU/g或1.5SSU/g)發(fā)酵72小時(shí)之后，不同的玉米面粉固體所致的殘留淀粉的百分?jǐn)?shù)，如在實(shí)施例12中進(jìn)一步解釋。圖12描繪了在71小時(shí)時(shí)測(cè)量的來(lái)自發(fā)酵液的乙醇體積百分?jǐn)?shù)v/v，所述發(fā)酵液包括在固定AkAA劑量水平-1.5SUU/gdsAkAA下的完整型利截短型AkAA的變化比例。圖13說(shuō)明了來(lái)自里氏木霉(Trichodermareesei)菌株的葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQIDNO11)。圖14說(shuō)明了來(lái)自灰腐質(zhì)霉高溫變種(Humicolagriseavar.thermoidea)菌株的葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQIDNO12)。圖15說(shuō)明了來(lái)自白曲霉(Aspergilluskawachi)菌株的葡糖淀粉酶的氨基酸序列(SEQIDNO13)。圖16是示意圖，其說(shuō)明了本發(fā)明的一種實(shí)施方式。該實(shí)施方式包括將顆粒淀粉底物與葡糖淀粉酶、asAA和微生物在反應(yīng)器中混合，使得在包含25-40℃下發(fā)酵2-100小時(shí)的這樣的條件下、在單一的步驟中發(fā)酵。在發(fā)酵中所產(chǎn)生的混合物被分離?？梢詮姆蛛x過(guò)程中回收醇，并且可以產(chǎn)生乙醇。此外，可以回收未發(fā)酵的固體和水的混合物。該未發(fā)酵的固體和水的混合物，其包含有殘留的淀粉、釜餾物、蛋白質(zhì)和微生物，可以被進(jìn)一步處理，以便產(chǎn)生產(chǎn)品，例如DDG(酒廠干糟，干酒糟)和DDGS(含有可溶物的干酒糟，含可溶物酒廠干酒糟)或者所述混合物的成分可以(單獨(dú)地或被組合地)被再循環(huán)回到反應(yīng)器中進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵。發(fā)明詳述在一些方面，本發(fā)明依靠在遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域中使用的常規(guī)技術(shù)和方法。下面的資源含有對(duì)根據(jù)本發(fā)明有用的一般方法學(xué)的描述Sambrooketal.，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL(2ndEd.，1989)；Kreigler，GENETRANSFERANDEXPRESSION；ALABORATORYMANUAL(1990)以及Ausubeletal.，Eds.CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(1994)。這些一般性的參考資料提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的定義和方法。然而，并不意欲將本發(fā)明限制到所述的任何具體的方法、步驟和試劑，因?yàn)檫@些可以變化。除非本文中另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。Singleton，etal.，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2DED.，JohnWileyandSons，NewYork(1994)和Hale&Markham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)中的許多條目的通用詞典。盡管類似或等價(jià)于本文中所描述的那些的任何方法和材料可以在本發(fā)明的實(shí)踐和測(cè)試中使用，但描述的是優(yōu)選的方法和材料?，F(xiàn)在，將通過(guò)僅僅是參考的方式，使用下面的定義和例子，詳細(xì)地描述本發(fā)明。本文中所引用的所有專利和出版物，包括在這類專利和出版物中公開的所有序列，被清楚地引入作為參考。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字。除非另外指出，分別地，核酸以5′到3′方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向從左到右書寫。本文所提供的標(biāo)題不是對(duì)本發(fā)明的不同方面或者實(shí)施方式的限制，本發(fā)明的各種不同方面或者實(shí)施方式可以通過(guò)從整體上參閱說(shuō)明書而獲知。A.定義如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“淀粉(starch)”是指含有植物的復(fù)合多糖碳水化合物的任何物質(zhì)，包括具有式子(C6H10O5)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任意數(shù)字。具體而言，該術(shù)語(yǔ)是指任何植物型物質(zhì)，包括但不限于谷粒、草、塊莖和根，更特別地是小麥、大麥、玉米、黑麥、水稻、高梁、麩、木薯、黍、馬鈴薯、甘薯和木薯。術(shù)語(yǔ)“顆粒淀粉(granularstarch)”是指生(未蒸煮過(guò))淀粉，例如未經(jīng)歷糊化作用的顆粒淀粉。術(shù)語(yǔ)“顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))酶”或“具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性”是指具有能夠水解顆粒形式的淀粉之能力的酶。術(shù)語(yǔ)“α淀粉酶(alpha-amylase)(例如E.C.3.2.1.1類)”是指催化α-1，4-糖苷鍵水解的酶。這些酶還被描述為那些實(shí)現(xiàn)含有1，4-α-連接D-葡萄糖單元的多糖中1，4-α-D-糖苷鍵的外切或內(nèi)切水解的酶。用于描述這些酶的另一個(gè)術(shù)語(yǔ)是“糖原酶(glycogenase)”。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(alpha-1，4-glucau4-glucanohydraseglucanohydrolase)。術(shù)語(yǔ)“酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(“asAA”))”是指在pH3.0到7.0的pH范圍內(nèi)有活性的α淀粉酶，優(yōu)選3.5到6.0的pH范圍。術(shù)語(yǔ)“截短型asAA(truncatedasAA)”是指具有GSH活性的asAA多肽，其中至少部分SBD已被去除。在一個(gè)實(shí)施方式中，截短型asAA是指包含SEQIDNO3的至少65％的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，截短型asAA將包括與SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的氨基酸的至少65％。術(shù)語(yǔ)“淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(strachbindingdomain(SBD))”是指優(yōu)先結(jié)合淀粉(多糖)底物的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“接頭(linker)”是指通常具有3到40個(gè)之間的氨基酸的短氨基酸序列，其共價(jià)連接包含淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和包含催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“催化結(jié)構(gòu)域(catalyticdomain)”是指區(qū)別于SBD并且含有底物水解的活性部位的多肽結(jié)構(gòu)區(qū)。術(shù)語(yǔ)“葡糖淀粉酶(glucoamylase)”是指酶的淀粉葡萄糖苷酶類(例如E.C.3.2.1.3、葡糖淀粉酶、1，4-α-D葡聚糖葡糖水解酶)。這些是外切作用的酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原端釋放葡糖基殘基。該酶還水解α-1，6鍵和α-1，3鍵，盡管速率比α-1，4鍵低得多。術(shù)語(yǔ)“糖基化(glycosylation)”是指通過(guò)加入糖部分而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾，其中碳水化合物糖可以是N-連接或O-連接，從而形成糖蛋白。糖蛋白的N-連接碳水化合物部分是通過(guò)糖苷鍵被附加到天冬酰胺殘基的β-酰胺氮上。O-連接碳水化合物是通過(guò)絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基以糖苷鍵被連接到蛋白質(zhì)上。術(shù)語(yǔ)“重組體(recombinant)”，當(dāng)被用于細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，是指該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體通過(guò)引入異源核酸或蛋白質(zhì)或天然核酸或蛋白質(zhì)的變更而被修飾，或者是指細(xì)胞是來(lái)自被如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的天然(非重組型)形式內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的基因，或者重組細(xì)胞表達(dá)在其他情況下將異常表達(dá)、欠表達(dá)或完全不表達(dá)的天然基因。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)(protein)”和“多肽(polypeptide)”在本文中可以互換使用。氨基酸殘基的傳統(tǒng)的單字母代碼和三字母代碼在本文中被使用?！靶盘?hào)序列(signalsequence)”指連接到蛋白質(zhì)的N末端部分上的氨基酸的序列，其促進(jìn)該蛋白質(zhì)的成熟形式分泌到細(xì)胞外。信號(hào)肽的定義是功能性定義。胞外蛋白的成熟形式缺少信號(hào)序列，信號(hào)序列在分泌過(guò)程中被切割去。術(shù)語(yǔ)“天然型酸穩(wěn)定性α淀粉酶(nativeacid-stablealphaamylase(n-asAA))”是指由asAA的內(nèi)源性表達(dá)而產(chǎn)生的asAA。例如，術(shù)語(yǔ)“n-asAA”意指來(lái)自白曲霉的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(即，SEQID3)的內(nèi)源表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“重組型酸穩(wěn)定性α淀粉酶(recombinantacid-stablealphaamylase(r-asAA))”、“重組表達(dá)的asAA(recombinantlyexpressedasAA)”和“重組產(chǎn)生的asAA(recombinantlyproducedasAA)”是指成熟asAA蛋白質(zhì)序列，其在宿主細(xì)胞中由異源多核苷酸的表達(dá)而被制備。例如，術(shù)語(yǔ)“r-asaA”意指白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(即SEQIDNO3)在引入編碼該asaA的多核苷酸的宿主中被表達(dá)和產(chǎn)生。r-asAA的成熟蛋白質(zhì)序列不包括信號(hào)序列?！盎?gene)”是指DNA片段，其與產(chǎn)生多肽有關(guān)并且包括編碼區(qū)前后的區(qū)域以及單獨(dú)的編碼區(qū)(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。術(shù)語(yǔ)“核酸(nucleicacid)”包涵DNA、RNA、其單鏈或雙鏈及化學(xué)修飾體。術(shù)語(yǔ)“核酸(nucleicacid)”和“多核苷酸(polynucleotide)”在本文中可以互換使用。因?yàn)檫z傳密碼是簡(jiǎn)并的，一個(gè)以上的密碼子可以被用于編碼一個(gè)具體的氨基酸，并且本發(fā)明涵蓋編碼一條具體的氨基酸序列的多條多核苷酸。“載體(vector)”是指被設(shè)計(jì)用以將核酸引入到一種或更多種細(xì)胞類型內(nèi)的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、表達(dá)盒及類似物。本文中所使用的“表達(dá)載體(expressionvector)”是指DNA構(gòu)建物，其包括可操縱性連接到合適的調(diào)控序列上的DNA序列，所述調(diào)控序列能夠引起該DNA在合適宿主中的表達(dá)。這樣的調(diào)控序列可以包括引起轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、調(diào)控轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子和調(diào)控轉(zhuǎn)錄與翻譯終止的序列?！皢?dòng)子(promoter)”是調(diào)控序列，其涉及結(jié)合RNA聚合酶以起始基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子。本發(fā)明使用的優(yōu)選的啟動(dòng)子是里氏木霉cbh1，其是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?！笆苻D(zhuǎn)錄調(diào)控(undertranscriptionalcontrol)”是本領(lǐng)域中被充分理解的一個(gè)術(shù)語(yǔ)，其表明多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，通常是DNA序列的轉(zhuǎn)錄，取決于其被可操縱性連接到有助于轉(zhuǎn)錄起始或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的元件上?！笆芊g調(diào)控(undertranslationalcontrol)”是本領(lǐng)域中被充分理解的一個(gè)術(shù)語(yǔ)，其表示發(fā)生在mRNA業(yè)已形成之后的調(diào)控過(guò)程。如本文中在描述蛋白質(zhì)和編碼它們的基因時(shí)所使用，關(guān)于基因的術(shù)語(yǔ)是斜體字，(例如，編碼asaA(白曲霉asAA)的基因可以被表示為asaA)。關(guān)于蛋白質(zhì)的術(shù)語(yǔ)通常不是斜體并且第一個(gè)字母一般是大寫，(例如，由asaA基因編碼的蛋白質(zhì)可以被表示為AsaA或asaA)。術(shù)語(yǔ)“源自(derived)”包括術(shù)語(yǔ)“起源自(originatedfrom)”、“得自(obtained)”或“可以得自(obtainablefrom)”、和“分離自(isolatedfrom)”以及如本文中所使用的，是指由核苷酸序列編碼的多肽是從細(xì)胞中制備，在所述細(xì)胞中天然存在該核苷酸或該核苷酸被插入到所述細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“可操縱性連接(operablylinked)”是指并列關(guān)系(juxtaposition)，其中元件被排列使得它們功能性相關(guān)。例如，如果啟動(dòng)子調(diào)控編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，那么其則被可操縱性連接到該序列上。術(shù)語(yǔ)“選擇性標(biāo)記(selectivemarker)”是指能夠在宿主中表達(dá)的基因，其使得容易選擇那些含有引入的核酸或載體的宿主。選擇性標(biāo)記的例子包括但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博萊霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細(xì)胞代謝優(yōu)勢(shì)的基因，例如營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)。多核苷酸或多肽與另一條序列具有某一百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性是指當(dāng)比對(duì)時(shí)，在比較的兩條序列中，該百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。該比對(duì)和百分比同源性或同一性可以使用本領(lǐng)域中已知的任何合適軟件程序來(lái)確定，例如在CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubeletal.(eds)1987，Supplement30，7.7.18部分)中描述的那些程序。優(yōu)選的程序包括GCGPileup程序、FASTA(Pearsonetal.(1988)Proc.Natl，Acad.SciUSA852444-2448)、和BLAST(BLASTManual，Altschuletal.，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，NatlLib.Med.(NCIBNLMNIH)，Bethesda，MD，和Altschuletal.，(1997)NAR253389-3402)。另一個(gè)優(yōu)選的程序是ALIGNPlus(ScientificandEducatiooalSoRware，PA)，優(yōu)選使用默認(rèn)參數(shù)。發(fā)現(xiàn)有用的另一個(gè)序列軟件程序是TFASTADataSearchingProgram，其在SequenceSoftwarePackageVersion6.0(GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin，Madison，WI)中可得到。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明包含的序列還由在嚴(yán)格雜交條件下與示例性的asaA序列(例如SEQIDNO1)進(jìn)行雜交的能力所定義。當(dāng)單鏈形式的核酸在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度條件下能與另一條核酸退火，該核酸是與另一條核酸序列可以雜交的。雜交和漂洗條件在本領(lǐng)域中是熟知的(參見(jiàn)，例如Sambrook(1989)，見(jiàn)上文，特別是第9章和第11章)。在一些實(shí)施方式中，嚴(yán)格條件相當(dāng)于65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS?！八拗骶?hoststrain)”或“宿主細(xì)胞(hostcell)”是指對(duì)于含有編碼根據(jù)本發(fā)明的顆粒淀粉水解酶的多核苷酸的表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物合適的宿主。特別地，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌細(xì)胞或經(jīng)遺傳學(xué)修飾的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，“宿主細(xì)胞”是指從絲狀真菌菌株以及尤其是木霉屬某種(Trichodermasp.)或曲霉屬某種(Aspergillussp.)的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞和原生質(zhì)體。術(shù)語(yǔ)“絲狀真菌(filamentousfungi)”是指真菌亞門(subdivisionEumycotina)(參見(jiàn)Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY，Wiley，NewYork以及AINSWORTHANDBISBYDICTIONARYOFTHEFUNGI，9thEd(2001)，KirketalEds.，CAB，InternationalPublishing)的所有絲狀形式。這些真菌的特征在于營(yíng)養(yǎng)菌絲體具有由幾丁質(zhì)、纖維素和其它復(fù)合多糖組成的細(xì)胞壁。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)上、生理學(xué)上和遺傳學(xué)上不同于酵母。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲延伸實(shí)現(xiàn)，并且碳分解代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌母細(xì)胞可以是但不限于下列種的細(xì)胞木霉屬(例如里氏木霉(以前分類為長(zhǎng)枝木霉(T.longibrachiatum)以及目前也被稱為紅褐肉座菌(Hypocreajecorina))、綠色木霉(Trichodermaviride)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))；青霉屬某種(Penicilliumsp.)、腐質(zhì)霉屬某種(Humicolasp.)(例如特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)和灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea))；金孢霉屬某種(Chrysosporiumsp.)(例如，拉克淖金孢菌(C.lucknowense))、粘帚霉屬某種(Gliocladiumsp.)、曲霉屬某種(Aspergillussp.)(例如米曲霉(A.oryzae)、白曲霉(A.kawachi)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori))、鐮刀霉屬某種(Fusariumsp.)、脈孢霉屬某種(Neurosporasp.)、肉座霉屬某種(Hypocreasp.)和翹孢霉屬某種(Emericellasp.)(還參見(jiàn)Innisetal.，(1985)Sci.22821-26)。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“木霉屬(Trichoderma)”或“木霉屬某種(Trichodermasp.)”是指以前或當(dāng)前被分類為木霉屬的任何真菌屬。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)(culturing)”是指在合適的條件下在液體或固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一群微生物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)是指含顆粒淀粉的淀粉底物變成終產(chǎn)物的發(fā)酵型生物轉(zhuǎn)化(典型地，在容器或反應(yīng)器中)。發(fā)酵(fermentation)是通過(guò)微生物對(duì)有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行酶分解和無(wú)氧分解，產(chǎn)生較簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。盡管發(fā)酵在無(wú)氧情況下發(fā)生，并不意圖使該術(shù)語(yǔ)完全限制于嚴(yán)格的無(wú)氧條件，因?yàn)榘l(fā)酵也可以在氧存在的情況下發(fā)生。短語(yǔ)“同步糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandfermentation(SSF))”是指在產(chǎn)生終產(chǎn)物中的一種工藝，其中微生物例如乙醇生產(chǎn)微生物和至少一種酶例如asAA在同一個(gè)處理步驟中存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，SSF是指在同一個(gè)反應(yīng)器容器中，同時(shí)發(fā)生的顆粒淀粉底物水解成包括葡萄糖在內(nèi)的糖類和糖類發(fā)酵成醇。術(shù)語(yǔ)“接觸(contacting)”是指使各個(gè)酶(一種或多種)足夠近地接近各自的底物，以使得該酶(一種或多種)能夠?qū)⒃摰孜镛D(zhuǎn)化成所述終產(chǎn)物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到將酶與各自底物的溶液混合可以實(shí)現(xiàn)接觸。術(shù)語(yǔ)“酶轉(zhuǎn)化(enzymaticconversion)”通常是指通過(guò)酶作用改變底物。本文中所使用的該術(shù)語(yǔ)，還指顆粒淀粉通過(guò)酶的作用而改變。正如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“糖化(saccharification)”是指淀粉被酶促轉(zhuǎn)化成葡萄糖。術(shù)語(yǔ)“糊化(gelatinization)”意思是通過(guò)蒸煮增溶淀粉分子，以便形成粘性懸浮液。術(shù)語(yǔ)“糊化溫度(gelatinizationtemperature)”是指淀粉糊化開始的溫度。糊化的確切溫度取決于特定的淀粉，并且取決于多種因素可以變化，例如植物種類以及環(huán)境和生長(zhǎng)條件。術(shù)語(yǔ)“在糊化溫度以下(belowgelatinizationtemperature)”是指溫度小于開始糊化的溫度。術(shù)語(yǔ)“液化(liquefaction)”是指在淀粉轉(zhuǎn)化中的階段，其中糊化的淀粉被水解，以產(chǎn)生低分子量的可溶性糊精。術(shù)語(yǔ)“聚合度(degreeofpolymerization(DP))”是指在一個(gè)給定的糖化物(saccharide)中的脫水吡喃型葡萄糖單元(anhydroglucopyranoseunit)的數(shù)目(n)。DP1的例子是單糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的例子是雙糖，例如麥芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合度大于3的聚合物。術(shù)語(yǔ)“終產(chǎn)物(end-product)”或“期望的終-產(chǎn)物(desiredend-product)”是指任何碳源來(lái)源的分子產(chǎn)物，其從顆粒淀粉底物被酶促轉(zhuǎn)化而來(lái)。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“干固體含量(drysolidscontent(ds))”是指基于干重的、以百分比(％)計(jì)的淤漿總固體。術(shù)語(yǔ)“淤漿(slurry)”是指含有不溶性固體的含水混合物。術(shù)語(yǔ)“殘留淀粉(residualstarch)”是指在含淀粉底物發(fā)酵之后，在組合物中剩余下來(lái)的殘余淀粉(可溶性的或不溶性的)。術(shù)語(yǔ)“可溶的淀粉水解產(chǎn)物(solublestarchhydrolysate)”是指淀粉水解所得到的可溶產(chǎn)物，其可以包括單糖、雙糖或寡糖(例如葡萄糖、麥芽糖和高級(jí)糖(highersugar))。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“再循環(huán)步驟(recyclingstep)”是指醪液成分(mashcomponents)的再循環(huán)，其可以包括殘留淀粉、酶和/或發(fā)酵含顆粒淀粉的底物的微生物。術(shù)語(yǔ)“醪液(mash)”是指可發(fā)酵碳源(碳水化合物)在水中的的混合物，其被用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，例如醇。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵醪(beer)”、“醪液(mash)”和“發(fā)酵液(fermentationbroth)”可以被互換使用。術(shù)語(yǔ)“釜餾物(stillage)”是指未發(fā)酵固體和水的混合物，其是將醇從已經(jīng)發(fā)酵的醪液除去之后的殘余物。術(shù)語(yǔ)“干酒糟(distillersdriedgrain(DDG))”和“含可溶物干酒糟(distillersdriedgrainwithsolubles(DDSG))”是指谷物發(fā)酵的有用的副產(chǎn)品。如本文中所使用，“產(chǎn)乙醇微生物(ethanologenicmicroorganism)”是指具有將糖或寡糖轉(zhuǎn)化成乙醇之能力的微生物。產(chǎn)乙醇微生物依靠它們表達(dá)單獨(dú)或一起將糖轉(zhuǎn)化成乙醇的一種或多種酶的能力而產(chǎn)乙醇。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“乙醇生產(chǎn)者(ethanolproducer)”或“乙醇生產(chǎn)微生物(ethanolproducingmicroorganism)”是指能夠從己糖或戊糖產(chǎn)生乙醇的任何生物體或細(xì)胞。通常，乙醇-生產(chǎn)細(xì)胞含有醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase)和丙酮酸脫羧酶(pyruvatedecarboxylase)。乙醇生產(chǎn)微生物的例子包括真菌微生物，例如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)的菌株，尤其是釀酒酵母(S.cerevisiae)。當(dāng)與多核苷酸或蛋白質(zhì)有關(guān)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“異源的(heterologous)”是指在宿主細(xì)胞里并非天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)。意圖在于該術(shù)語(yǔ)涵蓋由天然發(fā)生的基因(naturrallyoccurringgenes)、突變基因(mutatedgenes)和/或合成基因(syntheticgenes)編碼的蛋白質(zhì)。當(dāng)與多核苷酸或蛋白質(zhì)有關(guān)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源的(endogenous)”是指多核苷酸或蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生。如同本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“回收的(recovered)”、“分離的(isolated)”和“分開的(sepatated)”是指化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸從與其天然相關(guān)的至少一個(gè)組分中移出。如本文中所使用，與細(xì)胞有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的(transformed)”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的(stablytransformed)”和“轉(zhuǎn)基因的(transgenic)”是指細(xì)胞具有非天然的(例如異源的)核酸序列，所述核酸序列被整合進(jìn)細(xì)胞的基因組中或者作為游離型質(zhì)粒經(jīng)過(guò)多代而被保留。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)(expression)”是指基于基因的核酸序列而產(chǎn)生多肽的過(guò)程。該過(guò)程既包括轉(zhuǎn)錄又包括翻譯。在將核酸序列插入細(xì)胞的上下文中，術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入的(introduced)”是指“轉(zhuǎn)染(transfection)”、或“轉(zhuǎn)化(transformation)”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)”，并且包括涉及將核酸序列引入真核或原核細(xì)胞中，其中所述核酸序列可以被整合入該細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，被轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子，或被瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“比活力(specificactivity)”表示酶單位，由酶制劑在特定條件下每單位時(shí)間使底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的底物摩爾數(shù)所定義。比活力被表達(dá)為單位(U)/毫克蛋白。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“酶單位(enzymeunit)”是指酶的用量，是在試驗(yàn)條件下每給定量時(shí)間產(chǎn)生給定量產(chǎn)物的酶量。在一些實(shí)施方式中，酶單位(enzymeunit)是指在特定的試驗(yàn)條件下每分鐘產(chǎn)生1微摩爾產(chǎn)物的酶量。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“葡糖淀粉酶活性單位(glucoamylaseactivityunit”(GAU)被定義為在60℃和pH4.2的試驗(yàn)條件下，每小時(shí)從可溶性淀粉底物(4％ds)中產(chǎn)生1g葡萄糖所需的酶量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，顆粒淀粉水解酶單位(granularstarchhydrolyzingenzymeunit(GSHEU))被定義為是指在試驗(yàn)條件下，例如25℃、pH5.0下，每分鐘從顆粒淀粉中產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，GSHEU被定義為是指在50℃下、在pH4.5下每分鐘從顆粒淀粉底物中產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)量(yield)”是指使用本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的終-產(chǎn)物或期望的終-產(chǎn)物的量。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)量大于使用本領(lǐng)域已知方法所產(chǎn)生的產(chǎn)量。在一些實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)是指終產(chǎn)物的體積；以及在其它實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)是指終產(chǎn)物的濃度?！癆TCC”是指位于Manassas，VA20108的AmericanTypeCultureCollection(美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心)(ATCC；<www.atcc.com>)?！癗RRL”是指美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)，NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch(并且以前被稱為USDANorthernRegionalResearchLaboratory)，Peoria，ILL.“一個(gè)(a)”、“一(an)”或“該(the)”包括復(fù)數(shù)形式指代，除非上下文中另外明確指出。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”和其同源詞(cognates)被以它們包含在內(nèi)的含義使用；也就是說(shuō)，等價(jià)于術(shù)語(yǔ)“包含(including)”及其相應(yīng)的同源詞。B.優(yōu)選的實(shí)施方式本發(fā)明涉及顆粒淀粉水解酶組合物(granularstarchhydrolyzingenzymecomposition)，其包括具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(asAA)和任選含有葡糖淀粉酶(glucoamylase)，其中所述asAA與序列SEQIDNO3具有至少85％、90％和95％的序列同一性。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了顆粒淀粉底物生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生期望終產(chǎn)物的手段；以及在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將asAA與顆粒淀粉的淤漿接觸、顆粒淀粉被直接轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物，而沒(méi)有顆粒淀粉底物的糊化和液化。顆粒淀粉底物(Granularstarchsubstrates)——在本發(fā)明的方法中將被處理的顆粒淀粉底物(granularstarchsubstrate)可以得自任何植物部分，包括莖、谷粒、根和塊莖。特別優(yōu)選的植物來(lái)源包括玉米；小麥；黑麥；高梁；水稻；黍；大麥；木薯(cassava)；豆科植物，例如菜豆(beans)和豌豆(peas)；甘蔗；馬鈴薯；甘薯；香蕉；和木薯(tapioca)。特別考慮的淀粉底物是玉米淀粉和小麥淀粉。來(lái)自谷粒的淀粉可以是磨碎的或完整的，包括玉米固體物(cornsolids)，例如玉米仁(kernels)、麩(brans)和/或玉米穗(cobs)。此外，谷?？梢员环旨?jí)(fractionated)(例如，對(duì)于玉米，胚乳、胚芽或纖維(麩)；以及對(duì)于小麥，谷蛋白(gluten)、淀粉A和B)。淀粉可以是經(jīng)過(guò)淀粉精制工藝的高度精制粗淀粉(highlyrefinedrawstarch)或原料(feedstock)。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將熟知可以利用的方法，這些方法可以被用于制備在本發(fā)明所涉及的方法中所使用的顆粒淀粉底物。這些方法中的一些包括使用錘磨機(jī)和輥式粉碎機(jī)對(duì)整谷粒進(jìn)行干法磨粉，以及包括濕磨法。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)過(guò)磨碎的谷粒之至少80％、70％、60％、50％、40％、30％將通過(guò)0.5mm的篩。在其它實(shí)施方式中，更細(xì)小的顆粒大小是優(yōu)選的；并因此，磨碎了的谷粒之至少80％、85％、90％和95％將通過(guò)0.5mm的篩。仍然在其它實(shí)施方式中，磨碎了的谷粒可以是粗糙顆粒；并且在這些情況下至少90％的磨碎谷粒將通過(guò)1.0mm、1.5mm或2.0mm的篩，但僅僅約少于5％、10％和15％的將通過(guò)0.5mm的篩。各種各樣的淀粉是商業(yè)上可得的。例如，玉米淀粉可以從Cerestar、Sigma和KatayamaChemicalIndustryCo.(Japan)獲得；小麥淀粉可以從Sigma獲得；甘薯淀粉可以從WakoPureChemicalIndustryCo.(Japan)獲得；以及馬鈴薯淀粉可以從NakaariChemicalPharmaceuticalCo.(Japan)獲得。多篇參考文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了在谷粒中發(fā)現(xiàn)的淀粉量，并且查閱了TheAlcoholTextbook，3rdEd.K.Jacquesetal.，Eds.1999，NottinghamUniversityPress。例如，玉米含有約60-68％的淀粉；大麥含有約55-65％的淀粉；黍含有約75-80％的淀粉；小麥含有約60-65％的淀粉；以及精白米(polishedrice)含有約70-72％的淀粉。在本發(fā)明所包含的方法的一些實(shí)施方式中，顆粒淀粉底物被漿化(通常使用水)并且該淤漿包括i)約10％到約55％的干固體含量(drysolidscontent(ds))；ii)約15％到約50％的干固體含量；iii)約20％到約45％的干固體含量；iv)約25％到約45％的干固體含量；v)約30％到約45％的干固體含量；vi)約30％到約40％的干固體含量；和，同樣地，vii)約30％到35％的干固體含量。具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asid-stalealphaamylase(asAA))——在一個(gè)實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA得自曲霉屬的菌株，例如米曲霉、白曲霉、黑曲霉和泡盛曲霉。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA得自白曲霉菌株。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA包括與SEQIDNO3列出的氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA包括與SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA包括與SEQIDNO3有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。asAA還可以包括與SEQIDNO3有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA包括SEQIDNO3的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，SEQIDNO3或與其具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列被認(rèn)為是完整型asAA。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQIDNO9具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的催化結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQIDNO10的SBD具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的SBD。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQIDNO9具有至少97％、98％和99％的序列同一性；與SEQIDNO8具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及與SEQIDNO10具有至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，催化結(jié)構(gòu)域和SBD得自白曲霉菌株的α淀粉酶。在其它實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA是截短型酶(truncatedenzyme)。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的截短型asAA將包括SEQIDNO3的氨基酸序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％或者包括與SEQIDNO3具有至少90％并且優(yōu)選95％的序列同一性的氨基酸序列。酶可以在多肽的羧基端被截短。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的截短型asAA將包括SEQIDNO9的催化結(jié)構(gòu)域的至少90％、95％、96％、97％、98％和99％或者包括與其具有至少97％、98％和99％的序列同一性的序列。在其它實(shí)施方式中，截短型asAA將包括SEQIDNO3的至少430個(gè)、至少440個(gè)、至少450個(gè)、至少460個(gè)和至少470個(gè)氨基酸或包括與SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性且具有GSH活性的序列。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的截短型asAA(truncatedasAAhavingGSHactivity)將含有SEQIDNO9的催化結(jié)構(gòu)域或者含有與其具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的序列，以及與SEQIDNO8具有至少90％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的接頭。優(yōu)選地，截短型酶將包括與SEQIDNO9具有至少97％的序列同一性的催化結(jié)構(gòu)域和與SEQIDNO8具有至少95％的序列同一性的接頭。在一些實(shí)施方式中，截短型酶將包括與SEQIDNO9具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的催化結(jié)構(gòu)域，并且至少約5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)和35個(gè)氨基酸位于該催化結(jié)構(gòu)域的下游。在其它實(shí)施方式中，截短型酶將包括如上所定義的催化結(jié)構(gòu)域和接頭，并且進(jìn)一步包括與SEQIDNO10的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的SBD之一部分。SBD的該部分將包括至少約5個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、70個(gè)、80個(gè)、90個(gè)和100個(gè)氨基酸，位于所述接頭下游。在其它實(shí)施方式中，包括SEQIDNO3氨基酸序列或者與SEQIDNO3有至少95％的序列同一性的氨基酸序列的asAA，是由與SEQIDNO1有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性的多核苷酸編碼。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼SEQIDNO3的asAA(AsaA)的核酸序列是SEQIDNO1的核酸序列。重組表達(dá)的酶(recombinantlyexpressedenzymes)和宿主細(xì)胞(hostcells)在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物被遺傳工程化，以表達(dá)具有GSH活性的異源asAA，并且微生物還可以被工程化，以表達(dá)異源葡糖淀粉酶。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，絲狀真菌宿主是曲霉屬某種(Aspergillussp)、木霉屬某種(Trichodermasp)、鐮刀霉屬某種(Fusariumsp)和青霉屬某種(Penicilliumsp)的菌株。特別優(yōu)選的真菌宿主細(xì)胞包括構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉(A.niger)、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉(T.reesei)、綠色木霉(T.viride)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和茄腐皮鐮孢霉(F.solani)。曲霉屬菌株在Wardetal.(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743和Goedegebuuretal.，(2002)CurrGene4189-98中被公開。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主是木霉屬的菌株，并且特別是里氏木霉(T.reesei)。里氏木霉菌株是已知的，并且非限制性例子包括ATCCNo.13631、ATCCNo.26921、ATCCNo.56764、ATCCNo.56765、ATCCNo.56767和NRRL15709。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37在Sheir-Neissetal.(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology2046-53中被公開。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，木霉屬宿主細(xì)胞或曲霉屬宿主細(xì)胞被遺傳工程化，以表達(dá)具有GSH活性的asAA，該asAA特征在于與SEQIDNO3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQIDNO9具有至少97％、98％和99％的序列同一性；與SEQIDNO8具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及與SEQIDNO10具有至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，asAA得自白曲霉菌株的α淀粉酶。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括編碼SEQIDNO3的asAA、SEQIDNO9的asAA或如本文中所定義的截短型酶的多核苷酸。另外，多核苷酸可以編碼具有GSH活性的AsAA，該AsAA包括與序列SEQIDNO3具有至少95％、98％和99％的同一性或與序列SEQIDNO9具有至少97％、98％和99％的同一性的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，編碼asAA的多核苷酸將具有核酸序列SEQIDNO1或與SEQIDNO1具有至少70％的序列同一性的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)宿主細(xì)胞工程化而包括編碼具有GSH活性的asAA的異源多核苷酸從而產(chǎn)生的asAA將具有不同的性質(zhì)，例如相比于由在天然宿主中具有GSH活性的asAA的內(nèi)源表達(dá)所產(chǎn)生的asAA具有改善的性質(zhì)。這些性質(zhì)可以包括，例如提高的酶活力、在較低pH水平下提高的酶穩(wěn)定性或提高的比活力。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明異源產(chǎn)生的具有GSH活性的asAA將表現(xiàn)出如下pH范圍內(nèi)的最高pH活性3.0至6.0的pH范圍；3.0至5.0的pH范圍；3.5至5.0的pH范圍；以及，同樣地，在3.5至4.5的pH范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方式中，異源產(chǎn)生的asAA，在3.0、3.5、4.0、4.5和/或5.0的pH水平下，相比于在基本上相同的條件下從天然宿主內(nèi)源產(chǎn)生的相應(yīng)asAA，將具有更高的穩(wěn)定性或者殘余活性。在一些實(shí)施方式中，在具體的pH水平下，相比于在相同的pH水平下，相比于在同一pH水平下的內(nèi)源表達(dá)asAA，異源產(chǎn)生的asAA的酶穩(wěn)定性水平將高出至少0.5倍、至少1.0倍、至少2.0倍或至少2.5倍。在一些實(shí)施方式中，異源表達(dá)的具有GSH活性的asAA的這些提高的或不同的性質(zhì)在木霉屬宿主細(xì)胞中特別明顯。在一些實(shí)施方式中，異源表達(dá)的asAA將作為具有GSH活性的完整型asAA而被產(chǎn)生，該完整型asAA含有催化結(jié)構(gòu)域、接頭和SBD，例如圖2所例示性說(shuō)明的成熟多肽(SEQIDNO3)。在其它實(shí)施方式中，異源表達(dá)的asAA將作為具有GSH活性的截短型asAA而被產(chǎn)生，例如，其中SBD被部分地或全部地從催化結(jié)構(gòu)域切割掉。在其它實(shí)施方式中，被遺傳工程化以表達(dá)具有GSH活性的asAA的宿主菌，還可以被遺傳工程化以便表達(dá)異源GA。在本發(fā)明中有用的宿主菌可能業(yè)已通過(guò)遺傳工程被預(yù)先操縱。在一些實(shí)施方式中，遺傳工程化宿主細(xì)胞或菌株可以是蛋白酶缺陷型菌株。在其它實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞的多種天然基因的表達(dá)將被減少或被失活。這些基因包括，例如編碼蛋白酶和纖維素分解酶的基因，如內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases(EG))和外切纖維二糖水解酶(exocellobiohydrolases(CBH))的基因(例如cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)。美國(guó)專利5,650,322公開了在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37衍生菌株。也參考USP5,472,864。載體(vectors)——盡管下面的描述具體指asAA，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解相同或相似的方法適用于DNA構(gòu)建物和載體，用于將編碼GA的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明，包括編碼本發(fā)明涉及的asAA之核酸的DNA構(gòu)建物被構(gòu)建，以便將asAA轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，DNA構(gòu)建物通過(guò)表達(dá)載體被轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體包括可操縱性連接到asAA編碼序列上的調(diào)節(jié)序列。載體可以是任何載體；當(dāng)被導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞時(shí)，該載體被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并被復(fù)制。對(duì)于載體列表，參考FungalGeneticsStockCenterCatalogueofStrains(FGSC，<www.fgsc.net>)。合適的表達(dá)載體和/或整合載體的另外的例子被提供在上文中Sambrooketal.，(1989)、上文中Ausubel(1987)、vandenHondeletal.(1991)inBennettandLasure(Eds.)MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPresspp.396-428以及美國(guó)專利5,874,276。特別有用的載體包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明涉及的asAA的核酸被可操縱性連接到合適的啟動(dòng)子，其在真菌宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性。該啟動(dòng)子可以源自相對(duì)于宿主細(xì)胞是同源的或異源的蛋白質(zhì)編碼基因。優(yōu)選地，該啟動(dòng)子在木霉屬宿主中是有用的。啟動(dòng)子的合適的、非限制性例子包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1和amy。在一個(gè)實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是對(duì)于宿主細(xì)胞而言是天然的啟動(dòng)子。例如，當(dāng)里氏木霉是宿主，啟動(dòng)子是天然的里氏木霉啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是里氏木霉cbh1，其是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子并且以登記號(hào)D86235(AccessionNo.D86235)被存于Genbank中?！罢T導(dǎo)型啟動(dòng)子(induciblepromoter)”為在環(huán)境調(diào)控或發(fā)育調(diào)控下具有活性的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，啟動(dòng)子為對(duì)于真菌宿主細(xì)胞而言是異源的啟動(dòng)子。有用的啟動(dòng)子的其它例子包括來(lái)自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)(Nunbergetal.，(1984)Mol.CellBiol.42306-2315和Boeletal.，(1984)EMBOJ.31581-1585)、黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1和里氏木霉纖維素二糖水解酶1(EPA137280A1)的基因的啟動(dòng)子。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，asAA編碼序列被可操縱性地連接到信號(hào)序列上。編碼序號(hào)序列的DNA優(yōu)選地是與將被表達(dá)的asAA基因天然關(guān)聯(lián)的序列。優(yōu)選地，信號(hào)序列由編碼Ak-asaA的白曲霉asaA基因編碼。更優(yōu)選地，信號(hào)序列與SEQIDNO2的信號(hào)序列具有至少90％、至少95％、至少97％和至少99％的序列同一性。在另外的實(shí)施方式中，包括在將被導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞中的DNA構(gòu)建物或載體之中的信號(hào)序列和啟動(dòng)子序列來(lái)自相同的來(lái)源。例如，在一些實(shí)施方式中，信號(hào)序列是可操縱性連接到cdh1啟動(dòng)子上的cdh1信號(hào)序列。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體還包括終止序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，終止序列和啟動(dòng)子序列來(lái)自相同的來(lái)源。在另一個(gè)實(shí)施方式中，終止序列與宿主細(xì)胞同源。一個(gè)特別合適的終止子序列是來(lái)自木霉屬菌株特別是里氏木霉的cbh1。其它有用的真菌終止子包括來(lái)自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子(Nubergetal.，(1984)，見(jiàn)上文；和Boeletal.，(1984)，見(jiàn)上文)。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體包括選擇標(biāo)記。優(yōu)選的選擇標(biāo)記的例子包括賦予抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的標(biāo)記。營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記也發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中有用，包括本領(lǐng)域已知為amdS、argB和pyr4的那些標(biāo)記。在用于木霉轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)中有用的標(biāo)記在本領(lǐng)域中是已知的。(參見(jiàn)，例如Finkelstein，BIOTECHNOLOGYOFFILAMENTOUSFUNGI中第6章，F(xiàn)inkelsteinetal.Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章；以及Kinghometal.(1992)APPLIEDMOLECULARGENETICSOFFILAMENTOUSFUNGI，BlackieAcademicandProfessional，ChapmanandHall，London)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇標(biāo)記是amdS基因，其編碼酶-乙酰胺酶，允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞依靠乙酰胺作為氮源而生長(zhǎng)。構(gòu)巢曲霉amdS基因作為選擇標(biāo)記的使用在Kelleyetal.，(1985)EMBOJ.4475-479和Penttilaetal.，(1987)Gene61155-164被描述。包括具有編碼asAA的多核苷酸的DNA構(gòu)建物的表達(dá)載體，可以是能夠在給定的真菌宿主微生物中自主復(fù)制或能夠整合進(jìn)宿主的DNA中的任何載體。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體是質(zhì)粒。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，考慮了兩種類型的表達(dá)載體，用以獲得基因表達(dá)。第一表達(dá)載體包括DNA序列，其中啟動(dòng)子、asAA編碼區(qū)以及終止子都起源自將被表達(dá)的基因。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)缺失不期望的DNA序列(例如編碼不需要的結(jié)構(gòu)域的DNA)獲得基因截短，以留下在其自身轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列的控制下而被表達(dá)的結(jié)構(gòu)域。第二類型表達(dá)載體被預(yù)裝配，并包含高水平轉(zhuǎn)錄所需的序列，以及選擇標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，asAA基因或其部分的編碼區(qū)被插入這一通用表達(dá)載體，使得其處于表達(dá)構(gòu)建物啟動(dòng)子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄控制下。在一些實(shí)施方式中，基因或其部分被插入強(qiáng)cbh1啟動(dòng)子的下游。用于連接包括編碼asAA的多核苷酸、啟動(dòng)子、終止子和其它序列的DNA構(gòu)建物的方法以及用于將它們插入到合適載體中的方法，在本領(lǐng)域中是已知的。連接(linking)通常通過(guò)在適宜的限制位點(diǎn)進(jìn)行連接反應(yīng)(ligation)而進(jìn)行。如果這類位點(diǎn)不存在，根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，使用合成的寡核苷酸接頭。(參見(jiàn)，Sambrook(1989)，見(jiàn)上文；以及BennettandLasure，MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPress，SanDiego(1991)pp70-76。)。另外，使用已知的重組技術(shù)，可以構(gòu)建載體(例如InvitrogenLifeTechnologies，GatewayTechnology)。在期望獲得具有一個(gè)或多個(gè)失活基因的真菌宿主細(xì)胞的情況下，可以使用已知的方法(例如，美國(guó)專利5,246,853、美國(guó)專利5,475,101和WO92/06209中公開的方法。)?；蚴Щ羁梢酝ㄟ^(guò)完全或部分缺失、通過(guò)插入失活或通過(guò)任何其它手段，使得基因?qū)τ谒念A(yù)期目的無(wú)功能化的方法(這樣使得基因被阻止，而不能表達(dá)功能蛋白)而進(jìn)行。已被克隆的任何來(lái)自木霉屬某種(Trichodermasp)或其它絲狀真菌宿主的基因可以被缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)用本領(lǐng)域已知的方法，使欲被失活的期望基因的一種形式被插入到質(zhì)粒中，實(shí)現(xiàn)基因缺失。然后，位于期望基因編碼區(qū)的內(nèi)部的適宜限制性酶切位點(diǎn)(一個(gè)或多個(gè))處切割缺失質(zhì)粒，并且用選擇標(biāo)記取代基因編碼序列或其部分。待被缺失基因的座位的側(cè)翼DNA序列(優(yōu)選約0.5至2.0kb之間)，保持在標(biāo)記基因的每一邊。適宜的缺失質(zhì)粒通常具有存在于其中的單一限制性酶切位點(diǎn)，以使得含有缺失基因的片段，包括側(cè)翼DNA序列和選擇標(biāo)記基因能夠被作為單一線性片段而被移出。宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和培養(yǎng)——DNA構(gòu)建物或載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞包括技術(shù)，例如轉(zhuǎn)化；電穿孔；核顯微注射；轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)染(例如，脂轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的和DEAE-Dextrin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)；與磷酸鈣DNA沉淀物溫育；DNA包被微粒的高速轟擊；以及原生質(zhì)體融合。普通轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的(參見(jiàn)，例如上文Ausubeletal.，(1987)，第9章；以及上文Sambrook(1989)，和Campbelletal.，(1989)Curr.Genet.1653-56)。木霉屬中異源蛋白的表達(dá)被描述在USP6,022,725；美國(guó)專利6,268,328；Harkkietal.(1991)；EnzymeMicrob.Technol.13227-233；Harkkietal.，(1989)BioTechnol.7596-603；EP244,234；EP215,594；以及Nevalainenetal.，″TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandHeterologousGenes″，inMOLECULARINDUSTRIALMYCOLOGY，Eds.LeongandBerka，MarcelDekkerInc.，NY(1992)pp.129-148。對(duì)于曲霉屬菌株的轉(zhuǎn)化，還參考Caoetal.，(2000)Sci.9991-1001、EP238023以及Yeltonetal.(1984)Proceedings.Natl.Acad.Sci.USA811470-1474。優(yōu)選地，用載體系統(tǒng)構(gòu)建遺傳上穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，從而編碼asAA的核酸被穩(wěn)定整合進(jìn)宿主菌株染色體中。然后，通過(guò)已知技術(shù)純化轉(zhuǎn)化體。在一個(gè)非限制性例子中，在含有乙酰胺的固體培養(yǎng)基上，通過(guò)它們的更快生長(zhǎng)速率和形成具有平滑而非粗糙的輪廓的圓形菌落，從不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體區(qū)分出含有amds標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。另外，在一些情況下，通過(guò)使轉(zhuǎn)化體在固體非選擇性培養(yǎng)基(即，缺乏乙酰胺的培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)、從該培養(yǎng)基收集孢子，并測(cè)定這些孢子隨后在含乙酰胺的選擇培養(yǎng)基上萌發(fā)和生長(zhǎng)的百分比，進(jìn)行進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗(yàn)。替代地，本領(lǐng)域中已知的其它方法可以被用來(lái)選擇轉(zhuǎn)化體。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，用于轉(zhuǎn)化的木霉屬某種(Trichodermasp.)的制備過(guò)程包括從真菌菌絲體制備原生質(zhì)體。(參見(jiàn)Campbelletal.，(1989)Curr.Genet.1653-56)。在一些實(shí)施方式中，菌絲體得自萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)孢子。菌絲體用酶處理，該酶消化細(xì)胞壁得到原生質(zhì)體。然后，原生質(zhì)體，在懸浮培養(yǎng)基中，在滲透穩(wěn)定劑存在下得到保護(hù)。這些穩(wěn)定劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂和類似物。通常，這些穩(wěn)定劑的濃度在0.8M和1.2M之間變化。優(yōu)選的是，在懸浮培養(yǎng)基中使用1.2M山梨醇溶液。DNA被吸收進(jìn)宿主木霉菌菌株取決于鈣離子濃度。通常，約10mMCaCl2和50mMCaCl2之間被用在吸收溶液中。在吸收溶液中除了需要鈣離子，通常包括的其它化合物是緩沖體系，例如TE緩沖液(10mMTris，pH7.4；1mMEDTA)或10mMMOPS，pH6.0緩沖液(嗎啡啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。據(jù)認(rèn)為，聚乙二醇起著融合細(xì)胞膜的作用，從而允許培養(yǎng)基的內(nèi)容物被輸送至木霉菌菌株的細(xì)胞質(zhì)中以及質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到核。該融合經(jīng)常允許多拷貝質(zhì)粒DNA整合進(jìn)宿主染色體。通常，含有木霉菌原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液被用于轉(zhuǎn)化，所述原生質(zhì)體或細(xì)胞已經(jīng)在105至107/mL的密度下經(jīng)過(guò)透性處理，優(yōu)選2×106/mL。將100μL體積的、在適宜溶液(例如1.2M山梨醇；50mMCaCl2)中的這些原生質(zhì)體或細(xì)胞與期望的DNA混合。通常，高濃度的PEG被加入到吸收溶液。從0.1至1體積的25％PEG4000可以被加入到原生質(zhì)體懸浮液。然而，優(yōu)選的是將約0.25體積加入到原生質(zhì)體懸浮液中。添加劑例如二甲亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀和類似物也可以被加入到吸收溶液并幫助轉(zhuǎn)化。對(duì)于其它真菌宿主細(xì)胞，相似的步驟也是可以利用的。(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利6,022,725和6,268,328，兩者都被引入作為參考)。通常，該混合物隨后在大約0℃下溫育10至30分鐘之間的一段時(shí)間。然后，另外的PEG被加入到混合物，以進(jìn)一步提高期望基因或DNA序列的吸收。25％PEG4000通常以轉(zhuǎn)化混合物之體積的5至15倍的體積被加入；然而，更多或更少的體積都可以是適合的。25％PEG4000優(yōu)選以轉(zhuǎn)化混合物之體積的10倍體積被加入。在加入PEG之后，然后，轉(zhuǎn)化混合物—在加入山梨醇和CaCl2溶液之前一或者在室溫下或者在冰上溫育。然后，原生質(zhì)體懸浮液被進(jìn)一步加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基的熔融等分試樣中。該生長(zhǎng)培養(yǎng)基僅允許轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)。通常，細(xì)胞在含有生理鹽和養(yǎng)分的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(參見(jiàn)，例如Pourquie，J.etal.，BIOCHEMISTRYANDGENETICSOFCELLULOSEDEGRADATION，eds.Aubert，J.P.etal.，AcademicPress，pp.71-86，1988和Ilmen，M.etal.，(1997)Appl.Environ.Microbiol.631298-1306)。也發(fā)現(xiàn)普通商業(yè)制備的培養(yǎng)基(例如酵母麥芽提取物(YeastMaltExtract(YM))培養(yǎng)液、LuriaBertani(LB)培養(yǎng)液和沙氏葡萄糖(SabouraudDextrose)(SD)培養(yǎng)液)在本發(fā)明中有用。培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的，(例如，在振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐中，在適宜的培養(yǎng)基中，于大約28℃，溫育培養(yǎng)物直至達(dá)到asAA表達(dá)的期望水平)。對(duì)于一種給定的絲狀真菌，優(yōu)選的培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域中是已知的；并可以在科學(xué)文獻(xiàn)中和/或從真菌提供者，例如AmericanTypeCultureCollection(美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心)和FungalGeneticsStockCenter(美國(guó)堪薩斯州醫(yī)學(xué)中心真菌遺傳學(xué)庫(kù)中心)找到。在建立起真菌生長(zhǎng)后，細(xì)胞被暴露于有效導(dǎo)致或允許本文所定義的asAA表達(dá)的條件中。在具有GSH活性的asAA編碼序列受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的情況下，誘導(dǎo)劑(例如糖、金屬鹽或抗菌劑)被以誘導(dǎo)asAA表達(dá)的有效濃度加入到培養(yǎng)基。asAA活性的鑒定——為了評(píng)價(jià)用編碼本發(fā)明所涉及的asaA之異源多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系表達(dá)具有GSH活性的asAA，可以在蛋白質(zhì)水平、RNA水平或通過(guò)使用特別針對(duì)α淀粉酶活性和/或產(chǎn)生的功能生物學(xué)鑒定法而進(jìn)行試驗(yàn)。通常，所使用的試驗(yàn)包括RNA印跡法、斑點(diǎn)印跡法(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))或原位雜交、使用適當(dāng)標(biāo)記的探針(基于核酸編碼序列)以及常規(guī)DNA印跡法和放射自顯影。另外，具有GSH活性的asAA的產(chǎn)生和/或表達(dá)可以在樣品中直接測(cè)量，例如，通過(guò)直接測(cè)量培養(yǎng)基中的還原糖例如葡萄糖的試驗(yàn)和通過(guò)測(cè)量葡糖淀粉酶活性、表達(dá)和/或產(chǎn)量的試驗(yàn)進(jìn)行。對(duì)測(cè)量GSH活性有用的底物包括顆粒淀粉底物。例如，葡萄糖濃度可以通過(guò)任何方便的方法被測(cè)量，例如通過(guò)使用葡萄糖試劑盒No15-UV(SigmaChemicalCo.)或儀器例如TechniconAutoanalyzer。還參考從InstrumentationLab.(Lexington，MA)商購(gòu)可得的葡萄糖氧化酶試劑盒和葡萄糖己糖試劑盒。另外，基因表達(dá)可以通過(guò)免疫學(xué)方法評(píng)價(jià)，例如細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色；組織切片；或組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的免疫測(cè)定，例如通過(guò)蛋白質(zhì)印跡或ELISA。此類免疫測(cè)定可以被用于定性或定量評(píng)價(jià)asAA的表達(dá)。此類方法的細(xì)節(jié)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，并且用于實(shí)踐這類方法的許多試劑是商業(yè)可得的。α淀粉酶活性可以通過(guò)使用DNS法被測(cè)定，如在Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31426-428中所描述。葡糖淀粉酶活性可以通過(guò)3，5-二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylicacid(DNS))法(參見(jiàn)，Gotoetal.，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.5849-54)被測(cè)定。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，由木霉屬或曲霉屬宿主表達(dá)的具有GSH活性的asAA為每升1克蛋白質(zhì)以上(g/L)、2g/L以上、5g/L以上、10g/L以上、20g/L以上、25g/L以上、30g/L以上、50g/L以上，以及也可以是培養(yǎng)基的100g/L以上。純化asAA的方法——通常，細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的asaA(包括n-asAA或r-asAA)被分泌到培養(yǎng)基中，并且可以被純化或分離，例如通過(guò)從細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中除去不需要的組分而被純化或分離。在一些情況下，AsaA可以以細(xì)胞形式被產(chǎn)生，這使得從細(xì)胞裂解液回收成為必要。在這樣的情況下，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)采用的技術(shù)，從酶被產(chǎn)生的細(xì)胞中純化酶。例子包括，但不限于，親和層析(Tilbeurghetal.，(1984)FEBSLett.16215)；離子交換色譜法(Goyaletal，(1991)Biores.Technol.3637；Fliessetal.，(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17314；Bhikhabhaietal.，(1984)J.Appl.Biochem.6336；和Ellouzetal.，(1987)Chromatography396307)，包括使用具有高分辯本領(lǐng)的物質(zhì)的離子交換(Medveetal，(1998)J.ChromatographyA808153)；疏水相互作用色譜法(TomazandQueiroz，(1999)J.ChromatographyA865123)；兩相分配(Brumbauer，etal.，(1999)Bioseparation7287)；乙醇沉淀；反相HPLC；硅膠上或陽(yáng)離子交換樹脂例如DEAE上的色譜；層析聚焦；SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)；硫酸銨沉淀和凝膠過(guò)濾，使用例如SephadexG-75的凝膠過(guò)濾。發(fā)酵—在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，表達(dá)異源asAA的真菌細(xì)胞在分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵條件下生長(zhǎng)。經(jīng)典的分批發(fā)酵是封閉的系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成成分在發(fā)酵開始時(shí)被設(shè)定，并且在發(fā)酵過(guò)程中不經(jīng)受人為改變。因此，在發(fā)酵開始時(shí)，用期望的生物體(一種或多種)接種培養(yǎng)基。在此方法中，在不向系統(tǒng)加入任何成分的情況下，允許發(fā)酵發(fā)生。典型地，對(duì)于碳源的加入而言，分批發(fā)酵可稱為“批式”資格，并且經(jīng)常力圖去控制諸如pH和氧濃度的因素。分批式系統(tǒng)的代謝物和生物量組成持續(xù)變化，直至發(fā)酵停止的時(shí)刻。在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞由靜止滯后期進(jìn)入快速生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期以及最終到生長(zhǎng)速度被降低或停止的穩(wěn)定期。如果不被處理，處于穩(wěn)定期的細(xì)胞最終死亡。通常，處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞負(fù)責(zé)終產(chǎn)物的大批生產(chǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)分批式體系上的變化是“補(bǔ)料分批發(fā)酵(分批補(bǔ)料發(fā)酵(fed-batchfermentation))”系統(tǒng)，也發(fā)現(xiàn)其在本發(fā)明中有用。在典型分批發(fā)酵的該變化中，隨著發(fā)酵進(jìn)行，底物以增量被加入。當(dāng)分解代謝物阻遏易于抑制細(xì)胞代謝和期望在培養(yǎng)基中含有受限量的底物時(shí)，補(bǔ)料分批系統(tǒng)是有用的。在分批加料系統(tǒng)中，對(duì)實(shí)際底物濃度的測(cè)量是困難的；從而，在可測(cè)量的因子例如pH、溶解氧和廢氣例如CO2分壓變化的基礎(chǔ)上進(jìn)行估計(jì)。分批發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵，在本領(lǐng)域中是常見(jiàn)和熟知的。連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中確定的發(fā)酵培養(yǎng)基被連續(xù)加入到生物反應(yīng)器中并且等量的條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)被同時(shí)移出，用于處理。連續(xù)發(fā)酵通常使培養(yǎng)物保持在恒定的高密度，其中細(xì)胞主要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和/或終產(chǎn)物濃度的一個(gè)因素或任意數(shù)量的因素。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，限制性養(yǎng)分例如碳源或氮源被維持在固定的比率，并且所有其它參數(shù)被允許調(diào)節(jié)。在其它系統(tǒng)中，當(dāng)由培養(yǎng)基濁度測(cè)量的細(xì)胞濃度被保持恒定時(shí)，影響生長(zhǎng)的許多因素可以被連續(xù)改變。連續(xù)系統(tǒng)盡力保持穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)條件。因此，由于培養(yǎng)基被撤出導(dǎo)致的細(xì)胞損失必須與發(fā)酵中的細(xì)胞生長(zhǎng)速率平衡。調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵過(guò)程的養(yǎng)分和生長(zhǎng)因素的方法，以及使產(chǎn)物形成的速率最大化的技術(shù)，在工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域中是熟知的。組合和方法—在一個(gè)實(shí)施方式中，使顆粒淀粉底物與具有GSH活性的asAA接觸，其中asAA作為無(wú)細(xì)胞濾液而提供(例如其中asAA分離自培養(yǎng)基)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使顆粒淀粉底物與具有GSH活性的asAA接觸，其中asAA在含有表達(dá)和分泌具有GSH活性的asAA的真菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中提供。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括含有木霉屬細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的發(fā)酵物或培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明特別有用的酶組合物是顆粒淀粉水解酶組合物，其包括與SEQIDNO3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的asAA。在一些實(shí)施方式中，asAA得自asAA的異源表達(dá)，并且特別是在木霉屬或曲霉屬宿主中的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶之異源表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)特別有用的酶組合物是包括與SEQIDNO9的序列具有至少97％、98％和99％的序列同一性的截短型asAA的顆粒淀粉水解酶組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物將包含具有GSH活性的asAA酶的組合，其包括a)與SEQIDNO3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的具有GSH活性的完整型asAA；和b)具有GSH活性的截短型asAA。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的截短型asAA將是與SEQIDNO9序列具有至少96％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。在一些實(shí)施方式中，相比于在酶組合物中具有GSH活性的asAA的總量(完整型加上截短型)，具有GSH活性的完整型asAA的量將至少為約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和98％。在其它實(shí)施方式中，在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物中，具有GSH活性的完整型asAA與具有GSH活性的截短型asAA的比率，將是約10％至90％、20％至80％、30％至70％、35％至65％、40％至60％、45％至55％、50％至50％、55％至45％、60％至40％、65％至35％、70％至30％、80％至20％和90％至10％(完整型比截短型)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，該比率將在約40％至60％和約60％至40％之間。在一些實(shí)施方式中，完整型asAA的量比總asAA將為至少大約70％、80％、85％和90％。在其它實(shí)施方式中，完整型asAA與截短型asAA的比率將為約35％至65％，并也為約40％至60％(完整型比截短型)。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解，用在本發(fā)明的組合物和方法中的具有GSH活性的asAA的量將取決于asAA的酶活性。在一些實(shí)施方式中，存在于酶組合物中的asAA的范圍是每克ds為從0.01至40SSU；0.01至30SSU；0.01至20SSU；0.01至15.0SSU和0.01至10SSU。根據(jù)本發(fā)明特別有用的酶組合物是如上公開的顆粒淀粉水解酶組合物，其另外包含葡糖淀粉酶。在本發(fā)明的組合物和方法中有用的葡糖淀粉酶(glucoamylases(GA))(E.C.3.2.1.3)可以是野生型或者是遺傳修飾的，包括變種和雜種。一般來(lái)說(shuō)，葡糖淀粉酶可以源自細(xì)菌、植物和真菌來(lái)源。在本發(fā)明的組合物和方法中有用的優(yōu)選葡糖淀粉酶是由幾種絲狀真菌菌株和酵母菌株產(chǎn)生的。具體而言，從曲霉屬和木霉屬菌株分泌的葡糖淀粉酶在商業(yè)上是重要的。這些葡糖淀粉酶的來(lái)源包括黑曲霉G1和G2葡糖淀粉酶及其變體(Boeletal.，(1984)EMBOJ.31097-1102；WO92/00381；WO00/04136和USP6,352,851)；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶及其變體(Hataetal.，(1991)Agric.Biol.Chem.55941-949)以及Aspergillusshirousami(參見(jiàn)Chenetal.，(1996)Prot.Eng.9499-505；Chenetal.(1995)Prot.Eng.8575-582；和Chenetal.，(1994)BiochemJ.302275-281)。葡糖淀粉酶還得自踝節(jié)菌屬(Talaromyces)菌株例如源自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和嗜熱踝節(jié)菌(1.thermophilus)的那些菌株(WO99/28488；USPNo.RE32,153；和USPNo.4,587,215)；根霉屬菌株例如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；毛霉屬(Mucor)菌株；木霉屬菌株，例如里氏木霉和綠色木霉以及腐質(zhì)霉屬菌株，例如灰腐質(zhì)霉(參見(jiàn)Boeletal.，(1984)EMBOJ.31097-1102；WO92/00381；WO00/04136；Chenetal.，(1996)Prot.Eng.9499-505；Tayloretal.，(1978)CarbohydrateRes.61301-308；US專利4,514,496；US專利4,092,434；以及Jensenetal.，(1988)Can.J.Microbiol.34218-223)。在本發(fā)明中有用的其它葡糖淀粉酶包括得自羅氏阿太菌(Atheliarolfsii)的那些葡糖淀粉酶及其變體(WO04/111218)。商業(yè)上使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶，例如是從黑曲霉產(chǎn)生的酶(來(lái)自GenencorInternationalInc.，商品名為DISTILLASE、OPTIDEXL-400和GZYMEG9904X)或根霉屬的種產(chǎn)生的酶(來(lái)自ShinNihonChemicals，Japan，商品名為CU.CONC)。也可以是商業(yè)消化酶，商品名為GLUCZYME，來(lái)自AmanoPharmaceuticals，Japan(Takahashietal.，(1985)J.Biochem.98663-671)。另外的酶包括根霉菌(Rhizopussp.)的3種形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Glucl”(MW74,000)、“Glue2”(MW58,600)和“Gluc3”(MW61,400)”。發(fā)現(xiàn)Glucl在本發(fā)明中特別有用。一些GA酶也是顆粒淀粉水解酶(granularstarchhydrolyzingenzyme(s)(一種或多種))GSHE(參見(jiàn)，例如Tosietal.，(1993)Can.J.Microbiol.39846-855)。這些GA-GSHEs不僅具有葡糖淀粉酶活性，而且能夠水解顆粒(粗)淀粉。GA-GSHEs已經(jīng)從真菌細(xì)胞中回收，并且尤其是從絲狀真菌細(xì)胞例如腐質(zhì)霉菌(Humicolasp.)、曲霉菌(Aspergillussp.)、木霉菌(Trichodermasp.)以及根酶菌(Rhizopussp.)中回收。米根霉GA-GSHE已經(jīng)被描述在Ashikarietal.，(1986)Agric.Biol.Chem.50957-964和USP4,863,864中。也可參考雪白根霉?；腋|(zhì)酶GA-GSHE被描述于Allisonetal.，(1992)Curr.Genet.21225-229，Tosietal.，(1993)Can.J.Microbiol.39846-852，Camposetal.，(1995)App.AndEnviron.Microbiol.612436-2438和歐洲專利171218。編碼這個(gè)酶的基因在本領(lǐng)域中已知為“gla1”。泡盛曲霉河內(nèi)變種(Aspergillusawamorivar.kawachi)GA-GSHE被描述在Hayashidaetal，(1989)Agric.Biol.Chem53923-929。AspergillusshirousamiGA-GSHE由Shibuyaetal.，(1990)Agric.Biol.Chem.541905-1914描述。用于本發(fā)明的一種具體的酶制劑包括從BioconIndia，Ltd，India可獲得的以名稱“M1”出售的酶制劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶是源自木霉屬的GA-GSHE，特征在于具有蛋白質(zhì)序列SEQIDNO11或與SEQIDNO11具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶是源自曲霉屬的GA-GSHE，特征在于具有蛋白質(zhì)序列SEQIDNO13或與SEQIDNO13具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，GA-GSHE酶可以源自灰腐質(zhì)霉的菌株，特別是灰腐質(zhì)霉高溫變種的菌株(參見(jiàn)，美國(guó)專利4,618,579)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，灰腐質(zhì)霉GA-GSHE酶從包括ATCC16453、NRRL(USDANorthernRegionalResearchLaboratory，Peoria，ILL)15219、NRRL15220、NRRL15221、NRRL15222、NRRL15223、NRRL15224和NRRL15225的真菌以及其基因改造菌株中回收。這些種產(chǎn)生免疫學(xué)上相同的葡糖淀粉酶酶制劑(參見(jiàn)EP0171218)。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，灰腐質(zhì)霉GA-GSHE(HumicolagriseaGA-GSHE)可以具有蛋白質(zhì)序列SEQIDNO12或與SEQIDNO12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性的序列。當(dāng)使用具有GSH活性的asAA時(shí)，葡糖淀粉酶可以單獨(dú)供應(yīng)；或者，根據(jù)本發(fā)明，葡糖淀粉酶可以與具有GSH活性的asAA一起被配制。在酶組合物中有用的葡糖淀粉酶的量是在0.001至10.0GAU/gds、0.01至10.0GAU/gds以及也在0.1至10.0GAU/gds的范圍內(nèi)。GA-GSHE制劑的活性可以根據(jù)葡糖淀粉酶的活性被定義。在一些實(shí)施方案中，酶組合物將包括asAA和葡糖淀粉酶，所述asAA與SEQIDNO3具有至少85％、90％、95％、98％和99％的序列同一性，其中該asAA得自于asAA的異源表達(dá)，并且尤其是在木霉屬和青霉屬的宿主中異源表達(dá)白曲霉asAA。該葡糖淀粉酶可以是野生型酶或它可以是變種GA或雜種。在其它實(shí)施方式中，酶組合物將包括葡糖淀粉酶、完整型asAA和如上所定義的截短型asAA的組合。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，GA得自曲霉屬菌株，例如DISTILLASE_。在其它實(shí)施方式中，GA得自根霉屬、木霉屬或腐質(zhì)霉屬的菌株。更具體地，在一些實(shí)施方式中，asAA酶組合物將與葡糖淀粉酶組合起來(lái)，該葡糖淀粉酶包括與序列SEQIDNO11、SEQIDNO12或SEQIDNO13具有至少90％、95％和98％的序列同一性的氨基酸序列。盡管不意欲于限制本發(fā)明，其它特別優(yōu)選的酶組合物包括下面的組合a)得自黑曲霉的葡糖淀粉酶和與SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性的具有GSH活性的asAA；b)得自黑曲霉的葡糖淀粉酶和與SEQIDNO9具有至少96％的序列同一性的具有GSH活性的asAA；c)得自黑曲霉的葡糖淀粉酶、與SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性的具有GSH活性的asAA、和與SEQIDNO9具有至少96％的序列同一性的asAA；d)本發(fā)明涉及的asAA酶組合物和含有與SEQIDNO11有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶；e)本發(fā)明涉及的asAA酶組合物和含有與SEQIDNO12有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶；和f)本發(fā)明涉及的aaAA酶組合物和含有與SEQIDNO13有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶。一些特別有用的酶組合物，包括由與SEQIDNO3有至少95％的序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA組成的混合物。另一個(gè)特別有用的酶組合物包括由與SEQIDNO3有至少98％的序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA組成的混合物。仍然是另一個(gè)特別有用的酶組合物，包括與SEQIDNO9有至少98％的序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。在一些實(shí)施方式中，存在于此混合物中的asAA，以活性測(cè)量，其范圍為從0.01至15.0SSU。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA(asAAhavingGSHactivity(SSU))與GA活性(GAactivity(GAU))的比率范圍為40∶1至1∶40、也在30∶1至1∶30的范圍內(nèi)、還在20∶1至1∶20的范圍內(nèi)和15∶1至1∶15的范圍內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該比率(SSU比GAU)將在約20∶1至1∶10的范圍內(nèi)；約10∶1至1∶10；約10∶1至1∶5；約5∶1至1∶5；約4∶1至1∶4；約3∶1至1∶3；約2∶1至1∶4以及還在約2∶1至1∶2的范圍內(nèi)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，SSU與GAU的比率將在約4∶1至2∶1之間。在其它實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA和GA以這樣的比率存在當(dāng)在相同的條件下、以相同的水平被供給時(shí)，該比率使得對(duì)在底物中顆粒淀粉的水解大于這些酶的加性效應(yīng)。在一些情況下，水解將增大至少1.0倍、增大至少1.5倍、增大至少2.0倍、以及還增大至少3.0倍。本發(fā)明的組合物所包含的成分的精確量將取決于酶的組合。通常，具有GSH活性的asAA以每克淤漿干固體約0.01至15.0SSU的量與顆粒淀粉底物淤漿混合。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA以每克淤漿干固體約0.01至10.0SSU、約0.01至5.0SSU、約0.05至10.0SSU、約0.05至5.0SSU、約0.1至10.0SSU、約0.1至5.0SSU、約0.1至2.0SSU、約0.25至2.5SSU、約0.5至5.0SSU、約0.5至2.5SSU以及也以約0.5至1.5SSU的量被加入。如本領(lǐng)域人員所理解，用在本發(fā)明的方法和組合物中的葡糖淀粉酶的數(shù)量取決于該葡糖淀粉酶的酶活性。通常，每克(ds)被調(diào)節(jié)到20-45％干固體的淤漿中可以加入0.001和10.0GAU之間的量的葡糖淀粉酶。在一些實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶以每克(ds)淤漿中0.01和10GAU之間、0.01和5.0GAU之間、0.05和5.0GAU之間、0.1和10.0GAU之間、0.1和5.0GAU之間、0.1和2.0GAU之間、0.25和1.5GAU之間的葡糖淀粉酶的量被加入。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶的劑量范圍為從0.1至2.0GAU/g(ds)淤漿。附加的酶可以被包括在本發(fā)明所涉及的組合物和方法中。這些在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)有用的附加的酶包括脫支酶，例如支鏈淀粉酶(E.C.3.2.1.41)和異淀粉酶(E.C.3.2.1.68)。這類酶水解α-1，6-糖苷鍵。因此，在淀粉的水解期間，脫支酶從淀粉的非還原端連續(xù)除去葡萄糖單元?？梢杂迷诒景l(fā)明的組合物中的另一個(gè)酶是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)。這些是外部作用產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(exo-actingmaltogenicamylases)，其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉和相關(guān)的葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷鍵的水解。這些酶中的一些，特征在于具有從4.5至7.0的最適pH范圍和從40℃至65℃的最適溫度范圍。商業(yè)β淀粉酶是可得的，例如來(lái)自GenencorInternationalInc.的SPEMZYMEBBA和OPTIMALT。附加的酶可以包括α淀粉酶，其特征可以在于或不在于具有GSH活性。α淀粉酶的例子既包括細(xì)菌和真菌α淀粉酶又包括其變體。具體但非限制性的例子包括來(lái)自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的α淀粉酶和其變種或雜種(USP5,093,257；USP6,093,562；USP5,736,499；USP5,958,739；USP6,436,888；USP6,867,031；WO96/39528；WO96/23874和WO05/001064)。商業(yè)可得的α淀粉酶是SPEZYMEFRED和SPEZYMEETHYL(GenencorInternationalInc.)。環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlucanotransferases(CGTases))(E.C.2.4.1.19)及其變體也發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中有用(USP5,278,059；USP5,545,587和WO05/003337)?？梢员皇褂玫倪M(jìn)一步的附加酶是蛋白酶，例如真菌和細(xì)菌的蛋白酶。真菌蛋白酶包括例如得自曲霉屬、木霉屬、毛酶屬和根霉屬的那些蛋白酶，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米赫毛霉(M.miehei)。其它酶包括但不限于纖維素酶，例如內(nèi)切葡聚糖酶；半纖維素酶，例如甘露聚糖酶；脂肪酶(例如E.C.3.1.1.3)、葡糖氧化酶；果膠酶；木聚糖酶、角質(zhì)酶(cutinases)(例如E.C.3.1.1.74)；轉(zhuǎn)葡糖苷酶和α-1，6-葡糖苷酶(例如E.C.3.2.1.20)。被包括在本發(fā)明的方法中的這些酶的有效量可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在一些實(shí)施方式中，抗微生物劑可以被加入到本發(fā)明的組合物和發(fā)酵培養(yǎng)基中?？刮⑸飫┦菤⑺阑蛞种莆⑸锷L(zhǎng)的化合物。包括根據(jù)本發(fā)明的asAA的酶組合物，可以包括用于淀粉轉(zhuǎn)化特別是顆粒淀粉轉(zhuǎn)化的組合物；清洗組合物(cleaningcompositions)；用于紙和紙漿生產(chǎn)的組合物；釀造組合物；烘烤組合物(bakingcompositions)；紡織應(yīng)用的組合物；用于增甜劑的組合物以及類似物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，單獨(dú)包括asAA或asAA與葡糖淀粉酶之組合的酶組合物將被用于產(chǎn)生醇，例如乙醇。在一些實(shí)施方式中，乙醇將在同步的糖化發(fā)酵期間被產(chǎn)生。方法在一個(gè)實(shí)施方式中，單獨(dú)包括具有GSH活性的asAA的酶組合物或該asAA與葡糖淀粉酶之組合的酶組合物，將被加入到顆粒淀粉底物的淤漿中；并且該混合物在一個(gè)單一步驟中被發(fā)酵。該淤漿可以具有約10-50％ds；約10-45％ds；約15-40％ds；約20-40％ds；約25-40％ds；或約25-35％ds。本發(fā)明的組合物和方法所包括的成分的精確量，取決于所應(yīng)用的酶的組合以及所處理的顆粒淀粉的類型。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生終產(chǎn)物的方法，包括在一步中使顆粒淀粉底物淤漿與含有本發(fā)明涉及的具有顆粒淀粉(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的酶組合物接觸，以產(chǎn)生終產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，接觸步驟在顆粒淀粉的淀粉糊化溫度以下的溫度中進(jìn)行。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生終產(chǎn)物的方法，包括在一步中使顆粒淀粉底物淤漿與含有葡糖淀粉酶和具有顆粒淀粉(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的酶的組合接觸，以產(chǎn)生終產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，asAA和GA被分開加入的，而在其它實(shí)施方式中，asAA和GA以組合摻混物被加入。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，接觸步驟在顆粒淀粉的淀粉糊化溫度以下的溫度中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的方法所使用的精確溫度，取決于所使用的具體淀粉底物。通常的淀粉糊化溫度范圍公開在Swinkels，STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY第32-38頁(yè)，edsVanBeynumetal.，(1985)MarcelDekkerInc.，NY和THEALCOHOLTEXTBOOK，AREFERENCEFORTHEBEVERAGE，F(xiàn)UELANDINDUSTRIALALCOHOLINDUSTRIES，3rdEd.，edsJacquesetal.，1999，NottinghamUniversityPress，UK。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法將在至少約10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的溫度中進(jìn)行。在其它實(shí)施方式中，該溫度將在25-65℃、約30-65℃、約35-65℃、約40-65℃和約45-65℃之間。在其它實(shí)施方式中，該溫度將在約25-45℃、約25-40℃、約30-40℃和約30-35℃之間。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，淀粉底物從不經(jīng)受用以液化的熱條件。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法將在約pH3.0至6.0、約pH3.5至6.0、約pH3.5至5.5、約pH3.5至5.0和約pH3.5至4.5的pH中進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，該方法的停留時(shí)間為從約2至300小時(shí)，但更典型地從2至120小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，該步驟被進(jìn)行約5至100小時(shí)。在其它實(shí)施方式中，該步驟被進(jìn)行約5至80小時(shí)。仍然在其它實(shí)施方式中，該步驟被進(jìn)行至少約5小時(shí)，但在100小時(shí)以下。在一些實(shí)施方式中，顆粒淀粉的干固體之至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％被水解。在一些實(shí)施方式中，顆粒淀粉底物被完全水解。在一些實(shí)施方式中，在100小時(shí)中，顆粒淀粉的至少90％被水解。在某些實(shí)施方式中，在24小時(shí)的一段時(shí)間內(nèi)，至少90％的顆粒淀粉底物被水解。在其它實(shí)施方式中，在24小時(shí)的一段時(shí)間內(nèi)，至少95％的顆粒淀粉底物被水解。葡萄糖的產(chǎn)量(總的增溶干固體的百分?jǐn)?shù))可以是至少約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％和98％。在一些實(shí)施方式中，葡萄糖可以被用于產(chǎn)生高果糖糖漿(highfructosesyrup(HFS))。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡萄糖被連續(xù)產(chǎn)生并基本上所有葡萄糖都被用在該方法中，以產(chǎn)生終產(chǎn)物，例如乙醇。(參考MOLECULARSTRUCTUREANDFUNCTIONOFFOODCARBOHYDRATE，ED.G.G.BIRCHETAL，APPLIEDSCIENCEPUBLISHERS，LONDON)。然而，葡萄糖可以用于產(chǎn)生其它終產(chǎn)物，包括，但不限于有機(jī)酸；氨基酸；甘油；抗壞血酸中間體；(例如葡糖酸和2，5-二酮葡糖酸(2，5-diketoglucoante))；以及其它復(fù)合化合物，例如激素和抗生素。在另一個(gè)實(shí)施方式中，顆粒淀粉底物，在與asAA和任選與GA接觸之前，可以被預(yù)處理。預(yù)處理(pretreatment)可以包括在用產(chǎn)乙醇微生物發(fā)酵或培養(yǎng)之前，使顆粒淀粉底物，優(yōu)選含粗底物的淤漿，暴露于淀粉糊化溫度以下的溫度。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，預(yù)處理包括使用α淀粉酶，例如細(xì)菌α淀粉酶(即SPEZYME和GZYME997(GenencorInternational，Inc.))和任選使用纖維素酶(例如Cellulase2000)。在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理將在40-65℃之間、還在40-60℃之間以及在42-52℃之間，在3.5至5.5的pH范圍內(nèi)、還在3.5至5.0的pH之間、在3.5至4.5的pH之間以及還在3.8至4.2的pH之間。在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理可以被進(jìn)行30分鐘至24小時(shí)、也可以進(jìn)行30分鐘至12小時(shí)、也可以進(jìn)行30分鐘至8小時(shí)、也可以進(jìn)行30分鐘至4小時(shí)以及優(yōu)選從1小時(shí)至3小時(shí)以下。在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理將被包括在帶有根據(jù)本發(fā)明的具有GSH活性的asAA的培養(yǎng)中以及任選被包括在帶有葡糖淀粉酶的培養(yǎng)中。在其它實(shí)施方式中，預(yù)處理將從包括具有GSH活性的asAA和任選具有葡糖淀粉酶的培養(yǎng)中被分開。在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理將進(jìn)行1至24小時(shí)，也是2至24小時(shí)。在其它實(shí)施方式中，預(yù)處理將進(jìn)行2至18小時(shí)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法包括同步糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandfermentation(SSF))，其中所述顆粒淀粉水解步驟和發(fā)酵步驟被同時(shí)進(jìn)行。包括與具有GSH活性的asAA接觸的顆粒淀粉底物的培養(yǎng)基還包括微生物，例如細(xì)菌、真菌或酵母并且特別是產(chǎn)乙醇微生物，所述具有GSH活性的asAA或者在無(wú)細(xì)胞濾液中供應(yīng)或者由培養(yǎng)物中的真菌宿主表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，發(fā)酵系統(tǒng)可以包括至少兩種細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，除了與具有GSH活性的asAA接觸外，SSF將包括使顆粒淀粉底物與葡糖淀粉酶接觸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)乙醇微生物將包括酵母，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(美國(guó)專利第4,316,956號(hào))。產(chǎn)乙醇微生物優(yōu)選的例子還包括表達(dá)醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的細(xì)菌，例如可以用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmoblis)或從運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中獲得(美國(guó)專利5,028,539；5,424,202；5,487,989；5,482,846；5,554,520；和5,514,583)。在另外的實(shí)施方式中，產(chǎn)乙醇微生物表達(dá)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖的酶。酵母的商業(yè)來(lái)源包括FALI、REDSTAR(RedStar)、FERMIOL(DSMSpecialties)和SUPERSTART(Alltech)。在一些實(shí)施方式中，同步糖化發(fā)酵的停留時(shí)間將為約2至300小時(shí)，但優(yōu)選從約2至120小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，該時(shí)間為約5至100小時(shí)。在其它實(shí)施方式中，該時(shí)間為約5至80小時(shí)。仍然在其它實(shí)施方式中，該時(shí)間為至少5小時(shí)，但在100小時(shí)以下。在其它實(shí)施方式中，在10-40℃的溫度下并優(yōu)選在25-40℃下，以及在3.5至6.0的pH下，該處理時(shí)間(processtime)為至少約10小時(shí)、但小于100小時(shí)。酵母在發(fā)酵中的使用是熟知的，并參考THEALCOHOLTEXTBOOK，K.JACQUESETAL.，EDS.1999，NOTTINGHAMUNIVERSITYPRESS，UK。在一些實(shí)施方式中，至少5體積％、至少8體積％、至少10體積％、至少12體積％、至少15體積％和至少18體積％的乙醇將在發(fā)酵培養(yǎng)基中被產(chǎn)生。在其它實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的乙醇的量將在5-30％之間、也在5-25％之間以及在5-20％之間。在發(fā)酵之后，醇(例如乙醇)可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基回收。在一些實(shí)施方式中，發(fā)酵過(guò)的培養(yǎng)基中的醇可以被蒸餾，例如通過(guò)加熱或真空蒸餾。然后，醇被用作例如燃料醇或飲用醇。剩下的殘留物，被稱為釜餾物，可以被回收并且重復(fù)用于下次發(fā)酵的釜餾物組分或釜餾物可以被分離成可溶餾分或不可溶餾分。當(dāng)釜餾物例如通過(guò)離心或篩選被分成可溶餾分和不可溶餾分時(shí)，這些餾分可以被用來(lái)制備酒糟可溶物或干酒糟可溶物或被混合在一起而制備含可溶物的干酒糟(distillers’driedgrainplussolubles(DDGS))。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉通常形成DDGS和酒糟的方法。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，當(dāng)在發(fā)酵過(guò)程中乙醇百分比提高時(shí)，DDGS的量降低。然而，本發(fā)明所包括的方法的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)可以是DDGS中的總蛋白百分比之提高，并參考實(shí)施例10。然后，DDGS可以被用在例如動(dòng)物飼料配方中。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括的SSF方法將產(chǎn)生含有30％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下和1％以下的殘留淀粉的DDGS。預(yù)期的是，盡管與現(xiàn)有技術(shù)的方法制備的DDGS相比具有較低的殘留淀粉含量，然而根據(jù)本發(fā)明的方法得到的DDGS確實(shí)具有提高的蛋白總量，從而用在動(dòng)物飼料中具有另外的益處。從發(fā)酵中回收的殘留淀粉可以與酶和/或微生物一起被重復(fù)利用，并經(jīng)受重新開始的發(fā)酵。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到預(yù)定的醇含量(例如8至30％)時(shí)，同時(shí)使用具有GSH活性的asAA和任選葡糖淀粉酶以及微生物發(fā)酵20-50％ds的顆粒淀粉淤漿的方法，將產(chǎn)生殘留淀粉。該殘留淀粉、微生物和/或殘留酶，可以與新鮮顆粒淀粉和另外的酶等分試樣混合，正如產(chǎn)生用于另一次發(fā)酵的發(fā)酵物料所需。然而，意圖不是本發(fā)明被限制在重復(fù)利用帶有殘留淀粉的酶和/或微生物。在一些實(shí)施方式中，微生物，在重復(fù)利用殘留淀粉之前，被從殘留淀粉中除去；而在其它實(shí)施方式中，僅僅微生物被重復(fù)利用。本文中介紹的多個(gè)實(shí)施方式的一個(gè)例子被陳述在圖16中。盡管在優(yōu)選的實(shí)施方式中，期望的終產(chǎn)物是乙醇，但期望的終產(chǎn)物可以是可以通過(guò)顆粒淀粉底物的酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。得自顆粒淀粉水解的葡萄糖可以被生物轉(zhuǎn)化成數(shù)量眾多的產(chǎn)品，例如但不限于抗壞血酸中間體(葡糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、idonate、5-酮-葡糖酸和2，5-二酮葡糖酸)；1，3-丙二醇；酶，芳族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有機(jī)酸(例如乳酸、琥玻酸、異檸檬酸和草酰乙酸)；氨基酸(絲氨酸和甘氨酸)；丙酮酸和其它物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以用在這些終產(chǎn)物的產(chǎn)生中的多種發(fā)酵條件以及測(cè)量蛋白質(zhì)表達(dá)水平的酶試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)下面的實(shí)施例被提供，以展示和進(jìn)一步示例性說(shuō)明本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方式和方面，并不被解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，預(yù)期的是，這些教導(dǎo)將在進(jìn)一步優(yōu)化本文中描述的方法系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)有用。在隨后的公開和試驗(yàn)部分，使用了下面的縮寫具有GSH活性的asAA(具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylasehavinggranularstarchhydrolyzingactivity))；asaA(具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶，如SEQIDNO3中所說(shuō)明，并且其得自白曲霉中asAA的內(nèi)源性表達(dá))；Tr-asaA(白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶的表達(dá)，表達(dá)于里氏木霉(Trichodermareesei)宿主中)；AkAA(具有SEQIDNO3的酸穩(wěn)定性α淀粉酶并且有時(shí)與asaA互換使用)；GA(glucoamylase(葡糖淀粉酶))HGA(源自灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)的葡糖淀粉酶，具有SEQIDNO12)；TrGA(源自木霉屬的葡糖淀粉酶，具有SEQIDNO11(aglucoamylasederivedfromaTrichodermahavingSEQIDNO11))；wt％(重量百分比)；℃(攝氏度)；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))；H2O(水)；dH2O(去離子水)；dlH2O(去離子水，Milli-Q過(guò)濾)；aa(氨基酸)；bp(堿基對(duì))；kb(千堿基對(duì))；kD(千道爾頓)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(體積摩爾濃度(molar))；mM(體積毫摩爾濃度(millimolar))；μM(體積微摩爾濃度(micromolar))；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘/數(shù)分鐘)；hr(s)(小時(shí)/數(shù)小時(shí))；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；DO(溶解氧)；鄰苯二甲酸鹽緩沖液(于水中的鄰苯二甲酸鈉，20mM，pH5.0)；PBS(磷酸緩沖鹽水[150mMNaCl，10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2])；SDS(十二烷基磺酸鈉)；Tris(三羥甲基氨基甲烷)；w/v(重量體積比)；w/w(重量比)；v/v(體積比)；Genencor(GenencorInternational，Inc.，PaloAlto，CA)；DDGS(DistilleriesDryGrainplusSolids(含固體干酒糟))；MT(公噸)；和EtOH(乙醇)。下面的試驗(yàn)和方法被用在下面提供的實(shí)施例中葡糖淀粉酶試驗(yàn)(glucoamylaseassay)使用熟知的試驗(yàn)測(cè)量葡糖淀粉酶活性，該試驗(yàn)基于葡糖淀粉酶催化對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside(PNPG))水解成葡萄糖和對(duì)硝基苯酚的能力。在堿性pH下，硝基苯酚形成與葡糖淀粉酶活性成比例的黃顏色，并且在400nm下被監(jiān)測(cè)，并與酶標(biāo)準(zhǔn)品比較，計(jì)量為GAU。1個(gè)“葡糖淀粉酶活性單位(GlucoamylaseActivityUnit)”(GAU)被定義為產(chǎn)生1克還原糖的酶的量，計(jì)算為在pH4.2下、于60℃時(shí)每小時(shí)來(lái)自可溶性淀粉(4％ds)的葡萄糖。酸穩(wěn)定性α淀粉酶活性(acid-stablealphaamylaseactivity)的測(cè)量是基于在pH4.5于50℃下，通過(guò)酶樣品的等分試樣水解可溶性馬鈴薯淀粉底物(4％ds)的程度。使用DNS法測(cè)量還原酶含量，如Miller，GL.(1959)Anal.Chem.31:426-428所描述。1單位的酶活力(SSU，可溶性淀粉單位(solublestarchunit))相當(dāng)于在具體的溫育條件下，每分鐘釋放1mg葡萄糖的還原能力?？偟矸酆康臏y(cè)定酶-酶淀粉液化和糖化方法(雙酶法)被用于測(cè)定總淀粉含量。在一個(gè)典型的分析中，2g干樣品被放入100ml科耳勞奇瓶(Kohlraucshflask)中，并且加入45mlpH7.0的MOPS緩沖液。該淤漿被充分?jǐn)嚢?0分鐘。1.0mlSPEZYMEFRED(1:50稀釋于水中)被加入，并被加熱到沸騰，持續(xù)3-5分鐘。該瓶被置于加壓釜中，維持在121℃下，達(dá)15分鐘。在熱壓處理后，該瓶被置于95℃水浴中，并加入1ml的1:50稀釋的SPEZYMEFRED并溫育45分鐘。調(diào)節(jié)pH到pH4.2，而溫度被降到60℃。隨后加入20ml醋酸鹽緩沖液，pH4.2。通過(guò)加入1.0ml的1:100稀釋的OPTIDEXL-400(來(lái)自GenencorInternationalInc.的葡糖淀粉酶)進(jìn)行糖化，并且于60℃持續(xù)溫育18小時(shí)。通過(guò)于95℃加熱10分鐘，終止酶反應(yīng)。使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物，通過(guò)HPLC分析，測(cè)定總糖組成。從總糖中減去在室溫下未經(jīng)酶處理之樣品的水抽提物的可溶性淀粉水解產(chǎn)物。殘留淀粉碘試驗(yàn)將發(fā)酵醪(beer)樣品(發(fā)酵液)在2ml塑料離心管中離心。傾去上清液，將含有沉淀的管置于冰浴中。將幾滴0.025N碘溶液(0.1N碘，來(lái)自VWR目錄號(hào)VW3207-1，稀釋4X)被加到該沉淀中，并被混合。陽(yáng)性(+)淀粉顯示的顏色范圍是從藍(lán)色到紫色，并且顏色強(qiáng)度與淀粉濃度成正比。陰性結(jié)果(-)保持淡黃色?？偟鞍追治鍪褂肒jeldhal法(AmericanAssoc.CerealChemists(AACC)，(1983)，Methods22B608thEd.StPaul，MN)，測(cè)定樣品配制液中的總氮(N)。蛋白質(zhì)含量由6.25×總氮計(jì)算出。乙醇和碳水化合物測(cè)定使用HPLC法測(cè)定樣品中乙醇和碳水化合物組成，如在此所述a)將1.5mLEppendorf離心管裝滿發(fā)酵罐發(fā)酵醪，并在冰上冷卻10分鐘；b)該樣品管在Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorftabletopcentrifuge)中離心1分鐘；c)將0.5mL上清液樣品轉(zhuǎn)移到含0.05mL的Kill溶液(1.1NH2SO4)的試管中，并允許靜置5分鐘；d)將5.0mL水加入到試管樣品中，然后通過(guò)0.45μm尼龍針頭過(guò)濾器(NylonSyringeFilter)過(guò)濾到HPLC瓶中；和e)在HPLC上運(yùn)行。HPLC條件a)乙醇系統(tǒng)柱PhenomenexRezexOrganicAcidColumn(RHM-單糖)#00H-0132-KO(等價(jià)于Bio-Rad87H)柱溫60℃流動(dòng)相0.01NH2SO4流速0.6mL/min檢測(cè)器RI注射體積20μLb)碳水化合物系統(tǒng)柱PhenomenexRezexCarbohydrate(RCM-單糖)#00H-0130-KO(等價(jià)于Bio-Rad87H)柱溫70℃流動(dòng)相納米純DIH2O流速0.8mL/min檢測(cè)器RI注射體積10μL(3％DS材料)該柱基于糖類的分子量分離，該糖類被稱為DPI(單糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)和DP+4(具有聚合度大于3的寡糖)。如下制備用在實(shí)施例7-16中的asaA。在表達(dá)asaA的里氏木霉(根據(jù)實(shí)施例2和3制備)的發(fā)酵結(jié)束時(shí)，通過(guò)離心分離生物量，并且使用10,000分子量截留超濾膜濃縮澄清培養(yǎng)物濾液。該具有90SSU/g的超濾濃縮液被使用。如下制備用在實(shí)施例7-16中的葡糖淀粉酶使用如在USP3,249,514中描述的經(jīng)選擇的黑曲霉真菌菌株。發(fā)酵之后，使用包括過(guò)濾和離心的常規(guī)分離方法，分離真菌菌絲體。通過(guò)在5℃下進(jìn)行超濾，濃縮該澄清濾液，達(dá)到規(guī)定活力。實(shí)施例1克隆白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶基因從白曲霉菌絲體的過(guò)夜培養(yǎng)物中，提取基因組DNA。根據(jù)制造商關(guān)于真菌的指示，使用FastDNAKit(QbioGene，Carlsbad，CA)SPINTM方案。就勻漿化過(guò)程而言，是將樣品在FastPrepInstrument上、以速度4.0、處理30秒。在A.Kaneko，etal.(Kanekoetal.，(1996)，J.FermBioeng81292-298)的asaA序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)PCR引物。正向引物包含用于定向克隆到pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。α6引物的序列是CACCATGAGAGTGTCGACTTCAAG(SEQIDNO.6)，而Akaa3引物的序列是CTACCTCCACGTATCAACCAC(SEQIDNO.7)。通過(guò)凝膠提取法(gelextraction)(GelPurificationKit，Qiagen)，分離2.36kbPCR產(chǎn)物；并根據(jù)InvitrogenGateway系統(tǒng)方案，克隆入pENTR/D。然后，載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)以化學(xué)方式所致感受態(tài)的Top10E.coli(Top10大腸桿菌(Invitrogen))中，它具有卡那霉素選擇。用限制性酶消化來(lái)自幾個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，以確認(rèn)正確大小的插入物。從幾個(gè)克隆對(duì)α淀粉酶基因插入物進(jìn)行測(cè)序(Sequetech，MountainView，CA)(SEQIDNO1)。來(lái)自1個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，pENTR/D_Akaa#11，被加入到帶有pTrex3g/amdS目的載體的DNALR克隆酶反應(yīng)(LRclonasereaction)(InvitrogenGateway系統(tǒng))中。在LR克隆酶反應(yīng)中，重組使來(lái)自pENTR/D載體的白曲霉asaA代替目的載體之CmR和ccdB基因。該重組在cbhl啟動(dòng)子和目的載體的終止子之間定向插入asaA。48bp和80bp的重組位點(diǎn)序列，分別保留在α淀粉酶的上游和下游。LR克隆酶反應(yīng)的等分試樣，被轉(zhuǎn)化進(jìn)化學(xué)感受態(tài)的Top10E.coli中，并在羧芐青霉素選擇下過(guò)夜生長(zhǎng)。為從細(xì)菌質(zhì)粒中移出真菌表達(dá)盒，按照StratageneQuickChange方案，將EcoRI位點(diǎn)3′加入到amdS基因上。真菌表達(dá)盒的序列被確認(rèn)。來(lái)自幾個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA被限制性消化，以確認(rèn)正確的插入片段大小。用EcoRI消化來(lái)自克隆pTrex3g_Akalpha#1(圖4)的質(zhì)粒DNA，以釋放包括cbhl啟動(dòng)子asaAcbhl終止子amdS的表達(dá)盒。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)瓊脂糖提取方法，純化該7.8kb的表達(dá)盒，并且使之轉(zhuǎn)化到源自公眾可得的菌株QM6a的里氏木霉菌菌株中，如下面進(jìn)一步描述。實(shí)施例2里氏木霉的生物射彈轉(zhuǎn)化里氏木霉孢子懸浮液被鋪在MABA轉(zhuǎn)化板的～6cm直徑的中心處(150μl的5×107-5×108孢子/ml的懸浮液)。然后，該板在生物通風(fēng)廚中被風(fēng)干。將阻擋屏(Stoppingscreens)(BioRad165-2336)和微載體固定器(macrocarrierholders)(BioRad1652322)浸泡在70％的乙醇中，并風(fēng)干。DriRite干燥劑被置于小培養(yǎng)皿(6cmPyrex)中，并被用Whatman濾紙覆蓋。該含有微載體(BioRad165-2335)的微載體固定器被平放于濾紙的上面，并將培養(yǎng)皿蓋重新放回去。通過(guò)加入60mg鎢M-10粒子(微載體，0.7微米，BioRad#1652266)到Eppendorf管中，制備鎢粒子懸浮液。加入1ml乙醇(100％)。在乙醇溶液中渦旋(votex)鎢，并使其被浸泡15分鐘。以最大速度，短暫地微量離心Eppendorf管，以沉淀鎢。輕輕倒出乙醇，并用無(wú)菌蒸餾水洗滌3次。在水洗滌液被第三次輕倒出后，鎢被重懸在1ml無(wú)菌50％甘油中。至少每2周一次配制新鮮鎢。對(duì)于每次轉(zhuǎn)化，通過(guò)加入25μl懸浮鎢到1.5mlEppenderf管而制備轉(zhuǎn)化反應(yīng)物。隨后，順序加入0.5-5μlDNA(Xbal消化的表達(dá)盒)、25μl2.5MCaCl2、10μl0.1M亞精胺。該反應(yīng)物被連續(xù)渦旋5-10分鐘，保持鎢為懸浮狀態(tài)。然后，Eppendorf管被短暫地微量離心并被輕輕倒出液體。用200μl70％的乙醇洗滌鎢沉淀，短暫微量離心成粒狀沉淀并被傾去液體。用200μl100％的乙醇洗滌沉淀，短暫微量離心沉淀，并倒出液體。鎢沉淀被重懸于24μl100％的乙醇中。Eppendorf管被置于超聲水浴中15秒，且8μl等分試樣被轉(zhuǎn)移到干燥過(guò)的微載體的中心處。該微載體被留置在干燥的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行干燥。He罐被打開到1500psi。1000psi可裂膜(可裂膜圓片(rupturediscs))(BioRad165-2329)被用在ModelPDS-1000/HeBiolisticParticleDeliverySystem(BioRad)中。當(dāng)鎢溶液變干時(shí)，阻擋屏和微載體固定器被插入PDS-1000中。含有目標(biāo)里氏木霉孢子的MABA板，被置于阻擋屏下6cm處。29英寸Hg的真空度被加到室上，并被保持。HeBiolisticParticleDeliverySystem(氦生物彈射粒子輸送系統(tǒng))開槍。使該室通風(fēng)并且MABA被移出，以便在28℃培養(yǎng)直至菌落出現(xiàn)(5天)。對(duì)于這個(gè)實(shí)施例2，下面的溶液被配制，改性amds生物射彈瓊脂(ModifiedamdSBiolisticagar(MABA))每升部分I，在500mldH2O中制備1000×鹽1ml高質(zhì)量瓊脂(Nobleagar)20gpH達(dá)6.0，高壓滅菌部分II，在500mldH2O中制備乙酰胺0.6gCsCl1.68g葡萄糖20gKH2PO415gMgSO4·7H2O0.6gCaCl2·2H2O0.6gpH達(dá)4.5，0.2微米過(guò)濾除菌；放入50℃烘箱中溫?zé)?，加到瓊脂中，混合，倒板。室溫下保存?000×鹽每升FeSO4·7H2O5gMnSO4·H2O1.6gZnSO4·7H2O1.4gCoCl2·6H2O1g加到1LdH2O0.2微米過(guò)濾除菌實(shí)施例3里氏木霉的PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化將萌發(fā)孢子的菌絲體(在Difco的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar(PDA))上，于30℃，生長(zhǎng)5天)的1-2cm2瓊脂塊(agarplug)，接種到處于250ml、4擋板搖瓶中的50mlYEG(含20g/L葡萄糖的5g/L酵母提取物)培養(yǎng)液中；并在200rpm和30-37℃下，溫育16-20小時(shí)。通過(guò)將搖瓶?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移進(jìn)50ml錐形管中并以2500rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘，回收菌絲體。上清液被丟棄而菌絲體沉淀被轉(zhuǎn)移到250ml、0.22mCA或PES的Coming過(guò)濾瓶中，該過(guò)濾瓶含有40ml過(guò)濾過(guò)的β-D葡聚糖酶溶液。該溶液在30℃、200rpm下被溫育2小時(shí)，以產(chǎn)生原生質(zhì)體。原生質(zhì)體通過(guò)過(guò)濾收集，經(jīng)過(guò)無(wú)菌Miracloth(CalBiochem，LaJolla，CA)，進(jìn)入50ml錐形管中。通過(guò)以2000rpm離心5分鐘，沉淀原生質(zhì)體，并且丟棄上清液。用50ml1.2M山梨醇洗滌原生質(zhì)體沉淀1次；離心(2000rpm，5分鐘)并丟棄上清液。用25ml山梨醇/CaCl2洗滌沉淀。使用血球計(jì)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后通過(guò)以2000rpm離心5分鐘而形成沉淀。丟棄上清液，并將原生質(zhì)體沉淀重懸于山梨醇/CaCl2中，該山梨醇/CaCl2的體積足以產(chǎn)生原生質(zhì)體濃度為1.25×108個(gè)/ml的原生質(zhì)體溶液。對(duì)于每一轉(zhuǎn)化，20μg等分試樣的表達(dá)載體DNA(體積不大于20μl)被轉(zhuǎn)移到冰上的15ml錐形管中。原生質(zhì)體懸浮液(200μl)和50μlPEG溶液被加到每一管中。這被緩慢混合并在冰上孵育20分鐘。PEG(2ml)溶液被加到每一轉(zhuǎn)化管中并在室溫下孵育5分鐘。4ml山梨醇/CaCl2溶液被加入到每一管中(總體積6.2ml)并被輕輕混合。然后，2ml轉(zhuǎn)化混合物被加入到3個(gè)熔融(50℃)上層瓊脂管中的每一個(gè)中。每一上層瓊脂混合物被倒在單獨(dú)的轉(zhuǎn)化板上，并于30℃溫育4至7天。對(duì)于采用amdS選擇的轉(zhuǎn)化，乙酰胺/山梨醇板和上層瓊脂被使用。選擇板與轉(zhuǎn)化板相同，但不含山梨醇。通過(guò)轉(zhuǎn)移分離的菌落到新鮮的含乙酰胺的選擇培養(yǎng)基中，純化推定的轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)基和溶液被如下配制。1)40mlβ-D-葡聚糖酶溶液——在40ml1.2M山梨醇中，溶解600mgβ-D-葡聚糖酶(InterSpexProductsInc.，SanMateo，CA)和400mgMgSO4·7H2O。2)200mlPEG混合物——在200mldlH2O中，溶解50gPEG4000(BDHLaboratorySuppliesPoole，England)和1.47gCaCl2·2H2O。每月新鮮配制。3)山梨醇/CaCl2溶液——在1.2M山梨醇中溶解50mMCaCl2。4)乙酰胺/山梨醇瓊脂——部分I——在200mldlH2O中溶解0.6g乙酰胺(Aldrich，99％升華)、1.68gCsCl、20g葡萄糖、20gKH2PO4、0.6gMgSO4·7H2O、0.6gCaCl2·2H2O、1ml1000×鹽(參見(jiàn)下面)，調(diào)節(jié)pH到pH5.5，用dH2O使體積達(dá)到300毫升，并過(guò)濾除菌。部分II——20g高質(zhì)量瓊脂(Nobleagar)和218g山梨醇被加到1L量筒中，用dlH2O使體積達(dá)到700mls，并高壓滅菌。部分II被加到部分l，得到1L的最終體積。5)1000×鹽——混合5gFeSO4·7H2O、1.6gMnSO4·H2O、1.4gZnSO4·7H2O、1gCoCl2·6H2O，并用dlH2O使體積達(dá)到1L。過(guò)濾除菌。實(shí)施例4黑曲霉的PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化從萌發(fā)孢子的黑曲霉板取出2cm2圓柱形瓊脂塊，接種到50mlYEG(5g/L酵母提取物，含有20g/L葡萄糖)培養(yǎng)液中，其中該培養(yǎng)液是處于250ml、4擋板搖瓶中。以200rpm，于30-37℃下，溫育瓊脂塊16-20小時(shí)；菌絲體通過(guò)無(wú)菌Miracloth濾器被收集，并且用溶液A(SolutionA)洗滌。洗滌過(guò)的菌絲體被無(wú)菌轉(zhuǎn)移到40ml原生質(zhì)體化溶液(protoplastingsolution)中，并在30℃、200rpm溫育1-2小時(shí)，原生質(zhì)體化進(jìn)展被顯微監(jiān)測(cè)。原生質(zhì)體化反應(yīng)物通過(guò)無(wú)菌Miracloth被過(guò)濾到2個(gè)50ml無(wú)菌一次性離心管中，并用溶液B(SolutionB)使每一管的體積達(dá)到45毫升。在2500rpm下離心原生質(zhì)體5分鐘，以獲得粒狀沉淀，并丟棄上清液。用20ml體積的溶液B再洗滌沉淀2次。該沉淀被重懸在10ml溶液B中，并使用血球計(jì)進(jìn)行計(jì)數(shù)原生質(zhì)體。原生質(zhì)體被再次離心并丟棄上清液。原生質(zhì)體被重懸在溶液B中，以達(dá)到～1×107個(gè)/100μl。在冰上，100μl原生質(zhì)體溶液被加入到預(yù)冷的15ml管中，每一個(gè)轉(zhuǎn)化為一管。10μgDNA以不超過(guò)10μl的體積被加入。加入溶液C(SolutionC)(12.5μl)，輕輕混合，并在冰上溫育20分鐘。MMS上層瓊脂(對(duì)于每一轉(zhuǎn)化而言，做3管，各管10ml)被熔融并保持在55℃。從冰上移走原生質(zhì)體；并且溶液C(1ml)和溶液B(2ml)被加入到被每個(gè)管中并緩慢混合所述管。1ml原生質(zhì)體混合物被加入到3個(gè)上層瓊脂管中的每一個(gè)中，并且所述上層瓊脂被倒在MMS板上。對(duì)于每一轉(zhuǎn)化，這被重復(fù)；并且板于30℃被溫育4-7天。溶液A(SolutionA)(每500ml)——0.44gK2HPO4、0.34gKH2PO4、48.156g無(wú)水MgSO4(FW120.37)；以及加入dlH2O到500ml的終體積，pH5.5。過(guò)濾除菌并在室溫下儲(chǔ)藏。原生質(zhì)體化溶液——在40ml溶液A中，溶解180單位的β-D-葡聚糖酶(InterSpexProducts，Inc)。0.2微米過(guò)濾器，過(guò)濾除菌。溶液B(SolutionB)(每500ml)——5ml1MTris，pH7.5；2.77gCaCl2(FW110.99)；109.32g山梨醇(FW182.2；1.2M)；以及加入dlH2O，達(dá)到500ml的最終體積。過(guò)濾除菌并在室溫下儲(chǔ)藏。溶液C(SolutionC)(每500ml)——250gPEG4000；2.77gCaCl2；5ml1MTris.pH7.5；以及加入dlH2O，達(dá)到500ml的最終體積。過(guò)濾除菌。MMS瓊脂*——在1LdlH2O中溶解，6g/LNaNO3；0.52g/LKCl；1.52g/LKH2PO4；218.5g/LD-山梨醇；1ml/L痕量元素(參見(jiàn)下面)；10g/L瓊脂(上層瓊脂中的低熔點(diǎn)瓊脂糖)。高壓滅菌。滅菌后，無(wú)菌加入10ml50％葡萄糖和1.25ml20％MgSO4·7H2O。*對(duì)于amdS選擇，用0.59g/L乙酰胺和3.4g/LCsCl代替MMS中的硝酸鹽。痕量元素溶液在250mldlH2O中溶解，1g/LFeSO4·7H2O8.8g/LZnSO4·7H2O0.4g/LCuSO4·5H2O0.15g/LMnSO4·4H2O0.1g/LNa2B4O7·10H2O50mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O混合并加入0.2ml濃HC1以溶解。用d1H2O使體積達(dá)到1L。過(guò)濾器過(guò)濾除菌。實(shí)施例5用asaA基因轉(zhuǎn)化的里氏木霉的發(fā)酵和在里氏木霉克隆中的活性測(cè)定一般地，遵照Foremanetal.(Foremanetal.(2003)J.Biol.Chem27831988-31997)中所述的發(fā)酵方案進(jìn)行。更具體地，對(duì)于菌株中的每一個(gè)，進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵，顯示于圖5A中。用1.5ml的冷凍孢子懸浮液，接種0.8L的含有5％葡萄糖的Vogels基本培養(yǎng)基(Davisetal.，(1970)METHODSINENZYMOLOGY17A，第79-143頁(yè)和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONSOFAMODELORGANISM，OxfordUniversityPress，(2000))。48小時(shí)后，每一培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到處于14LBiolatitte發(fā)酵罐中的6.2L相同培養(yǎng)基中。該發(fā)酵罐，在每分鐘8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)升的氣流下，于25℃以750RPM運(yùn)行。初始葡萄糖被消耗完后1小時(shí)時(shí)，開始25％(w/w)乳糖進(jìn)料，并且以碳限制模式進(jìn)料，以防止乳糖積聚。分別使用葡糖氧化酶測(cè)定試劑盒或含有加入的、切割乳糖的β-半乳糖苷酶的葡糖己糖激酶測(cè)定試劑盒，監(jiān)測(cè)葡萄糖和乳糖的濃度(InstrumentationLaboratoryCo.，Lexington，MA)。定期取樣，以監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)展。在InternationalEquipmentCompany(NeedhamHeights，MA)醫(yī)用離心機(jī)中，將收集的樣品于50ml離心管中以3/4速度旋轉(zhuǎn)。在具有MOPS(嗎啡啉丙磺酸)SDS運(yùn)行緩沖液(runningbuffer)和LDS樣品緩沖液的還原條件下，使樣品上清液進(jìn)行4-12％BIS-TRISSDS-PAGE凝膠試驗(yàn)(圖5A)。在另外的發(fā)酵中，樣品上清液基本上如上所述被試驗(yàn)。然而，不同比例的完整型和截短型Tr-asaA被獲得。圖5B泳道2說(shuō)明了50和90kD之間的3條主要帶。使用本領(lǐng)域已知的改進(jìn)方法(Hellmanetal.，(1995)Anal.Biochem.224451-455)消化凝膠的3條帶。使用反相HPLC提取、分離肽，并測(cè)定多肽質(zhì)量和質(zhì)譜/質(zhì)譜碎裂模式(ms/msfragmemtationpattern)。所得到的肽圖確認(rèn)兩條較低MW的帶是截短型。一條帶代表截短型asAA，其中修剪發(fā)生在SEQIDNO3的氨基酸位置434和580之間；而第二條帶代表其中修剪發(fā)生在大約SEQIDNO3的氨基酸位置581處。每條帶表現(xiàn)出α淀粉酶和GSH活性。實(shí)施例6天然和重組的具有GSH活性的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asaA)的pH穩(wěn)定性的比較在pH4.5下，用20mM乙酸鹽緩沖液，將如上所述重組產(chǎn)生的asaA(Tr-asaA)樣品和天然asaA樣品稀釋到相等的蛋白質(zhì)濃度。反應(yīng)在3至7的pH水平下，于50℃下，在100mM檸檬酸/NaOH緩沖液中，進(jìn)行30分鐘。1.0mL的反應(yīng)物被加到于樣品管中的5mL10％玉米淀粉中，該玉米淀粉在100mM、pH4.5的乙酸鹽中。管于50℃下被振蕩20分鐘。然后，加入0.5mL2.0％NaOH。管被旋轉(zhuǎn)，并且使用二硝基水楊酸分析法(DinitoSalicylicAcid(DNS)Assay)(Gotoetal.，(1994)，見(jiàn)上文)測(cè)定0.5ml上清液的還原糖。結(jié)果被描繪在圖6中。r-asaA在pH3.9下表現(xiàn)出100％的殘余活性。比較之下，n-asaA在pH4.5下表現(xiàn)出100％的殘余活性。實(shí)施例7在未蒸煮過(guò)的整粒粉碎玉米粉(wholegroundcorn)底物的同步糖化發(fā)酵(SSF)期間，Tr-asaA濃度的效應(yīng)在來(lái)自無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物濾液的葡糖淀粉酶(glucoamylase(GA))的兩個(gè)水平(0.5和1.0GAU/g)下，評(píng)價(jià)Tr-asaA。百分之三十六的玉米面粉淤漿被制備，其中含有干玉米浸漬液(drycornsteep)(占玉米面粉的2.5％)。用稀硫酸調(diào)節(jié)該淤漿的pH至4.8。淤漿的總干固體是33.85％。在含有100gm(克)醪液(mash)(淤漿)的125ml燒瓶中，進(jìn)行發(fā)酵。期望水平的酶被加入，然后，3ml增殖的酵母淤漿被加入，以起動(dòng)發(fā)酵。通過(guò)加入0.26gm(克)的干Fali酵母到100gm(克)醪液中，制備酵母接種物，其中醪液含有GA活性為0.9GAU/g原材料固體的醪液。該淤漿被置于32℃的水浴中，并輕輕混合約17小時(shí)。在不同的時(shí)間間隔，取出發(fā)酵樣品(發(fā)酵醪)，進(jìn)行HPLC分析。72小時(shí)后，終止發(fā)酵；并且發(fā)酵醪于60℃干燥，以獲得DDGS。測(cè)定DDGS的淀粉含量，并且通過(guò)加入碘，抽樣調(diào)查終止發(fā)酵后的發(fā)酵醪中的不溶性固體中的淀粉。在該研究中所使用的酶是黑曲霉GA。表1總結(jié)了乙醇水平、醪液固體的碘染色和DDGS的淀粉百分比。表1在酵母發(fā)酵條件下、在顆粒玉米淀粉轉(zhuǎn)化成乙醇期間，asaA的效應(yīng)實(shí)施例8通過(guò)葡糖淀粉酶和α淀粉酶的顆粒淀粉底物的轉(zhuǎn)化相對(duì)于ds，在0.5GAU/g的葡糖淀粉酶存在下，在同步糖化發(fā)酵條件下，將不同來(lái)源的商業(yè)α淀粉酶與Tr-asaA進(jìn)行比較。使用在前所述的可溶性淀粉底物(solublestarchsubstrate(SSU))法試驗(yàn)，測(cè)定商業(yè)α淀粉酶的活性。表2**表示重組菌株使用如實(shí)施例7所述的整粒磨碎玉米進(jìn)行乙醇發(fā)酵。來(lái)自表2所列來(lái)源的α淀粉酶，以每克磨碎玉米加入1.0SSU而被加入，并且葡糖淀粉酶以0.5GAU/g被加入。在發(fā)酵過(guò)程期間，取樣并分析乙醇含量(圖7)。在發(fā)酵之后，不溶性固體(DDGS)被分離，并且玉米醪液的殘留淀粉含量在pH5.0下被測(cè)定。結(jié)果總結(jié)于表3中。表3平均(Ave)％v/vEtOH表3中的結(jié)果清楚地顯示出在使用酵母的乙醇發(fā)酵條件下，Tr-asaA在幫助葡糖淀粉酶水解顆粒淀粉中是非常有效的。另外，如從該表中所觀察到的，在使用本發(fā)明的酶組合時(shí)，發(fā)酵中所產(chǎn)生的乙醇百分比(18.44)較大，并且DDGS中殘留淀粉百分比(9.0)顯著較低。實(shí)施例9使用Tr-asaA的乙醇發(fā)酵中整粒破碎小麥(全麥磨碎小麥粉(wholegroundwheat))的評(píng)價(jià)在36％的全麥磨碎小麥的淤漿中，加入干玉米浸漬液，加入量為2.5％——基于全麥磨碎小麥的重量。在含有100gm醪液的125ml燒瓶中，進(jìn)行發(fā)酵。用稀硫酸，將淤漿的pH調(diào)到4.8。醪液被稀釋到33.85％ds的終濃度。葡糖淀粉酶(0.5GAU/g磨碎小麥)和asaA(1.0SSU/g整粒磨碎小麥)被加到醪液中。隨后加入3.0ml繁殖的酵母，以起動(dòng)發(fā)酵。通過(guò)加入0.26gm的干Fali酵母到100gm的醪液中，制備酵母接種物。在溫和攪拌的同時(shí)，于32℃水浴中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。在不同的時(shí)間間隔取出發(fā)酵液(發(fā)酵醪)的樣品，離心，以對(duì)糖類組成和乙醇進(jìn)行HPLC分析(表4)。表4用于乙醇生產(chǎn)的酵母發(fā)酵中的全麥磨碎顆粒淀粉實(shí)施例10底物處理對(duì)乙醇產(chǎn)量和含固體干酒糟(DDGS)組成的影響對(duì)于燃料醇發(fā)酵，使用錘磨機(jī)，使整粒破碎玉米底物經(jīng)受常規(guī)的干法磨粉工藝，以減小顆粒大小。制備3種不同的醪液。處理1(Treatment1(Trt1))是高溫處理，其包括根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)方法程式，通過(guò)噴射蒸煮(jetcooking)，在pH5.6下，用3.5U/gSPEZYMEETHYL批式液化36％ds的玉米面粉淤漿，該玉米面粉的淤漿中含有0.9％的干玉米浸漬液(drycornsteep(DCS))。該淤漿被置于90℃浴中1.5小時(shí)，混合，然后冷卻到30℃，用稀硫酸將pH調(diào)節(jié)到5.0。用水進(jìn)一步稀釋淤漿到32.71％ds。處理2(Treatment2(Trt2))是低溫處理。通過(guò)于60℃，用稀硫酸將pH調(diào)節(jié)到5.0，溫育36％ds的、含有0.9％DCS的玉米面粉淤漿3小時(shí)而制備醪液。在溫育之前，加入0.05GAU/g葡糖淀粉酶。處理3(Treatment3(Trt3))是室溫處理——在將玉米淤漿用在與0.5GAU葡糖淀粉酶/g玉米和1.0SSU/g玉米的Tr-asaA的發(fā)酵之前，在室溫下獲得玉米淤漿。然后，對(duì)每一處理進(jìn)行如實(shí)施例7所述的酵母發(fā)酵。在發(fā)酵后，測(cè)定乙醇產(chǎn)量，并通過(guò)離心分離每一處理的不溶性固體，于60℃干燥，并且測(cè)定總糖類含量和氮含量。結(jié)果在表5中被說(shuō)明，其中Trt3是本發(fā)明所涉及的方法。表5在使用酵母的乙醇發(fā)酵條件下，對(duì)整粒破碎玉米底物的不同處理的乙醇產(chǎn)量和DDGS組成的比較如從表5示出的結(jié)果所觀察到根據(jù)本發(fā)明的方法(Trt3)所處理的DDGS中的殘留淀粉百分比，小于得自現(xiàn)有技術(shù)處理(Trt1)或低溫處理(Trt2)的殘留淀粉百分比。值是3.5％(Trt3)，相對(duì)于Trtl和Trt2的4.8％或3.8％。相比于現(xiàn)有技術(shù)處理(Trt1)，根據(jù)本發(fā)明的Trt3的DDGS的總蛋白含量和所產(chǎn)生乙醇的量較高。實(shí)施例11顆粒玉米淀粉與純化的白曲霉α淀粉酶和純化的黑曲霉葡糖淀粉酶的溫育酶純化采用使用AKTA(AmershamPharmacia，Biotech.，NJ)的制備型高壓液相色譜(HPLC)法，純化黑曲霉葡糖淀粉酶(GA)和白曲霉α淀粉酶(AkAA)，都是從培養(yǎng)物濾液純化而來(lái)。在典型的試驗(yàn)中，使用離心柱(Bio-Rad，CA)，用10mMMES緩沖液(pH5.75)使兩個(gè)粗酶樣品脫鹽，以降低電導(dǎo)率。樣品被提升到2MNH4SO2中。上樣到Q-Sepharose柱(Amersham，Biosciences，NJ)，并用20mMMES緩沖液(pH5.75)洗脫，使用1.5MKCl梯度。具有相應(yīng)活性的部分被合并在一起并被濃縮，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。顆粒玉米淀粉和純化酶的溫育純化酶制備物被加入到于0.1M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中的4.0％顆粒玉米淀粉(Cargill，Minneapolis，MN)中，如下所述用于掃描電子顯微鏡(SEM)分析。在32℃下溫育0.5GAU/g玉米淀粉的純化GA、1.0SSU/g淀粉的純化AkAA以及組合起來(lái)的GA與AkAA，并溫和攪拌。在2、4和8小時(shí)的時(shí)間隔時(shí)取出等分試樣(0.75ml)，離心；并且通過(guò)上面的實(shí)施例中所述的方法，測(cè)定可溶性糖。沉淀被重懸于蒸餾水(5ml)，并被離心。沉淀再次重懸于5ml無(wú)水乙醇(99％)中，攪拌以均勻混合并離心。醇處理的沉淀在管中被風(fēng)干，并用于SEM分析。SEM分析大約200μl干體積被轉(zhuǎn)移到1.5mlEppendorf管，并且加入0.8ml無(wú)水乙醇。組分被渦旋以制備淀粉顆粒的懸浮液。幾滴懸浮液被置于剛清潔過(guò)的玻璃蓋玻片上，并允許被風(fēng)干。用碳粘合劑調(diào)整片(carbonadhesivetabs)將蓋玻片安放在樣品臺(tái)上，四周噴涂膠體銀粘合劑(ElectronMicroscopySciences，F(xiàn)t.Washington，PA)，并在ScanCoatSixSputterCoater(EdwardsHighVacuumIntl.Crawley，UK)上用薄層金涂覆。使用Quanta200FEG掃描電子顯微鏡(FEIInc.，Hillsboro，Ore)，在1,000和5,000×的儀器放大倍數(shù)下，在二級(jí)電子成像模式下，于5kv下進(jìn)行掃描電子顯微。從樣品臺(tái)上不同的區(qū)域獲得8到10個(gè)圖像。單獨(dú)酶處理或組合酶處理對(duì)于顆粒玉米淀粉的影響，在圖8和9中被予以例示性說(shuō)明。水解和顯微檢查圖8例示性說(shuō)明了還原糖(mg/ml還原當(dāng)量)，其被測(cè)定為由AkAA和GA進(jìn)行的顆粒淀粉水解的結(jié)果，是4小時(shí)后所釋放出的葡萄糖情況。單獨(dú)使用葡糖淀粉酶的顆粒淀粉的降解是4.9mg/ml；單獨(dú)使用AkAA的顆粒淀粉的降解僅僅是0.3mg/ml。然而，使用GA和AkAA組合的顆粒淀粉降解是12.1mg/ml。酶被組合起來(lái)的降解值說(shuō)明了協(xié)同相互作用，其顯著大于這些酶的加和值。使用掃描電子顯微鏡觀察如本實(shí)施例所述處理的淀粉顆粒。如圖9所示，與純化AkAA溫育的玉米淀粉顆粒確實(shí)顯示出較小的表面改變。這些被觀察為小的針刺小孔。與純化GA溫育的玉米淀粉顆粒顯示出許多小的明確的深孔。顯著地，與GA和AkAA組合物溫育的玉米淀粉顆粒顯示出十分大量的寬的和深的穿透腔隙。另外，在與GA和AkAA之組合溫育的顆粒中，觀察到暴露了顆粒中心的層化結(jié)構(gòu)的表面腐蝕。實(shí)施例12顆粒玉米淀粉淤漿的干固體百分含量對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響用水將玉米面粉制成淤漿，獲得36％ds的醪液(mash)。在用硫酸將pH調(diào)節(jié)到4.5之前，小量玉米浸漬液(占淤漿(slurry)的0.2％)與400ppm(0.04％)脲，被一起加入到醪液中。淤漿的干固體含量從20％ds被調(diào)節(jié)為至36％ds。在含有總量為100g醪液的125ml燒瓶中，進(jìn)行發(fā)酵。酶被稀釋；以便對(duì)于每一種酶，使用恒定體積0.5ml。用3ml酵母接種每一燒瓶，其中酵母在使用前繁殖17小時(shí)。酵母繁殖步驟涉及將0.5％干Fali酵母加入到含0.5GAU/gGA和1.5SSU/gAkAA的25％ds醪液中；以及在32℃水浴中培養(yǎng)，同時(shí)溫和混合。以約24小時(shí)的時(shí)間間隔，在60℃下干燥發(fā)酵醪的樣品，以便獲得DDGS。表6DS含量對(duì)在75小時(shí)時(shí)的乙醇產(chǎn)量和DDGS中殘留淀粉的影響幾乎所有在發(fā)酵期間產(chǎn)生的葡萄糖(DP-1)都被轉(zhuǎn)化成乙醇，除了在高固體下(數(shù)據(jù)未示出)。對(duì)于每一個(gè)測(cè)試的％DS，AkAA增加了乙醇的速率和數(shù)量。圖10A總結(jié)了在每一固體水平下的最終乙醇水平，而圖10B顯示了對(duì)于每一固體水平，相對(duì)于醪液固體，使用AkAA的乙醇增加百分比。兩個(gè)圖證實(shí)了AkAA對(duì)水解顆粒淀粉尤其在高固體百分含量下具有正效應(yīng)。在圖10A中還觀察到，隨著溶解的固體增加，有AkAA和無(wú)AkAA的殘留淀粉的差別也增加了。如在圖10B所觀察到，當(dāng)玉米淤漿中％ds增加時(shí)，AkAA對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響也增加。表6和圖11的結(jié)果清楚顯示了在本發(fā)明的方法中使用AkAA和GA組合物的益處。在所有情況下，當(dāng)AkAA與GA結(jié)合使用時(shí)，DDGS中的淀粉百分比下降；并且進(jìn)一步地，當(dāng)與未添加AkAA的DDGS中的淀粉百分比相比時(shí)，在來(lái)自具有高至36％的玉米淀粉底物的DDGS中發(fā)現(xiàn)的淀粉百分比被減半。實(shí)施例13玉米面粉(AzureStandardFarms)的33％淤漿在DIH2O中被制備，400ppm脲被加入其中。調(diào)節(jié)pH到5.0。在含有100g醪液的125ml燒瓶中進(jìn)行發(fā)酵，并且進(jìn)行下面的處理。A)黑曲霉GA和AkAA以1.0GAU/g和3.0SSU/gds進(jìn)行摻混；B)HGA-GSHE在1.0GAU/gds；C)HGA-GSHE在1.0GAU/gds和AkAA在3.0SSU/gds；D)HGA-GSHE在2.0GAU/gds和E)HGA-GSHE在2.0GAU/gds和AkAA在3.0SSU/gds；這些酶被稀釋，使得0.5ml被加入到每一燒瓶。制備Fali干酵母在水中的3％淤漿，并在32℃水浴中混合1小時(shí)，這些是在通過(guò)加入1.0ml酵母淤漿而接種發(fā)酵罐之前進(jìn)行。燒瓶被置于32℃水浴中，并且溫和混合醪液。在發(fā)酵期間，樣品被移出，進(jìn)行HPLC分析。在72小時(shí)之后終止發(fā)酵，并于62℃干燥發(fā)酵醪，獲得DDGS。通過(guò)雙酶法測(cè)定DDGS的淀粉含量。表7實(shí)施例1433％的玉米面粉(AzureStandardFarms)淤漿在DIH2O中被制備，400ppm脲被加入其中。用5NH2SO4調(diào)節(jié)pH到4.5。在含有100g醪液的125ml燒瓶中，進(jìn)行發(fā)酵。如下所示的酶被稀釋，使得0.5ml被加入到每一燒瓶。水中的Fali干酵母的3％淤漿被制備；并在通過(guò)加入1.0ml酵母淤漿而接種發(fā)酵罐之前，在32℃水浴中混合1小時(shí)。燒瓶被置于32℃水浴中，并且醪液被溫和混合。在發(fā)酵期間，樣品被移出，進(jìn)行HPLC分析。在72小時(shí)之后終止發(fā)酵，并于62℃干燥發(fā)酵醪，獲得DDGS。DDGS的淀粉含量被測(cè)定。對(duì)于下面的表8，酶處理是2.25SSUAkAA和0.75GAU/gds的黑曲霉GA-DISTILLASE(AkAA/AnGA)；2.25SSUAkAA和0.72GAU/g的包含SEQIDNO13所示蛋白質(zhì)的HGA(AkAA/HGA)以及2.25SSUAkAA和1.6GAU/g的包含SEQIDNO12蛋白質(zhì)的TrGA(AkAA/TrGA)。表8實(shí)施例1533％玉米面粉(AzureStandardFarms)淤漿在DIH2O中被制備，向其中加入400ppm脲。用5NH2SO4調(diào)節(jié)pH到4.5。在含有100g醪液的125ml燒瓶中進(jìn)行發(fā)酵。如下所示的酶被稀釋，使得0.5ml被加入到每一燒瓶。制備水中的3％Fali干酵母淤漿；并在通過(guò)加入1.0ml酵母淤漿而接種發(fā)酵罐之前，在32℃水浴中混合1小時(shí)。燒瓶被置于32℃水浴中，并且醪液被溫和混合。在發(fā)酵期間，在22.5小時(shí)、46小時(shí)和71小時(shí)時(shí)，樣品被移出，進(jìn)行HPLC分析。在71小時(shí)之后終止發(fā)酵。黑曲霉葡糖淀粉酶以0.5GAU/g被加入到所有燒瓶中。另外，AkAA酶處理包括a)完整型AkAA和b)圖5B的截短型AkAA酶，它們被合并在一起(參見(jiàn)實(shí)施例5)；在固定的AkAA劑量水平1.5SSU/gds下，以完整型比截短型的不同比率進(jìn)行試驗(yàn)。增加完整型AkAA比截短型AkAA的比率得到增加的乙醇產(chǎn)率。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)(71小時(shí))，乙醇產(chǎn)率的差別沒(méi)在22.5小時(shí)時(shí)或46小時(shí)時(shí)顯著。如在圖11所觀察到，在71小時(shí)時(shí)，具有截短型AkAA所發(fā)生的乙醇產(chǎn)率，比無(wú)AkAA的對(duì)照組要高。完整型AkAA的量從占總量的0％逐漸提高至50％，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)率增加。實(shí)施例16支鏈淀粉酶與葡糖淀粉酶和AkAA的組合產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)率36％玉米面粉淤漿被制備，并將干玉米浸漬液以玉米重量的2.5％被加入其中。調(diào)節(jié)淤漿的pH到4.8。通過(guò)在125ml燒瓶中放置100gm醪液，在不經(jīng)任何進(jìn)一步處理的下，淤漿被用于發(fā)酵。期望量的酶被加入到每一燒瓶中，如表9所示，然后，燒瓶中接種3ml的增殖17小時(shí)的酵母。每一條件被重復(fù)試驗(yàn)兩次。所用的酶是來(lái)自無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)濾液的葡糖淀粉酶(GA)，其中所述無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)濾液通過(guò)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)被濃縮到683GAU/gm酶；5540SSU/ml酶的AkAA；和作為OptimaxL-100提供的支鏈淀粉酶。燒瓶被置于30℃水浴中，并用磁性攪拌棒溫和攪拌。在不同的時(shí)刻，移出發(fā)酵醪樣品，進(jìn)行HPLC分析。在72小時(shí)后，發(fā)酵被終止。于60℃干燥一部分發(fā)酵醪，獲得DDGS。然后測(cè)定DDGSs的淀粉含量。表9如從表9所觀察，支鏈淀粉酶提高了發(fā)酵速度，并稍微增加了乙醇。然而，支鏈淀粉酶似乎對(duì)72小時(shí)時(shí)的終乙醇產(chǎn)率無(wú)影響。另外，對(duì)于DP＞2、DP-2、DP-1，測(cè)量了％w/v，乳酸和甘油數(shù)據(jù)未示出。權(quán)利要求1.終產(chǎn)物的制備方法，包括在合適的發(fā)酵條件下、在約25至65℃之間的溫度下，使顆粒淀粉底物與酶組合物和產(chǎn)乙醇微生物接觸以及產(chǎn)生終產(chǎn)物，所述酶組合物包括具有顆粒淀粉水解(GSH)活性并與SEQIDNO3具有至少90％序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述具有GSH活性的asAA源自所述asAA在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的異源表達(dá)。3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸是在低于所述顆粒淀粉底物中的顆粒淀粉之糊化溫度的溫度下。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸是在25℃至45℃之間的溫度下。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述接觸是在30℃至35℃之間的溫度下。7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸是在約3.5至5.5的pH下。8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸為2至120小時(shí)。9.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括回收所述終產(chǎn)物。10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述終產(chǎn)物是乙醇。11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所產(chǎn)生的乙醇的量為至少約10％v/v。12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所產(chǎn)生的乙醇的量為至少12％v/v。13.權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵中獲得含可溶物干酒糟(DDGS)。14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述DDGS在發(fā)酵72小時(shí)后包括低于15％的殘留淀粉。15.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵獲得殘留淀粉和將所述殘留淀粉再循環(huán)用于第二發(fā)酵。16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述顆粒淀粉底物是谷?；蚱浞旨?jí)部分。17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述谷?；蚱浞旨?jí)部分得自玉米、小麥、水稻、黑麥、大麥、高梁。18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述谷粒被磨成如此顆粒大小，其中所述磨碎谷粒的至少80％將通過(guò)0.5mm篩。19.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述具有GSH活性的asAA與SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性。20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述具有GSH活性的asAA具有SEQIDNO3的序列。21.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包括具有GSH活性的截短型asAA。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述截短型asAA與SEQIDNO9具有至少97％的序列同一性。23.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括使所述顆粒淀粉底物和葡糖淀粉酶接觸。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶得自絲狀真菌宿主。25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述絲狀真菌宿主選自曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)和根霉屬(Rhizopus)菌株。26.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述產(chǎn)乙醇微生物是酵母。27.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶和具有GSH活性的asAA在所述接觸之前混合。28.以乙醇作為終產(chǎn)物的制備方法，包括組合顆粒淀粉水解組合物和顆粒淀粉底物，并且，同時(shí)，在包括25℃至45℃的合適條件下，用產(chǎn)乙醇微生物發(fā)酵所述組合，以及產(chǎn)生乙醇，其中，所述顆粒淀粉水解組合物包括a)具有顆粒淀粉水解(GSH)活性、并與SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)；和b)葡糖淀粉酶。29.權(quán)利要求28所述的方法，進(jìn)一步包括回收所述乙醇。30.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述具有GSH活性的asAA得自asAA在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的異源表達(dá)。31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞。32.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶得自絲狀真菌。33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述絲狀真菌是曲霉屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬和根霉屬的菌株。34.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述顆粒淀粉底物得自谷?；蚱浞旨?jí)部分。35.權(quán)利要求28所述的方法，其中來(lái)自所述顆粒淀粉底物的淀粉固體的至少50％在2至100小時(shí)后被水解。36.權(quán)利要求28所述的方法，其中asAA與GA的比率以重量測(cè)量為10∶1至1∶10。37.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述顆粒淀粉底物是具有25-40％干固體含量(ds)的玉米。38.降低含固體干酒糟(DDGS)中的殘留淀粉含量的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法產(chǎn)生醇，從所述發(fā)酵液分離所述醇以獲得釜餾物，以及將所述釜餾物轉(zhuǎn)化成DDGS。39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述顆粒淀粉底物具有約25％到40％的ds。40.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述DDGS中的殘留淀粉含量為15％以下。41.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述顆粒淀粉底物來(lái)自玉米。全文摘要本發(fā)明涉及制備終產(chǎn)物尤其是醇的方法，其包括使顆粒淀粉底物與具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)和葡糖淀粉酶(GA)在約25至65℃之間的溫度下的發(fā)酵步驟中接觸以及產(chǎn)生終產(chǎn)物，其中所述發(fā)酵步驟還包括產(chǎn)乙醇微生物。文檔編號(hào)C12P7/06GK1997735SQ200580022276公開日2007年7月11日申請(qǐng)日期2005年5月24日優(yōu)先權(quán)日2004年5月27日發(fā)明者N·迪恩-科萊曼,S·M·菲斯克,O·小蘭特羅,S·E·蘭茨,M·J·佩普森,J·K·希泰申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司