專利名稱：一種支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著植物分子生物學(xué)的飛速發(fā)展、植物遺傳分析和遺傳工程技術(shù)的不斷革新，轉(zhuǎn)基因植物在基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐上都具有重要意義。尤其是轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器的研究和開(kāi)發(fā)使植物能以極低的成本大量生產(chǎn)外源蛋白，為人類提供了一個(gè)更加安全和廉價(jià)的生產(chǎn)體系，與微生物發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等生產(chǎn)系統(tǒng)相比，它具有許多潛在的優(yōu)勢(shì)和極大的商業(yè)價(jià)值。
植物生物反應(yīng)器是指以植物懸浮細(xì)胞、某一組織和器官或整株植物為工廠大量生產(chǎn)具有重要功能的蛋白。自1986至1990年間，人們建立了植物表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了人類生長(zhǎng)激素融合蛋白，干擾素和人血清白蛋白。之后，隨著技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家對(duì)于植物生物反應(yīng)器的研究漸趨深入，主要表現(xiàn)在三個(gè)方面首先是應(yīng)用的廣泛性。從生產(chǎn)植物抗體到口服疫苗到重要的藥用蛋白，其分子的復(fù)雜程度和修飾度都在提高。自十幾年前轉(zhuǎn)基因煙草成功地表達(dá)免疫球蛋白的重鏈和輕鏈基因并組裝成功能抗體以來(lái)，植物已經(jīng)能夠生產(chǎn)完整的IgG和IgA分子，分泌型IgG和IgA分子，雙特異性抗體，膜錨定抗體等不同類型抗體。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的口服疫苗包括細(xì)菌疫苗、病毒疫苗、寄生蟲(chóng)疫苗等；第二是可用做反應(yīng)器的植物種類的擴(kuò)展。從最初的模式植物煙草，到現(xiàn)在的馬鈴薯、番茄，玉米，油菜，大豆，擬南芥，香蕉，番木瓜，豇豆，菠菜，苜蓿、蕪青等。Elizabeth E Hood報(bào)道的用轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)的重組抗生素蛋白的表達(dá)量占種子中抽提的總可溶蛋白的2％，在目前表達(dá)外源蛋白的所有轉(zhuǎn)基因玉米中表達(dá)量最高；第三實(shí)現(xiàn)植物生物反應(yīng)器的技術(shù)改良。如，提高蛋白表達(dá)水平，人們?cè)谌~綠體內(nèi)合成復(fù)雜的需要翻譯后加工的或亞基裝配的真核蛋白質(zhì)，如sIgA；整合到煙草葉綠體基因組中的外源基因拷貝數(shù)能夠達(dá)到每個(gè)細(xì)胞10000個(gè)拷貝，相應(yīng)的重組蛋白占全部可溶性蛋白的比例也提高到47％。
轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器研究使農(nóng)業(yè)這一概念大大拓寬，突破了傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)范疇，但要使外源基因在植物中穩(wěn)定的整合，并且能夠在特定的器官或細(xì)胞中特異性表達(dá)，一個(gè)很重要的前提條件是要有合適的啟動(dòng)子。植物基因工程中常用的啟動(dòng)子按其作用方式及功能可分為三類組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子，可以使基因的表達(dá)僅限于某些特定的器官或組織部位，并降低對(duì)植物的負(fù)面影響。
目前，在植物中發(fā)現(xiàn)的種子特異性啟動(dòng)子主要有谷醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、花生種子豆球蛋白legA基因啟動(dòng)子、水稻谷蛋白gluA和gluB基因啟動(dòng)子和玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子等。
玉米淀粉的合成途徑中有許多相關(guān)酶，其中玉米淀粉去分支酶有兩種類型一種是支鏈淀粉酶型去分支酶(the pullulanase-type DBEs)，一種是異淀粉酶型去分支酶(the isoamylase-type DBEs)。ZPU1是一種支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶，在不同玉米組織中檢測(cè)Zpu1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，發(fā)現(xiàn)在玉米授粉20天后種子胚乳中大量存在，而在胚和穗中只有微量的表達(dá)，但在葉和根中沒(méi)有表達(dá)。說(shuō)明調(diào)控Zpu1基因的調(diào)控序列可能是胚乳特異性或種子特異性的。而且該基因只在胚乳、幼胚和穗中表達(dá)，也即只在生殖組織中表達(dá)，表明該基因的調(diào)控序列可能存在與生殖相關(guān)的功能區(qū)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子。
本發(fā)明所提供的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子，是玉米淀粉合成途徑中的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶Zpu1基因的啟動(dòng)子，具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID №1或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含1×SSC、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列的啟動(dòng)子名稱為zpu1P-4，由516個(gè)堿基組成。
含有本發(fā)明的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子的載體、細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增本發(fā)明啟動(dòng)子任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子可啟動(dòng)報(bào)告基因gusA基因在種子中特異性表達(dá)，說(shuō)明它能使目的基因在植物的種子中特異性表達(dá)，該啟動(dòng)子將在玉米種子改良和植物生物反應(yīng)器中發(fā)揮重要作用。


圖1為RT-PCR擴(kuò)增得到的用于篩庫(kù)的片段的電泳圖譜圖2A為第一輪篩選玉米基因組文庫(kù)的雜交顯影的X光片掃描2B為第二輪篩選玉米基因組文庫(kù)的雜交顯影的X光片掃描2C為第三輪篩選玉米基因組文庫(kù)的雜交顯影的X光片掃描2D為第四輪篩選玉米基因組文庫(kù)的雜交顯影的X光片掃描2E為驗(yàn)證第三輪和第四輪篩選得到的單克隆雜交顯影的X光片掃描3A為lambda DNA的酶切電泳圖譜圖3B為lambda DNA酶切后的雜交圖譜圖4為用PCR擴(kuò)增得到的Zpu1基因啟動(dòng)子序列zpu1P-4圖5為zpu1P-4片段構(gòu)建到真核表達(dá)載體pBI121上的圖譜示意圖具體實(shí)施方式
材料與方法1、菌株與質(zhì)粒大腸桿菌(E.coli)DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404均購(gòu)自博大公司、λ噬菌體的宿主菌LE392購(gòu)自Clontech公司。
2、工具酶及生化試劑各種限制性內(nèi)切酶、pGEM@T-Easy載體試劑盒購(gòu)自Promega公司；普通Taq酶和Trizol RNA小量提取試劑盒購(gòu)自天為時(shí)代公司，ExTaq酶購(gòu)自Takara公司；dNTP混合物購(gòu)自上海生工；T4DNA連接酶購(gòu)自Takara公司和BioLabs公司；萘乙酸(NAA)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Km)、鏈霉素(Sm)和噻孢霉素(Cef)購(gòu)自欣經(jīng)科公司；同位素α-32P dCTP購(gòu)自北京亞輝生物公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自Amersham公司。4-甲基傘型酮(4-MU)、4-甲基傘型酮酰-β-葡萄糖醛酸酐酶(4-MUG)均購(gòu)自上海生工。
3、培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基(1升)10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，pH7.0LB固體培養(yǎng)基(1升)1升液體LB培養(yǎng)基加15g瓊脂YEB液體培養(yǎng)基(1升)1g酵母提取物，10g蛋白胨，0.5g MgSO4·7H2O，5g蔗糖，pH 7.5YEB固體培養(yǎng)基(1升)1升YEB液體培養(yǎng)基加15g瓊脂MS基本培養(yǎng)基(1升)MS大量元素，MS微量元素，MS有機(jī)物，各組份的基本成分參照Murashige，T&Skoog，F(xiàn).在1962發(fā)表的MS培養(yǎng)基成分(Murashige，T&Skoog，F(xiàn).A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissueculture.Physiol.Plant.1962，15473-497)MS鹽溶液只含有MS大量元素和微量元素MS固體培養(yǎng)基1升MS基本培養(yǎng)基中加30g蔗糖，8g瓊脂，pH5.6-5.8煙草分化固體培養(yǎng)基1升MS基本培養(yǎng)基中加30g蔗糖，8g瓊脂，3mg 6-BA，0.2mgNAA，pH 5.6-5.8煙草誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基1升MS基本培養(yǎng)基加30g蔗糖，8g瓊脂，pH5.6-5.84.篩選基因組文庫(kù)所需溶液1)20×SSC175.3gNaCl(3.0M)88.2g 檸檬酸三鈉(0.3M)用NaOH調(diào)pH至7.0，定容至1升，室溫保存?zhèn)溆谩?br> 2)20×SSPE175.3gNaCl(3.0M)27.6g 磷酸二氫鈉(0.2M)40ml 0.5M EDTA(終濃度0.02M)用NaOH調(diào)pH至7.4，定容至1升，室溫保存?zhèn)溆谩?br> 3)50×Denhardt’s solution5.0g 聚蔗糖(Ficoll)5.0g 聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)5.0g BSA(組分V)加水定容至500ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)20％SDS5)10×lambda稀釋緩沖液58.3g NaCl(0.1M)24.65g MgSO4·7H2O(0.1M)350ml 1.0M Tris-HCl(pH7.5)(終濃度0.35M)5.PCR引物P2775’CGCACAGGGGTTCTTGTTGGA 3’P9505’CAACCAACCAAGTTCGTGTGC 3’P37F5’AAGCTTGTGTGACATAGTTATCCACGAACC 3’P38R5’GGATCCTTGCGTCCGCGTTTGGATTC 3’P45F5’CAGGAAGTGATGGAGCATCAG 3’P46R5’TCGTGCACCATCAGCACGTTA 3’以上引物均由上海生工合成。
實(shí)施例1、玉米支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶Zpu1基因5`側(cè)翼序列的克隆一、探針的制備根據(jù)GenBank中Zpu1基因的cDNA序列(Accession no.AF080567)設(shè)計(jì)一對(duì)引物(P277和P950)。用Trizol RNA提取試劑盒提取授粉后28天的玉米種子總RNA，提取步驟按試劑盒內(nèi)提供的方法操作。以提取的玉米種子總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
取1μL Oligo(dT)18加到10μL濃度為200ng/uL的總RNA溶液中，70℃，5分鐘后置于冰上冷卻5分鐘，然后加入以下成分試劑體積5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液 5μLdNTP混合物(每種10mM)2.5μLRNasin核糖核酸酶抑制劑(濃度為50U/uL)1μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶(30U/μL)3μLDEPC處理水 定容至25μL參照Promega公司AMV Reverse Transcriptase使用說(shuō)明書(shū)設(shè)定如下的反應(yīng)條件室溫10min，42℃ 60min，70℃ 10min，冰浴2min。然后以合成的cDNA第一鏈為模板，以P277和P950為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體系為試劑體積10×緩沖液 5μLdNTP混合物(每種10mM)1μL引物P277(濃度為10μM) 1μL引物P950(濃度為10μM) 1μLEx-Taq(5U/μL) 1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(濃度為10ng/uL) 5μL滅菌水 定容至50μL反應(yīng)條件94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃1min(10個(gè)循環(huán))；94℃1min，59℃30s，72℃1min(30個(gè)循環(huán))；72℃10min；4℃保存。
將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，表明擴(kuò)增得到一條600bp左右的片段，將此片段作為篩選玉米基因組文庫(kù)的探針。圖1中，M為1kb laddermarker；1為目的片段(箭頭所示)。
二、篩選玉米基因組文庫(kù)得到Zpu1基因5`側(cè)翼序列1、玉米基因組文庫(kù)玉米基因組文庫(kù)購(gòu)自Clontech公司，目錄號(hào)為FL1032D。
2、文庫(kù)滴度的測(cè)定1)、挑取一個(gè)宿主菌(LE392)的單斑于10ml LB液體培養(yǎng)基(含10mM MgSO4、0.2％麥芽糖)中，在200rpm、37℃條件下振蕩過(guò)夜，使OD600達(dá)2.0左右。
2)、文庫(kù)噬菌體的稀釋a.從購(gòu)買(mǎi)的玉米基因組文庫(kù)中取2μLλ噬菌體原種加到1ml 1×lambda稀釋緩沖液中(Dilution1＝1∶500)。
b.從Dilution1中取出20μL加到980μL 1×lambda稀釋緩沖液中(Dilution2＝1∶25000)。
c.在六只試管加入100μL 1×lambda稀釋緩沖液，200μL宿主菌，然后分別加入稀釋噬菌體Dilution20μL、5μL、10μL、50μL、100μL和250μL。
3)、將上述六管在37℃水浴20分鐘左右。
4)、然后加4ml溶解的0.7％LB頂層培養(yǎng)基(50℃左右)，充分混勻后鋪到15％LB固體平板上，快速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平板。
5)、室溫靜置10分鐘，待頂層培養(yǎng)基凝固后，在37℃倒置培養(yǎng)6-7hr。
6)、統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板上長(zhǎng)出的噬菌斑，根據(jù)下面的公式計(jì)算文庫(kù)的滴度(pfu/ml)。
將六個(gè)平板測(cè)得的滴度求平均值為1.22×108pfu/ml。文庫(kù)的滴度大于108pfu/ml，所以該文庫(kù)可以用于篩選。
3、用DNA探針篩選文庫(kù)1)鋪板宿主菌的準(zhǔn)備；接種λ噬菌體的宿主菌LE392單菌落于LB液體培養(yǎng)基(MgSO410mM，麥芽糖0.2％)，37℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0，取出備用。
2)λ噬菌體侵染宿主菌及鋪板取15ml溶化的頂層培養(yǎng)基加到侵染后的噬菌體和宿主菌的混合物中，充分混勻，迅速均勻地鋪在預(yù)先準(zhǔn)備好的1.5％LB固體平板上。室溫靜置10分鐘，待頂層培養(yǎng)基凝固后，在37℃倒置培養(yǎng)3-8hr。當(dāng)噬菌體長(zhǎng)到不同噬斑間邊緣剛彼此接觸時(shí)，取出平板放于4℃，以備后面的轉(zhuǎn)膜。
3)噬菌斑原位吸附固定至硝酸纖維素膜a.剪取適當(dāng)大小(比培養(yǎng)皿略小)的硝酸纖維素膜。在每張膜上剪三個(gè)不對(duì)稱的缺口，并用鉛筆在膜上標(biāo)號(hào)。
b.將與平板編號(hào)相同的膜輕輕放到平板培養(yǎng)基上，盡量不產(chǎn)生氣泡。
c.用滅菌牙簽插在預(yù)先在膜上剪好的三個(gè)不對(duì)稱缺口處，作為膜回位標(biāo)記。2分鐘后用無(wú)菌鑷子小心地揭起硝酸纖維素膜，吸附有噬菌體的一面朝上，放于干凈濾紙上，室溫晾干。
d.將晾干的膜分別在變性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)和中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl PH8.0)中分別放5min。然后轉(zhuǎn)到2×SSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸三鈉)中漂洗一下，把膜放到干凈濾紙上，室溫晾干。
e.80℃，烘膜2hr，用保鮮膜包好后放于4℃?zhèn)溆谩?br> 4)預(yù)雜交按以下成分配制預(yù)雜交液

預(yù)雜液配制好后，將保存于4℃的膜取出放入預(yù)雜液中，42℃，40rpm，預(yù)雜交4hr以上。
5)標(biāo)記探針取4μL濃度為20ng/μL的DNA探針加入26μL水中，在沸水中變性5min，接著冰浴5min，然后依次加入以下成分5×標(biāo)記緩沖液 10μLdATP、dGTP、dTTP(每種1.5mM) 2μLBSA(10mg/ml) 2μLKlenow片段(5U/μL)1μLα-32P-dCTP(10μCi/μL) 5μL。
加入上述成分后，在37℃標(biāo)記4hr左右。其中，5×標(biāo)記緩沖液的成分如下250mM Tris-HCL(pH8.0)、25mM MgCl2、10mM DTT、1M HEPES(pH6.6)和26 A260u/ml隨機(jī)6堿基脫氧核苷酸。
6)雜交將標(biāo)記好的探針在沸水中變性10min，在冰上迅速冷卻后加入預(yù)雜交液中。在42℃，40rpm條件下雜交16-20小時(shí)。
7)洗膜和壓X光片以及陽(yáng)性克隆的挑選雜交結(jié)束后，加入洗膜buffer 1(2×SSC，0.5％SDS)，42℃，40rpm洗1hr。然后再分別用buffer 2(1×SSC，0.1％SDS)和buffer 3(0.2×SSC)，65℃，40rpm各洗1hr。洗膜結(jié)束后，用干凈濾紙吸去膜上的大部分液體，然后用保鮮膜將膜包裹后壓在X光片之下。根據(jù)X光片上影像在膜上標(biāo)出陽(yáng)性斑的位置。然后再將膜放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)平板上，缺口和平板上的牙簽對(duì)齊。根據(jù)膜上的標(biāo)號(hào)挑出含陽(yáng)性斑的培養(yǎng)基放入1.5ml離心管中，加入1ml滅菌1×lambda稀釋液，室溫放置1-2hr，使噬菌體從培養(yǎng)基上擴(kuò)散出來(lái)，然后12000rpm離心10分鐘，收集上清液，用于下一輪篩選。經(jīng)過(guò)5輪篩選和驗(yàn)證，共得到10個(gè)陽(yáng)性單克隆(圖2A-圖2E)。
4、λ噬菌體DNA提取1)將10個(gè)陽(yáng)性單克隆分別鋪板，每個(gè)陽(yáng)性克隆鋪兩個(gè)200mm平板。當(dāng)每個(gè)平板的表面幾乎完全被噬菌斑覆蓋時(shí)，取出平板并直接加入15ml的lambda稀釋緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，10mM MgSO4)，室溫放置1-2hr，使噬菌體從上層培養(yǎng)基中擴(kuò)散出來(lái)。
2)將lambda稀釋緩沖液從培養(yǎng)皿中移入50ml離心管中，4℃，8000rpm離心20min，除去細(xì)菌碎片。
3)將上清移入一新的離心管中，加入RNaseA(終濃度為2μg/ml)，DNase(終濃度為1μg/ml)，37℃消化30min。
4)加PEG8000(終濃度為10％)，NaCl(終濃度為1M)于lambda稀釋緩沖液中，充分混勻，冰浴1hr以上。
5)4℃，11000rpm，離心10min。棄上清，收集管壁上噬菌體顆粒。
6)加1ml 1×lambda稀釋緩沖液重懸噬菌體，并將重懸后噬菌體分裝到1.5ml離心管中(500μL/管)。向每管中加RNaseA至終濃度1ug/ml，DNaseI至終濃度5ug/ml，37℃消化20min。
7)加EDTA至終濃度20mM，終止酶反應(yīng)；然后加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml，破壞噬菌體外殼蛋白，同時(shí)將RNase A和DNase消化掉，加SDS至終濃度0.5％，65℃水浴1小時(shí)。
8)等體積苯酚、氯仿抽提兩次，氯仿抽提一次。
9)上清加入等體積的異丙醇，沉淀lambda DNA。
10)70％乙醇洗滌沉淀，抽干后溶于適量TE，取少量電泳檢測(cè)，其余-20℃保存?zhèn)溆?、Lambda噬菌體DNA酶切分析與亞克隆片段測(cè)序取10個(gè)陽(yáng)性克隆中1個(gè)的λ噬菌體DNA用多種酶進(jìn)行單酶切和雙酶切分析，它們的組合如下1.HindIII+BamHI，2.HindIII+EcoRV，3.EcoRV，4.HindIII+SmaI，5.SmaI，6.HindIII+PstI，7.PstI，8.HindIII+PvuII，9.EcoRI，10.HindIII，11.HindIII+SalI，12.HindIII+EcoRI。
單酶切體系10×緩沖液5μLLambda DNA30μL限制性內(nèi)切酶 6μL滅菌水 定容至50μL。
雙酶切體系10×緩沖液5μLLambda DNA30μL限制性內(nèi)切酶I 5μL限制性內(nèi)切酶II5μL滅菌水 定容至50μL。
將酶切產(chǎn)物電泳、轉(zhuǎn)膜后用篩選文庫(kù)的探針進(jìn)行雜交，具體步驟如下1、電泳及轉(zhuǎn)膜1)將酶解完全的DNA每管加入5μl 10×loading buffer(70％甘油，0.5×TBE，0.2％SDS，20mM EDTA，0.2％溴酚藍(lán))，混勻。樣品于1×TAE(40mM Tris-乙酸，1mMEDTA)電泳緩沖液，0.8％瓊脂糖凝膠，在40cm電泳槽中100v電壓下使得所有樣品從點(diǎn)樣孔進(jìn)入凝膠，然后在30v恒壓下，電泳16h。
2)將電泳后的凝膠切去多余膠邊，并切一小角以表明方向，置于0.25M HCl中輕搖15min。
3)將一磁盤(pán)加入0.4M NaOH溶液，架上一塊玻璃板，上放4層寬于凝膠的吸水紙，兩頭浸于液體中，濾紙間不能有氣泡。
4)膠用蒸餾水沖洗后，點(diǎn)樣孔向下置于濾紙之上，排盡其間氣泡，膠塊四周放好隔水條。
5)剪長(zhǎng)寬比膠塊大1mm的硝酸纖維素膜(Hybond-N+，Amersham)，置于0.4MNaOH中均勻浸透后鋪于膠上，再鋪上四張與膜相同大小的濾紙，其間均不能有氣泡。
6)加數(shù)層紙巾，其上壓一塊玻璃板及750g重物，吸印20～24小時(shí)。
7)吸印完畢后，用鉛筆做標(biāo)記，2×SSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸，pH7.0)浸泡10分鐘。
8)將膜移至濾紙上，超凈臺(tái)吹干。
9)將膜夾于濾紙和兩塊玻璃之間，于80℃烘箱中烘1～2小時(shí)，用保鮮膜包裹，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、雜交轉(zhuǎn)膜完畢之后的雜交方法與篩選玉米基因組文庫(kù)時(shí)所用的雜交方法完全相同，雜交所用的探針也是篩選文庫(kù)時(shí)所用的探針。雜交結(jié)果如圖3B所示。
酶切結(jié)果如圖3A所示，酶切結(jié)果表明所用的幾種限制性內(nèi)切酶對(duì)λ噬菌體DNA的酶切都比較完全，不同大小的條帶基本都已分開(kāi)。酶切片段的雜交結(jié)果如圖3B所示，表明由HindIII、EcoRV、SmaI、HindIII+SalI、HindIII+PvuII和EcoRI酶切的產(chǎn)物中能雜出信號(hào)的片段都比較大，包含有較長(zhǎng)的啟動(dòng)子區(qū)域，可以選擇其中一個(gè)酶的酶切片段回收，進(jìn)行亞克隆分析。(圖3A和圖3B中，M為1kb ladder marker；1.HindIII+BamHI，2.HindIII+EcoRV，3.EcoRV，4.HindIII+SmaI，5.SmaI，6.HindIII+PstI，7.PstI，8.HindIII+PvuII，9.EcoRI，10.HindIII，11.HindIII+SalI，12.HindIII+EcoRI)。
根據(jù)已知的cDNA序列可知在探針的下游距離zpu1基因的起始密碼子約1kb的區(qū)域有一個(gè)HindIII切點(diǎn)，在探針之中有一個(gè)EcoRI的酶切位點(diǎn)，探針距離zpu1基因的起始密碼子約300bp左右。由圖3A和圖3B的酶切雜交結(jié)果可知HindIII單酶切產(chǎn)物中有信號(hào)的片段比較大，雖然可能包含較長(zhǎng)的啟動(dòng)子區(qū)域，但是不易連接到測(cè)序載體上。由HindIII和EcoRI雙切及EcoRI單切的結(jié)果可知EcoRI單切的得到的片段約3～5kb左右，這樣的長(zhǎng)度易于連接且包含啟動(dòng)子的區(qū)域也比較長(zhǎng)。雖然其他內(nèi)切酶酶切的片段長(zhǎng)度也有適宜的，但是與測(cè)序載體上的酶切位點(diǎn)不一致。因此決定回收由EcoRI酶切的片段。然后又用EcoRI酶切了λDNA幾次，確定目標(biāo)條帶約在3.7kb左右，最后回收該片段將其連接到測(cè)序載體pGEM-3zf上，送上海聯(lián)眾公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明該3.7kb片段全長(zhǎng)為3603bp，其中有2267bp是Zpu1基因ATG上游的5`側(cè)翼序列，另外的1332bp序列為Zpu1基因組序列。將3603bp的序列提交GenBank中進(jìn)行比對(duì)，其中1332bp序列中外顯子序列與cDNA序列同源性為100％。說(shuō)明所得到的2267bp序列確為Zpu1基因的5`側(cè)翼序列。
實(shí)施例2、zpu1P-4啟動(dòng)子的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草一、zpu1P-4啟動(dòng)子的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建
1、從Zpu1基因5`側(cè)翼序列中擴(kuò)增zpu1P-4啟動(dòng)子根據(jù)測(cè)序得到的Zpu1基因的5`側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了2條引物P37F和P38R。以連接在測(cè)序載體上的3.7kb序列為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增方法從Zpu1基因5`側(cè)翼序列中擴(kuò)增出一條500bp左右的片段。
擴(kuò)增體系10×buffer 5μLdNTP混合物(每種10mM) 1μLP37F(10μM) 1μLP38R(10μM) 1μLTaq酶(5U/μL)0.5μL模板(濃度為10ng/μL) 0.5μL滅菌水 定容至50μL擴(kuò)增條件為94℃10min94℃1min，55℃30s，72℃1min(30個(gè)循環(huán))72℃10min4℃保存。
結(jié)果如圖4所示，將用引物P37F與P38R擴(kuò)增得到的片段命名為zpu1P-4(序列1，516bp)。圖4中，M為1kb ladder marker；1為zpu1P-4(箭頭所示)。
將擴(kuò)增出的zpu1P-4片段連接到pGEM@T-Easy測(cè)序載體上，送上海聯(lián)眾公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與所得的2267bpZpu1基因的5`側(cè)翼序列比較，一致性為100％，表明擴(kuò)增沒(méi)有出現(xiàn)錯(cuò)配。
2、真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)引物P37F和P38R兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，用HindIII和BamHI將zpu1P-4片段從pGEM@T-Easy載體切下，把酶切后回收的zpu1P-4片段與經(jīng)HindIII和BamHI酶切的pBI121載體片段相連。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a菌株中，提取質(zhì)粒DNA，用HindIII和BamHI酶切鑒定、利用引物P37F與P38R PCR鑒定zpu1P-4片段與pBI121載體的連接物。將構(gòu)建好的載體命名為pBI121-zpu1P-4(其示意圖如圖5所示)。
二、轉(zhuǎn)化煙草大量提取構(gòu)建的表達(dá)載體(pBI121-zpu1P-4)的質(zhì)粒DNA，取20μL(約1ug)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在28℃、YEB培養(yǎng)基(含卡那霉素Km 100ug/ml，鏈霉素Sm 125ug/ml)上培養(yǎng)兩天。各挑選兩個(gè)克隆做菌液PCR鑒定，均擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。
將含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種于YEB培養(yǎng)基(含卡那霉素Km 100ug/ml，鏈霉素Sm 125ug/ml)，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，室溫離心10分鐘(4000rpm)。沉淀用MS鹽溶液(pH7.0)懸浮，并稀釋至原體積的20-50倍。取煙草無(wú)菌苗葉片，切去葉片邊緣和主脈，將葉片切成約0.4×0.6cm2左右大小，放入制備好的菌液中浸泡5-10min，用無(wú)菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入表面鋪有一層濾紙的MS固體培養(yǎng)基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，pH 5.8)中，28℃暗培養(yǎng)。三天后，轉(zhuǎn)入MS篩選培養(yǎng)基(含3mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，含卡那霉素100ug/ml，噻孢霉素250ug/ml，pH5.8)中，28℃光照培養(yǎng)，每日光照12-16小時(shí)。每2周繼代一次，每次將變黃的葉片和愈傷組織丟掉，大的愈傷組織切割成小塊，經(jīng)2-3次繼代后，培養(yǎng)的愈傷組織陸續(xù)分化出幼苗。將幼苗轉(zhuǎn)移入罐頭瓶裝的MS固體培養(yǎng)基(含卡那霉素Km 100ug/ml，鏈霉素Sm 125ug/ml，pH 5.8)中，28℃光照培養(yǎng)，待其根系發(fā)育完全后，移栽到溫室中。
實(shí)施例3、煙草轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測(cè)及zpu1P-4啟動(dòng)子活性的檢測(cè)一、煙草轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測(cè)1、煙草總DNA小量提取取煙草幼嫩葉片150mg左右于1.5ml離心管中，研成粉末。加800μL 65℃預(yù)熱的SDS裂解緩沖液(0.1M Tris-HCl，0.05M EDTA，0.5M NaCl，1％SDS)，振蕩混勻。65℃水浴20分鐘，加入250μL 5M KAc，冰浴5分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘。取上清于另一1.5ml離心管中，4℃、12000rpm再離心5分鐘。將上清轉(zhuǎn)入另一干凈離心管，加入600μL異丙醇，充分混勻，4℃12000rpm離心15分鐘。最后用70％乙醇清洗沉淀2次，真空干燥后，加80μL滅菌重蒸水溶解DNA。
2、PCR檢測(cè)根據(jù)gusA基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物P45F和P46R，用這對(duì)引物檢測(cè)用SDS法提取的轉(zhuǎn)基因煙草DNA。其中，PCR反應(yīng)體系組成如下10×緩沖液 2.5μLdNTP混合物(每種10mM)0.5μLP45F(濃度為10uM)0.5μLP46R(濃度為10uM)0.5μLTaq酶(濃度為5U/uL) 0.5μL轉(zhuǎn)基因煙草總DNA(濃度為20ng/uL) 1μL滅菌水定容至25μL。
PCR檢測(cè)結(jié)果表明陽(yáng)性煙草植株與待檢測(cè)煙草植株的株數(shù)比為72％。
二、支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因的啟動(dòng)子活性的檢測(cè)將PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的煙草植株，提取其莖、葉和種子的總蛋白，定量檢測(cè)gusA基因編碼蛋白β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)的活性，具體步驟如下1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用反應(yīng)終止液(0.2mol/L Na2CO3)將4-MU(4-甲基傘形酮)配制成0.00、6.25、12.50、50.00、100.00、250.00、500.00、1000.00pmol的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，通過(guò)測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度，作出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、總蛋白提取與蛋白濃度的測(cè)定1)取0.1g材料于1.5ml離心管中，加入液氮，研成粉末。
2)加600μL酶提取液(0.05M PH7.0磷酸緩沖液，0.1％SDS，0.01M PH8.0EDTA，20％甲醇，0.1％Triton X-100，0.1％巰基乙醇)，在13000rpm 4℃離心10min，取上清于一新的離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3)取上清，用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白的含量。
3、β-葡萄糖苷酸酶的酶促反應(yīng)及其熒光定量1)取50μL含GUS的上清，加入到450μL 37℃預(yù)熱的檢測(cè)液(2mmol/L 4-MUG溶液)中，迅速充分混勻。
2)立刻取出50μL加入到950μL反應(yīng)終止液(0.2mol/L Na2CO3)，將該管作為酶促反應(yīng)的0點(diǎn)。
3)分別在10min、20min、30min、45min和60min從反應(yīng)液中取出50μL，轉(zhuǎn)入950μL的反應(yīng)終止液中。
4)酶促反應(yīng)結(jié)束后，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)365nm、發(fā)射波長(zhǎng)455nm下，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光值。
5)根據(jù)測(cè)定的熒光值以及參與反應(yīng)的總蛋白，求出GUS活性，GUS活性＝單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)生成的MU/蛋白量(單位pmol 4-MU.min-1.mg-1蛋白)。
β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase)活性測(cè)定結(jié)果如表1，表2和表3所示，表明(1)Zpu1基因起始密碼子ATG上游516bp的序列(zpu1P-4)足以啟動(dòng)報(bào)告基因gusA表達(dá)。(2)gusA基因在種子中的表達(dá)量比在葉中的表達(dá)量高9倍，比莖中高20倍，充分說(shuō)明zpu1P-4啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。
表1、zpu1P-4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gusA基因在煙草葉中表達(dá)


表2、zpu1P-4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gusA基因在煙草莖中表達(dá)

表3、zpu1P-4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gusA基因在煙草種子中的表達(dá)

序列表<160>1<210>1<211>516<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>1gtgtgacata gttatccacg aaccaaacag acctttaatg gtgttttgaa tagttttagt60ccataaacca aacatgatag ggactaaatt ttagtctcct aactaaatgt tagtcattga120actaaaggaa ccaaacggat accaatactc aatgtatgga aaagacgaga aatcaataac180tttatcaaat atgagaacca gccgtgaaga catggcagaa taaaaaaaac aaagcaaaag240agctggatat accttaacgg ggaagtcttg acgaaaacaa cattacgtgt atagaaatga300gaagataaag aaaagagata agatggccac ggtagctatt agccaaacaa gcactcttct360agttcttccg tttctcactt tctcttcctg agaatctccc ctttatatga ataatataaa420tgtcacataa gtaaataaac aaataaatca atcaatatta ctacgaagct gtcctcaccg480ccttctctct ccctccgaat ccaaacgcgg acgcaa 51權(quán)利要求
1.一種支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子，具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID No1或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子的載體。
3.含有權(quán)利要求1所述的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子的細(xì)胞系
4.含有權(quán)利要求1所述的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子的宿主菌。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子任一片段的引物對(duì)。
6.權(quán)利要求1所述的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子在玉米種子改良中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子在植物生物反應(yīng)器中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子具有下述核苷酸序列序列表中SEQ ID №1或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的支鏈淀粉酶型淀粉去分支酶基因啟動(dòng)子可啟動(dòng)報(bào)告基因gusA基因在種子中特異性表達(dá)，說(shuō)明它能使目的基因在植物的種子中特異性表達(dá)，該啟動(dòng)子將在玉米種子改良和植物生物反應(yīng)器中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/113GK1789418SQ20041009849
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月13日
發(fā)明者王國(guó)英, 陳小平, 王章英, 王建華 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)