專利名稱：黃色桿菌及其殺螺劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有殺釘螺作用的細(xì)菌及其培養(yǎng)方法、用為殺螺劑的用途和用其制備的殺釘螺劑，具體地是一種殺釘螺黃色桿菌及其殺螺劑。
背景技術(shù)：
釘螺是血吸蟲的中間宿主，是傳染血吸蟲病的重要媒介，因而殺滅釘螺是控制阻斷血吸蟲病傳播的有效途徑之一；目前世界各國所使用的殺螺劑，多為化學(xué)殺螺劑，如早期使用的五氯酚鈉，近年來推廣應(yīng)用的溴乙酰胺和煙酰苯胺及氯硝柳胺等，這些殺螺劑不同程度地存在著選擇性較弱、持久性差、易造成環(huán)境污染等問題，為了避免化學(xué)合成滅螺劑對(duì)環(huán)境的污染，人們一直想獲得純天然的植物滅螺藥物。自Archibsld(1933)第一次用Balanites aegyptiace的果實(shí)進(jìn)行滅螺以來，至今已有1000余種植物用于滅螺試驗(yàn)(Marstor，1985；Amusan et al.，1995；belot et al.，1993；Cepleanu et al.，1994；Yamamoto et al.，1996；El-Sawy et al.，1981；糜留西等，1997；陳光，1995；孫振中等，1957)，發(fā)現(xiàn)其中20多種植物具有強(qiáng)烈的滅螺作用(Guo，1987)；又如武漢植物研究所和湖北省血防研究所用盾葉薯蕷和根莖粉末來滅螺，取得滅螺率達(dá)98.8％的效果(崔天義等，1998)；近年，武漢市血吸蟲防治研究所、同濟(jì)醫(yī)大寄生蟲病教研室、德國海德堡大學(xué)熱帶研究所、武漢市血吸蟲病地方病防治辦公室等單位的專家聯(lián)手攻關(guān)，用“植物殺手”麻瘋樹素滅螺取得勝過化學(xué)藥物的好效果(高霞，1999)，但植物的干品或提取物雖少污染，卻基本上與化學(xué)合成滅螺劑一樣，效果僅一次性，作用不能持久，不能防止釘螺的遷入(李順意等，1999；馬安寧等，1999c，2000)，尤其對(duì)于江河湖庫洲灘釘螺遷入機(jī)會(huì)多的螺區(qū)，其費(fèi)工費(fèi)資與實(shí)際滅螺效果就更難令人滿意了。
為了彌補(bǔ)化學(xué)殺螺劑這些方面的不足，進(jìn)行生物滅螺方法研究及生物滅螺劑的開發(fā)，篩選有效的殺螺微生物日顯必要，且對(duì)環(huán)境保護(hù)十分有意義。
經(jīng)過多年研究工作者的不懈尋找和實(shí)驗(yàn)，迄今為止，已經(jīng)篩選出一些能有效殺滅釘螺的微生物菌株，并且進(jìn)行了相關(guān)方面的研究，如凸形假單胞菌(Psudomonas conrexa chester)是1967年湖南省寄生蟲病防治研究所從活田螺體內(nèi)分離出一株Thp1菌株，1971年又從自然死亡率高達(dá)48％的病態(tài)釘螺中分離出一株Lb菌株，這兩個(gè)菌株經(jīng)鑒定(中科院北京微生物研究所)均為假單胞菌屬的凸形假單胞菌，滅螺實(shí)驗(yàn)及結(jié)果表明使用浸泡法和噴灑感染釘螺，無論哪一種方法，凸形假單胞菌殺滅釘螺的效果均非常顯著，釘螺死亡率均達(dá)90％以上，被感染的釘螺一般在2～4天內(nèi)大部分死亡。但用浸泡法時(shí)，每毫升菌液含菌數(shù)需要達(dá)千萬級(jí)(千萬/mL)時(shí)，才顯示滅螺效果；用噴灑法，每平方米含菌數(shù)需要達(dá)萬億級(jí)(萬億/m2)時(shí)，滅螺效果才穩(wěn)定。噴灑時(shí)，當(dāng)土壤含水量低于45％，滅螺效果下降；又如淺灰鏈霉菌230(Streptomyces griseolus 230)該菌株是1978年從湖南岳陽市樓西灣湖洲土壤中分離出的一株編號(hào)為230的放線菌株，經(jīng)鑒定為淺灰鏈霉菌(Streptomycesgriseolus 230)[2～4]。通過實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)物均有較好的殺釘螺作用，實(shí)驗(yàn)證明其殺釘螺有效成份是在菌絲體內(nèi)，為吲哚咔唑并氧雜環(huán)化合物(C28H26N4O3)。淺灰鏈霉菌230的殺螺有效成份稱之為抗生素230?？股?30殺釘螺效果與環(huán)境濕度有一定的關(guān)系。濕度高殺螺效果好，特別是施用后第一天尤為重要，這可能與抗生素230在水中分解作用快有關(guān)，因此毒殺作用主要在施用后第一天。但對(duì)魚具有一定的毒性；一株殺螺有效微生物的滅螺效果，與其施用方法密切相關(guān)，一般而言，由于滅螺必須使微生物與螺體接觸才能充分發(fā)揮效用，這一點(diǎn)極大地限制了微生物滅螺劑的施用方法，并且由于微生物的株系不同，其生物學(xué)特性也不同，同時(shí)由于多方面理化因素的影響，例如溫度、光照、土壤含水量、滅螺劑的劑型、pH值等，因此微生物滅螺至今還未真正意義的實(shí)際應(yīng)用，大多數(shù)試驗(yàn)均為實(shí)驗(yàn)室，少數(shù)進(jìn)行現(xiàn)場試驗(yàn)的菌種或制劑，使用的也多是粗粉，現(xiàn)場噴灑實(shí)驗(yàn)用量較大，但其中培養(yǎng)基的成份較多；另外所使用的多是現(xiàn)場直接分離的野生菌株，未經(jīng)選種。而使用微生物制劑滅螺，有效菌種的篩選是關(guān)鍵的步驟。此外，其劑型的選擇，減少用量、使用微生物殺螺劑與環(huán)境相溶也是能否真正使用其推廣使用的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種具有較強(qiáng)毒殺釘螺作用的黃色桿菌及其培養(yǎng)方法，尤其是提供一種黃色桿菌作為殺螺劑的應(yīng)用和提供一種滅螺效果好的黃色桿菌殺螺劑。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是一種黃色桿菌，所述的黃色桿菌(Xanthobacterautotrophicus)為黃色桿菌II(Xanthobacter autotrophicus II)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號(hào)為AB 204050，保藏日期為20030813。
一種制備黃色桿菌的方法黃色桿菌的培養(yǎng)和發(fā)酵方法如下第一，菌種分離取頻病態(tài)釘螺洗潔消毒后研碎，8-12倍水稀釋后接種到蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基上，或?qū)难x和非血吸蟲病流行區(qū)采集的土壤用8-12倍水稀釋后接種到蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基上，26-30℃培養(yǎng)，避光，48-96小時(shí)后挑單株分離菌種；第二，菌種培養(yǎng)將挑單株分離菌種接種到蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基上作平板或斜面增菌培養(yǎng)，26-30℃培養(yǎng)，避光，48-96小時(shí)；第三，菌液搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)用消毒300ml三角瓶，裝120ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液，取0.5-1cm2平板或斜面增菌活化菌株，紗布棉塞封瓶口，搖瓶轉(zhuǎn)速120-180轉(zhuǎn)/分，26-28℃，72-96小時(shí)；得具有殺釘螺作用的黃色桿菌菌液；上述蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基是將蛋白胨6-10g、牛肉胨浸膏2-5g、瓊脂20g、加蒸餾水1000ml配制而成，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液是將蛋白胨12-18g、牛肉胨浸膏5.2-8.5g、磷酸氫二鉀1-2g、碳酸鈣3-6g、硫酸鎂1-2g、氯化鈉1-2g、硫酸銨2-4g、酵母粉6-12g、玉米粉45-72g、植物油(金龍魚食用調(diào)和油)2-4ml及水2000ml混合；上述蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面菌種分離培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液均用氫氧化鈉或碳酸氫鈉調(diào)pH7.2～7.4，120-131℃滅菌20-30min，冷卻后至室溫備用；黃色桿菌作為殺螺劑的應(yīng)用，利用黃色桿菌的殺螺作用與植物附形劑制備成具有良好殺釘螺效果的黃色桿菌殺螺劑。
黃色桿菌的殺螺劑是將用上述方法制備的具有殺釘螺作用的黃色桿菌菌液與植物附形劑混合組成一種黃色桿菌殺螺劑，其中，菌液∶植物附形劑＝1000ml∶1000g；混合物經(jīng)800-1500Hz超聲震蕩處理。
上述植物附形劑為具有殺釘螺作用植物的細(xì)屑粉末，即將具殺釘螺作用的植物莖葉、干燥研磨或微波殺菌干燥研磨成粉末，粉末過60-120目篩。
上述具有殺釘螺作用的植物附形劑為蝦鉗草(又名空心蓮子草)和夾竹桃葉的粉末混合物；蝦鉗草與夾竹桃葉重量比例為70∶30。
本發(fā)明黃色桿菌具有較強(qiáng)的殺螺作用，用其菌液與植物附形劑配制的殺螺劑具有下述優(yōu)點(diǎn)1、對(duì)環(huán)境無毒副無污染，自然降解迅速；2、對(duì)釘螺能迅速擊殺，有效降低了釘螺上爬逃逸現(xiàn)象；3、對(duì)人畜無毒副作用，對(duì)非靶生物及魚類無毒殺作用，維持滅螺時(shí)間長(15天以上)；4、保藏，運(yùn)輸、使用方便；5、比純菌液或植物粗粉末滅螺效果好，且減少了用藥量。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)一步說明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及制造方法和用途。
具體實(shí)施例方式1.材料和方法1.1殺螺菌株 自養(yǎng)黃色桿菌II(Xanthobacter autotrophicus II)是從湖南岳陽洞庭湖畔的釘螺孳生地洲灘土壤和自然死病螺體中篩選分離出的具有較強(qiáng)殺螺效果的菌株之一，黃色桿菌屬(Xanthobacter Wiegel et al.，1978)，自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacter autotrophicus)。
1.2菌種檢測菌落圓形、微隆起、均勻、表面光滑、濕潤、黃色；細(xì)胞桿狀、多形、產(chǎn)粘液、革蘭氏染色陰性、接觸酶陽性、能利用丙酸鹽、吐溫40、吐溫80和琥珀酸、乙酸、丙酮酸甲酯、奎尼酸、D一葡糖二酸、硝酸鹽還原陽性、自養(yǎng)。
1.3培養(yǎng)基及方法分離菌種用培養(yǎng)基配方蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基

取頻病態(tài)釘螺5-10只，洗潔后用1‰汞水溶液表層涮洗消毒，用蒸餾水涮洗后迅速研碎，10倍水稀釋后涂抹法接種上述平板或斜面培養(yǎng)基上，或取5g從湖南岳陽洞庭湖畔的釘螺孳生地洲灘土壤中到的細(xì)土置三角燒瓶加45ml蒸餾水，充分混均，作連續(xù)10倍稀釋后傾注法接種到上述平板或斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，避光，3d后挑單株分離菌種。
斜面增菌(活化菌株)用培養(yǎng)基同分離菌種用培養(yǎng)基配方。
將挑單株分離菌種接種到上述培養(yǎng)基上28-30℃，72-96h，常壓通氣培養(yǎng)，晝夜光照3600Lo×12h。
殺螺菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方


用NaHCO3或NaOH調(diào)pH7.2-7.4，121℃滅菌30min，冷卻室溫后接種；消毒300ml三角瓶，裝120ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液，0.5cm2平板或斜面活化菌株，紗布棉塞封瓶口，搖瓶轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分，28℃，72-96h。含菌數(shù)5000萬-1億菌/1ml。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1水浸殺螺效果取2ml上述搖瓶發(fā)酵4d后菌液，滴入998ml去氯水燒杯中攪拌均勻，黃色桿菌液室內(nèi)浸殺釘螺試驗(yàn)，室溫28℃，(每樣處理30只螺，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次平均值)

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)每毫升菌液含菌數(shù)達(dá)千萬級(jí)(如3-5千萬菌/ml)時(shí)，顯示滅螺效果，達(dá)億級(jí)(億/ml)時(shí)，效果顯著均為100％，死螺測定用敲擊法。
2.2現(xiàn)場粗提菌粉噴灑效果現(xiàn)場試驗(yàn)在武漢市東郊天興鄉(xiāng)三隊(duì)堤外水洼處，選擇釘螺密度較高地帶，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2003年10-11月，氣溫16-24℃間，土表pH7.5，較潮濕，土壤含水量達(dá)40％。黃色桿菌培養(yǎng)3-5d后，拌沙真空干燥(W∶W＝100ml∶100g)，砂菌粉30g/m2，噴灑10m2樣地，試驗(yàn)第3d、7d、12d、15d統(tǒng)計(jì)死螺數(shù)，殺螺效果不明顯，死螺絕對(duì)數(shù)不高，15d最高僅達(dá)20％左右，但抑螺較明顯，即多數(shù)螺閑厴，不活動(dòng)停食。
3.討論3.1黃色桿菌II水浸實(shí)驗(yàn)殺螺效果明顯，啟效快，48h后殺螺效果可達(dá)95％以上，但要求水浸殺螺菌液的含菌數(shù)需達(dá)3000萬菌/1ml才顯示殺螺效果，達(dá)5000萬菌/1ml以上殺螺菌液，殺螺效果顯著。
3.2黃色桿菌II粗砂攪拌真空干燥(50℃以內(nèi)烘干)菌粉，現(xiàn)場殺螺效果不佳，雖然砂拌可達(dá)均勻潑灑目的，但菌粉發(fā)揮效力還需借潮濕和水傳播，尤其在洲難水線上，實(shí)驗(yàn)中可見粗砂菌粉若灑入水邊水線處，殺螺效果明顯好于旱地，灑入草灘中可見明顯抑螺效果，即螺普遍閉厴，爬行不活躍。
使用上述黃色桿菌菌液殺螺效果好，但其用量大，運(yùn)輸、使用不方便；用菌粉則滅螺效果欠佳。由于殺螺植物的莖葉等粗屑粉末已有人試驗(yàn)，但粗提物殺螺應(yīng)用用量大，效果欠佳，源料植物資源也存問題。能否降低用量，增強(qiáng)效果，既解決部分源料困難，又提高殺螺效果，為此我們把植物粉末作為殺螺微生物菌液的附形物，制造成粉末狀新型殺螺劑，不僅便于運(yùn)輸、包裝、耐貯存，也便于使用增效，現(xiàn)場試驗(yàn)顯示滅螺效果良好。
黃色桿菌作為殺螺劑的應(yīng)用，利用黃色桿菌的殺螺作用與植物附形劑制備成具有良好殺釘螺效果的黃色桿菌殺螺劑。
黃色桿菌殺螺劑1.材料與方法1.1自養(yǎng)黃色桿菌II(Xanthobacter autotrophicus II)蛋白牛肉胨搖瓶培養(yǎng)基，300ml三角瓶，裝入100-120ml培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)/分，28℃，通氣培養(yǎng)4-7d收獲，鏡檢5000萬菌以上/ml即可。
1.2殺螺植物粉末蝦鉗草(Alternanthera philoxeroides)夾竹桃(Nerium undicum)新鮮葉，莖表皮微波迅速干燥。分別研碎，粉末通過60～120目篩(顆粒0.20mm以下)均一粉末。50℃以內(nèi)真空干燥粉末含水量不得超過3％。夾竹桃葉粉末蝦鉗草粉末(W.W.W重量比)30∶70。
1.3黃色桿菌殺螺劑殺螺植物混合干粉末與黃色桿菌液1∶1攪拌混合，即1000ml菌液加1000g植物混合粉末，800-1500Hz超聲震蕩，充分?jǐn)嚢韬螅?0℃以下真空干燥12h，塑料封口包裝，貯藏或現(xiàn)場應(yīng)用。
2.結(jié)果2.1黃色桿菌殺螺劑室內(nèi)浸泡殺螺試驗(yàn)黃色桿菌殺螺劑5克粉末倒入1000ml去氯水中，每燒杯分裝100ml殺螺劑液，置入一袋陰性成螺，每袋裝30螺，室溫28℃.，浸泡24-72h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次取平均值，檢查比較結(jié)果如下

死螺檢驗(yàn)用水測法和敲擊法。
2.2現(xiàn)場試驗(yàn)及效果比較30g/m2黃色桿菌殺螺劑，均勻噴灑潮濕水線上密螺帶，或江灘密螺草灘處，單位面積內(nèi)查螺計(jì)數(shù)，并輔助人工投螺，滿足實(shí)驗(yàn)要求；試驗(yàn)時(shí)，當(dāng)?shù)貧鉁?6-24℃、微風(fēng)、天氣多為陰天、晴天、小雨，轉(zhuǎn)換頻繁；試驗(yàn)結(jié)果如下試驗(yàn)日期2004.4.5-7.2，當(dāng)?shù)貧鉁?2-34℃，土表pH7.5。

試驗(yàn)重復(fù)二次，水浸法測試螺死活。
2.3潮濕水浸土表較草叢旱地殺螺效果好粉末狀藥劑灑在潮濕土表或隔天灑水浸潤土表，可以增強(qiáng)藥效，增加殺螺效果，噴灑殺螺植物粉末和黃色桿菌殺螺劑后的土表釘螺，全部閉厴不活動(dòng)，停食，數(shù)天內(nèi)原位不移動(dòng)，但水浸檢測時(shí)，仍有活螺，可見生物殺螺劑首先作用是抑螺，隨著施藥后天數(shù)增加，有效成分溶化至環(huán)境地表，約3天后才多見殺螺效果顯現(xiàn)。
本發(fā)明殺螺劑具有制造原料充足、用量低，速殺藥效好，時(shí)效長特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種黃色桿菌，其特征在于所述的自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacter autrophicus)為自養(yǎng)黃色桿菌II(Xanthobacter autrophicus II)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號(hào)為AB204050，保藏日期為20030813。
2.一種黃色桿菌的生產(chǎn)方法，其特征在于其培養(yǎng)和發(fā)酵方法如下第一，菌種分離取頻病態(tài)釘螺洗潔消毒后研碎，8-12倍水稀釋后接種到蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基上，或?qū)难x和非血吸蟲病流行區(qū)采集的土壤用8-12倍水稀釋后接種到蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基上，26-30℃培養(yǎng)，避光，48-96小時(shí)后挑單株分離菌種；第二，菌種培養(yǎng)將挑單株分離菌種接種到蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基上作平板或斜面增菌培養(yǎng)，26-30℃培養(yǎng)，避光，48-96小時(shí)；第三，菌液搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)用消毒300ml三角瓶，裝120ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液，取0.5-1cm2平板或斜面增菌活化菌株，紗布棉塞封瓶口，搖瓶轉(zhuǎn)速120-180轉(zhuǎn)/分，26-28℃，72-96小時(shí)；得具有殺釘螺作用的黃色桿菌菌液；上述蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基是將蛋白棟6-10g、牛肉浸膏2-5g、瓊脂20g、加蒸餾水1000ml配制而成，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液是將蛋白胨12-18g、牛肉浸膏5.2-8.5g、磷酸氫二鉀1-2g、碳酸鈣3-6g、硫酸鎂1-2g、氯化鈉1-2g、硫酸銨2-4g、酵母粉6-12g、玉米粉45-72g、植物油2-4ml及水2000ml混合；上述蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面菌種分離培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液均用氫氧化鈉或碳酸氫鈉調(diào)pH7.2～7.4，120-131℃滅菌20-30min，冷卻后至室溫備用。
3.一種黃色桿菌作為殺螺劑的應(yīng)用。
4.一種黃色桿菌殺螺劑，其特征在所述殺螺劑由如權(quán)利要求2所述的黃色桿菌菌液與植物附形劑組成，菌液∶植物附形劑＝1000ml∶1000g。
5.如權(quán)利要求4所述的黃色桿菌殺螺劑，其特征在于所述的植物附形劑為具有殺釘螺作用植物的細(xì)屑粉末，粉末為60-120目。
6.如權(quán)利要求4所述的黃色桿菌殺螺劑，其特征在于所述的具有殺釘螺作用的植物附形劑為蝦鉗草植株和夾竹桃葉粉末的混合物，蝦鉗草粉末與夾竹桃葉粉末重量比為70∶30。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黃色桿菌及其殺螺劑。一種殺釘螺細(xì)菌，即自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacterautotrophicus)為自養(yǎng)黃色桿菌II(Xanthobacter autotrophicus II)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為AB204050，保藏日期為20030813。用蛋白牛肉胨瓊脂平板或斜面培養(yǎng)基分離菌株，搖瓶發(fā)酵方法獲得具有殺釘螺作用的黃色桿菌菌液(億級(jí)/ml)，該黃色桿菌用作殺螺劑的應(yīng)用，即用該菌液與植物材料附型劑經(jīng)超聲波處理混合配制成新型生物殺螺劑。該殺螺劑具有①迅速擊殺釘螺作用，有效防治釘螺上爬逃逸；②對(duì)非靶生物及魚類無毒害，自然降解迅速，無環(huán)境污染問題；③對(duì)人畜無毒副作用，維持滅螺藥效時(shí)間長(15天)；④保藏、運(yùn)輸、使用方便；⑤比已有生物類滅螺制劑及滅螺植物藥劑更具獨(dú)到迅殺顯效特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1597930SQ200410060738
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月18日
發(fā)明者楊建明 申請(qǐng)人:楊建明