幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒、檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學發(fā)光免疫檢測技術(shù)，尤其涉及一種幽門螺桿菌抗體化學發(fā)光免疫 檢測試劑盒、檢測方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 1982年，澳大利亞學者馬歇爾觀察到胃黏膜中有一種與慢性胃病發(fā)病有關(guān)的細 菌。1989年，Goodwin等人將其命名為幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，HP)，得到學術(shù)界 的承認。1994年，世界衛(wèi)生組織/國際癌癥研宄機構(gòu)（WH0/IARC)將幽門螺桿菌定為人類I 致癌原。幽門螺桿菌是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的細菌，長2. 5?4. 0ym、 寬0. 5?1. 0ym，在胃粘膜上皮細胞表面常呈典型的螺旋狀或弧形；在固體培養(yǎng)基上生長 時，除典型的形態(tài)外，有時可出現(xiàn)桿狀或圓球狀。幽門螺桿菌是微需氧菌，環(huán)境氧要求5? 8%，在大氣或絕對厭氧環(huán)境下不能生長。
[0003] 幽門螺桿菌是引起口臭的最直接病菌之一，由于幽門螺桿菌可以在牙菌斑中生 存，在口腔內(nèi)發(fā)生感染后，會直接產(chǎn)生有臭味的碳化物，引起口臭。幽門螺桿菌感染的患者 多會出現(xiàn)餐后噯氣、惡心、腹脹、腹部不適的胃腸疾病癥狀，而且這些癥狀隨時都會出現(xiàn)，但 是有些患者沒有明顯的癥狀，只有到醫(yī)院做相對的檢查才能發(fā)現(xiàn)。隨著病情的嚴重，會逐漸 破壞胃腸道壁，引發(fā)癌變的發(fā)生，感染幽門螺旋桿菌后，可能使患胃癌的危險增加2. 7至12 倍。而且，感染幽門螺桿菌患者一般都患有胃病，發(fā)生胃病的患者，多數(shù)與幽門螺桿菌有一 定的關(guān)系。幽門螺桿菌癥狀一般感染者在檢查中顯示陽性，一般不會有什么癥狀，病毒在患 者體內(nèi)長期的破壞、寄生、繁殖，隨著病情的發(fā)展，幽門螺桿菌會使菌群失調(diào)，引起其他一系 列的癥狀。
[0004] 我國是幽門螺旋桿菌感染高發(fā)國家之一，作為慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等主 要病因，治療消化性潰瘍、預(yù)防胃癌的一個可行措施就是預(yù)防并根除幽門螺旋桿菌感染。由 于早期胃癌患者大約80%沒有癥狀，少數(shù)患者即使有一些癥狀也是些非特異性表現(xiàn)，比如： 食欲不振、早飽、腹部不適等，極易被當作消化性潰瘍或其他胃腸道疾病而忽視。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中，已發(fā)展了涉及細菌學、病理學、血清學、同位素示蹤、分子生物學等多 種學科的多種檢測HP感染的方法，主要包括：細菌的直接檢查、尿素酶檢查/尿素呼氣試 驗、ELISA、CLIA等免疫學檢測及聚合酶鏈反應(yīng)等方法。
[0006] 細菌的直接檢查
[0007] 是指通過胃鏡檢查鉗取胃粘膜（多為胃竇粘膜）作直接涂片、染色，組織切片染色 及細菌培養(yǎng)來檢測幽門螺旋桿菌。其中胃粘膜細菌培養(yǎng)是診斷幽門螺旋桿菌最可靠的方 法，可作為驗證其他診斷性試驗的"金標準"，同時又能進行藥敏試驗，指導臨床選用藥物。 但這種方法取樣、檢查過程繁瑣，無法自動化。
[0008] 尿素酶檢查
[0009] 因為幽門螺旋桿菌是人胃內(nèi)唯一能夠產(chǎn)生大量尿素酶的細菌，故可通過檢測尿素 酶來診斷幽門螺旋桿菌感染。尿素酶分解胃內(nèi)尿素生成氨和二氧化碳，使尿素濃度降低、氨 濃度升高?；诖嗽硪寻l(fā)展了多種檢測方法：①胃活檢組織尿素酶試驗；②呼吸試驗；③ 胃液尿素或尿素氮測定；④15N-尿素試驗。這種方法簡單方便，但不利于自動化處理。
[0010] 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)
[0011] 正常胃粘膜很少檢出幽門螺旋桿菌（〇?6 % )，慢性胃炎患者幽門螺旋桿菌的檢 出率很高，約50%?80%，慢性活動性胃炎患者幽門螺旋桿菌檢出率則更高，達90%以上。 但這種方法分子診斷成本較高。
[0012] 唾液法測定幽門螺桿菌
[0013] 只需要收集4滴唾液即可檢測，沒有任何毒副作用。該方法適合各年齡段人群的 檢測，特別是老人、孕婦和兒童。針對口腔幽門螺桿菌的敏感性96%，特異性97-100%。若 配合胃部幽門螺桿菌檢測，行共同診斷和治療，可根除人體幽門螺桿菌。
[0014] 尿素呼氣試驗
[0015] 由于HP具有較強的內(nèi)源性尿素酶，能分解胃內(nèi)及核素標記的尿素，產(chǎn)生0)2和順3， C02被吸收后經(jīng)肺呼出，因此只需分析呼氣中的14C或13C即可診斷HP是否存在。
[0016] 尿素呼氣試驗的原理是HP在體內(nèi)產(chǎn)生尿素酶，用13C或14C標記的尿素由受試者 服下后，即分解產(chǎn)生帶同位素標記的二氧化碳，收集呼氣標本，用液體閃爍計數(shù)器或用氣體 核素質(zhì)譜儀檢測標記的二氧化碳，靈敏度極高，可定量，患者無創(chuàng)傷無痛苦，方法簡單快速， 對檢測HP是否根治十分可靠。敏感性95%，特異性95% -100%。
[0017] 免疫學檢測
[0018] 目前已有多種免疫學檢測方法，通過測定血清中的幽門螺旋桿菌抗體來檢測幽門 螺旋桿菌感染，包括補體結(jié)合試驗、凝集試驗、被動血凝測定、免疫印跡技術(shù)和酶聯(lián)合吸附 測定（ELISA)等。這種方法試劑成本低、操作簡單，但靈敏度低，只適用于定性和半定量診 斷。
[0019] 目前市面上有索林公司提供糞便樣本中的幽門螺旋桿菌抗原檢驗，和其他多為測 定血清IgG，IgA抗體的試劑盒。血清抗體可反映機體對幽門螺旋桿菌的免疫應(yīng)答能力，檢 測抗體十分必要。但是，由于幽門螺旋桿菌感染后數(shù)周血中才會出現(xiàn)特異抗體，且細菌根除 后血中抗體可維持6個月以上。因此幽門螺旋桿菌不能肯定患者有活動性感染，陰性不能 排除初期的感染，故該項檢查只能用于流行病學的篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是，提供一種幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒，該試劑盒可 檢測幽門螺桿菌IgG抗體、幽門螺桿菌IgM、幽門螺桿菌IgA及幽門螺桿菌總抗體多種抗體， 更好地適用幽門螺桿菌感染者的復雜情況。
[0021 ] 本發(fā)明進一步所解決的技術(shù)問題是，提供一種幽門螺桿菌抗體化學發(fā)光免疫檢測 方法，該方法可在無需對樣本進行預(yù)稀釋的情況下，準確地檢測出幽門螺桿菌抗體，大大提 高檢測靈敏度和檢測結(jié)果準確性、簡化檢測流程、加快檢測速度。
[0022] 本發(fā)明進一步所解決的技術(shù)問題是，提供一種幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒在化學 發(fā)光免疫分析儀中的應(yīng)用，該應(yīng)用可在無需對樣本進行預(yù)稀釋的情況下，準確地檢測出幽 門螺桿菌抗體，大大提高檢測靈敏度和檢測結(jié)果準確性、簡化檢測流程、加快檢測速度且作 規(guī)范，避免人為引入誤差，可實現(xiàn)自動化檢測。
[0023] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了以下方案：
[0024] 一種幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒，包括有封裝于盒體內(nèi)的檢測試劑盒，包括如下 組分：
[0025] 直接包被或間接連接幽門螺桿菌抗原的磁性微球溶液；和
[0026] 直接包被或間接連接抗人IgG抗體的標記示蹤物溶液；和/或
[0027] 直接包被或間接連接抗人IgM抗體的標記示蹤物溶液；和/或
[0028] 直接包被或間接連接抗人IgA抗體的標記示蹤物溶液；和/或
[0029] 直接包被或間接連接金黃色葡萄球菌A蛋白的標記示蹤物溶液。
[0030] 優(yōu)選地，所述直接包被或間接連接幽門螺桿菌抗原的磁性微球溶液為：
[0031] 包被有幽門螺桿菌抗原的磁性微球溶液；或為：
[0032] 包被有抗異硫氰酸熒光素抗體的磁性微球溶液，標記幽門螺桿菌抗原的異硫氰酸 熒光素溶液；或為：
[0033] 包被有鏈霉親和素的磁性微球溶液，生物素標記的幽門螺桿菌抗原溶液。
[0034] 優(yōu)選地，所述直接包被或間接連接抗人IgG抗體的標記示蹤物溶液為：
[0035] 包被有抗人IgG抗體的標記示蹤物溶液；或為：
[0036] 包被有抗異硫氰酸熒光素抗體的標記示蹤物溶液，標記抗人IgG抗體的異硫氰酸 熒光素溶液；或為：
[0037] 包被有鏈霉親和素的標記示蹤物溶液，生物素標記的抗人IgG抗體溶液。
[0038] 優(yōu)選地，所述直接包被或間接連接抗人IgM抗體的標記示蹤物溶液為：
[0039] 包被有抗人IgM抗體的標記示蹤物溶液；或為：
[0040] 包被有抗異硫氰酸熒光素抗體的標記示蹤物溶液，標記抗人IgM抗體的異硫氰酸 熒光素溶液；或為：
[0041] 包被有鏈霉親和素的標記示蹤物溶液，生物素標記的抗人IgM抗體溶液。
[0042] 優(yōu)選地，所述直接包被或間接連接抗人IgA抗體的標記示蹤物溶液為：
[0043] 包被有抗人IgA抗體的標記示蹤物溶液；或為：
[0044] 包被有抗異硫氰酸熒光素抗體的標記示蹤物溶液，標記抗人IgA抗體的異硫氰酸 熒光素溶液；或為：
[0045] 包被有鏈霉親和素的標記示蹤物溶液，生物素標記的抗人IgA抗體溶液。
[0046] 優(yōu)選地，所述直接包被或間接連接金黃色葡萄球菌A蛋白的標記示蹤物溶液為：
[0047] 包被有金黃色葡萄球菌A蛋白的標記示蹤物溶液；或為：
[0048] 包被有抗異硫氰酸熒光素抗體的標記示蹤物溶液，標記金黃色葡萄球菌A蛋白的 異硫氰酸熒光素溶液；或為：
[0049] 包被有鏈霉親和素的標記示蹤物溶液，生物素標記的金黃色葡萄球菌A蛋白溶 液。優(yōu)選地，所述幽門螺桿菌抗原和磁性微球之間與各抗人抗體/金黃色葡萄球菌A蛋白 和標記示蹤物之間不采用相同的化合物間接連接。
[0050] 優(yōu)選地，所述標記示蹤物包括有發(fā)光標記物，所述發(fā)光標記物為金鋼烷、異魯米諾 及其衍生物、魯米諾及其衍生物和吖啶酯中的任意一種。
[0051] 優(yōu)選地，所述標記示蹤物還包括有化學發(fā)光催化劑，所述化學發(fā)光催化劑為堿性 磷酸酶或過氧化物酶。相應(yīng)地，本發(fā)明還公開了一種幽門螺桿菌抗體檢測方法，包括以下步 驟：
[0052] 反應(yīng)步驟：將待測樣本與直接包被或間接連接幽門螺桿菌抗原的磁性微球溶液混 勻后，25-40°C溫育5-20分鐘后，加入直接包被或間接連接抗人IgA抗體/抗人IgG抗體/ 抗人IgM抗體/金黃色葡萄球菌A蛋白的標記示蹤物，25-40°C溫育5-20分鐘后，清洗，得 到反應(yīng)產(chǎn)物；
[0053] 檢測步驟：外加磁場將所述反應(yīng)產(chǎn)物沉淀，去除上清液，清洗后，加入化學發(fā)光激 發(fā)物，檢測發(fā)出的相對光強度，通過計算得到待測樣本中的幽門螺桿菌IgA/IgG/IgM/總抗 體濃度。
[0054] 相應(yīng)地，本發(fā)明還公開了上述幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒在化學發(fā)光免疫分析儀 上的應(yīng)用。
[0055] 本發(fā)明的有益效果是：
[0056] 本發(fā)明的實施例通過直接對樣本中的抗體進行檢測，并提供可選擇地檢測多種抗 體的方案，從而實現(xiàn)了在無需對樣本進行預(yù)稀釋的情況下，準確地檢測出幽門螺桿菌抗體， 大大了提高檢測靈敏度和檢測結(jié)果準確性、簡化了檢測流程、加快了檢測速度。
【具體實施方式】
[0057] 下面詳細描述本發(fā)明提供的幽門螺桿菌檢測試劑盒的第一實施例，本實施例用于 測定H.pyloriIgG，主要包括以下組分：
[0058] 包被有HP抗原的磁性微球溶液
[0059] HP抗原濃度：10-200yg/1 磁性微球濃度：〇?l_5mg/ml
[0060] 標記抗人IgG抗體的標記示蹤物溶液
[0061] 抗人IgG抗體濃度：10-200 y g/1 標記示蹤物濃度：〇?1-lmg/l
[0062] 含HPIgG的低點校準品，其中HPIgG濃度：5_20EIU
[0063] 含HPIgG的高點校準品，其中HPIgG濃度：40_80EIU。
[0064] 下面詳細描述本發(fā)明提供的幽門螺桿菌