專利名稱：基于氧消耗速率的維生素b12發(fā)酵生產(chǎn)控制工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地涉及一種優(yōu)化的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素 B12方法以及相關(guān)的操作控制工藝。
背景技術(shù)：
維生素B12是一種結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的分子，根據(jù)與其中心鈷離子結(jié)合配基基團(tuán)的不 同可形成羥鈷胺素、甲基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和氰鈷胺素[1]。
維生素B12的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖5所示。
維生素B12是一種生物催化活性物質(zhì)，是哺乳動物不可缺少的維生素，能夠預(yù)防和治療惡性貧血癥，維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的健康，促進(jìn)碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝[2]O
現(xiàn)在國內(nèi)和國外商品化的維生素B12幾乎都是通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)的。能夠 合成維生素B12的微生物根據(jù)其耗氧情況分為兩類(1)厭氧菌或間性厭氧菌如費(fèi)氏丙 酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)[3]> 謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii) [4]和鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium)等。(2)好氧菌比如脫氮假單胞桿 菌(Pseudomonas denitrificans)[5]，鈷胺素根瘤菌[6] (Rhizobium cobalaminogenum FERM BP-4429)等。
供氧對微生物的生長和產(chǎn)物形成有著重要的影響。對于耗氧微生物發(fā)酵過程 中，必須供給適量的無菌空氣，菌體才能繁殖和積累所需代謝產(chǎn)物。不同菌種及不同 發(fā)酵階段的菌體的需氧量是不同的，發(fā)酵液的供氧能力的大小直接影響微生物的酶的活 性、代謝途徑及產(chǎn)物產(chǎn)量。因此研究供氧大小對發(fā)酵的影響及控制對提高生產(chǎn)效率，改 善產(chǎn)品質(zhì)量等都有重要意義。一般的耗氧發(fā)酵過程均控制較高的供氧以避免氧限制的發(fā) 生，在這種情況下可以以溶解氧濃度(Dissolved Oxygen，簡稱DO)來表征供氧水平[7]， 通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量可以有效的控制DO，但對于某些特殊的高耗氧菌種來說， 溶氧可能不能成為有效的控制指標(biāo)，這就需要尋找另外的能有效表征供氧水平的參數(shù)。
目前，維生素B12需求量較大，因此優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高維生素B12的生產(chǎn)水 平成為當(dāng)務(wù)之急。本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高效的生產(chǎn)維生素B12的方法，不僅要提高維 生素B12的產(chǎn)量，而且盡可能的節(jié)約能耗、降低成本，提高生產(chǎn)效率，以滿足市場的需 求。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效的生產(chǎn)維生素B12的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種生產(chǎn)維生素B12的發(fā)酵方法，它包括步驟
(a)在適合發(fā)酵的條件下，培養(yǎng)維生素B12的生產(chǎn)菌株，并且在發(fā)酵過程前期維 持發(fā)酵體系的高水平的氧消耗速率，從而促進(jìn)菌體生長和維生素B12合成的啟動，其中 所述的發(fā)酵過程前期是指從發(fā)酵開始起至菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期；4
(b)在發(fā)酵過程的中后期降低并維持發(fā)酵體系的低水平的氧消耗速度，從而維持 高水平的維生素B12的產(chǎn)物合成速率，從而產(chǎn)生維生素B12，其中所述的發(fā)酵過程中后期 是指從發(fā)酵過程前期結(jié)束起至發(fā)酵結(jié)束；和
(c)從發(fā)酵液中分離純化出維生素B12。
在另一優(yōu)選例中，一旦菌體的生長進(jìn)入生長穩(wěn)定期，就可視為發(fā)酵過程前期結(jié)束ο
在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，氧消耗速度的降低是間歇式降低、連續(xù)下降 或逐步降低。
在另一優(yōu)選例中，在步驟ω中高水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率為 35-45mmol · L1 · h1。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中低水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率為 12-25mmol · L1 · 1Γ1，更佳地 15_20mmol · L1 · h—1 范圍。
在另一優(yōu)選例中，所述的氧消耗速率按以下公式計(jì)算
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)維生素B12的發(fā)酵方法，其特征在于，它包括步驟(a)在適合發(fā)酵的條件下，培養(yǎng)維生素B12的生產(chǎn)菌株，并且在發(fā)酵過程前期維持發(fā) 酵體系的高水平的氧消耗速率，從而促進(jìn)菌體生長和維生素B12合成的啟動，其中所述 的發(fā)酵過程前期是指從發(fā)酵開始起至菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期；(b)在發(fā)酵過程的中后期降低并維持發(fā)酵體系的低水平的氧消耗速度，從而維持高水 平的維生素B12的產(chǎn)物合成速率，從而產(chǎn)生維生素B12，其中所述的發(fā)酵過程中后期是指 從發(fā)酵過程前期結(jié)束起至發(fā)酵結(jié)束；和(C)從發(fā)酵液中分離純化出維生素B12。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，氧消耗速度的降低是間歇 式降低、連續(xù)下降或逐步降低。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中高水平的氧消耗速率是控制 氧消耗速率為35-45mmol · L1 · h1 ；和/或在步驟(b)中低水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率為12-25mm0l · L1 · h—1。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的氧消耗速率按以下公式計(jì)算
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高水平的維生素B12的產(chǎn)物合成速 率是2l.5mg · L1 · IT1。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵體系的體積為5L至200立方 米，較佳地為50L至150立方米。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的工程菌是費(fèi)氏丙酸桿菌 (Propionibacterium freudenreichii) > Hi 氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii) > 鼠傷寒 沙門氏菌(Salmonella typhimurium) > 脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)或鈷胺 素根瘤菌。
8.—種維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，在發(fā)酵過程中，當(dāng)生產(chǎn)維生 素B12的工程菌菌體生長進(jìn)入生長穩(wěn)定期時(shí)或之后，控制發(fā)酵體系的氧消耗速率， 使得氧消耗速率小于或等于25mmol · L1 · IT1 (較佳地，12_25mmol · L1 · IT1， 更佳地15-20mmol · L1 · IT1范圍)，從而維持維生素B12的生產(chǎn)速率大于或等于 1.5mg · L1 · IT1。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的工程菌是費(fèi)氏丙酸桿菌 (Propionibacterium freudenreichii) > Hi 氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii) > 鼠傷寒 沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)或鈷胺素根瘤菌。
10. —種提高維生素B12生產(chǎn)速率和/或降低糖消耗的方法，所述方法包括步驟在 維生素B12的生產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)生維生素B12的期間，控制發(fā)酵體系的氧消耗速率，使得 氧消耗速率小于或等于25mmol · L1 · IT1 (較佳地，12_25mmol · L1 · 1Γ1，更佳地 15-20mmol · L1 · h—1 范圍)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于氧消耗速率的維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)控制工藝。具體地，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)維生素B12的發(fā)酵方法，包括步驟(a)在發(fā)酵過程前期維持發(fā)酵體系的高水平的氧消耗速率，從而促進(jìn)菌體生長和維生素B12合成的啟動；(b)在發(fā)酵過程的中后期降低并維持發(fā)酵體系的低水平的氧消耗速度；和(c)從發(fā)酵液中分離純化出維生素B12。本發(fā)明方法可明顯提高維生素B12產(chǎn)率，降低底物消耗，同時(shí)降低單位能耗，可大幅降低生產(chǎn)成本，具有工藝控制簡單、可操作性強(qiáng)、節(jié)約能源等特點(diǎn)。
文檔編號C12R1/41GK102021214SQ20091019603
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日
發(fā)明者儲炬, 莊英萍, 張嗣良, 王慧媛, 王澤建 申請人:華東理工大學(xué)