專利名稱：食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及貝類、蔬 果和水等食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，由于食用受病毒污染食品而引起的疾病爆發(fā)在全世界范圍內(nèi)多見(jiàn)報(bào) 道，其中源于腸道病毒而引發(fā)的疾病占到了 67%以上。
作為一種典型的致病性腸道病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒野生株雖然已在全世界基本 消滅，但由于脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的廣泛使用，其突變株在近幾年引發(fā)了多起病毒爆發(fā) 事件。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2008年疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒感染病例升至80例，野生 型病毒感染病例近1800例。為了加強(qiáng)脊髓灰質(zhì)炎病毒的監(jiān)控，防止“病從口入”至關(guān)重要。
脊髓灰質(zhì)炎病毒可在污水及食品中存活，而貝類是主要的病毒攜帶體。因此， 對(duì)貝類食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。
脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus，PV)是一種屬于小RNA病毒科的腸道病毒，可引起小兒麻痹癥。近幾年很多國(guó)家在貝類及水體等食品中發(fā)現(xiàn)了脊髓灰質(zhì)炎病毒野生型 或疫苗突變株的存在。為了防止脊髓灰質(zhì)炎病毒通過(guò)糞-口途徑傳播，加強(qiáng)即食性食品 中脊髓灰質(zhì)炎病毒的監(jiān)控至關(guān)重要。由于脊髓灰質(zhì)炎病毒主要在人類排泄物和污水中存 活，即食性水果和蔬菜等在施肥和灌溉中可能受含脊髓灰質(zhì)炎病毒糞便和水的污染。
然而，目前在食品中脊髓灰質(zhì)炎檢測(cè)存在諸多難點(diǎn)。與人類排泄物相比，食品 中病毒含量低得多，干擾因子和抑制因子更加復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)方法帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)，因此 需要針對(duì)性和靈敏度更高的檢測(cè)方法。近十多年來(lái)，各國(guó)研究者建立的如巢式RT-PCR、 普通RT-PCR、ELISA等技術(shù)多應(yīng)用于糞便或污水等樣品的檢驗(yàn)，而對(duì)食品基質(zhì)中脊髓灰 質(zhì)炎病毒檢測(cè)的報(bào)道較少。目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)方法的報(bào)道。
目前我國(guó)對(duì)進(jìn)出口食品只進(jìn)行常規(guī)的細(xì)菌檢測(cè)，還沒(méi)有相應(yīng)方法對(duì)進(jìn)出口食品 脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)行檢測(cè)。也就是說(shuō)，進(jìn)出口食品脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測(cè)仍處于空白狀 態(tài)，這嚴(yán)重地制約著我國(guó)食品進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展，威脅著人民的身體健康。然而，目前 尚沒(méi)有快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)和鑒定脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)技術(shù)。
綜上所述，鑒于目前尚沒(méi)有特異性好、靈敏度高的食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí) 熒光RT-PCR檢測(cè)方法。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)特異性好、靈敏度高的食品中脊髓 灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的貝類、蔬果和水等食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供貝類、蔬果和水等食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的再一目的在于提供貝類、蔬果和水等食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測(cè)相關(guān) 引物和探針。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，它包括步驟在聚合 酶反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異 性引物對(duì)和脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有脊髓灰質(zhì) 炎病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組2A區(qū)的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性引物對(duì)選自下組
I型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2 ；和/或
II型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4 ；和/或
III 型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ ID NO: 5 禾Π SEQ ID NO 6。
在另一優(yōu)選例中，所述的脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針是Taqman-MGB探針或 Taqman 探針。
在另一優(yōu)選例中，所述的脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針具有選自下組的核苷酸序 列SEQIDNO 7、8 禾口 / 或 9。
在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中或之后，檢 測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)體系中含有來(lái)自食品的待檢測(cè)的核酸樣品。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)試劑盒，它含有以下試劑
(a)擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性引物對(duì)，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有 脊髓灰質(zhì)炎病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組2A區(qū)；
(b)脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針。
在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性引物對(duì)選自下組
I型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2 ；和/或
II型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4 ；和/或
III 型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQIDNO: 5 禾Π SEQ ID NO 6。
在另一優(yōu)選例中，所述的脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針是Taqman-MGB探針或 Taqman 探針。
在另一優(yōu)選例中，所述的脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針具有選自下組的核苷酸序 列SEQIDNO 7、8 禾口 / 或 9。
在另一優(yōu)選例中，提供了一種用于檢測(cè)食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)試劑盒， 其含有
(a)針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒三種血清型(I、II、III型)設(shè)計(jì)的三對(duì)POL特異性引 物，所述的POL特異性引物對(duì)特異性地?cái)U(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒三種血清型基因組2A區(qū)的一 段序列；
(b)Taqman-MGB探針，所述的T^aqman-MGB探針與對(duì)應(yīng)的POL特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合；
(c)任選的標(biāo)準(zhǔn)參照物；
在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)準(zhǔn)參照物是脊髓灰質(zhì)炎病毒CDNA或含脊髓灰質(zhì)炎 病毒擴(kuò)增目的片段的質(zhì)粒DNA ；
在另一優(yōu)選例中，所述的POL特異性引物選自下組
權(quán)利要求
1.一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于，它包括步驟在聚合酶反應(yīng)體系中進(jìn)行 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性引物對(duì)和脊髓灰 質(zhì)炎病毒特異性探針，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有脊髓灰質(zhì)炎病毒脊髓灰質(zhì)炎 病毒基因組2A區(qū)的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性引物 對(duì)包括I型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；和/或II型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4 ；和/或III型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ ID NO: 5禾Π SEQ ID NO 6。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針是 Taqman-MGB 探針或 Taqman 探針。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述的脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探 針具有選自下組的核苷酸序列SEQ ID NO: 7、8和/或9。
5.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟在聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中或之后，檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
6.—種檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它含有以下試劑(a)擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性引物對(duì)，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有脊髓 灰質(zhì)炎病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組2A區(qū)；和(b)脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性引 物對(duì)選自下組I型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2 ；和/或II型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4 ；和/或III型脊髓灰質(zhì)炎病毒SEQ ID NO: 5禾Π SEQ ID NO 6。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針是 Taqman-MGB 探針或 Taqman 探針。
9.如權(quán)利要求6-8中任一所述的試劑盒，其特征在于，所述的脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性 探針具有選自下組的核苷酸序列SEQ ID NO: 7、8和/或9。
10.如權(quán)利要求6所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于檢測(cè)在食品中是否存在脊 髓灰質(zhì)炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法和試劑盒。具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒的方法，在聚合酶反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性引物對(duì)和脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性探針。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明可靈敏、簡(jiǎn)便地檢測(cè)和鑒定脊髓灰質(zhì)炎病毒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102021248SQ20091019539
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日
發(fā)明者盧鐘山, 呂蓉, 張舒亞, 李想, 潘良文, 黃一 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心