專(zhuān)利名稱：一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法及其專(zhuān)用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法及其專(zhuān)用菌株。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年首先從牛眼玻璃體中分離出的一種高粘性物質(zhì)(Meyer K.，Palmer J.W.The polysaccharideof the vitreous humor.J.biol.chem，1934，107629-634)。此后，人們又對(duì)HA的分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)、生理功能和臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，特別是Balazs于1960年首次將HA用于復(fù)雜的視網(wǎng)膜脫離手術(shù)，并取得了理想的療效之后，有關(guān)HA在醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域的研究又取得了一系列重大的進(jìn)展。HA作為一種生化藥物，不僅在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用廣泛，在日化工業(yè)，由于HA具有良好的保濕作用，又是皮膚和其它組織中廣泛存在的天然生物分子，從20世紀(jì)80年代開(kāi)始用于化妝品中，被譽(yù)為理想的天然保濕因子(凌沛學(xué)，賀艷麗，郭學(xué)平。透明質(zhì)酸。中國(guó)輕工業(yè)出版社，2000)，因而其在化妝品工業(yè)中也有廣闊的應(yīng)用前景。
HA最初的生產(chǎn)方法是從動(dòng)物組織(主要是雞冠、牛眼)中提取。這種動(dòng)物組織提取法成本高、HA含量低(一般1kg新鮮雞冠僅可以提取到4gHA)，且分離純化復(fù)雜，提取的HA的分子量也比較小。1937年，Kendall等發(fā)現(xiàn)溶血性鏈球菌streptococcushaemolyticus可以合成透明質(zhì)酸并分泌到胞外形成莢膜(Kendall F.E.Heidelberger M.Dawson M.H.A serologically inactive polysaccharide elaborated by mucoid strain ofgroup A hemolytic Streptococcus.J.Biol.Chem.1937，118(1)61-69)；其后，又陸續(xù)報(bào)道了能合成HA的微生物菌種。由于許多鏈球菌都可以合成以HA多糖為唯一成分的莢膜，使得鏈球菌(特別是對(duì)人體危害較小的C型)成為研究最多的HA生產(chǎn)菌，已報(bào)道的能作為HA生產(chǎn)菌的鏈球菌有溶血性鏈球菌(A型)，獸疫鏈球菌(C型)，馬鏈球菌(C型)，糞馬鏈球菌(C型)，缺乳鏈球菌(C型)以及雞霍亂桿菌(C型)等；其中A型為人體致病菌，C型則只能感染畜類(lèi)。1983年，首次報(bào)道了日本的資生堂用鏈球菌生產(chǎn)HA(赤坂日出道，駒崎久幸，柳光男，株式會(huì)社資生堂。アルロン酸の制造方法。日本公開(kāi)特許公報(bào)，昭58-56692，1983)，隨后，英美等國(guó)相繼報(bào)道了采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA的方法，大大拓寬了HA的來(lái)源，推動(dòng)了HA的研究和應(yīng)用。微生物發(fā)酵生產(chǎn)HA的實(shí)現(xiàn)是HA生產(chǎn)領(lǐng)域在近年來(lái)取得的最重大的進(jìn)展。鏈球菌屬于蒹性厭氧菌，在有氧和無(wú)氧條件下都可以生長(zhǎng)。而從代謝調(diào)控的角度來(lái)說(shuō)，有氧發(fā)酵有利于HA的合成(Goh，L.T.Fermentation studies of hyaluronic acidfermentat ion by Streptococcus zooepidemicus.In Chemical Engineering；BrisbaneUniversity of Queensland，1998)。但是在發(fā)酵過(guò)程中由于產(chǎn)生的透明質(zhì)酸包裹在菌體周?chē)?，增加了發(fā)酵液粘稠度，降低溶氧，限制了菌的生長(zhǎng)和透明質(zhì)酸的產(chǎn)量，成為了限制透明質(zhì)酸發(fā)酵工業(yè)的一個(gè)重要因素。
透明顫菌(Vitreoscilla sp.)是一種專(zhuān)性好氧的革蘭氏陰性菌，在低氧環(huán)境中誘導(dǎo)合成透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)，其編碼基因?yàn)橥该黝澗t蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene，vgb，序列見(jiàn)序列表中的序列1)，這種血紅蛋白能在極低的溶氧量(＜5％)下被大量誘導(dǎo)合成，使透明顫菌在貧氧環(huán)境中(如泥塘腐地)很好地生存(Fish P A，Webster D A，Stark B C.Vitreoscillahemoglobin enhances the first step in 2，4-dinitroluene degradation in vitroand at low aeration in vivo，Journal of Molecular Catalysis BEnzymatic，2000，975-82)。VHb是以氧合態(tài)參與和氧有關(guān)的代謝，通過(guò)將氧傳遞給呼吸鏈，而調(diào)節(jié)末端氧化酶的活性，改變氧化磷酸化的效率，進(jìn)而改變低氧條件下的代謝途徑，以至影響到某些基因的表達(dá)。它能夠從分子水平上提高重組菌對(duì)氧氣的利用能力(Jacobsen J R，Khosla C.New directions in metabolic engineering.CurrentOpinion in Chemical Biology 1998，2133-137)。一些文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了vgb基因的應(yīng)用實(shí)例，表明它具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)密度和外源基因表達(dá)的作用。如vgb基因在金色鏈霉菌中的表達(dá)可將產(chǎn)物鏈霉素的合成提高40％～60％(孟春，葉勤，石賢愛(ài)，邱荔，宋思揚(yáng)，郭養(yǎng)浩。透明顫菌血紅蛋白基因在金色鏈霉菌中的克隆與表達(dá)。微生物學(xué)報(bào)，2002，42(3)305-310)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法及其專(zhuān)用菌株。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的專(zhuān)用菌株為含有vgb基因的重組鏈球菌。
所述鏈球菌為溶血性鏈球菌、獸疫鏈球菌、馬鏈球菌、糞馬鏈球菌、缺乳鏈球菌和雞霍亂桿菌中的任意一種。
所述鏈球菌優(yōu)選為A型溶血性鏈球菌、C型獸疫鏈球菌、C型馬鏈球菌、C型糞馬鏈球菌、C型缺乳鏈球菌和C型雞霍亂桿菌中的任意一種。
所述鏈球菌更優(yōu)選為獸疫鏈球菌ATCC 39920。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，是構(gòu)建含有vgb基因序列的質(zhì)粒表達(dá)載體，將構(gòu)建的載體導(dǎo)入鏈球菌中，獲得重組鏈球菌，發(fā)酵重組鏈球菌得到透明質(zhì)酸。
所構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體為將vgb基因插入到載體pEU308(Eichenbaum Z.，F(xiàn)ederleM.J.1998.Use of the lactococcal nisA promoter to regulate gene expressionin Gram-positive bacteriacomparison of induction level and promoter strength.Appl.Environ.Microbiol.642763-2769)的多克隆位點(diǎn)獲得的pEUVGB。
為提高轉(zhuǎn)化效率，將重組質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入鏈球菌中的方法優(yōu)選為電轉(zhuǎn)化法，但也可以采用其它生物工程領(lǐng)域中常用的方法，例如熱激法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法等。
目前在發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的中后期，隨著透明質(zhì)酸的生成，發(fā)酵液粘稠度增加，溶氧降低，限制了菌體的生長(zhǎng)。本發(fā)明巧妙地將vgb基因?qū)腈溓蚓?，通過(guò)在鏈球菌中表達(dá)vgb基因，可顯著提高菌體對(duì)氧的利用率，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，使透明質(zhì)酸的產(chǎn)量提高了約20％。將本發(fā)明應(yīng)用到發(fā)酵工業(yè)中，可以解決高密度發(fā)酵中氧氣的供求矛盾，提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。
圖2不同菌體搖瓶實(shí)驗(yàn)的透明質(zhì)酸含量檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、構(gòu)建含有vgb基因的質(zhì)粒pEUVGB菌種大腸桿菌E.coli JM109用于構(gòu)建質(zhì)粒的培養(yǎng)基為(g/l)蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10，壯觀霉素100mg/l。
構(gòu)建含有vgb基因的質(zhì)粒pEUVGB的過(guò)程如圖1所示1)在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以pBR322-vgb質(zhì)粒(Yu H M，Shi Y，ZhangY P，Yang S L，Shen Z Y.Effect of Vitreoscilla hemoglobin biosynthesis inEscherichia coli on production of poly(β-hydroxybutyrate)and fermentativeparameters.FEMS Microbiol.Lett.，2002，214223-227)為模板，以Pvgb-upGCGAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGTATGGCAAAACCATAAT和Pvgb-doATTAGATCT(BglII)CTTTATTCAACCGCTTGAGC為引物得到485bp的DNA擴(kuò)增片段，其基因序列為基因序列表中的SEQ ID NO1。
PCR反應(yīng)條件95℃變性1min，57℃褪火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)。
2)將上述包含有vgb基因的DNA擴(kuò)增片段，用限制性內(nèi)切酶HindIII，ClaI酶切處理后，插入到質(zhì)粒pEU308的HindIII，BglII位點(diǎn)之間，得到質(zhì)粒pEUVGB。
實(shí)施例2、獸疫鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞的制備以及電轉(zhuǎn)化方法菌種獸疫鏈球菌ATCC 39920轉(zhuǎn)化中所用培養(yǎng)基為T(mén)HYB(g/l)todd-hewitt broth 36.4，酵母浸出物0.5％(w/v)，壯觀霉素100mg/l。
1) 感受態(tài)細(xì)胞的制備I) 將獸疫鏈球菌在THYB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；II)將其接種到50ml新鮮的THYB培養(yǎng)基中，接種后D530不超過(guò)0.05，培養(yǎng)到OD530約0.25左右即可；III)在培養(yǎng)結(jié)束前半小時(shí)加入透明質(zhì)酸酶0.4mg/ml；IV)4℃，8000g，離心10分鐘，棄上清，用20mL 0.5M蔗糖溶液重懸細(xì)胞；V) 4℃，8000g，離心10分鐘，棄上清，用1mL 0.5M蔗糖溶液重懸細(xì)胞，再離心，棄上清；VI)將細(xì)胞重懸在250uL含有10％甘油的0.5M蔗糖溶液中，按使用體積分裝到eppendorf管中；VII) 迅速置于-80℃保存。
2)獸疫鏈球菌的電轉(zhuǎn)化I) 在200uL感受態(tài)細(xì)胞中加入8uLDNA，冰浴10分鐘；II)將混合體系轉(zhuǎn)移到2mm電激杯中電激，電壓設(shè)為2.5kv；III)用1mL冰冷的THYB將混合體系轉(zhuǎn)移到10mlTHYB中，冰浴30-60分鐘；IV) 37℃靜置培養(yǎng)1小時(shí)；V) 4℃，6000g，離心10分鐘，菌體用1mlTHYB重懸并涂于抗性平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，得到重組獸疫鏈球菌。
實(shí)施例3，重組獸疫鏈球菌的發(fā)酵以及HA的檢測(cè)菌種重組獸疫鏈球菌外源基因vgb基因培養(yǎng)基成分1)種子培養(yǎng)基蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏10g/l，MgSO4·7H2O2g/l，MnSO4·4H2O0.1g/l，KH2PO42g/l，微量元素液1ml/l，緩沖液40ml/l；其中微量元素液含CaCl22g/l，MnSO4·4H2O24mg/l，ZnCl246mg/l，CuSO4·5H2O19mg/l。
緩沖液含Na2HPO4·12H2O36.76g/l，NaH2PO4·12H2O15.98g/l，NaHCO312.5g/l。
2)發(fā)酵培養(yǎng)基酵母粉20g/l，Na2HPO4·12H2O6.2g/l，MgSO4·7H2O2g/l，K2SO41.3g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O5mg/l，微量元素液2.5ml/l，蔗糖40g/l，壯觀霉素100mg/l(重組菌發(fā)酵時(shí)加入)。
1)培養(yǎng)方法用接種環(huán)挑取平板上的菌種接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于200rpm的搖床上培養(yǎng)14-16小時(shí)，培養(yǎng)溫度設(shè)為37℃。然后按10％的接種量將種子培養(yǎng)液接入盛有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中培養(yǎng)14小時(shí)，培養(yǎng)溫度設(shè)為37℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。重組菌以100mg/l的濃度加入壯觀霉素。
2)透明質(zhì)酸含量測(cè)定方法采用bitter-muir氏法(Bitter T.，Muri H.M.A modified uronic acid carbazolreaction.Anal.Biochem.1962，4330-334)，將5ml0.025M十水合四硼酸鈉的濃硫酸溶液加入具塞試管，冷卻到-20℃；小心加入0.5ml的樣品或標(biāo)準(zhǔn)樣，試管用磨砂玻璃塞密封，搖動(dòng)試管。在劇烈沸騰的沸水浴中加熱10分鐘，然后冷卻到室溫，加入0.2ml咔唑試劑(0.125％咔唑溶于無(wú)水乙醇中)，再次搖動(dòng)試管，在沸水浴中再加熱15分鐘，冷卻到室溫，在530nm下，用1cm比色皿測(cè)量光密度值，OD530值對(duì)硫酸空白的應(yīng)小于0.025。其中標(biāo)準(zhǔn)樣為葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液4-40ug/ml，用儲(chǔ)備的苯甲酸飽和去離子水制備，4℃下能夠穩(wěn)定存放6個(gè)月。發(fā)酵液的測(cè)量樣品制備方法如下a)取1ml發(fā)酵液準(zhǔn)確稀釋到4ml，6000轉(zhuǎn)離心10分鐘；b)取1ml上清加入到4ml無(wú)水乙醇中，振蕩，6000轉(zhuǎn)離心5分鐘；c)棄去上清，加入2ml0.2MNaCl，放置，間或振蕩，直至最終溶解；d)加入4ml無(wú)水乙醇，振蕩，6000轉(zhuǎn)離心5分鐘；e)棄去上清，沉淀用2ml去離子水溶解作為HA測(cè)定的樣品。
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果從圖2可以看出(1-S.Z.獸疫鏈球菌，2-轉(zhuǎn)入空載體pEU308的獸疫鏈球菌，3-轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pEUVGB的重組菌)，帶有vgb基因的重組菌的透明質(zhì)酸產(chǎn)量高于原始菌。在本發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，重組菌的透明質(zhì)酸產(chǎn)量相對(duì)于原始菌提高了約20％。
序列表<210>1<211>485<212>DNA<213>透明顫菌(Vitreoscilla)<400>1atgtatggca aaaccataat aatgaactta aggaagaccc tcatgttaga ccagcaaacc 60attaacatca tcaaagccac tgttcctgta ttgaaggagc atggcgttac cattaccacg120actttttata aaaacttgtt tgccaaacac cctgaagtac gtcctttgtt tgatatgggt180cgccaagaat ctttggagca gcctaaggct ttggcgatga cggtattggc ggcagcgcaa240aacattgaaa atttgccagc tattttgcct gcggtcaaaa aaattgcagt caaacattgt300caagcaggcg tggcagcagc gcattatccg attgtcggtc aagaattgtt gggtgcgatt360aaagaagtat tgggcgatgc cgcaaccgat gacattttgg acgcgtgggg caaggcttat420ggcgtgattg cagatgtgtt tattcaagtg gaagcagatt tgtacgctca agcggttgaa480taaag48權(quán)利要求
1.含有vgb基因的重組鏈球菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組鏈球菌，其特征在于所述鏈球菌為溶血性鏈球菌、獸疫鏈球菌、馬鏈球菌、糞馬鏈球菌、缺乳鏈球菌和雞霍亂桿菌中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組鏈球菌，其特征在于所述鏈球菌為A型溶血性鏈球菌、C型獸疫鏈球菌、C型馬鏈球菌、C型糞馬鏈球菌、C型缺乳鏈球菌和C型雞霍亂桿菌中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組鏈球菌，其特征在于所述鏈球菌為獸疫鏈球菌ATCC 39920。
5.一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，是構(gòu)建含有vgb基因的表達(dá)載體，將構(gòu)建的載體導(dǎo)入鏈球菌中，獲得重組鏈球菌，發(fā)酵重組鏈球菌得到透明質(zhì)酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體為將vgb基因插入到載體pEU308的多克隆位點(diǎn)獲得的pEUVGB。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述將重組質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入鏈球菌中的方法為電轉(zhuǎn)化法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法。本發(fā)明所提供的提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法是構(gòu)建一個(gè)含有vgb基因序列的質(zhì)粒表達(dá)載體，再導(dǎo)入鏈球菌中進(jìn)行表達(dá)。所構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體為pEUVGB，是將vgb基因序列插入到質(zhì)粒載體pEU308的多克隆位點(diǎn)獲得的。所述鏈球菌優(yōu)選為獸疫鏈球菌。通過(guò)在獸疫鏈球菌中表達(dá)vgb基因，可顯著提高菌體對(duì)氧的利用率，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，增加透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。將本發(fā)明應(yīng)用到發(fā)酵工業(yè)中，可以解決高密度發(fā)酵中氧氣的供求矛盾，提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量。因而本發(fā)明具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1587387SQ200410070768
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月26日
發(fā)明者陳國(guó)強(qiáng), 郝寧 申請(qǐng)人:清華大學(xué)