專利名稱：一種精氨酸脫酰酶融合蛋白、其制造方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種新的融合蛋白即人血白蛋白-支原體精氨酸脫酰酶融合蛋白(HSA-ADI)，發(fā)明還涉及該融合蛋白的制造方法以及該融合蛋白在制備用于治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等腫瘤是人體常見腫瘤。研究表明，這些腫瘤多是精氨酸營養(yǎng)缺陷型，這些腫瘤的細(xì)胞往往不能合成精氨酸，必須依賴外界的精氨酸來維持細(xì)胞的生長繁殖，這為腫瘤的治療提供了一個重要的線索。而人體正常細(xì)胞是能夠自身合成精氨酸的。因此，把循環(huán)血液中的精氨酸濃度降低，將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞營養(yǎng)缺乏，達(dá)到抑制腫瘤生長的作用。
支原體M.arginini是許多細(xì)胞培養(yǎng)的污染物微生物，它編碼的一種酶精氨酸脫酰酶(arginine deiminase，ADI)具有專一降解精氨酸的作用，在水的參與下能夠把精氨酸分解為瓜氨酸和氨。ADI由arcA基因編碼，蛋白總量占M.arginini可溶蛋白的10％。除了支原體M.arginini以外，其它許多微生物如Mycoplasma hominis、Mycoplasma arthritidis、Mycobacterium tuberculosis、Lymedisease spirochetes和Streptococcus等都編碼ADI，后者催化精氨酸代謝為生物體提供能量。M.arginini編碼的ADI是由410個氨基酸組成的球型的生物大分子，分子量為46000，等電點(diǎn)為4.7，沒有分子內(nèi)二硫鍵，以二聚體形式出現(xiàn)。
最近幾年，ADI引起了人們極大的興趣。據(jù)報道，ADI濃度在ng/ml的情況下可以抑制黑色素瘤、白血病、前列腺癌等細(xì)胞系的生長。除了能夠減少特殊腫瘤細(xì)胞生長所必需的精氨酸以外，近幾年的研究也認(rèn)為這種酶參與細(xì)胞凋亡，并且具有抑制一氧化氮(NO)合成、中和腫瘤壞死因子等作用。令人興奮的是，新近的研究顯示ADI不但可以直接抑制癌細(xì)胞生長，而且可以抑制腫瘤新血管的生成。而腫瘤新血管的形成被認(rèn)為是腫瘤生長的重要環(huán)節(jié)。
美國Phoenix Pharmacologics現(xiàn)在正在進(jìn)行ADI修飾物治療肝細(xì)胞癌的III期臨床研究。日本Nippon Mining公司通過動物實(shí)驗(yàn)證明，ADI能夠在體內(nèi)、體外抑制6種腫瘤細(xì)胞系的生長，延長動物的生存時間。德國Essen的科研單位和醫(yī)院聯(lián)合試驗(yàn)，已經(jīng)證明ADI抑制白血病細(xì)胞的生長比asparaginase更有效，也能抑制成神經(jīng)細(xì)胞瘤。韓國漢城也在研究E.coli表達(dá)的ADI在抑制一氧化氮合成方面的調(diào)控作用。
眾多基礎(chǔ)和臨床研究報告的結(jié)果證實(shí)了ADI的藥理作用，據(jù)此可以樂觀地期望ADI成為一個強(qiáng)有力的腫瘤治療藥物。但是相對人體來說，這種酶屬于異源蛋白質(zhì)，容易引起過敏反應(yīng)，同時該蛋白質(zhì)在人體內(nèi)容易被酶降解。
人血清白蛋白是血漿的重要成分，也是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體。人血清白蛋白全長585個氨基酸，分子量約66500。正常情況下人血清白蛋白不容易透過腎小球，血漿半衰期在兩周以上。這些特點(diǎn)都有助于其成為一個藥物修飾分子。
本發(fā)明的目的是提供一種新的融合蛋白即HSA-ADI，該蛋白具有以下特點(diǎn)1、特異性降解精氨酸。2、免疫原性低于ADI。3、血漿半衰期長于ADI。
這種新的融合蛋白HSA-ADI用于治療肝癌、黑色素瘤等腫瘤具有明顯的優(yōu)勢1、減少過敏反應(yīng)，便于多療程或持續(xù)用藥。2、增加血漿半衰期，減少注射次數(shù)，延長給藥間隔，減少患者痛苦，提高患者依從性。
本發(fā)明采用下述技術(shù)方案(1)為了獲得人血白蛋白基因和支原體ADI基因，可以采用PCR或者RT-PCR的方法擴(kuò)增兩條基因，同樣也可以采取全合成的方法。優(yōu)選的方法是全合成ADI基因，并將支原體編碼色氨酸的密碼子TGA改編成TGG，以便于在酵母或者哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。一個優(yōu)選的獲得HSA基因的方法是用RT-PCR的方法從人胚胎肝臟組織總RNA中獲得。
(2)將HSA基因和支原體ADI基因串聯(lián)。優(yōu)選的串聯(lián)方法是將HSA基因串聯(lián)在ADI基因的上游，會提高表達(dá)量。更優(yōu)選的方案是在兩個基因中間加入一段編碼連接肽的基因序列。所述連接肽主要由甘氨酸、絲氨酸或者脯氨酸組成。連接肽的長度可以是1-100個氨基酸，優(yōu)選的連接肽長度是10-30個氨基酸。優(yōu)選的連接肽序列是(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)n，n小于10。連接肽的加入將有利于提高融合蛋白的活性。
將串聯(lián)好的基因克隆到適當(dāng)?shù)恼婧吮磉_(dá)載體，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)可以選用但不僅限于pcDNA系列載體，優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體是攜帶二氫葉酸還原酶基因的pcDNA系列質(zhì)粒。哺乳動物宿主細(xì)胞可以選擇但不僅限于CHO細(xì)胞系列，優(yōu)選的是二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細(xì)胞。
酵母表達(dá)可以選用但不僅限于pPIC系列載體，優(yōu)選的酵母載體是pPIC9?？梢赃x擇將串聯(lián)基因置于pPIC9載體的α因子下游。宿主酵母可以選擇但不僅限于畢赤酵母，最優(yōu)選的是畢赤酵母GS115。
(3)發(fā)酵工程菌種。哺乳動物細(xì)胞的發(fā)酵可以選用但不僅限于DMEM、1640、MEM或者CHO專用系列培養(yǎng)基。采用pPIC9轉(zhuǎn)化GS115方法獲得的酵母菌種發(fā)酵時，可采用常規(guī)培養(yǎng)基，以甘油碳源，另外加入一定比例的磷酸鹽、硫酸鹽、生物素等等成分。甘油消耗盡后進(jìn)行0.5-2小時饑餓，然后補(bǔ)加甲醇，誘導(dǎo)48-96小時。
(4)對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，其中包括透析、陽陰離子交換層析和凝膠排阻層析等。目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)可因連接肽的大小而有輕微變化。在優(yōu)選的酵母分泌表達(dá)中，由于目標(biāo)產(chǎn)物分子量較大，而酵母培養(yǎng)上清成分比較簡單，可以采用但不僅限于鹽沉淀、透析、離子交換、凝膠排阻等手段。優(yōu)選的純化工藝過程是透析-陰離子交換-S200。該工藝可以是目的產(chǎn)物純度達(dá)到98％以上，并可以去除內(nèi)毒素，得到符合生產(chǎn)制劑要求的原液。
(5)純品加入的藥用輔料可以是但不僅限于藥用甘露醇以及磷酸鹽緩沖液等穩(wěn)定劑和助溶劑，經(jīng)過過濾除菌，冷凍干燥成凍干制品。注射用水溶解后應(yīng)用，可用于肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等腫瘤的治療。
(6)采用體外精氨酸降解試驗(yàn)檢驗(yàn)新融合蛋白質(zhì)的生物活性。
(7)用種植有肝癌等腫瘤的裸鼠進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)新融合蛋白對腫瘤生長的抑制效果。
本技術(shù)方案提供了一種新的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，易于進(jìn)行放大，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。該融合蛋白質(zhì)具有ADI活性，在肝癌乳腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、舌咽腫瘤等的治療中具有應(yīng)用前景。
本發(fā)明用下述實(shí)例進(jìn)行說明實(shí)施例1HSA基因的獲得根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)兩條引物，并在上、下游引物5’端分別加入EcoRI酶切位點(diǎn)和BamHI酶切位點(diǎn)。以人胚胎肝組織總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，獲得人血白蛋白成熟蛋白的全長基因，該基因3’端缺失終止碼。參見附

圖1。測序正確后連接入pBV220載體，構(gòu)建成pBV220-HSA。
HSA15’CggAATTCgATgCACACAAgA 3’HSA25’CgggATCCTAAgCCTAAggCA 3’實(shí)施例2支原體ADI基因全長片段的合成按照生物化學(xué)原理，分別對全基因的正反兩條鏈進(jìn)行分段合成，然后進(jìn)行退火、連接。合成中把支原體編碼色氨酸的密碼子TGA該為TGG，并在基因編碼鏈5’端分別加入BamHI酶切位點(diǎn)和SalI酶切位點(diǎn)。該基因編碼鏈5’端除了添加酶切位點(diǎn)外還添加了(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2的編碼序列，見附圖2。測序正確后連接入pBV220-HSA載體，構(gòu)建成pBV220-HSA-ADI載體。
實(shí)施例3HSA-ADI融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)兩條引物HSA-ADI1和HSA-ADI2，并在引物5’端分別加入XhoI酶切位點(diǎn)和EcoRI酶切位點(diǎn)。以pBV220-HSA-ADI載體為模板進(jìn)行PCR，獲得HSA-ADI基因。該基因雙酶切后連接到真核表達(dá)載體，優(yōu)選pPCI9，構(gòu)建成pPCI9-HSA-ADI。該融合蛋白第一區(qū)和第二區(qū)之間的連接肽為12個氨基酸即Gly-Ser-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2。融合蛋白的編碼序列見附圖3。實(shí)施例1、2、3的質(zhì)粒構(gòu)建過程參見附圖4。
HSA-ADI1TCTCTCgAgAAAAgAgAggCTATggATgCACACAAgAHSA-ADI25’CggAATTCTTACCACTTAACATCTTTAC實(shí)施例4轉(zhuǎn)化并篩選工程菌菌種并發(fā)酵選用SacI、SalI等適當(dāng)內(nèi)酶切pPCI9-HSA-ADI質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，按照規(guī)定辦法篩選Mut+、His+克隆，搖瓶內(nèi)培養(yǎng)后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，選擇表達(dá)量高的作為工程菌。在發(fā)酵罐內(nèi)以甘油為碳源進(jìn)行培養(yǎng)約24小時，然后以甲醇為碳源進(jìn)行誘導(dǎo)48-96小時。發(fā)酵培養(yǎng)基采用常規(guī)培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束后收獲培養(yǎng)上清液。
實(shí)施例5目標(biāo)產(chǎn)物的分離、純化融合蛋白HSA-ADI主要以可溶性形式存在培養(yǎng)上清液內(nèi)。收獲的上清首先用磷酸緩沖液進(jìn)行透析，置換掉培養(yǎng)基溶液，然后采用陰離子交換和分子篩等手段進(jìn)行分離精制。
實(shí)施例6目標(biāo)產(chǎn)物的鑒定SDS-PAGE測定融合蛋白分子量約為114KD，純度均在98％以上。
采用體外精氨酸降解實(shí)驗(yàn)檢查融合蛋白的生物活性?；驹硎茿DI催化精氨酸轉(zhuǎn)變成瓜氨酸，后者與diacetyl mono-oxime結(jié)合，在460nm處有強(qiáng)吸收，在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液460nm處吸光度的變化量與反應(yīng)的氨基酸量成正比。操作步驟為(1)37℃孵育酶和底物混合物1小時，混合物組成(50mM精氨酸150ul、50mM醋酸鹽緩沖液(PH5.5)2.3ml、酶適量、濃度0.05％的疊氮鈉3.6ul)。(2)添加2M的鹽酸0.5ml終止反應(yīng)。(3)1ml終止過反應(yīng)的上清液中加入H3PO4-H2SO4(3/1，V/V)1.5ml和250ul diacetyl mono-oxime(1.5％)的10％甲醇溶液，黑暗中95℃反應(yīng)30分鐘，冷卻10分鐘。(4)460nm測光吸收值，該值反應(yīng)了瓜氨酸的生成量。
活力單位定義1分鐘反應(yīng)時間內(nèi)催化1微摩爾精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?微摩爾瓜氨酸的酶量定義為1個活力單位(IU)。
30L發(fā)酵罐一次發(fā)酵可以得到10萬IU以上的HSA-ADI。
實(shí)施例7無菌過濾、分裝、凍干純品可加入甘露醇等輔料制成小容量注射劑或者凍干制劑?？刹捎?但不僅限于)緩沖體系為10mM PB、pH6.8、5％甘露醇。在環(huán)境潔凈度達(dá)到百級的條件下，用0.22μM微孔濾膜過濾，然后進(jìn)行分裝、凍干、封口、貼簽、裝箱。保存于2～8℃的冷藏環(huán)境中。
實(shí)施例8HSA-ADI體內(nèi)抗腫瘤細(xì)胞增殖試驗(yàn)選用種植有肝細(xì)胞癌細(xì)胞的裸鼠30只，腫瘤直徑為1-3厘米。分為低劑量給藥組(10只)、高劑量給藥組(10只)和對照組(10只)。采用尾靜脈注射給藥方法，給藥容量為每只小鼠1ml。低、高劑量給藥組每天注射HSA-ADI融合蛋白分別為100IU或400IU，對照組給與相同容量的生理鹽水。連續(xù)給藥2周，給藥后7天和14天分別觀察并測量腫瘤直徑的變化，記錄腫瘤直徑增長數(shù)值。兩次觀察測量結(jié)果顯示，給藥組動物腫瘤組織生長緩慢，與對照組相比差別顯著。對最后一次觀察結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，兩個給藥組動物腫瘤直徑與對照組相比均明顯縮小，P值均小于0.01。說明HSA-ADI融合蛋白對肝癌細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用。末次記錄數(shù)據(jù)如下表.HSA-ADI體內(nèi)抗腫瘤細(xì)胞增殖試驗(yàn)數(shù)據(jù)表(腫瘤直徑變化，厘米)。
組別1 2 3 4 5 6 7 8 9 10高劑量 0.1-0.2 0.3 -0.1 -0.2 0.0 0.1 0.1-0.3 -0.4低劑量 0.20.30.4 -0.1 -0.2 0.1 0.1 -0.2 0.0-0.1對照組 0.60.70.7 0.80.9 1.0 0.8 1.30.60.權(quán)利要求
1.一種用于治療肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、舌咽腫瘤等腫瘤的人血白蛋白(human serum albumin，HSA)-支原體精氨酸脫酰酶(arginine deiminase，ADI)融合蛋白(HSA-ADI)。
2.權(quán)利要求1的人血白蛋白-支原體精氨酸脫酰酶融合蛋白，其特征在于融合蛋白的N端是人血白蛋白，C端是支原體精氨酸脫酰酶，分別稱為第一區(qū)和第二區(qū)。
3.權(quán)利要求2的人血白蛋白-支原體精氨酸脫酰酶融合蛋白，其特征在于該融合蛋白第一區(qū)和第二區(qū)之間可以設(shè)有連接肽，所述連接肽長度是1-100個氨基酸，主要由甘氨酸、絲氨酸或者脯氨酸組成。
4.一種權(quán)利要求3所述融合蛋白(HSA-ADI)的制造方法，包括(1)合成用于克隆人血白蛋白基因的特異性引物；(2)合成ADI全長基因；(3)以人胎肝總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增HSA基因；(4)將(2)和(3)獲得的基因串聯(lián)，插入到合適的載體，構(gòu)建重組高效表達(dá)載體；(5)用酵母、動物細(xì)胞或者植物細(xì)胞作為宿主，表達(dá)權(quán)利要求4(4)所得到的高效表達(dá)載體，建立工程菌。(6)對(5)得到的工程菌進(jìn)行發(fā)酵；(7)用透析、離子交換和分子篩等方法處理(6)得到的發(fā)酵產(chǎn)物，獲得HSA-ADI融合蛋白純品；(8)在(7)所得純品中加入保護(hù)劑，制成小容量注射劑；
5.權(quán)利要求3所述的人血白蛋白-支原體精氨酸脫酰酶融合蛋白在制備用于治療肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、舌咽癌等腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人血白蛋白(human serum albumin，HSA)和支原體精氨酸脫酰酶(arginine deiminase，ADI)的融合蛋白(HSA－ADI)、該蛋白制備方法及其在制備用于治療肝癌等腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用真核表達(dá)原理與技術(shù)，通過PCR方法克隆了人血白蛋白基因，化學(xué)合成了支原體精氨酸脫酰酶基因。選用真核表達(dá)載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞得到穩(wěn)定表達(dá)HSA－ADI的菌種。菌種發(fā)酵后，發(fā)酵液上清經(jīng)過透析、離子交換、分子篩等方法進(jìn)行產(chǎn)品純化。生物活性檢查確證得到的新分子具有ADI活性。純品加入保護(hù)劑后制成藥用凍干制劑。藥效學(xué)研究結(jié)果表明，該制劑可以用于肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、舌咽腫瘤等的治療。
文檔編號C12N15/62GK1634995SQ20041008387
公開日2005年7月6日 申請日期2004年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月21日
發(fā)明者徐明波, 吳彥卓, 周永新, 王勇波, 盧安京, 陳遙, 楊仲凡, 王小山, 王俊玲, 崔鐵民, 連治國, 高勇, 鄧迪哥, 王璐, 梁果義 申請人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司