專利名稱：一種制備人溶菌酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用基因工程重組技術(shù)生產(chǎn)人溶菌酶的方法。
與其他來(lái)源溶菌酶相比，人溶菌酶具有獨(dú)特的優(yōu)越性和多種藥理作用，在臨床上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但天然人溶菌酶來(lái)源極其困難，利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)是解決這一難題的有效途徑。
本項(xiàng)發(fā)明的目的在于建立一種適宜大批量生產(chǎn)純化人溶菌酶的方法。
本項(xiàng)發(fā)明所采用的技術(shù)方法是利用基因重組技術(shù)，將人溶菌酶基因克隆入酵母菌體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，再經(jīng)純化、配制、冷凍干燥制得人溶菌酶成品。
具體技術(shù)方案如下1.獲取人溶菌酶基因?yàn)榱双@得人溶菌酶基因，可以采用RT-PCR的方法，也可以采取全合成的方法。為了獲得高水平表達(dá)，優(yōu)選的方法是全基因合成方法，將部分密碼子改變成酵母偏愛(ài)密碼子。
2.表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)用宿主菌有許多?？梢圆捎冕劸平湍富蛘呒状冀湍?。優(yōu)選的方法是采用選用畢赤酵母菌GS115。表達(dá)的形式可以是細(xì)胞內(nèi)可溶表達(dá)，也可以是分泌表達(dá)。為了表達(dá)產(chǎn)物純化的方便，優(yōu)選的表達(dá)方式是分泌表達(dá)，為此，優(yōu)選的真核表達(dá)載體是pPIC9。
3.表達(dá)產(chǎn)物純化本項(xiàng)發(fā)明采用真核分泌型表達(dá)，發(fā)酵上清中除目的蛋白外的雜蛋白較少，純化工藝簡(jiǎn)便易行，純化效率高，并能最大限度地保持酶活，適宜大批量生產(chǎn)人溶菌酶。
以下的實(shí)施例及附圖可使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本項(xiàng)發(fā)明。
實(shí)施例1.獲取人溶菌酶基因全基因合成人溶菌酶基因，序列見(jiàn)附

圖1。該基因編碼序列全長(zhǎng)390bp，選用酵母偏愛(ài)密碼子。
實(shí)施例2.重組質(zhì)粒構(gòu)建合成如下兩條引物，5’端分別帶有XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)，以合成的溶菌酶基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增該基因。以上述二酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和pPIC9，再進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC9-LYS。
引物15’TCTCTCGAGAAAAGAGAAGCTAAAGTCTTCGAACGTTG 3’引物25’GACGAATTCTTAAACGCCACAACCTTGA 3’實(shí)施例3重組GS115-HLY工程菌株的篩選采用組氨酸缺陷培養(yǎng)基篩選Mut+、His+重組子。
實(shí)施例4.基因工程重組人溶菌酶生產(chǎn)工藝重組人溶菌酶工程菌接種于BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)36小時(shí)，離心收菌，接入BMGY培養(yǎng)基中，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，30℃培養(yǎng)24-72小時(shí)，離心收集發(fā)酵上清液，經(jīng)Sephadex G-25去除各種金屬離子后，上CM-Sepharose FF離子交換柱，分階段梯度洗脫，收集活性洗脫峰液，鑒定合格后用作配制半成品的原液。
實(shí)施例5.人溶菌酶制劑制備工藝以pH7.0、20mM磷酸鹽緩沖液作為緩沖體系，加入5％甘露醇，將鑒定合格的酶蛋白原液配成半成品，經(jīng)冷凍干燥后即得成品。
純化酶蛋白原液和凍干成品經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)均顯示電泳為一條帶，其蛋白分子量約為14KD；免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)用以上方法制得的目的蛋白具有天然人溶菌酶的屬性；溶菌酶活性測(cè)定采用濁度減低法，酶活檢測(cè)結(jié)果顯示該重組人溶菌酶的酶活比雞蛋清來(lái)源溶菌酶的活力高1-3倍；試管法抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明臨床分離的對(duì)常用抗菌素耐藥的細(xì)菌，對(duì)重組人溶菌酶敏感，說(shuō)明開(kāi)發(fā)生產(chǎn)該制品具有很好的臨床應(yīng)用前景。
附圖1.合成的人溶菌酶基因編碼序列和相應(yīng)的氨基酸序列1 AAAGTCTTCGAACGTTGTGAACTGGCCCGTACTCTGAAACGTCTGGGTATGGATGGCTAC1 K V F E R C E L A R T L K R L G M D G Y61CGTGGTATCAGCTTGGCAAACTGGATGTGTCTGGCCAAATGGGAGTCTGGTTACAACACC21 R G I S L A N W M C L A K W E S G Y N T121 CGTGCCACCAACTACAATGCTGGCGACCGTAGCACTGATTATGGTATCTTTCAGATCAAT41 R A T N Y N A G D R S T D Y G I F Q I N181 AGCCGTTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGTGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCC61 S R Y W C N D G K T P G A V N A C H L S241 TGCTCTGCTCTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTCGCTTGTGCAAAGCGTGTTGTC81 C S A L L Q D N I A D A V A C A K R V V301 CGTGATCCACAAGGCATTCGTGCATGGGTTGCATGGCGTAATCGTTGTCAAAACCGTGAT101R D P Q G I R A W V A W R N R C Q N R D361 GTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGCGTT121V R Q Y V Q G C G V
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)基因工程重組人溶菌酶的方法，由以下步驟完成(1)采取全長(zhǎng)序列合成的方法獲取人溶菌酶基因(2)采用真核表達(dá)載體pPIC9與畢赤酵母宿主菌GS115進(jìn)行人溶菌酶表達(dá)；(3)從發(fā)酵液中純化人溶菌酶；(4)選擇合適的賦型劑和穩(wěn)定劑，與酶蛋白原液配制成一定濃度的半成品后凍干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人溶菌酶的制備方法，合成一條人溶菌酶基因，該基因序列參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人溶菌酶的制備方法，重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)SacI內(nèi)切酶線性化后，采用電穿孔法將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115細(xì)胞中，篩選Mut+、His+菌株作為工程菌種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述菌種發(fā)酵后，離心收集發(fā)酵上清液，經(jīng)Sephadex G-25去除金屬離子、CM-Sepharose FF離子交換的方法進(jìn)行純化目的產(chǎn)物。
5.權(quán)利要求4的目的產(chǎn)物，以磷酸鹽緩沖液作為緩沖體系，加入一定濃度的甘露醇，將鑒定合格的酶蛋白原液配成半成品，經(jīng)冷凍干燥后即得成品。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人溶菌酶的制備方法。本發(fā)明利用真核表達(dá)原理與技術(shù)，選擇酵母偏愛(ài)的密碼子，化學(xué)合成了人溶菌酶基因。選用真核表達(dá)載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞得到穩(wěn)定表達(dá)人溶菌酶的菌種。菌種發(fā)酵后，發(fā)酵液上清離子交換等方法進(jìn)行產(chǎn)品純化。該方法在制藥領(lǐng)域有較好應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1664096SQ20041008387
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2004年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月21日
發(fā)明者徐明波, 楊仲凡, 王小山, 王俊玲, 崔鐵民, 連治國(guó), 高勇, 鄧迪哥, 王璐, 梁果義, 吳彥卓 申請(qǐng)人:北京雙鷺立生醫(yī)藥科技有限公司