專利名稱：缺失型α－地中海貧血基因診斷芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種可用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)人α-珠蛋白基因缺失的DNA芯片。
本發(fā)明還涉及該芯片的制備方法。
本發(fā)明還涉及目標(biāo)DNA片斷的擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
α-地中海貧血是由于α-珠蛋白基因缺失導(dǎo)致其合成速率改變而致，在遺傳學(xué)上具有高度的異質(zhì)性，我國(guó)南方有較高的發(fā)病率(Lau YL，1997；XM Xu，2004)。α-地貧分子缺陷主要為基因的大片段缺失。導(dǎo)致α-地貧的缺失突變有多種類型，在中國(guó)人中共有7種缺失型突變，即--SEA、-α3.7、-α4.2、-α2.7、--THAI、--FIL和--HW，其中以東南亞(--SEA)、左缺(-α3.7)和右缺(-α4.2)最常見(jiàn)。臨床上常用測(cè)定紅細(xì)胞有關(guān)參數(shù)的方法對(duì)α-地貧進(jìn)行篩查性診斷(Lau YL，1997；XM Xu，2004)。但最后的確診診斷和類型判斷仍需要用基因診斷。鑒于東南亞、左缺和右缺占中國(guó)人缺失型α-地貧的96％以上(XM Xu，2004)。因此α-地貧基因診斷的主要任務(wù)就在于快速檢出這三種缺失。傳統(tǒng)的Southern雜交法是缺失型α-地貧最可靠的診斷方法，但其缺點(diǎn)顯而易見(jiàn)(Waye，1993)。PCR技術(shù)已應(yīng)用于α-地貧的基因診斷(Chong SS，2000)。
DNA芯片技術(shù)自上世紀(jì)九十年代出現(xiàn)以來(lái)(Schena M，1995)，因其具有高通量、并行性、快速、靈敏等特點(diǎn)，獲得了巨大發(fā)展。已在遺傳性疾病、致病微生物檢測(cè)等方面獲得了廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)中國(guó)人中最常見(jiàn)的三種缺失型α-地中海貧血(--SEA、-α3.7、-α4.2)的檢測(cè)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速、穩(wěn)定、靈敏度高、重復(fù)性好的DNA芯片檢測(cè)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括對(duì)人基因組DNA待測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增，其特征在于采用7條(4對(duì))引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7組成四重PCR，分別擴(kuò)增正常等位基因和缺失等位基因。而其中的四條引物(P2，P4，P6，P7)的5’端為熒光(Cy-3或Cy5)或生物素標(biāo)記。
P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’
P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’本發(fā)明的技術(shù)方案包括檢測(cè)正常等位基因和缺失等位基因的特異性探針，其特征在于檢測(cè)正常α2基因的特異性探針為5’-CCCCCGCCCCGCGTGCACCCCCAGGGGAGGCCGAGCCCGCCGCCCGGCCCCGCGCAGGCCCCGCCCGGGA-3’檢測(cè)東南亞缺失型(--SEA)的特異性探針為5’-TGACGCTGTCTGCTTAAGGCCCAGGGAAACCCAGGTGCAAACTCACACTCATCACCCAGGCAGCCACAGC-3’檢測(cè)右側(cè)缺失型(-α3.7)的特異性探針為5’-GCAGCTGGATAGGGTAGGAAAAGGCAGGGGCGGGAGGAGGGGATGGAGGAGGGAAAGTGGAGCCACCGCG-3’檢測(cè)左側(cè)缺失型(-α4.2)的特異性探針為5’-GCCCATGCCTGTAAACCCACCTACTCCGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCATTTTAACCAAGGAGGCAGAGG-3’本發(fā)明的技術(shù)方案包括DNA芯片的制備方法，其特征在于用于芯片制備的基質(zhì)包括玻片、硅片和膜等。玻片可為經(jīng)醛基、氨基或多聚賴氨酸等修飾。探針經(jīng)點(diǎn)樣液稀釋后用點(diǎn)樣儀打印到基質(zhì)表面，構(gòu)成微陣列芯片。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交，對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)以及分析，進(jìn)一步判斷是否有缺失基因存在。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施實(shí)例一PCR擴(kuò)增在滅菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反應(yīng)體系中，分別加入等濃度的7條PCR引物的混合貯存液5μl，等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合貯存液8μl，反應(yīng)緩沖液為10μl，其組分為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。石蠟30μl。加入人基因組DNA1μl，PCR反應(yīng)用酶1μl，短暫離心后進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃5min；97℃45s，61℃75s，72℃150s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。
芯片制備探針經(jīng)點(diǎn)樣液稀釋到0.1μg/μl-1.51μg/μl，用點(diǎn)樣儀打印到基質(zhì)表面，構(gòu)成微陣列芯片(見(jiàn)附

圖1)。
芯片雜交將PCR產(chǎn)物與雜交液按一定比例稀釋混勻后，加入5-20μl混合液到雜交孔，在42℃雜交30-180min后，用洗液將玻片洗二次，晾干。
雜交信號(hào)檢測(cè)用熒光掃描儀檢測(cè)DNA芯片雜交信號(hào)。結(jié)果如圖1。
權(quán)利要求
1.一種診斷缺失型α-地中海貧血的DNA芯片，通過(guò)固定在玻片、硅片等基質(zhì)上的特異性探針，與特異性的PCR產(chǎn)物雜交從而對(duì)中國(guó)人常見(jiàn)的缺失等位基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述DNA芯片的基質(zhì)包括玻片、硅片和膜等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述DNA芯片的探針為檢測(cè)正常α2基因的特異性探針為5’-CCCCCGCCCCGCGTGCACCCCCAGGGGAGGCCGAGCCCGCCGCCCGGCCCCGCGCAGGCCCCGCCCGGGA-3’檢測(cè)東南亞缺失型(--SEA)的特異性探針為5’-TGACGCTGTCTGCTTAAGGCCCAGGGAAACCCAGGTGCAAACTCACACTCATCACCCAGGCAGCCACAGC-3’檢測(cè)右側(cè)缺失型(-α3.7)的特異性探針為5’-GCAGCTGGATAGGGTAGGAAAAGGCAGGGGCGGGAGGAGGGGATGGAGGAGGGAAAGTGGAGCCACCGCG-3’檢測(cè)左側(cè)缺失型(-α4.2)的特異性探針為5’-GCCCATGCCTGTAAACCCACCTACTCCGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCATTTTAACCAAGGAGGCAGAGG-3’
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述PCR為單管多重PCR，其特征在于待測(cè)樣品中DNA的特異性片段通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物含有與特異性探針雜交的DNA序列；其所采用的7條優(yōu)選引物序列為P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述PCR引物其特征在于其5’端為熒光(Cy-3或Cy-5)或生物素標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種缺失型α－地中海貧血基因檢測(cè)的DNA芯片，其特征在于通過(guò)固定在玻片、硅片等基質(zhì)上的特異性探針，與特異性的PCR產(chǎn)物雜交從而對(duì)中國(guó)人常見(jiàn)的缺失等位基因(－－
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1661098SQ20041009190
公開(kāi)日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者李澤松, 張文 申請(qǐng)人:深圳益生堂生物企業(yè)有限公司