一種檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的引物組和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的引物組和試劑盒?？芍苯佑糜趪?guó)內(nèi)11種已知稀有缺失型地中海貧血進(jìn)行快速、穩(wěn)定的檢測(cè)。本發(fā)明的用于檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的引物組，包括引物組A和引物組B；所述引物組A包括檢測(cè)α-地貧缺失基因型的12條引物，所述引物組B包括檢測(cè)β-地貧缺失基因型的10條引物。本發(fā)明試劑盒可采用多重Gap-PCR技術(shù)對(duì)11種稀有缺失基因型進(jìn)行檢測(cè)，可以直接一次檢測(cè)多達(dá)11種稀有缺失地貧基因型，較在產(chǎn)前診斷利用巢式PCR結(jié)合遺傳分析操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、節(jié)約成本，為更全面的進(jìn)行地貧篩查創(chuàng)造條件，為婚前、產(chǎn)前檢測(cè)和孕期胎兒的地中海貧血診斷提供科學(xué)的依據(jù)。
【專利說明】一種檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的引物組和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及ー種檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的引物組和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]地貧是世界上最常見的人類單基因遺傳血液病之一，被世界衛(wèi)生組織列入危害人類健康的6種常見病，也是中國(guó)南方各省最常見、危害最大的遺傳病。
[0003]a -地中海貧血(Thalassemia，以下簡(jiǎn)稱a -地貧)，是ー組因a -珠蛋白鏈合成減少或不能合成，a-鏈/非a-鏈比例失衡為特征的遺傳溶血性血紅蛋白病。我國(guó)最常見的缺失類型為-03.7、-04.2、-SEA3種，隨著a-地中海貧血機(jī)制的進(jìn)ー步闡明，一些新的基因缺失類型相繼被發(fā)現(xiàn)，例一11.1、-FIL、一THA1、- a 27.6、- a 2.4、- a 2.8，--11.1 -FIL, -THAI 均是缺失了兩個(gè)a基因，當(dāng)與--SEA結(jié)合時(shí)可產(chǎn)生一定量的HbBarts，而-a27.6、-a2.4、-a2.8均是缺失了ー個(gè)a基因，當(dāng)這些基因型結(jié)合--SEA時(shí)，會(huì)引起Hb H病，這些新缺失類型的發(fā)現(xiàn)說明我國(guó)a-地貧有較廣的基因譜，對(duì)目前地貧基因缺陷的篩查有重要的補(bǔ)充作用，提醒我們要避免異?；蛐偷穆z。
[0004]β-地中海貧血(簡(jiǎn)稱0 -地貧)是位于11號(hào)染色體末端llpl5.3位點(diǎn)上的人 β- 珠蛋白基因(HBB)的先天性遺傳缺陷。β-缺陷的后果是珠蛋白肽鏈合成減少或缺如，
導(dǎo)致Hb生成障礙，而產(chǎn)生溶血性貧血。β-地貧主要是因點(diǎn)突變(或少數(shù)幾個(gè)核苷酸的插入或缺失)使β-珠蛋白肽鏈合成障礙(減少或缺如)所致。此外，由于β-珠蛋白基因簇的大片段缺失而導(dǎo)致的遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白綜合征(hereditary persistence offetal hemoglobin, HPFH)和δβ-地中海貧血(簡(jiǎn)稱δβ-地貧)在中國(guó)人群中也占有相當(dāng)?shù)谋壤?，其共同特征是基因發(fā)育階段特異性表達(dá)失控而使出生后胎兒血紅蛋白(fetalhemoglobin, HbF)持續(xù)增高,是ー組遺傳異質(zhì)性很大的血紅蛋白病。
[0005]目前世界上在不同種族中已報(bào)道了至少40種此類因P -珠蛋白基因簇的大段缺
失而引起的血紅蛋白病，中國(guó)人群中最常見的類型是βChinese(AYδβ)0(中國(guó)型)、βSEAβ0 (東南亞型，SEA)、βThai(AYδβ)0 (泰國(guó)型)，另外 βTunnanese(AYδβ)0(云南型)、βCatonese(AYδβ)0(廣東型)、βTaiwanese(AYδβ)0(臺(tái)灣型)也有報(bào)道。缺失型β -地貧雜合子與β -地貧點(diǎn)突變雜合子婚配后，有生育缺失突變復(fù)合β -地貧點(diǎn)突變患兒的風(fēng)險(xiǎn)，此類雙重雜合子患兒多表現(xiàn)為中間型或重癥β -地貧，也是需要重點(diǎn)預(yù)防的類型。缺失型β -地貧具有特異的表型，在臨床上較易被發(fā)現(xiàn)，但目前暫時(shí)沒有相關(guān)的基因檢測(cè)試劑盒上市，給產(chǎn)前診斷帶來一定困難，因此，開展并推廣缺失型β -地貧的表型篩查和基因診斷技術(shù)，有助于我國(guó)β -地貧高發(fā)區(qū)產(chǎn)如診斷水平的進(jìn)一步提尚。
[0006]目前，地貧還沒有效的根治方法，主要以預(yù)防為主。因此開展稀有缺失型地貧的檢測(cè)，提早發(fā)現(xiàn)地貧異?；虻臄y帯者，對(duì)指導(dǎo)婚前及產(chǎn)前診斷具有重要的意義。
[0007]1、現(xiàn)有地貧檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介:
[0008](1) Southern印跡雜交-限制性酶譜分析法:曾是a -地貧基因診斷的主要方法，但由于操作繁瑣，所需時(shí)間較長(zhǎng)，一般只適合研究使用，不適于臨床的推廣應(yīng)用；(2)RFLP (限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)連鎖分析:其先決條件是在該家庭中至少有ー個(gè)患兒或一個(gè)正常兒，以前是P地貧產(chǎn)前診斷最常用的方法，限制性片段長(zhǎng)度的差異反應(yīng)了各種基因型的差異，是ー種間接測(cè)試法，對(duì)部分家系不能診斷，且操作比較繁瑣；(3)寡核苷酸探針技木:這ー技術(shù)可快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)已知突變的地貧基因，具有很高的靈敏性和準(zhǔn)確性，但ー次雜交只能檢測(cè)ー種突變，而且還需要同位素探針，難以推廣應(yīng)用；(4)依賴探針連接擴(kuò)增技術(shù)(MLPA):MLPA能對(duì)所有的缺失基因型檢測(cè)以及未知的基因型開展檢測(cè)，具有聞效、特異的特點(diǎn)，常用于a、(6-地貧大片段缺失基因型的檢測(cè)，但由于檢測(cè)成本高，操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)流程長(zhǎng)達(dá)16小時(shí)，且需要特殊的儀器設(shè)備，一般只用于研究使用，不便于分子篩查方法的推廣應(yīng)用；(5)測(cè)序技術(shù):測(cè)序技術(shù)直接對(duì)DNA序列的分析，一直被認(rèn)為是臨床檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)；目前測(cè)序技術(shù)面臨著標(biāo)本的處理(核酸提取)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)化認(rèn)證問題，信號(hào)檢測(cè)、測(cè)序平臺(tái)特異的出錯(cuò)和糾錯(cuò)問題，以及生物信息學(xué)方面可能出現(xiàn)的問題，臨床驗(yàn)證程序和標(biāo)準(zhǔn)化問題等，一直沒有有效的解決，因此還未能在臨床中推廣應(yīng)用；(6)反向斑點(diǎn)雜交(Reverse Dot Blot, RDB)法:這ー方法具有靈敏度高、特異性好和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于a、(6-地貧點(diǎn)突變的臨床產(chǎn)前診斷和基因診斷。這種方法靈敏，但耗時(shí)較長(zhǎng)，一般用于點(diǎn)突變檢測(cè)；(7)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Taqman探針法):實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前臨床診斷系統(tǒng)最受歡迎的檢測(cè)平臺(tái)。在地中海貧血檢測(cè)中，報(bào)道的均只局限于ー種基因型的檢測(cè)，工作量大，由于探針需要進(jìn)行熒光標(biāo)記，檢測(cè)成本高；(8) Gap-PCR及其改進(jìn)的技木:由于其易操作，此技術(shù)廣泛用于缺失地貧的分子診斷，在缺失區(qū)域兩端設(shè)計(jì)ー對(duì)引物，正常情況下兩引物擴(kuò)增 產(chǎn)物很長(zhǎng)不屬于擴(kuò)增的范圍，而出現(xiàn)缺失區(qū)域的時(shí)候能出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增。目前市場(chǎng)上以Gap-PCR開發(fā)的試劑盒只能檢測(cè)中國(guó)最常見的3種缺型-a3.7、-a4.2和」'而不能檢測(cè)一11_1、--^--1^1、-027_6、-02_4、-02_8等非常見的0-地貧缺失基因型
和 3 Chinese (A Y中國(guó)型)、^ SEABO (東南亞型，gEA ) > &5@)° (泰國(guó)型)、^ Y—…5
(云南型)、^TaiWaneSe0°(臺(tái)灣型)等P -地貧缺失基因型。
[0009]2、現(xiàn)有產(chǎn)品及專利:
[0010]盡管檢測(cè)地貧的方法和產(chǎn)品很多，但是目前尚未有直接、快速、同時(shí)檢測(cè)多種稀有缺失型地貧的產(chǎn)品。本公司相關(guān)專利為《診斷a-地中海貧血的核酸膜條及試劑盒》(專利號(hào)為ZL200710074203.5)、《用于診斷P -地中海貧血的核酸雜交膜條及試劑盒》(專利號(hào)為ZL200510034015.0)和《a和0地中海貧血基因檢測(cè)的核酸膜條及試劑盒》(專利號(hào)為ZL201210494748.2)，這些專利和本申請(qǐng)發(fā)明專利不屬于同一個(gè)技術(shù)平臺(tái)，與本申請(qǐng)發(fā)明專利相關(guān)的已經(jīng)公開或者有權(quán)的專利相關(guān)統(tǒng)計(jì)對(duì)比如下，見表1。
[0011]表1與本申請(qǐng)專利相關(guān)的已經(jīng)公開或者有權(quán)的部分專利
[0012]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的引物組，其特征在于，包括引物組A和引物組B; 所述引物組A包括檢測(cè)a -地貧缺失基因型的12條引物，所述12條引物的序列分別如下:引物 A1:SEQ ID NO:1 ;引物 A2:SEQ ID NO:2 ;引物 A3:SEQ ID NO:3 ;引物 A4:SEQID NO:4 ;引物 A5:SEQ ID NO:5 ;引物 A6:SEQ ID NO:6 ;引物 A7:SEQ ID 勵(lì):7;引物八8:SEQ ID NO:8 ;引物 A9:SEQ ID NO:9 ;引物 AlO:SEQ ID NO:10 ;引物 All:SEQ ID NO:11 ；引物 A12:SEQ ID NO:12 ； 所述引物組B包括檢測(cè)P -地貧缺失基因型的10條引物，所述10條引物的序列分別如下:引物 B1:SEQ ID NO:13 ;引物 B2:SEQ ID NO:14 ;引物 B3:SEQ ID NO:15;引物 B4:SEQ ID NO:16 ;引物 B5:SEQ ID NO:17 ;引物 B6:SEQ ID NO:18 ;引物 B7:SEQ ID NO:19 ；引物 B8:SEQ ID NO:20 引物 B9:SEQ ID NO:21 ;引物 BlO:SEQ ID NO:22。
2.一種用于檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的試劑盒，其特征在干，包括PCR反應(yīng)液A和PCR反應(yīng)液B，所述PCR反應(yīng)液A包含如權(quán)利要求1所述的引物組A，所述PCR反應(yīng)液B包含如權(quán)利要求1所述的引物組B。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液A還包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反應(yīng)緩沖液、PCR增強(qiáng)劑組合，所述PCR反應(yīng)液B還包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反應(yīng)緩沖液、PCR增強(qiáng)劑，所述PCR增強(qiáng)劑組合包括5XQ Solution和Surfactin。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)液A各組分含量為:
5 X Q Solution:5 u L ；`
10XCoralLoad PCR Buffer:2.5 u L ；
2.5mM dNTP:2.0u L ；
25u M Surfactin:1.0 u L;
IOOii M 弓丨物 Al:0.051 u L ；
IOOiiM 弓丨物 A2:0.052u L ；
IOOiiM 弓丨物 A3:0.05u L ；
IOOiiM 引物 A4:0.05u L ；
IOOiiM 弓丨物 A5:0.047 u L ；
IOOiiM 引物 A6:0.049 u L ；
IOOiiM 弓 I物 A7:0.035u L ；
IOOiiM 引物 A8:0.038u L ；
IOOiiM 引物 A9:0.04u L ；
IOOiiM 引物 AlO:0.037u L ；
IOOiiM 引物 All:0.05u L ；
IOOiiM 引物 A12:0.05u L ；
5U/u L Hotstar-Taq DNA polymerase:0.5 U L ； 去尚子水:9.451 u L0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)稀有缺失型地中海貧血的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)液B各組分含量為:.5X Q Solution:5.0u L ;IOXCoralLoad PCR Buffer:2.5u L ；.2.5mM dNTP:2.0u L ；.25 u M Surfactin:1.0 u L;IOOiiM 弓丨物 BI:0.03u L ；IOOiiM 引物 B2:0.03u L ；IOOiiM 引物 B3:0.033u L ；IOOiiM 引物 B4:0.035u L ；IOOiiM 引物 B5:0.028u L ；IOOiiM 引物 B6:0.028u L ；IOOiiM 引物 B7:0.036u L ；IOOiiM 引物 B8:0.033u L ； IOOiiM 引物 B9:0.04u L ；IOOiiM 引物 BlO:0.043 u L ；.5U/u L Hotstar-Taq DNA polymerase:0.5 U L ；去尚子水:9.664 u L0
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602752SQ201310656450
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】李印淑, 劉福平, 劉晶晶, 任維 申請(qǐng)人:亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司