專利名稱：一種缺失型α-地中海貧血基因、檢測(cè)試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及缺失型a-地中海貧血基因(-a 29 6)、檢測(cè)試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
α-地中海貧血是由于a-珠蛋白基因缺失導(dǎo)致其合成速率改變而致，在遺傳學(xué)上具有高度的異質(zhì)性，我國南方有較高的發(fā)病率。a-地中海貧血分子缺陷主要為基因的大片段缺失。導(dǎo)致a -地中海貧血的缺失突變有多種類型，在中國人中已發(fā)現(xiàn)至少共有7種缺失型突變，即一SEA、-a 3_7、-a 4_2、-a 2_7、一THAI、一FIlP — ，其中以東南 (_」EA)、左缺(-a3·7)和右缺(_a4_2)最常見。近年來，新的缺失不斷被發(fā)現(xiàn)與鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的缺失型α-地中海貧血基因(-α 29 6)及其檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法。本發(fā)明提供一種缺失型a-地中海貧血基因(-a 29 6)，其序列如SEQ ID NO: I所示。攜帶該缺失型基因的雜合病人表現(xiàn)為輕微的地中海貧血癥狀。一種檢測(cè)試劑盒，含有能夠識(shí)別所述基因的試劑。所述試劑包括檢測(cè)缺失型α-地中海貧血基因(-α 29 6)的上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示。所述試劑包括檢測(cè)作為對(duì)照的人CLCN7基因的上游引物和下游引物，上游引物序列如SEQ ID N0:4所示，下游引物序列如SEQ ID N0:5所示。權(quán)利要求I所述基因的檢測(cè)方法，包括如下步驟a)提取待測(cè)人體外周血的基因組DNA ；b)以所述基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；c)對(duì)所述PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，只得到一條帶I. 3kb條帶時(shí)，結(jié)果為陰性；得到I. 3kb和2. Okb兩條帶時(shí)結(jié)果為陽性；d)其中，所述步驟b)中，PCR擴(kuò)增缺失型α-地中海貧血基因(_α 29 6)用到的引物序列為:上游引物序列如SEQ ID Ν0:2所示，下游引物序列如SEQ ID Ν0:3所示。擴(kuò)增人CLCN7基因用到的引物序列為上游引物序列如SEQ ID Ν0:4所示，下游引物序列如SEQ IDNO:5所示。本發(fā)明的有益效果是得到一種缺失型α-地中海貧血基因，便于地中海貧血篩選。


圖I是先證者外周血DNA樣本的MLPA檢測(cè)結(jié)果圖，使用MLPA檢測(cè)先證者α -珠蛋白基因簇拷貝數(shù)(NG_000006. I 3893-165187)，結(jié)果顯示探針6-8完全缺失，在探針
4-5,9-11發(fā)生部分缺失；
圖2用于MLPA檢測(cè)的探針在α -珠蛋白基因上的相對(duì)位置，粗線條表示缺失型α-地中海貧血基因(-α 29 6)的缺失區(qū)域；圖3是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖，顯示母親和先證者攜帶該缺失型α-地中海貧血基因(-α 29 6)，父親未攜帶該缺失型α-地中海貧血基因(-α 29 6)；圖4是缺失片段連接點(diǎn)的測(cè)序峰圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施方式
結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說明。申請(qǐng)人:通過MLPA檢測(cè)試劑盒對(duì)人體外周血DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，其顯示存在缺失片段，該缺失片段范圍從圖2中的探針4到探針8，且包含整個(gè)α 2基因。 根據(jù)MLPA結(jié)果，推定上游斷裂點(diǎn)位于探針3和探針4之間的區(qū)域內(nèi)，下游斷裂點(diǎn)位于探針8和探針9之間的區(qū)域內(nèi)。根據(jù)該推定，設(shè)計(jì)如下引物上游引物TCCTTCACTTGGTGTAATGGTTCG(SEQ ID NO:2)下游引物CCAGGGTTAGTCTGAGGGCTTCC(SEQ ID NO:3)根據(jù)該引物，進(jìn)行跨越斷裂點(diǎn)擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物片段約為2000bp。為了對(duì)檢測(cè)反應(yīng)體系進(jìn)行評(píng)估，在該P(yáng)CR體系中，引入了另外一對(duì)擴(kuò)增人CLCN7基因的引物上游引物CTCTTGGGACTGAATGTGCTTGG(SEQ ID N0:4)下游引物GCAACAAACCCTAAAGAGCCTGG(SEQ ID NO:5)根據(jù)該引物，PCR擴(kuò)增的CLCN7基因產(chǎn)物1346bp。該檢測(cè)反應(yīng)體系為包含4條引物的雙重PCR，反應(yīng)參數(shù)為98で變性1011^11;98で變性 lmin, 60°C煺火 45s, 72°C延伸 2min ；35 個(gè)循環(huán)后，72°C延伸 IOmin.PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，僅有只得到一條帶I. 3kb條帶時(shí)，結(jié)果為陰性；得到I. 3kb和2. Okb兩條帶時(shí)結(jié)果為陽性。擴(kuò)增成功后，可對(duì)陽性產(chǎn)物直接測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與參考序列比對(duì)，以進(jìn)ー步證實(shí)。該參考序列如SEQ ID NO: I所示。使用本發(fā)明的檢測(cè)方法，對(duì)ー家庭進(jìn)行檢測(cè)。先證者為血紅蛋白H病，父親為典型的地中海貧血癥狀，母親有輕微的地中海貧血癥狀(如表I所示)。使用本發(fā)明檢測(cè)的結(jié)果如圖3所示。表I血液學(xué)參數(shù)表
權(quán)利要求
1.一種缺失型α -地中海貧血基因，其序列如SEQ ID NO: I所示。
2.一種檢測(cè)試劑盒，含有能夠識(shí)別權(quán)利要求I所述基因的試劑。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ ID NO: 2，所述下游引物序列如SEQ ID NO: 3所示，擴(kuò)增人CLCN7基因作為對(duì)照上游引物序列如SEQ ID Ν0:4所示，下游引物序列如SEQ ID Ν0:5所示。
4.一種權(quán)利要求I所述基因的檢測(cè)方法，包括如下步驟 a)提取待測(cè)人體外周血的基因組DNA； b)以所述基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物； c)對(duì)所述PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，只得到一條帶I.3kb條帶吋，結(jié)果為陰性；得到I. 3kb和2. Okb兩條帶時(shí)結(jié)果為陽性； d)對(duì)2.Okb長的產(chǎn)物進(jìn)行直接基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與參考序列比對(duì)，確定斷裂位點(diǎn)； 其中，所述步驟b)中，PCR擴(kuò)增用的引物序列為:上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種缺失型α-地中海貧血基因、檢測(cè)試劑盒及方法，其序列如SEQ ID NO:1所示。一種檢測(cè)試劑盒，含有能夠識(shí)別所述基因的試劑。所述試劑包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示。本發(fā)明得到一種缺失型α-地中海貧血基因，便于地中海貧血篩選。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102864153SQ20121027456
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者李澤松, 謝君, 愈晶 申請(qǐng)人:李澤松, 謝君, 愈晶