專利名稱：突變型p53基因反義表達(dá)載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，更具體地說是一種突變型p53基因反義表達(dá)載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
研究己證實腫瘤是一種基因病，基因治療是對癌發(fā)生的根本原因的治療。p53屬抑癌基因，與DNA損傷的修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤形成有密切的關(guān)系，因而有細(xì)胞內(nèi)“分子警察”之美譽。p53基因突變是人類腫瘤最常見的分子生物學(xué)事件，大約50％人類腫瘤具有p53基因的突變，且?guī)缀蹩梢娪诟鞣N類型的腫瘤細(xì)胞中。大量研究證實，突變型p53(mt-p53)不僅喪失野生型p53(wt-p53)所具有的抑癌功能，還具有與wt-p53形成異源寡聚體抑制wt-p53的功能，與p53家族成員p63、p73結(jié)合干擾它們的抑癌功能，實質(zhì)上成了一種癌基因。另外還能使腫瘤細(xì)胞獲得抵抗各種抗癌藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，使許多正在使用的抗癌藥物療效不理想。而且，有p53突變的腫瘤細(xì)胞生長旺盛，侵蝕性和轉(zhuǎn)移率高，患者預(yù)后差，是一種不利的預(yù)兆因素。因此阻斷mt-p53癌基因的表達(dá)成為抗癌研究的新領(lǐng)域。
通過人工方法化學(xué)合成或在生物體內(nèi)合成的反義核酸是與靶基因具有互補序列的DNA或RNA片段，通過堿基互補配對原理與特定靶基因或mRNA形成雜交鏈，從而阻斷靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，甚至導(dǎo)致靶基因編碼的功能蛋白被抑制。并且，反義RNA與靶mRNA形成雙鏈分子后，能使靶mRNA對RNA酶H或水解酶的敏感性增加，使其降解加速?？偠灾?。反義基因治療是從基因水平有選擇性地去控制、關(guān)閉或阻斷有害基因的表達(dá)，從而達(dá)到消除病害的目的。
到目前為止，對p53基因治療的研究一方面導(dǎo)入wt-p53進(jìn)行基因替代治療，并且這方面的研究己進(jìn)入臨床試驗階段，雖然結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞增殖減慢并發(fā)生細(xì)胞凋亡，但由于mt-p53基因的表達(dá)沒有受到阻滯，仍然有源源不斷的p53異常信號產(chǎn)生，而影響wt-p53的療效，2003年的《柳葉刀》雜志(THE LANCET Oncology Vol4 july2003 http//oncology.theiancet.com)已經(jīng)刊登了wt-p53進(jìn)行基因替代治療卵巢癌失敗的報道。另一方面，有學(xué)者利用反義RNA技術(shù)將p53全長cDNA轉(zhuǎn)到含有突變型p53的結(jié)腸癌細(xì)胞株，用來阻斷mt-p53基因的表達(dá)，但正常的wt-p53并沒有得到補充，結(jié)果僅顯示癌細(xì)胞的增殖速度有所下降。這一方法的特點是導(dǎo)入其編碼基因，而不是反義RNA本身，其重組的反義表達(dá)載體分子量大，較難進(jìn)入細(xì)胞，且操作復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，實現(xiàn)能方便的制備個體性的即特異的反義RNA來有選擇地阻斷相對應(yīng)的突變p53蛋白表達(dá)，為開拓新型反義抗癌藥物提供依據(jù)，而提供一種突變型p53基因反義表達(dá)載體及其制備方法。
本發(fā)明的任務(wù)是通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種突變型p53基因反義表達(dá)載體，其該載體上連接有突變的p53外顯子8基因序列GAATTCGCTT TGAGGTGCGT GTTTGTGCCT GTCCTGGGAA AGACCGGCGCACAGAGGAAG GAGGTCTCCG CAAGAAAGGG GAGCCTCACC ACTGCAGGCATGCAAGGCT；并由此載體能夠轉(zhuǎn)錄出與此突變點特異性結(jié)合的互補反義RNA，從而阻斷突變p53信號的表達(dá)。
一種突變型p53基因反義表達(dá)載體的制備方法，以免疫組化篩選突變型p53細(xì)胞系、PCR-SSCP法及基因測序確定突變的p53外顯子和基因序列，把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體的多克隆位點處，構(gòu)建pGEM3zf(+/-)p53exon8’重組載體。
所述的制備方法，其反義p53exon8’RNA是用EcoRI限制性內(nèi)切酶處理重組質(zhì)粒，使環(huán)狀重組質(zhì)粒成線狀質(zhì)粒，在SP6RNA聚合酶存在的系統(tǒng)中，以線狀質(zhì)粒雙鏈DNA的正鏈為模板，合成與mt-p53外顯子8mRNA互補的反義RNA，p53第8外顯子的第62位密碼子由AGA變成AAA，翻譯的蛋白由精氨酸變成賴氨酸。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點1.通過構(gòu)建重組反義表達(dá)載體，利用所采用的載體所具有的轉(zhuǎn)錄特性，在體外合成所需(特異性)的反義RNA分子，再將未經(jīng)修飾的反義RNA直接導(dǎo)入研究細(xì)胞內(nèi)。所采用的方法是直接導(dǎo)入反義RNA本身，這樣所導(dǎo)入的RNA分子量小，只有100bp，較易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
2.應(yīng)用這種體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可直接獲得能與靶mRNA互補的反義RNA分子，并且這種體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)能合成較多量的產(chǎn)物，且隨時可重復(fù)操作，滿足需要的RNA量。只需注意操作規(guī)范，防止核糖核酸酶(Rnase)的污染導(dǎo)致失敗，便可簡單、方便地在各實驗室開展。


附圖為本發(fā)明的反義表達(dá)載體示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
一種突變型p53基因反義表達(dá)載體，其該載體上連接有突變的p53外顯子8基因序列GAATTCGCTT TGAGGTGCGT GTTTGTGCCT GTCCTGGGAA AGACCGGCGCACAGAGGAAG GAGGTCTCCG CAAGAAAGGG GAGCCTCACC ACTGCAGGCATGCAAGGCT；并由此載體能夠轉(zhuǎn)錄出與此突變點特異性結(jié)合的互補反義RNA，從而阻斷突變p53信號的表達(dá)。
一種突變型p53基因反義表達(dá)載體的制備方法，以免疫組化篩選突變型p53細(xì)胞系、PCR-SSCP法及基因測序確定突變的p53外顯子和基因序列，把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體的多克隆位點處，構(gòu)建pGEM3zf(+/-)p53exon8’重組載體。
所述的制備方法，其反義p53exon8’RNA是用EcoRI限制性內(nèi)切酶處理重組質(zhì)粒，使環(huán)狀重組質(zhì)粒成線狀質(zhì)粒，在SP6RNA聚合酶存在的系統(tǒng)中，以線狀質(zhì)粒雙鏈DNA的正鏈為模板，合成與mt-p53外顯子8mRNA互補的反義RNA，p53第8外顯子的第62位密碼子由AGA變成AAA，翻譯的蛋白由精氨酸變成賴氨酸。
參照附圖，本發(fā)明采用的pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體，在其多克隆位點兩側(cè)含有兩個反向的噬菌體啟動子T7RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶，在T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶存在時，識別相應(yīng)啟動子，轉(zhuǎn)錄下游DNA序列，合成特異的RNA。這兩種噬菌體聚合酶都對自己的啟動子顯示出相當(dāng)大的專一性，幾乎不能在其他啟動子的驅(qū)動下起始轉(zhuǎn)錄，同時也不能識別克隆DNA序列中的細(xì)菌、質(zhì)?；蛘婧藛幼印Ｒ虼耸删w聚合酶能合成任何置于適當(dāng)啟動子控制下的DNA的全長轉(zhuǎn)錄物。本研究把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體的多克隆位點處，構(gòu)建pGEM3zf(+/-)p53exon8’重組載體。然后用EcoRI限制性內(nèi)切酶處理重組質(zhì)粒，使環(huán)狀重組質(zhì)粒成線狀質(zhì)粒，在SP6RNA聚合酶存在的系統(tǒng)中，以線狀質(zhì)粒雙鏈DNA的正鏈為模板，合成與mt-p53外顯子8mRNA互補的RNA，即反義D53exon8’RNA。而用HindIII限制性內(nèi)切酶處理成的線狀質(zhì)粒在T7RNA聚合酶作用下，合成與mt-p53exon8 mRNA同序列的RNA，即正義p53exon8’RNA。
一.構(gòu)建特異性的突變型p53體外反義表達(dá)載體1.技術(shù)措施1.1細(xì)胞株、菌株、質(zhì)粒載體(1)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MA-231，天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子生物學(xué)實驗室常規(guī)液氮保存。
(2)E.colil JM109感受態(tài)大腸肝菌購自大連寶生物公司(3)質(zhì)粒載體pGEM3zf(+/-)載體購自美國Promega公司1.2主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基，Invitrogen，美國胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)，Invitrogen，美國0.25％胰蛋白酶，Hyclone，美國二甲基亞砜(DMSO)，Sigma，美國EDTA抗原修復(fù)液、山羊血清封閉液、生物素標(biāo)記二抗工作液(Biotinylatedsecondary Antibody)、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(Streptavidin-HRP)、3，3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)及小鼠抗人p53單克隆抗體購自北京中山生物公司Taq酶，Promega，美國引物序列1

引物序列2

roche，瑞典丙烯酰胺、N’，N’-亞甲雙丙烯酰胺、N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)及去離子甲酰胺購自上海生物工程公司聚乙二醇(PEG)，胰化蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeastextract)購于上海生物工程公司EcoRI，PstI，HindIII限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、SP6RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、rNTP Mixture、RNase Inhibitor、DNaseI(RNase free)購于大連寶生物公司焦碳酸二乙酯(DEPC)，Invitrogen，美國RNA純化試劑盒(RNeasy kit)，Qiagen，德國脂質(zhì)體介導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞試劑盒(TransMessengerTransfection Reagent)Qiagen，德國原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)Roche，瑞典3-(4，5-二甲基噻唑-2?；?-2，5二苯基四氮唑溴鹽(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)Sigma，美國1.3主要儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，SANYO，日本。
超凈操作臺，PMV，德國。
PTC-200 PCR儀，MJ，美國。
垂直電泳漕，BioRad，美國。
DNA電泳槽(分鐘i gel electrophoresis system)Labnet，美國。
Labofuge 400R低溫高速離心機，Heraeus，德國。
核酸定量分析儀，GeneQuant，英國。
電泳膠攝影設(shè)備及分析軟件，Kodak，日本。
倒置顯微鏡Olympus 1X70及軟件拍攝系統(tǒng)Viewfinder 3.0，Olympus，日本。
酶標(biāo)儀，Tecan，奧地利。
1.4突變型p53靶基因的確定1)乳腺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)(1)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)從液氮中取出裝有MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的凍存管，放入37℃水浴中輕搖至完全融化后，70％酒精擦拭管口，無菌吸管轉(zhuǎn)入15ml離心管；加5ml含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，1000rpm離心5分鐘，棄上清；加2ml培養(yǎng)液吹打細(xì)胞團懸液，移入50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)并加入培養(yǎng)液至20ml，于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日鏡下觀察細(xì)胞，注意換液。
(2)傳代培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長至匯合度為80％左右，進(jìn)行細(xì)胞傳代；吸棄培養(yǎng)液，加入0.01M PBS 5ml洗滌2次，加入0.25％胰酶2ml，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2分鐘，鏡下觀察細(xì)胞呈懸浮時，加入含10％FBSRPMI-1640培養(yǎng)液終止消化；吹打懸液后移至離心管內(nèi)，1000rpm離心5分鐘，棄上清；加入培養(yǎng)液5ml，吹打后分裝入數(shù)個50ml培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液至20ml，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
(3)凍存?zhèn)溆卯?dāng)細(xì)胞己長滿培養(yǎng)瓶，且生長狀態(tài)良好時，以0.01M PBS洗滌，0.25％胰酶消化懸液，加培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5分鐘，棄上清；加入含10％DMSO的培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹打成懸液，分裝入凍存管，每管1ml；依次放入4℃半小時；-20℃1小時；-80℃24小時，最后放入液氮罐中保存，以備后用。
2)免疫組化法檢測突變型p53蛋白的表達(dá)(LsAB法)載玻片浸泡濃酸，蒸餾水清洗干凈，高壓滅菌，放入90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)；分別接種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至50％匯合度時取出載玻片，0.01MPBS洗滌2次，95％乙醇固定20分鐘，0.01M PBS洗滌1次；3％過氧化氫甲醇溶液室溫孵育10分鐘；90％乙醇5分鐘，80％乙醇5分鐘，0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；置于EDTA抗原修復(fù)液中于微波爐內(nèi)進(jìn)行微波抗原熱修復(fù)，溫度達(dá)98℃后維持10分鐘，取出置室溫冷卻30分鐘；0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；加山羊血清封閉液50ul，置濕盒內(nèi)，室溫孵育10分鐘；加入小鼠抗人p53單克隆抗體(1∶125)50ul，濕盒內(nèi)，37℃孵育1小時；0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；加入生物素標(biāo)記大鼠抗小鼠工作液50ul，置濕盒內(nèi)37℃孵育15分鐘；0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，濕盒內(nèi)37℃孵育15分鐘；0.01M PBS洗滌3分鐘×3次；DAB顯色劑顯色，鏡下觀察到足夠的棕黃色反應(yīng)出現(xiàn)且背景清晰時，PBS沖洗中止反應(yīng)；蘇木精細(xì)胞核覆染30-60秒鐘；蒸餾水終止反應(yīng)；入鹽水酒精5秒鐘；氨水5秒鐘；蒸餾水沖洗后，80％、90％、100％乙醇各10分鐘梯度脫水；二甲苯處理20分鐘透明化，中性樹膠封片。
檢測結(jié)果乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231在載玻片上培養(yǎng)至匯合度50％時作免疫組化染色，MCF-7細(xì)胞核呈淺藍(lán)色著色(Fig.2A)，表示結(jié)果為陰性。MDA-MB-231細(xì)胞核呈棕色著色(Fig.2B)，結(jié)果為陽性。
3)PCR-SSCP法檢測p53外顯子突變(1)提取MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的DNA培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長至80％匯合度時提取DNA，實驗前更換培養(yǎng)液。0.01M PBS洗滌1次，0.25％胰酶完全消化后轉(zhuǎn)入15ml離心管，1000rpm離心5分鐘，棄上清；10ml 0.01M PBS吹打細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘，棄上清；加入TE 800ul，充分混勻后轉(zhuǎn)入1.5ml離心管內(nèi)；加入10％SDS 100ul和10ug/ml蛋白酶K 100ul充分混勻后，50℃水浴3小時，不時混勻；冷卻至室溫，加入等量飽和酚，充分混勻；加入氯仿200ul充分混勻后，12000rpm離心10分鐘；吸出上清并轉(zhuǎn)移到另一離心管，加入等量異丙醇，充分混勻后室溫靜置10分鐘，12000rpm離心10分鐘；吸棄上清，用75％乙醇洗滌DNA沉淀，12000rpm離心1分鐘收集DNA沉淀；重復(fù)75％乙醇洗滌一次，吸棄乙醇，并于室溫下?lián)]發(fā)痕量乙醇；溶于TE 20-100ul，室溫溶解DNA12-24小時，取出5ul用于濃度、純度測定和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余保存于4℃。
(2)PCR擴增目的DNA片段按材料中引物序列1和下列反應(yīng)體系、反應(yīng)條件，分別以MCF-7和MDA-MB-231的DNA為模板擴增p53外顯子5、6、7、8。1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小。
①PCR反應(yīng)體系(終體積50ul)在0.6u l薄壁離心管中加入10 X PCR reaction buffer 5ul，4X dNTP(各2.5mM)4ul，Mgcl2(25mM)3ul，上下游引物1ul(約10pmol)，DNA模板2ul(約100ng/ul)，Taq酶0.5ul(2.5U/ul)和滅菌雙蒸水33.5ul。
②PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘后，94℃，20秒鐘；60℃，30秒鐘；72℃，20秒鐘，30個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。4℃保存。
(3)SSCP-銀染法檢測基因突變①單鏈構(gòu)向多態(tài)性分析(SSCP)制板后制備8％聚丙烯酰胺凝膠的反應(yīng)液10ml，包括2.66ml 30％丙烯酰胺；2ml 5XTBE；0.073ml 10％過硫酸銨；5.27ml DDH2O。充分混勻加入4.5ul TEMED，充分混勻后迅速灌膠；室溫靜置2h后小心取出梳子，立即用1XTBE電泳緩沖液沖洗加樣孔，將膠置于電泳漕上，加1XTBE電泳緩沖液至浸過加樣孔。PCR產(chǎn)物變性后上樣。取5ul PCR擴增產(chǎn)物，加5ul變性上樣緩沖液于薄壁離心管內(nèi)，15秒鐘低速離心混勻，置98℃水浴中變性10分鐘，即刻置于冰上10分鐘以上。取變性樣品8ul上樣于加樣孔。于室溫，50伏電壓，6-12mA條件電泳2h。
②銀染配制固定液/終止液30％乙醇和10％冰乙酸；染色液0.15％甲醛的AgNO3溶液(濃度1.0g/L)；顯影液30g/L Na2CO3，0.15％甲醛和200ug/L硫代硫酸鈉。仔細(xì)分離玻璃板間的凝膠，放入平皿；去離子水漂洗2次，加入固定液緩慢搖洗至甲苯晴藍(lán)顏色消失，棄固定液；去離子水漂洗3次；避光下染色液銀染30分鐘；棄染色液，去離子水漂洗5-10秒鐘；加入4℃預(yù)泠的顯影液顯色至條帶清楚；加入終止液終止反應(yīng)5分鐘，去離子水漂洗2分鐘x2次；最后干膠保存。
4)p53第8外顯子PCR擴增產(chǎn)物測序PCR大量擴增MDA-MB-231細(xì)胞p53外顯子8300ul，條件同上。1.5％瓊脂糖凝膠100V電泳25分鐘，PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，送醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院測序驗證序列。結(jié)果與p53外顯子8 Gene bank參考序列[gi4731629]進(jìn)行同源性比較。
1.5突變型p53 exon8反義表達(dá)載體的構(gòu)建1)PCR擴增p53 exon8及產(chǎn)物的純化(1)PCR擴增p53 exon8按引物序列2、下列反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，分別以MDA-MB-231的DNA為模板擴增p53外顯子8。1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小。
①PCR反應(yīng)體系(終體積50ul)在0.6ul薄壁離心管中加入10XPCR reaction buffer 5ul，4XdNTP(各2.5mM)4ul，Mgcl2(25mM)3ul，引物1ul(約10pmol)，DNA模板2ul(約100ng/ul)，Taq酶0.5ul(2.5U/ul)和滅菌雙蒸水33.5ul。
②PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘后，94℃，20秒鐘；62℃，30秒鐘；72℃，20秒鐘，35個循環(huán)后72℃延伸10分鐘。4℃保存。
(2)PCR擴增產(chǎn)物的純化PCR擴增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠，電壓100伏下電泳20分鐘。切下含有目的條帶的凝膠。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。切下含有目的條帶的凝膠置于1.5ml離心管內(nèi)，夾碎。每100mg凝膠加入300ul凝膠溶解液，50℃孵育至凝膠溶解；加300ul異丙醇，混勻后室溫靜置15分鐘。吸附管套入收集管，并把溶膠混合物移入吸附管內(nèi)，12000rpm離心1分鐘；棄流出液，加700ul洗滌液，12000rpm離心1分鐘；棄流出液，加200ul洗滌液，12000rpm離心1分鐘；吸附管套入1.5ml離心管，加TE 50ul，12000rpm離心1分鐘，收集洗出液；取5ul于1.5％瓊脂糖凝膠上鑒定特異性。
2)pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化提取(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸肝菌存于-80℃的E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞置于冰中融化；將50ul的菌液移至滅菌預(yù)冷的1.5ml離心管內(nèi)；加入pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒溶液20ul(濃度約10ng)；冰中放置1h；42℃水浴中放置45秒鐘；冰中放置5分鐘；加入37℃預(yù)溫好的SOC培養(yǎng)液，使終體積為1ml；空氣搖床37℃160rpm振蕩培養(yǎng)1h；取100ul菌液涂布于IPTG +xgel、Amp+LB平板；37℃ 300rpm振菌培養(yǎng)過夜。
(2)擴增質(zhì)粒挑取孤立、飽滿、半徑約2mm的藍(lán)色菌落5個，放于5ml Amp+LB培養(yǎng)基中，空氣搖床37℃ 300rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(3)SDS堿裂解法提取質(zhì)粒取1.5ml培養(yǎng)物于1.5ml離心管內(nèi)，4℃、12000rpm離心30秒鐘；吸干培養(yǎng)液，細(xì)菌沉淀重懸于500ul冰冷STE中，4℃、12000rpm離心30秒鐘；吸棄STE，細(xì)菌沉淀重懸于100ul冰預(yù)冷的堿裂解液I中，劇烈振蕩；加入200ul新配制的堿裂解液II，快速顛倒離心管5次，置于冰上；加入150ul冰預(yù)冷的堿裂解液III，反復(fù)顛倒數(shù)次，于冰上5分鐘；4℃、12000rpm離心5分鐘；上清轉(zhuǎn)移到新離心管中；加入等體積的酚∶氯仿(1∶1)，振蕩混合，4℃、12000rpm離心2分鐘，上清轉(zhuǎn)移到新離心管中；加2倍體積的異丙醇，振蕩混合，室溫放置10分鐘；4℃、12000rpm離心5分鐘；小心吸棄上清液，離心管倒置于紙巾上；加入1ml 70％乙醇，顛倒離心管數(shù)次洗滌核酸沉淀；4℃、12000rpm離心2分鐘；吸凈乙醇，重復(fù)70％乙醇洗滌，吸棄所有上清，室溫下使殘存的痕量乙醇揮發(fā)；加50ul含有RNA酶的無菌TE溶解沉淀；取5ul于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。
(4)聚乙二醇(PEG)沉淀法純化質(zhì)粒在50ul提取的pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒DNA中加入8ul 4mol/L Nacl和40ul 13％PEG 8000，置于冰上30分鐘；4℃、12000rpm離心15分鐘；吸去上清(小心，DNA呈透明狀，極易掉失)；用500ul 70％乙醇洗滌沉淀DNA；吸去乙醇，重復(fù)洗滌1次，吸干乙醇，并于室溫下放置使殘存的痕量乙醇揮發(fā)；用20-30ul無菌水溶解質(zhì)粒DNA。
(5)提取純化的質(zhì)粒用EcoRI，PstI內(nèi)切酶酶切后電泳鑒定在滅菌的離心管中加入EcoRI內(nèi)切酶1ul，10xH buffer2ul，質(zhì)粒DNA 10ul(約2ug/ul)和滅菌雙蒸水7ul。于另一管中加入PstI內(nèi)切酶1ul，10xH buffer 2ul，質(zhì)粒DNA 10ul(約2ug/ul)和滅菌雙蒸水7ul。于37℃水浴中反應(yīng)1小時，各加入10xLoading buffer 2ul以終止反應(yīng)，各取5ul于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。
3)pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒和p53 exon8PCR擴增產(chǎn)物的酶切及連接(1)pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒和p53 exon8PCR擴增產(chǎn)物的酶切pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒酶切體系EcoRI內(nèi)切酶和PstI內(nèi)切酶各1ul，10xH buffer2ul，質(zhì)粒DNA 10ul(2ug)和滅菌雙蒸水6ul。p53exon8 PCR擴增產(chǎn)物的酶切體系同pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒酶切體系。兩反應(yīng)體系于37℃水浴中反應(yīng)1小時；各取5ul加入10xLoadingbuffer 1ul，于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，其余放于4℃?zhèn)溆谩?br> (2)酶切產(chǎn)物的純化PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，步驟同前。
(3)pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒和p53 exon8的接連在滅菌管中加入T4 DNA Ligase 1ul，10xT4 DNA LigaseBuffer 2.5ul，exon8 DNAlul(0.83pmol)，質(zhì)粒DNAlul(0.83pmol)和滅菌雙蒸水19.5ul，于16℃水浴過夜；取5ul于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。
4)反義表達(dá)載體pGEM3zf(+/-)p53exon8’的構(gòu)建(重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、提取及酶切鑒定)(1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸肝菌方法同pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸肝菌。
(2)重組質(zhì)粒的擴增在轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的平板中挑取10個孤立、飽滿、半徑約2mm的白斑菌落克隆，分別放于5ml Amp+LB培養(yǎng)基中，空氣搖床37℃300rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(3)SDS堿裂解法提取質(zhì)粒步驟同pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒的提取。
(4)重組質(zhì)粒的酶切鑒定在滅菌的離心管中加入EcoRI內(nèi)切酶和PstI內(nèi)切酶各1ul，10xHbuffer2ul，10個克隆提取的重組質(zhì)粒DNA 10ul和滅菌雙蒸水6ul，37℃水浴反應(yīng)1小時；分別取5ul于1％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。
(5)重組質(zhì)粒測序取2ml培養(yǎng)菌液送大連寶生物公司測序，驗證外源DNA成功插入。結(jié)果與p53外顯子8 Gene bank參考序列[gi4731629]進(jìn)行同源性比較。
5)Mt-p53 exon8反義RNA的制備(體外轉(zhuǎn)錄)(1)線性模板DNA的制備①用于制備反義RNA的線性模板DNA的制備在滅菌的離心管中加入EcoRI內(nèi)切酶1ul，10xH buffer 2ul，重組質(zhì)粒DNA 10ul和滅菌雙蒸水7ul，37℃水浴反應(yīng)1小時；取5ul1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
②用于制備正義RNA的線性模板DNA的制備在滅菌的離心管中加入HindIII內(nèi)切酶1ul，10xM buffer2ul，重組質(zhì)粒DNA 10ul，和滅菌雙蒸水7ul，37℃水浴反應(yīng)1小時；取5ul1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
③線性模板DNA的純化酶切反應(yīng)后的線性質(zhì)粒加入等體積的酚∶氯仿(1∶1)，振蕩混勻；4℃、12000rpm離心5分鐘；移取上層的水相至新的離心管內(nèi)，加入等體積的氯仿，振蕩混勻；4℃、12000rpm離心5分鐘；移取上層的水相至新的離心管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻；4℃、12000rpm離心10分鐘；棄上清，取500ul 70％乙醇洗滌沉淀；吸棄乙醇，重復(fù)洗滌1次，吸干乙醇，并于室溫下放置使殘存的痕量乙醇揮發(fā)；沉淀重懸于50ul無菌水。取500ul純化物于Microcon濾筒的樣品池中，室溫下，2200rpm離心15分鐘，取下樣品池倒置插入另一離心管中，室溫下，5000rpm離心2分鐘回收DNA，分別取2ul于分光光度儀上測濃度及1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余保存4℃。
(2)反義RNA的制備①制備反義p53exon8’RNA在DEPC處理的離心管內(nèi)依次加入10xSP6 RNA Polymerase Buffer2ul，100mM DTT 2ul，0.1％BSA 2ul，NTP Mixture(each 2.5mM)4ul，RNase Inhibitor(40U/ul)0.5ul，EcoRI內(nèi)切酶處理的模板DNA1ul(0.5-lug/ul)，SP6 RNA Polymerase 1ul(50U)，加DEPC處理過的雙蒸水使終體積至20ul。38℃反應(yīng)1小時；加入無Rnase的DNaseI 1ul，37℃反應(yīng)15分鐘；取5ul電泳鑒定。
②制備正義p53exon8’RNA在DEPC處理的1.5ml離心管內(nèi)依次加入10xT7 RNA PolymeraseBuffer 2ul，50mM DTT 2ul，NTP Mixture(each 2.5mM)4ul，RNaseInhibitor(40U/u l)0.5ul，HindIII內(nèi)切酶處理的模板DNA1ul(0.5-1ug/ul)，T7 RNA Polymerase 1ul(50U)，加DEPC處理過的雙蒸水使終體積至20ul。37℃反應(yīng)1小時；加入無Rnase的DNaseI 1ul，37℃反應(yīng)15分鐘；取5ul電泳鑒定。
③RNA產(chǎn)物的純化利用RNA純化試劑盒(RNeasy kit)純化體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。取100ul RNA產(chǎn)物加入350ulβ-巰基乙醇-RLT緩沖液，混勻；加入250ul無水乙醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置15分鐘；將全部液體轉(zhuǎn)移至純化柱中，純化柱套入收集管中，室溫靜置2分鐘；室溫，12000rpm離心5分鐘；棄去收集管中液體，向純化柱內(nèi)加入500ul RPE緩沖液，室溫，12000rpm離心15秒鐘；棄去收集管中液體，向純化柱內(nèi)加入500ul RPE緩沖液，室溫，12000rpm離心2分鐘；棄去收集管中液體，室溫，12000rpm離心1分鐘；將純化柱置于另一個新的1.5ml離心管中，加入30ul 60℃預(yù)熱的DEPC水；室溫靜置3分鐘，室溫，12000rpm離心1分鐘；加入30ul 60℃預(yù)熱的DEPC水；室溫靜置3分鐘，室溫，12000rpm離心1分鐘。取部分純化產(chǎn)物測濃度及電泳鑒定，其余保存-80℃。
2.結(jié)果判定2.1培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀態(tài)MCF-7和MDA-MB-231人類乳腺癌上皮細(xì)胞株都是從轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人的胸腔積液中分離出來的，MCF-7為單層貼壁生長的類圓形細(xì)胞，MDA-MB-231則為單層貼壁生長的梭形細(xì)胞。
2.2免疫染色結(jié)果MDA-MB-231人類乳腺癌上皮細(xì)胞株p53免疫染色陽性。
2.3PCR-SSCP法檢測及測序結(jié)果MDA-MB-231人類乳腺癌上皮細(xì)胞株p53第8外顯子在62位密碼子由AGA突變成AAA(氨基酸由精氨酸變成賴氨酸)。
2.4pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒和p53 exon8 PCR擴增產(chǎn)物的酶切及連接電泳結(jié)果經(jīng)EcoRI和PstI內(nèi)切酶共處理的pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體和p53 exon8 PCR擴增產(chǎn)物，電泳可見在3000bp和100bp處有特異性條帶。經(jīng)酶切處理后的pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體和p53 exon8在T4 DNA連接酶的作用下形成的重組質(zhì)粒電泳條帶，在大于3000bp處有特異性條帶。在只有pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體的反應(yīng)體系中，pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體自連接成大于6000bp的產(chǎn)物。
2.5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、提取及酶切鑒定結(jié)果pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體LacZ基因編碼β-半乳糖苷酶的多克隆位點，在含有X-gal和IPTG的瓊脂培養(yǎng)基，通過α互補形成藍(lán)色菌落。外源p53 exon8 DNA片段插入到多克隆位點，產(chǎn)生不具有α互補功能的片段，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。挑選10個白色菌落，經(jīng)SDS堿裂解法提取質(zhì)粒，并用EcoRI+PstI雙酶切鑒定，10個克隆均有pGEM3zf(+/-)(3100bp)和p53 exon8(96bp)目的片段切出，證明反義表達(dá)載體pGEM3zf(+/-)p53exon8’構(gòu)建成功。
2.6重組質(zhì)粒的測序結(jié)果及與參考序列的同源性進(jìn)行比較結(jié)果在Gene bank內(nèi)應(yīng)用Blast軟件對測序結(jié)果進(jìn)行p53第8外顯子序列同源性比較，結(jié)果與第一部分研究的p53第8外顯子測序結(jié)果一致，密碼子由AGA變成AAA，翻譯的蛋白由精氨酸變成賴氨酸，證明重組質(zhì)粒pGEM3zf(+/-)p53exon8’構(gòu)建成功。
2.7Mt-p53exon8反義RNA的體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果重組質(zhì)粒DGEM3zf(+/-)p53exon8’經(jīng)EcoRI內(nèi)切酶或HindIII內(nèi)切酶處理后成線性質(zhì)粒，電泳呈一條帶。未經(jīng)酶切處理的質(zhì)粒是環(huán)狀和線狀共存，電泳呈兩條帶。以mt-p53exon8基因片段為轉(zhuǎn)錄模板，利用T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶，誘導(dǎo)重組質(zhì)粒上的T7啟動子和SP6啟動子合成正義p53exon8’RNA和反義p53exon8’RNA，體外轉(zhuǎn)錄合成的RNA在紫外分光儀測定濃度及分析OD260/OD280。
二.反義核酸特異性封閉p53基因突變點1.技術(shù)措施1.1三種方法介導(dǎo)ASp53exon8’RNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231①分組反義RNA直接加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞設(shè)為無血清細(xì)胞培養(yǎng)液組；加入生理鹽水內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞設(shè)為生理鹽水組；利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染設(shè)為脂質(zhì)體介導(dǎo)組。每組再設(shè)空白對照組，轉(zhuǎn)染正義RNA對照組和轉(zhuǎn)染反義RNA的實驗組。
②轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的準(zhǔn)備MDA-MB-231計數(shù)至5×104/ml種植到24孔板，每孔1ml。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時。
③制備RNA轉(zhuǎn)染同一天依照上述方法體外轉(zhuǎn)錄方案制備Sp53exon8’RNA和ASp53exon8’RNA，純化后測濃度和用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
④無血清細(xì)胞培養(yǎng)液組轉(zhuǎn)染步驟移出培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液，DEPC處理的0.01M PBS洗滌細(xì)胞2次，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液200ul的為空白對照組；加入0.8ug Sp53exon8’RNA配制的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液200ul的為正義RNA對照組；加入0.8ugASp53exon8’RNA配制的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液200ul的為實驗組。CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3小時后移出溶液，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，加入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
⑤生理鹽水組轉(zhuǎn)染步驟移出培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)液，DEPC處理的0.01M PBS洗滌細(xì)胞2次，加入DEPC處理的生理鹽水200ul的為空白對照組；加入0.8ug Sp53exon8’RNA配制的生理鹽水200ul的為正義RNA對照組；加入0.8ug ASp53exon8’RNA配制的生理鹽水200ul的為實驗組。CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1小時后移出溶液，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，加入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
⑥脂質(zhì)體介導(dǎo)組轉(zhuǎn)染步驟(依照RNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞試劑盒操作)分別在DEPC處理過的3個離心管中加入Enhaneer R1.6ul和BufferEC-R(根據(jù)轉(zhuǎn)染的RNA濃度調(diào)制，使Enhancer R、Buffer EC-R和RNA溶液的終體積為100ul)，充分混勻；加入0.8ug Sp53exon8’RNA(正義RNA對照組)和0.8ug ASp53exon8’RNA(實驗組)，混勻后室溫靜置5分鐘；加入TransMessenger transfection reagent(含陽離子脂質(zhì)體)2ul，混勻后室溫靜置10分鐘，加無血清RPMI-1640培養(yǎng)液100ul后即轉(zhuǎn)染細(xì)胞。3h后移出轉(zhuǎn)染溶液，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，加入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
1.2細(xì)胞生長實驗細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后的24小時(1天)、48小時(2天)、72小時(3天)、96小時(4天)和120小時(5天)計數(shù)，并計算生長抑制率。方法如下吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS沖洗1次，加入0.25％胰酶消化，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2分鐘，鏡下觀察細(xì)胞變圓并將近脫壁時，加入培養(yǎng)液終止消化，吸管移至無菌離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入1ml培養(yǎng)液，用吸管吹打細(xì)胞制成單個細(xì)胞懸液。吸出40ul作計數(shù)用，其余放回培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。在顯微鏡100倍放大倍數(shù)下計數(shù)血細(xì)胞計數(shù)板10個大方格中的細(xì)胞，重復(fù)計數(shù)一次。細(xì)胞總數(shù)(個/ml)＝細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)×103。生長抑制率＝[(Nnc-Na)-(Nnc-Ns)]/(Nnc-No)×100％。No開始接種時的細(xì)胞數(shù)，Na培養(yǎng)N天后轉(zhuǎn)染ASp53exon8’RNA的細(xì)胞數(shù)，NsN天之后轉(zhuǎn)染Sp53exon8’RNA對照組的細(xì)胞數(shù)，NncN天之后空白對照組的細(xì)胞數(shù)。
1.3MTT比色法測定細(xì)胞生長活性MDA-MB-231細(xì)胞計數(shù)至3×105/ml種植到96孔板，每孔100ul。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，依照2.2.31)3種方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時；加20ul 0.5％MTT溶液于各孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4小時；去除培養(yǎng)孔內(nèi)全部液體，每孔加入150ulDMSO，充分振蕩；在酶標(biāo)儀上測定570nm波長的吸光度值(A值)，取平均值代表細(xì)胞生長活性。結(jié)果于CS2000統(tǒng)計軟件行t檢驗分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
1.4TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡依照2.2.31)三種方法轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后計數(shù)并制成7×104/ml細(xì)胞懸液，取100ul于載玻片上，培養(yǎng)2h后加培養(yǎng)液至載玻片全部被浸在培養(yǎng)液中；放培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后48h；PBS沖洗2次，4％多聚甲醛室溫固定30分鐘；PBS沖洗1次，0.3％H2O2甲醇溶液室溫孵育30分鐘；PBS沖洗1次，0.1％TritonX-100溶液冰浴中孵育2分鐘；PBS沖洗3分鐘×2次，滴加50ul TUNEL反應(yīng)混合液(含末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶)，37℃、濕盒中孵育60分鐘；PBS沖洗3次，每次3分鐘，滴加50ul轉(zhuǎn)化劑-POD，37℃、濕盒中孵育30分鐘；PBS沖洗3分鐘×3次，加入50ul DAB，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗，蘇木精覆染，封片。
1.5免疫組化法檢測突變P53蛋白表達(dá)三種方法轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，制成7×104/ml細(xì)胞懸液，取100ul于載玻片上，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時后加培養(yǎng)液至載玻片全部被浸在培養(yǎng)液中；培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后48小時進(jìn)行免疫組化染色檢測突變型p53蛋白表達(dá)情況，方法同上。
1.6免疫組化法檢測脂質(zhì)體介導(dǎo)ASp53exon8’RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不同時間P53蛋白的表達(dá)依照上述方法RNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞試劑盒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3小時后換入10％FBS RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)2小時。制成7×104/ml細(xì)胞懸液，取100ul于載玻片上，培養(yǎng)2小時后加培養(yǎng)液至載玻片全部被浸在培養(yǎng)液中；繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后12小時，24小時，48小時，72小時并分別做p53免疫組化染色檢測p53蛋白表達(dá)情況，p53免疫組化方法同上。計算低倍鏡下隨機10個視野中100個細(xì)胞的染色結(jié)果，細(xì)胞核棕色染色為陽性細(xì)胞(++)，示mt-p53蛋白的表達(dá)未受阻斷；淺棕色染色為弱陽性細(xì)胞(+)，示部分mt-p53蛋白的表達(dá)受到阻斷；淺藍(lán)色染色為陰性細(xì)胞(-)，示mt-p53蛋白的表達(dá)被完全阻斷。計算結(jié)果用CS2000統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。
2.結(jié)果判定2.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長狀態(tài)細(xì)胞在含RNA的生理鹽水中培養(yǎng)1小時后，大部分細(xì)胞變圓，但未從培養(yǎng)板上脫離。換入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)3小時后，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)。細(xì)胞在含RNA的無血清培養(yǎng)液和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染溶液中孵育3小時，生長狀態(tài)良好。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，空白對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，但在轉(zhuǎn)染Sp53exon8’RNA和ASp53exon8’RNA的兩組培養(yǎng)板內(nèi)可見部分細(xì)胞殘骸存在。
2.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長抑制率MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)三種方法轉(zhuǎn)染后，在相同的細(xì)胞培養(yǎng)(含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng))條件下，轉(zhuǎn)染24小時始計數(shù)，連續(xù)計數(shù)5天，并按細(xì)胞生長實驗中的公式計算細(xì)胞生長抑制率。各組用ASp53exon8’RNA處理的細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后48小時比各自對照組生長緩慢，并于48小時時生長抑制率最高。無血清培養(yǎng)液組48小時生長抑制率為28.90％，脂質(zhì)介導(dǎo)組48小時生長抑制率為21.65％，生理鹽水組為31.80％，隨后生長抑制率降低。
2.3MTT吸收值經(jīng)ASp53exon8’RNA處理過的實驗細(xì)胞于48小時作MTT吸收實驗，MTT吸收值均較空白組和對照組細(xì)胞吸收值減弱，無血清培養(yǎng)液組中空白對照組的吸收均值為1.178±0.015，Sp53exon8’RNA對照組為1.163±0.034，ASp53exon8’RNA實驗組為1.053±0.057。脂質(zhì)體介導(dǎo)組中空白對照組的吸收均值為1.161±0.029，S p53exon8’RNA對照組為0.798±0.074，ASp53exon8’RNA實驗組為0.718±0.011。生理鹽水組中空白對照組的吸收值為1.170±0.011，Sp53exon8’RNA對照組為1.156±0.017，ASp53exon8’RNA實驗組為1.003±0.077。實驗組與空白組和對照組相比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
2.4TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果經(jīng)ASp53exon8’RNA處理的實驗組細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)可見被染成棕色月牙狀的凋亡小體，其中無血清培養(yǎng)液組和生理鹽水組較脂質(zhì)介導(dǎo)組顯著。另外，凋亡小體在兩個對照組的部分細(xì)胞內(nèi)也被同時觀察到。
2.5轉(zhuǎn)染細(xì)胞的p53免疫組化染色結(jié)果經(jīng)三種方法介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別于48小時后作p53免疫組化染色，結(jié)果見無血清培養(yǎng)液組和生理鹽水組中轉(zhuǎn)染ASp53exon8’RNA的實驗細(xì)胞，部分細(xì)胞核為淺藍(lán)色染色，部分細(xì)胞核呈棕色染色，還有部分細(xì)胞核呈淺棕色染色。無血清培養(yǎng)液組中的空白對照組和轉(zhuǎn)染Sp53exon8’RNA對照組及生理鹽水組中的空白對照組的細(xì)胞核呈棕色染色；脂質(zhì)介導(dǎo)組轉(zhuǎn)染ASp53exon8′RNA的實驗細(xì)胞大部分為淺棕色染色，部分呈淺藍(lán)色染色，小部分細(xì)胞呈棕色染色?？瞻讓φ战M和轉(zhuǎn)染Sp53exon8’RNA對照組細(xì)胞都呈棕色染色。脂質(zhì)體介導(dǎo)組與其余兩組比較，淺藍(lán)色和淺棕色核著色的細(xì)胞數(shù)明顯多過無血清培養(yǎng)液組和生理鹽水組，而呈棕色著色的細(xì)胞數(shù)少于其他兩組。
2.6脂質(zhì)體介導(dǎo)ASp53exon8’RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的p53免疫組化染色結(jié)果細(xì)胞通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染ASp53exon8’RNA后12h，24h，48h和72小時作p53免疫組化染色，可見12小時，24小時和48小時的實驗組細(xì)胞，以細(xì)胞核呈淺藍(lán)色和淺棕色染色為主。而72小時的實驗組細(xì)胞均呈棕色染色。隨機計算低倍鏡下10個視野中100個細(xì)胞的染色結(jié)果，棕色著色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，示p53蛋白合成沒被阻斷。淺棕色著色細(xì)胞為弱陽性細(xì)胞，示部分p53蛋白合成被阻斷。淺藍(lán)色著色細(xì)胞為陰性細(xì)胞，示p53蛋白合成被完全阻斷。
計算結(jié)果轉(zhuǎn)染ASp53exon8’RNA的實驗組細(xì)胞，12小時沒被阻斷細(xì)胞占34％，部分阻斷細(xì)胞占42％，完全阻斷細(xì)胞占25％。24小時沒被阻斷細(xì)胞率占23％，部分阻斷細(xì)胞占27％，完全阻斷細(xì)胞率占48％。48小時沒被阻斷細(xì)胞率占30％，部分阻斷細(xì)胞占52％，完全阻斷細(xì)胞占17％。
結(jié)果經(jīng)方差分析統(tǒng)計，示免疫組化結(jié)果與時間有密切關(guān)系(p＜0.001)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染ASp53exon8’RNA 12小時開始，p53表達(dá)即可被抑制，24小時時抑制作用最強，陰性細(xì)胞從25％增高到49％，隨后抑制作用逐漸下降，至72小時完全消失。
權(quán)利要求
1.一種突變型p53基因反義表達(dá)載體，其特征在于該載體上連接有突變的p53外顯子8基因序列GAATTCGCTT TGAGGTGCGT GTTTGTGCCT GTCCTGGGAA AGACCGGCGCACAGAGGAAG GAGGTCTCCG CAAGAAAGGG GAGCCTCACC ACTGCAGGCATGCAAGGCT；并由此載體能夠轉(zhuǎn)錄出與此突變點特異性結(jié)合的互補反義RNA，從而阻斷突變p53信號的表達(dá)。
2.一種突變型p53基因反義表達(dá)載體的制備方法，其特征在于以免疫組化篩選突變型p53細(xì)胞系、PCR-SSCP法及基因測序確定突變的p53外顯子和基因序列，把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/-)質(zhì)粒載體的多克隆位點處，構(gòu)建pGEM3zf(+/-)p53exon8’重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于反義p53exon8’RNA是用EcoRI限制性內(nèi)切酶處理重組載體質(zhì)粒，使環(huán)狀重組質(zhì)粒成線狀質(zhì)粒，在SP6 RNA聚合酶存在的系統(tǒng)中，以線狀質(zhì)粒雙鏈DNA的正鏈為模板，合成與mt-p53外顯子8mRNA互補的反義RNA，p53第8外顯子的第62位密碼子由AGA變成AAA，翻譯的蛋白由精氨酸變成賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種突變型p53基因反義表達(dá)載體及其制備方法，屬于基因工程技術(shù)。本發(fā)明載體上連接有突變的p53外顯子8基因序列，并能夠轉(zhuǎn)錄出與此突變點特異性結(jié)合的互補反義RNA，從而阻斷突變p53信號的表達(dá)；其制備方法是采用免疫組化篩選突變型p53細(xì)胞系、PCR－SSCP法及基因測序確定突變的p53外顯子和基因序列，把含有突變位點的p53外顯子8序列插入pGEM3zf(+/－)質(zhì)粒載體的多克隆位點處，構(gòu)建pGEM3zf(+/－)p53exon8’重組載體。這樣制備的反義RNA被直接導(dǎo)入研究細(xì)胞內(nèi)，因為是直接導(dǎo)入反義RNA本身，所導(dǎo)入的RNA分子量小，較易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，操作簡單；由于體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)能合成較多量的產(chǎn)物，可隨時重復(fù)操作，滿足需要的RNA量。
文檔編號C12N15/63GK1796562SQ20041009401
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者付麗, 許少峰, 張斌, 張媛媛, 馮玉海 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院