專利名稱：一種鑒定外周血dna肝癌相關(guān)p53基因249位密碼子突變的多重pcr的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及一種一次性擴(kuò)增多個(gè)P53基因片段，從而鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變的多重PCR的試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病，在我國(guó)發(fā)病率較高，病人占全球的40％～50％，年死亡率達(dá)20.4/10萬(wàn)人。隨著分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，研究表明，肝癌的發(fā)生和進(jìn)展與抑癌基因的突變及失活/癌基因的異?；罨芮邢嚓P(guān)，是其產(chǎn)生的重要分子生物學(xué)基礎(chǔ)。P53基因是當(dāng)前受到廣泛重視，已被深入研究了解的一個(gè)抑癌基因。P53基因的突變而導(dǎo)致的P53蛋白功能缺失已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。在我國(guó)及多數(shù)發(fā)展中國(guó)家，肝細(xì)胞肝癌(肝癌)的發(fā)生與黃曲霉素B1經(jīng)食物攝入以及乙型肝炎病毒感染密切相關(guān)，且這類病人多伴有P53基因249位密碼子突變。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約40％以上的肝細(xì)胞肝癌伴有P53基因249位密碼子突變。
傳統(tǒng)的肝癌輔助診斷手段主要包括血清學(xué)檢測(cè)和影像學(xué)檢測(cè)兩大類。血清學(xué)檢測(cè)主要是利用血清中的甲胎蛋白水平測(cè)定對(duì)肝癌進(jìn)行診斷，如中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200610112962.1號(hào)公開(kāi)的一種檢測(cè)肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱及含有該離心柱的試劑盒，該發(fā)明涉及了一種檢測(cè)肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱。該離心柱由上部分離管和下部收集管組成。上部分離管裝有偶聯(lián)小扁豆凝集素(LCA)的親合介質(zhì)，上部分離管底部是一個(gè)濾布，下部收集管中裝有緩沖溶液。小扁豆凝集素(LCA)能與甲胎蛋白異質(zhì)體糖鏈相結(jié)合。另外，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200510108154.3號(hào)公開(kāi)的一種凝集素競(jìng)爭(zhēng)法肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒可作為肝癌早期診斷的指標(biāo)，判斷肝癌的發(fā)生，為肝癌的預(yù)防、診斷、治療提供直接的支持。但由于在肝癌患者中仍有約56.6％可能出現(xiàn)甲胎蛋白檢測(cè)陰性，且甲胎蛋白水平無(wú)法準(zhǔn)確反映患者的疾病進(jìn)展及預(yù)后，因此仍具有一定的應(yīng)用局限性。
在對(duì)肝癌病人外周血DNA突變分析的研究中發(fā)現(xiàn)，外周血DNA的P53基因249位密碼子突變檢測(cè)可能作為肝癌的早期診斷指標(biāo)，與其他檢查指標(biāo)相結(jié)合，可以進(jìn)一步提高肝癌診斷的準(zhǔn)確性。此外，前瞻性研究表明，伴有外周血DNA P53基因249位密碼子突變的肝臟硬化病人，在兩年內(nèi)發(fā)生肝細(xì)胞肝癌的機(jī)率大大高于無(wú)外周血DNA P53基因249位密碼子突變的肝硬化病人，因此外周血DNA的P53基因249位密碼子突變可能作為發(fā)生肝細(xì)胞肝癌的診斷和預(yù)測(cè)指標(biāo)。
P53基因位于人17號(hào)染色體短臂上，全長(zhǎng)16-20Kb，共有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，其中第7外顯子的249位密碼子是最常見(jiàn)的肝癌相關(guān)P53基因突變位置，在我國(guó)占肝癌患者p53突變的80％以上。盡管其突變?cè)诶碚撋峡赡馨l(fā)生在三個(gè)堿基中的任意一個(gè)或者幾個(gè)，但大量的研究證實(shí)，對(duì)于肝癌的P53突變，絕大多數(shù)的突變集中于少數(shù)幾種單堿基突變(SNP)類型上。
傳統(tǒng)的P53基因突變研究主要通過(guò)PCR-SSCP(聚合酶鏈反應(yīng)--單鏈構(gòu)相多態(tài)性)進(jìn)行研究，并需通過(guò)酶切和測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，利用這些方法，目前已有大量研究對(duì)我國(guó)肝細(xì)胞肝癌常見(jiàn)的P53基因突變類型進(jìn)行了詳盡的分析和統(tǒng)計(jì)。盡管PCR-SSCP已在科研領(lǐng)域應(yīng)用于P53基因突變的分析，但其步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，其較高的成本和昂貴的儀器設(shè)備也是許多中小型實(shí)驗(yàn)室所無(wú)法承擔(dān)的。因此，有必要在上述現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，提供新的用于鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變的多重PCR的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即是提供一種鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變的多重PCR的試劑盒。
本發(fā)明方法的基本思路是選取肝癌常見(jiàn)的P53基因249位密碼子突變，利用特異性引物擴(kuò)增方法對(duì)P53基因249位密碼子上的多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。
此處，所說(shuō)的特異性引物PCR方法是在SNP的突變位置上，設(shè)計(jì)兩條特異性的正向PCR擴(kuò)增引物，每一條引物僅能針對(duì)一種突變(野生型和突變型)進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)，設(shè)計(jì)一條公共的反向PCR擴(kuò)增引物。當(dāng)利用這三條引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，不同特異性正向引物分別與反向引物共同作用后的PCR產(chǎn)物大小有差異(我們?cè)O(shè)計(jì)的試劑盒中的大小差異為2bp)，從而可以通過(guò)電泳檢測(cè)時(shí)進(jìn)行分型。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的一種鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變的多重PCR的試劑盒由分離包裝的引物混合物、PCR反應(yīng)液和分子量標(biāo)記物組成，其特征是所述引物混合物是由公共順向引物、野生型特異性引物、7476/T突變型引物、746G/T突變型引物、745A/G突變型引物共同組成，其中，野生型特異性引物的序列為5`-TGTGATGATGGTGGGGATGGGCCTC-3`7476/T突變型引物的序列為5`-TGATGATGGTGGGGATGGGACTC-3`746G/T突變型引物的序列為5`-ATGATGGTGGGGATGGGCATC-3`745A/G突變型引物的序列為5`-GATGGTGGGGATGGGCCCC-3`公共順向引物的序列為5`-TAGGTTGGCTCTGACTGTA-3`在所述引物混合物中，各引物之間的重量比如下公共順向引物∶745A/G突變型引物∶746G/T突變型引物∶747G/T突變型引物∶野生型特異性引物＝1∶0.82∶0.93∶1.14∶0.89；所述分子量標(biāo)記物按以下方式制取通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳得到所述野生型引物和747G/T突變型引物、746G/T突變型引物、745A/G突變型引物的四種PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證其片段大小分別為99，97，95，93bp，將以上四種PCR產(chǎn)物以重量相等的比例混合后即得到所述分子量標(biāo)記物。
在通過(guò)本發(fā)明的試劑盒所得到的反應(yīng)體系中，可以對(duì)P53基因249位密碼子上的三種SNP同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，即對(duì)P53基因上3種SNP同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)前述的原理，我們可以得知，對(duì)一種SNP擴(kuò)增需要3條引物，即2條特異性的正向引物，1條反向的公共引物，理論上3種SNP共需要9條引物。但是由于我們本試劑盒所檢測(cè)的3個(gè)P53基因的SNP在相鄰的位置上，同時(shí)位于249密碼子上，它們具有共同的野生型特異性引物和三條不同的特異性的突變型引物，因此本試劑盒共設(shè)計(jì)有5條引物，即3條特異性突變型引物(745A/G突變型、746G/T突變型、747G/T突變型)、1條野生型特異性引物和1條公共的反向引物。在此情形下，它們中的任何一條特異性的正向引物與公共的反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)之后的PCR產(chǎn)物大小均有差異，從而可以通過(guò)電泳技術(shù)進(jìn)行分離檢測(cè)，并通過(guò)不同的電泳產(chǎn)物判斷不同的基因型。
在本發(fā)明中，擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)是極為關(guān)鍵的，其設(shè)計(jì)需要考慮以下三個(gè)要素①、特異性引物必須設(shè)計(jì)在突變點(diǎn)上，同時(shí)多條特異性之間必須能夠共存，彼此之間不會(huì)發(fā)生類似引物二聚體反應(yīng)等。②、選取適當(dāng)?shù)囊镩L(zhǎng)度，18～24個(gè)堿基構(gòu)成的寡核苷酸鏈?zhǔn)潜容^優(yōu)化的引物長(zhǎng)度；③、選取引物中堿基GC的含量和引物的退火溫度Tm必須相似。但是，并不是簡(jiǎn)單地滿足上述三個(gè)要素的引物對(duì)就能夠充當(dāng)本發(fā)明中所說(shuō)的擴(kuò)增引物對(duì)。雖然，從理論上講，這些引物對(duì)可以按一定的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)并得出，但在實(shí)踐中可以發(fā)現(xiàn)，依據(jù)引物設(shè)計(jì)原理所設(shè)計(jì)出的引物能夠?qū)嶋H應(yīng)用且能取得較佳效果的并不多。也就是說(shuō)，真正能夠?qū)嶋H應(yīng)用的“引物對(duì)”必須經(jīng)過(guò)大量的、艱苦的試驗(yàn)才能得到，這是一個(gè)對(duì)引物的優(yōu)選過(guò)程。基于上述三個(gè)要素的限制，我們?cè)?jīng)設(shè)計(jì)出了數(shù)十對(duì)引物，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選后再篩出其中5條應(yīng)用于本發(fā)明的試劑盒。
我們之所以強(qiáng)調(diào)引物的設(shè)計(jì)是本發(fā)明的技術(shù)難點(diǎn)，是因?yàn)槠潆y度在于引物設(shè)計(jì)的局限性較大。本發(fā)明中的突變點(diǎn)一側(cè)的引物設(shè)計(jì)受限，其3’端必須緊鄰?fù)蛔兾恢?，而其長(zhǎng)度方面又不能覆蓋其他突變點(diǎn)，同時(shí)還需要在5’端設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的錯(cuò)配堿基以顯示差異。因此，5’端引物的設(shè)計(jì)相對(duì)更加重要。在完成本發(fā)明的過(guò)程中，我們?cè)芯吭O(shè)計(jì)出數(shù)十對(duì)引物，經(jīng)過(guò)軟件初步篩選分析后選擇了4條公共引物，2類突變點(diǎn)側(cè)的引物(不包含突變點(diǎn))。經(jīng)過(guò)實(shí)踐檢驗(yàn)后，又選擇了效果最好的作為上述試劑盒中的引物，這也正是本發(fā)明的主要技術(shù)項(xiàng)獻(xiàn)。現(xiàn)略舉在完成本發(fā)明的過(guò)程中所淘汰的其余效果不好的引物如下突變側(cè)aaacacttttcgacatagtgatagcgatggtctggccccttaccaccatccactacaact突變下游側(cè)gcccatcctcaccatcatcacactggaag在本發(fā)明中，所說(shuō)的多重PCR即是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣產(chǎn)生不同長(zhǎng)度特異性靶區(qū)域片段，經(jīng)凝膠電泳觀察各特異擴(kuò)增片段，用于鑒定不同擴(kuò)增片段。同時(shí)，由于PCR擴(kuò)增具有引物的3’端依賴性，如果引物的3’端發(fā)生堿基錯(cuò)配，PCR反應(yīng)就無(wú)法正常進(jìn)行，因而就無(wú)法得到擴(kuò)增產(chǎn)物。利用該原理，如果針對(duì)不同的P53基因249密碼子突變?cè)O(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的上游引物，將突變點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物的3’端，不同特異性引物對(duì)應(yīng)相同的下游引物，則不同的特異性上游引物經(jīng)擴(kuò)增后只能得到相應(yīng)產(chǎn)物，且不同的上游引物對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度不同，利用電泳分離染色后即可鑒定樣本是否存在P53基因249位密碼子突變，并能了解是否為我們預(yù)先設(shè)計(jì)的特異性上游引物對(duì)應(yīng)的突變類型。
如前所述，在本發(fā)明的試劑盒中，特別設(shè)置的引物混合物所擴(kuò)增的基因?yàn)镻53基因上+747G/T，+746G/T，+745A/G。其中，野生型特異性引物5`-TGTGATGATGGTGGGGATGGGCCTC-3`用于擴(kuò)增正常的基因，所得擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為99bp；747G/T突變型引物5`-TGATGATGGTGGGGATGGGACTC-3`用于擴(kuò)增異常的基因，所得擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為97bp；746G/T突變型引物5`-ATGATGGTGGGGATGGGCATC-3`用于擴(kuò)增異常的基因，所得擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為95bp；745A/G突變型引物5`-GATGGTGGGGATGGGCCCC-3`用于擴(kuò)增異常的基因，所得擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為93bp；公共順向引物5`-TAGGTTGGCTCTGACTGTA-3`用于與上述四條引物配對(duì)。
因此，就本發(fā)明而言，通過(guò)上述引物的設(shè)置，就可以使擴(kuò)增出的產(chǎn)物長(zhǎng)度不一致，從而能夠鑒定樣本是否存在P53基因249位密碼子突變，并能了解是否為我們預(yù)先設(shè)計(jì)的特異性上游引物對(duì)應(yīng)的突變類型。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了新的用于鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變的多重PCR的試劑盒。
在本發(fā)明的試劑盒中，我們通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳得到所述野生型引物和747G/T突變型引物、746G/T突變型引物、745A/G突變型引物的四種PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證其片段大小分別為99，97，95，93bp，將以上四種PCR產(chǎn)物以重量相等的比例混合后即得到所述分子量標(biāo)記物。該分子量標(biāo)記物在經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染后，可準(zhǔn)確分辨上述四種大小的目的片段。
需要特別說(shuō)明的是，就本發(fā)明的試劑盒來(lái)說(shuō)，試劑盒中的PCR反應(yīng)液可以直接由市售的現(xiàn)有產(chǎn)品充當(dāng)，如ABI公司生產(chǎn)的TaqMan universal master mixPCR反應(yīng)液等；但也可以是由分離包裝的無(wú)MgCl2的PCR體系緩沖液、dNTP、MgCl2(氯化鎂)、DNA聚合酶(Taq酶)和DDH2O(雙蒸水)組成的PCR反應(yīng)液。并且，所述引物和反應(yīng)液之間的用量比例的選取是次要的，即該用量比例的選取并不構(gòu)成本發(fā)明技術(shù)方案的必要條件。例如，參照前面的敘述可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)試劑盒中的PCR反應(yīng)液直接采用市售的現(xiàn)有產(chǎn)品(如ABI公司生產(chǎn)的TaqManuniversal master mix PCR反應(yīng)液)時(shí)，PCR反應(yīng)液與引物之間的用量比例會(huì)因市售產(chǎn)品的不同而有所不同。另外，擴(kuò)增時(shí)使用的擴(kuò)增儀可以直接采用現(xiàn)有市售的產(chǎn)品，如ABI 9600型擴(kuò)增儀等。
當(dāng)然，為了讓本試劑盒的使用效果更好，本發(fā)明推薦采用如下方案讓所述PCR反應(yīng)液由無(wú)MgCl2的PCR體系緩沖液、dNTP、MgCl2、DNA聚合酶和DDH20組成，當(dāng)試劑盒中各組份的純度均以100％計(jì)時(shí)，各組份的體積比為引物混合物1μL、10×無(wú)MgCl2的PCR體系緩沖液1mL、dNTP 1mL、MgCl21mL、DNA聚合酶500U、DDH2O 10mL和分子量標(biāo)記物500μL。如果試劑盒中的各組份直接采用上述用量，則在通常情況下，所制成的試劑盒可用于進(jìn)行200～250次PCR反應(yīng)。
此處，所說(shuō)的“試劑盒中各組份的純度均以100％計(jì)”是一種理論上的計(jì)量方法(實(shí)踐中當(dāng)然無(wú)法做到各組份的純度均為100％)，但它可以將不同純度或濃度的組份均折算成純度為100％，申請(qǐng)人認(rèn)為，這種計(jì)量方法更便于表述各組份之間的用量比。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實(shí)施例作更進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實(shí)施例中所涉及的內(nèi)容。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例本實(shí)施例中的試劑盒由分離包裝的引物混合物、PCR反應(yīng)液和分子量標(biāo)記物組成，其特征是所述引物混合物是由公共順向引物、野生型特異性引物、747G/T突變型引物、746G/T突變型引物、745A/G突變型引物共同組成，其中，野生型特異性引物的序列為5`-TGTGATGATGGTGGGGATGGGCCTC-3`747G/T突變型引物的序列為5`-TGATGATGGTGGGGATGGGACTC-3`746G/T突變型引物的序列為5`-ATGATGGTGGGGATGGGCATC-3`745A/G突變型引物的序列為5`-GATGGTGGGGATGGGCCCC-3`公共順向引物的序列為5`TAGGTTGGCTCTGACTGTA-3`在所述引物混合物中，各引物之間的重量比如下公共順向引物∶745A/G突變型引物∶746G/T突變型引物∶747G/T突變型引物∶野生型特異性引物＝1∶0.82∶0.93∶1.14∶0.89；在本實(shí)施例中，所述分子量標(biāo)記物按以下方式制取通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳得到所述野生型引物和747G/T突變型引物、746G/T突變型引物、745A/G突變型引物的四種PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證其片段大小分別為99，97，95，93bp，將以上四種PCR產(chǎn)物以重量相等的比例混合后即得到所述分子量標(biāo)記物。
本實(shí)施例中的試劑盒是針對(duì)200次PCR擴(kuò)增制作的。同時(shí)，為了便于用戶使用，本實(shí)施例中直接讓PCR反應(yīng)液由無(wú)MgCl2的PCR體系緩沖液、dNTP、MgCl2、DNA聚合酶和DDH20組成，當(dāng)試劑盒中各組份的純度均以100％計(jì)時(shí)，各組份的體積比為引物混合物1μL、10×無(wú)MgCl2的PCR體系緩沖液1mL、dNTP 1mL、MgCl21mL、DNA聚合酶500U、DDH2010mL和分子量標(biāo)記物500μL。
為了進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)施例中所制作試劑盒的使用方法和使用效果，下面繼續(xù)說(shuō)明將上述試劑盒用于鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變時(shí)的具體過(guò)程及使用效果。
實(shí)驗(yàn)步驟1.DNA提取按照常規(guī)的DNA提取方法進(jìn)行DNA提取。
2.目的基因的PCR擴(kuò)增采用上述試劑盒的試劑和提取的DNA模板構(gòu)成反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總體積為37.5μL。其中引物2μL，DNA模板用量2～4ng，dNTP(0.25mM)用量4.0μL，10×無(wú)MgCl2的PCR體系緩沖液用量3.75μL，MgCl2(2.25mM)用量2.25μL，DNA聚合酶(1U/μL)用量3U，DDH2O用量22.25μL。
對(duì)目的基因P53基因249位密碼子上的三種SNP同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，即對(duì)P53基因上3種SNP同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增使用ABI 9600型擴(kuò)增儀，熱循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，59℃退火45sec，72℃延伸45sec，27個(gè)循環(huán)，72℃保溫7min。
3.外周血DNA的P53基因249位密碼子突變分析樣本在膠聯(lián)度5％、膠濃度10％的PAGE凝膠中，經(jīng)過(guò)電壓800V電泳50分鐘，電泳時(shí)PCR產(chǎn)物加入2-5μL(由使用者調(diào)整)，分子量標(biāo)記物在一條泳道單獨(dú)電泳，加入量2-5μL，樣本銀染顯色后，兩個(gè)堿基的差別能夠清晰的在基因分型結(jié)果圖中被肉眼分辨。
另外，我們利用該方法對(duì)45例成都地區(qū)經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌患者的術(shù)前外周血DNAP53基因249位密碼子突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn)17例患者為陽(yáng)性，其陽(yáng)性率約為38％，在63例不伴腫瘤的乙肝患者7例陽(yáng)性，其陽(yáng)性率約為11％(p＝0.002)。15例術(shù)前DNAP53基因249位密碼子突變陽(yáng)性肝癌患者經(jīng)手術(shù)切除腫瘤后隨訪發(fā)現(xiàn)11例患者在術(shù)后1年內(nèi)發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而28例術(shù)前外周血DNA P53基因249位密碼子突變陰性肝癌患者僅6例在術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生肝內(nèi)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(73％vs 18％p＝0.001)。通過(guò)上述檢測(cè)結(jié)果，可以說(shuō)明本發(fā)明在肝癌患者的診斷上具有一定價(jià)值，但其更重要的作用在于預(yù)測(cè)肝癌患者在手術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，以便制定更為優(yōu)化的術(shù)后治療方案。因此，本專利具有較好的使用效果，從而更好地證明了本發(fā)明的實(shí)用性和創(chuàng)造性。
本發(fā)明所涉及的基因組序列表如下<210>1<211>
<212>DNA<213>人類(homo sapiens)<220>
<221>
<222>(920)...(1019)<400>1acttgtcatg gcgactgtcc agctttgtgc caggagcctc gcaggggttg atgggattgg 60ggttttcccc tcccatgtgc tcaagactgg cgctaaaagt tttgagcttc tcaaaagtct120agagccaccg tccagggagc aggtagctgc tgggctccgg ggacactttg cgttcgggct180gggagcgtgc tttccacgac ggtgacacgc ttccctggat tggcagccag actgccttcc240gggtcactgc catggaggag ccgcagtcag atcctagcgt cgagccccct ctgagtcagg300aaacattttc agacctatgg aaactacttc ctgaaaacaa cgttctgtcc cccttgccgt360cccaagcaat ggatgatttg atgctgtccc cggacgatat tgaacaatgg ttcactgaag420acccaggtcc agatgaagct cccagaatgc cagaggctgc tccccgcgtg gcccctgcac480cagcagctcc tacaccggcg gcccctgcac cagccccctc ctggcccctg tcatcttctg540tcccttccca gaaaacctac cagggcagct acggtttccg tctgggcttc ttgcattctg600ggacagccaa gtctgtgact tgcacgtact cccctgccct caacaagatg ttttgccaac660tggccaagac ctgccctgtg cagctgtggg ttgattccac acccccgccc ggcacccgcg720tccgcgccat ggccatctac aagcagtcac agcacatgac ggaggttgtg aggcgctgcc780cccaccatga gcgctgctca gatagcgatg gtctggcccc tcctcagcat cttatccgag840tggaaggaaa tttgcgtgtg gagtatttgg atgacagaaa cacttttcga catagtgtgg900tggtgcccta tgagccgcct gaggttggct ctgactgtac caccatccac tacaactaca960tgtgtaacag ttcctgcatg ggcggcatga accggaggcc catcctcacc atcatcacac1020tggaagactc cagtggtaat ctactgggac ggaacagctt tgaggtgcgt gtttgtgcct1080gtcctgggag agaccggcgc acagaggaag agaatctccg caagaaaggg gagcctcacc1140acgagctgcc cccagggagc actaagcgag cactgcccaa caacaccagc tcctctcccc1200agccaaagaa gaaaccactg gatggagaat atttcaccct tcagatccgt gggcgtgagc1260gcttcgagat gttccgagag ctgaatgagg ccttggaact caaggatgcc caggctggga1320aggagccagg ggggagcagg gctcactcca gccacctgaa gtccaaaaag ggtcagtcta1380cctcccgcca taaaaaactc atgttcaaga cagaagggcc tgactcagac tgacattctc1440cacttcttgt tccccactga cagcctccca cccccatctc tccctcccct gccattttgg1500gttttgggtc tttgaaccct tgcttgcaat aggtgtgcgt cagaagcacc caggacttcc1560atttgctttg tcccggggct ccactgaaca agttggcctg cactggtgtt ttgttgtggg1620gaggaggatg gggagtagga cataccagct tagattttaa ggtttttact gtgagggatg1680
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權(quán)利要求
1.一種鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變的多重PCR的試劑盒，由分離包裝的引物混合物、PCR反應(yīng)液和分子量標(biāo)記物組成，其特征是所述引物混合物是由公共順向引物、野生型特異性引物、747G/T突變型引物、746G/T突變型引物、745A/G突變型引物共同組成，其中，野生型特異性引物的序列為5`-TGTGATGATGGTGGGGATGGGCCTC-3`747G/T突變型引物的序列為5`-TGATGATGGTGGGGATGGGACTC-3`746G/T突變型引物的序列為5`-ATGATGGTGGGGATGGGCATC-3`745A/G突變型引物的序列為5`-GATGGTGGGGATGGGCCCC-3`公共順向引物的序列為5`-TAGGTTGGCTCTGACTGTA-3`在所述引物混合物中，各引物之間的重量比如下公共順向引物∶745A/G突變型引物∶746G/T突變型引物∶747G/T突變型引物∶野生型特異性引物＝1∶0.82∶0.93∶1.14∶0.89；所述分子量標(biāo)記物按以下方式制備通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳得到所述野生型引物和747G/T突變型引物、746G/T突變型引物、745A/G突變型引物的四種PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證其片段大小分別為99，97，95，93bp，將以上四種PCR產(chǎn)物以重量相等的比例混合后即得到所述分子量標(biāo)記物。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述PCR反應(yīng)液由無(wú)MgCl2的PCR體系緩沖液、dNTP、MgCl2、DNA聚合酶和DDH2O組成，當(dāng)試劑盒中各組份的純度均以100％計(jì)時(shí)，各組份的體積比為引物混合物1μL、10×無(wú)MgCl2的PCR體系緩沖液1mL、dNTP 1mL、MgCl2 1mL、DNA聚合酶500U、DDH2O 10mL和分子量標(biāo)記物500μL。
全文摘要
一種鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變的多重PCR的試劑盒，由分離包裝的引物混合物、PCR反應(yīng)液和分子量標(biāo)記物組成，其特征是所述引物混合物是由公共順向引物、野生型特異性引物、747G/T突變型引物、746G/T突變型引物、745A/G突變型引物共同組成。本發(fā)明通過(guò)上述引物的設(shè)置，可以使擴(kuò)增出的產(chǎn)物長(zhǎng)度不一致，從而能夠鑒定樣本是否存在P53基因249位密碼子突變，并能了解是否為我們預(yù)先設(shè)計(jì)的特異性上游引物對(duì)應(yīng)的突變類型。進(jìn)而提供了新的用于鑒定外周血DNA肝癌相關(guān)P53基因249位密碼子突變的多重PCR的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101067153SQ20071004907
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日
發(fā)明者魏永剛, 李波, 應(yīng)斌武, 范紅, 王蘭蘭 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院