專利名稱：一種蛋白酶的抑制劑蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，該抑制劑蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段對(duì)所述蛋白酶具有特異性的底物一酶相互作用位點(diǎn)的多肽序列。
本發(fā)明的其它另外的目的是提供一種已分離純化的DNA序列，該DNA序列編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白；提供一種特征在于其中包含所述已分離純化DNA序列的表達(dá)載體；提供一種轉(zhuǎn)化了所述表達(dá)載體的原核或真核宿主細(xì)胞；以及提供一種制備嵌合抑制劑蛋白的方法。
背景技術(shù)：
在活有機(jī)體表達(dá)的所有蛋白中，蛋白酶是其中調(diào)節(jié)細(xì)胞生死代謝途徑的最關(guān)鍵蛋白。事實(shí)上，蛋白酶和底物最初的相互作用和隨后的裂解，都以包括血栓形成、血凝固作用和細(xì)胞凋亡在內(nèi)的廣泛而重要的生物現(xiàn)象為基礎(chǔ)。
調(diào)節(jié)異常的蛋白酶解，或蛋白酶和抗蛋白酶的失衡可能是與蛋白酶有關(guān)的多種疾病(諸如癌癥、自身免疫性疾病、炎癥和感染性疾病)病理的關(guān)鍵因素?；谶@樣的猜想，對(duì)調(diào)節(jié)異常的蛋白酶解，或蛋白酶和抗蛋白酶的失衡進(jìn)行了集中研究。在癌癥和炎癥疾病(例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肺氣腫)模型中對(duì)抗蛋白酶解藥劑進(jìn)行的不同研究也均表明，加強(qiáng)抗蛋白酶解的治療和蛋白酶及抗蛋白酶的平衡作用，結(jié)果可以得到引人注意的改善。
例如在美國(guó)人最常被診斷出的癌癥前列腺癌中，一般認(rèn)為蛋白酶在包括腫瘤迅速增殖、侵入和轉(zhuǎn)移等腫瘤細(xì)胞的惡性表現(xiàn)中起重要作用。
人類腺激肽釋放酶(hK2)蛋白是一種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，主要在前列腺上皮中表達(dá)。最早從人精漿里分離的hK2目前已經(jīng)成為前列腺癌的診斷標(biāo)志(Deperthes等人，1995″Isolation of prostatic kallikrein hK2，alsoknown as hGK-1，in human seminal plasma″Biochim Biophys Acta，1245，311-6)。
除作為診斷標(biāo)志外，hK2的蛋白酶解活性表明hK2在癌癥進(jìn)程中起作用。現(xiàn)已提出該酶的幾個(gè)潛在功能，包括尿激酶型血纖蛋白溶酶原激活物的活化作用和血纖蛋白溶酶原激活物抑制劑-1的滅活作用、前體前列腺特異抗原(pro-PSA)的活化作用、纖連蛋白的降解作用和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的降解作用(IGF-BP)(詳見(jiàn)Cloutier等人，2004″Development ofrecombinant inhibitors specific to human kallikrein 2 using phase-displayselected substrates″Eur J Biochem 3，607-13)。
近來(lái)研究表明，在癌癥特別是前列腺癌中，激肽釋放酶hK2能與已知為蛋白酶抑制劑-6(PI-6)的蛋白酶抑制劑形成特異性復(fù)合體?；趯?duì)所述特異性復(fù)合體的發(fā)現(xiàn)，US 6284873和US 6472143提供了一種用于檢測(cè)是否存在癌癥或者有無(wú)組織壞死診斷方法。
考慮到hK2的前列腺組織特異性表達(dá)和在癌癥發(fā)展過(guò)程中其所有潛在底物的參與，也可以將hK2作為潛在的治療靶標(biāo)(Darson等人，1997″Humanglandular kallikrein 2(hK2)expression in prostatic intraepithelial neoplasia andadenocarcinomaa novel prostate cancer marker″Urology 49，857-62)。因此，開(kāi)發(fā)特異性長(zhǎng)效蛋白酶抑制劑，特別是激肽釋放酶抑制劑會(huì)非常有用。
所述蛋白酶抑制劑可以選自絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)家族，該家族很大，是涉及調(diào)節(jié)復(fù)合體生理過(guò)程的蛋白質(zhì)家族。所述蛋白的分子量在45千道爾頓左右，可以分成兩組一組有抑制作用，另一組沒(méi)有抑制作用。
絲氨酸蛋白酶抑制劑包括暴露的柔性反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)結(jié)構(gòu)，或絲氨酸蛋白酶抑制劑反應(yīng)環(huán)結(jié)構(gòu)(RSL)，所述環(huán)結(jié)構(gòu)涉及與推定的靶蛋白酶之間的相互作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑與所述靶蛋白酶結(jié)合，所述RSL的P1-P′1易裂鍵(P1-P′1scissile bond)斷裂之后，形成一種新的共價(jià)絡(luò)合物(Huntington等人，2000″Structure of a serpin-protease complex shows inhibition bydeformation″Nature 407，923-6)。所述絡(luò)合物的形成誘發(fā)主要構(gòu)象重排，并因此不可逆地捕獲所述靶蛋白酶。所述絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制特異性主要?dú)w結(jié)于P1-P′1位點(diǎn)殘基的屬性和所述RSL的長(zhǎng)度。改變RSL結(jié)構(gòu)域或絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應(yīng)位點(diǎn)可以作為一種途徑，用于推定絲氨酸蛋白酶抑制劑與靶蛋白酶之間的抑制過(guò)程，并用于開(kāi)發(fā)特異性的抑制劑(Dufour等人，2001″The contribution of arginine residues within the P6-P1 region of alpha1-antitrypsin to its reaction with furin″J Biol Chem 276，38971-9和Plotnick等人，2002″The effects of reactive site location on the inhibitory properties of theserpin alpha(1)-antichymotrypsin″J Biol Claem 277，29927-35)。
幾種絲氨酸蛋白酶抑制劑如蛋白C抑制劑、α2抗纖溶酶、抗凝血酶-III、α1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、或蛋白酶抑制劑6，已經(jīng)被鑒定為hK2的抑制劑(Saedi等人，2001″Human kallikrein 2(hK2)，but not prostate-specific antigen(PSA)，rapidly complexes with protease inhibitor 6(PI-6)released from prostatecarcinoma cells″Int J Cancer 94，558-63)。hK2和ACT之間形成絡(luò)合物的速度相對(duì)較慢，主要?dú)w因于所述RSL的P1-P′1位點(diǎn)上的亮氨酸358-絲氨酸359(Leu 358-Ser 359)殘基，和不利于所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的肽鍵。
迄今為止，只公開(kāi)了一些新的對(duì)血漿激肽釋放酶特異性抑制的激肽釋放酶抑制劑優(yōu)選物及其在治療和診斷方法中的應(yīng)用(專利US 6057287、US6333402、US 5994125和US 5795865)。然而這些專利所描述的抑制劑制品與牛胰胰蛋白酶抑制劑的Kunitz結(jié)構(gòu)域同源，尤其是與脂蛋白相關(guān)的促凝劑抑制物(LACI)的Kunitz結(jié)構(gòu)域同源。所述Kunitz結(jié)構(gòu)域特異性抑制血漿激肽釋放酶。
除了對(duì)血漿激肽釋放酶有特異性外，這些抑制劑分子非常小，并以一種可逆的方式與血漿激肽釋放酶結(jié)合。上述方法的主要缺點(diǎn)之一是，應(yīng)用上述蛋白以可逆的方式抑制靶蛋白酶有一定風(fēng)險(xiǎn)，即所述靶蛋白酶經(jīng)解絡(luò)作用而恢復(fù)其活性。
因此如這里所述，應(yīng)用較大分子抑制劑的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是形成以不可逆的方式抑制蛋白酶靶標(biāo)的共價(jià)絡(luò)合物。本發(fā)明的更大優(yōu)點(diǎn)是眾所周知，所述大型共價(jià)絡(luò)合物能從循環(huán)中被快速消除。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)所述蛋白酶具有高度特異性的蛋白酶抑制劑蛋白及其在藥用組合物中的應(yīng)用。所述抑制劑蛋白是一種嵌合體，該嵌合體包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段對(duì)所述蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點(diǎn)的多肽序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種已分離純化的DNA序列，該DNA序列編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白；提供一種特征在于其中包含所述已分離純化DNA序列的表達(dá)載體；以及提供一種轉(zhuǎn)化了所述表達(dá)載體的原核或真核宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種制備蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇對(duì)對(duì)蛋白酶的底物-酶特異相互作用位點(diǎn)進(jìn)行編碼的多核苷酸序列；b)將多核苷酸序列引入編碼絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶的抑制劑蛋白的序列中，由此得到嵌合序列；c)使所述嵌合序列在適合的條件下在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)；以及d)復(fù)性蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。


圖1顯示還原條件下純化重組體ACT的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，泳道1為變體6.1，泳道2為野生型ACT；圖2顯示ACT野生型重組體(rACTWT)及其變體對(duì)hK2抑制作用的化學(xué)計(jì)量(SI)；通過(guò)用線性回歸分析法外推I/E(抑制劑/hK2)的比率(即x軸的截距)，測(cè)定所述SI；圖3中，A和B表示hK2與重組體抑制劑形成絡(luò)合物；箭頭標(biāo)明hK2(E)，抑制劑(I)及hK2-ACT絡(luò)合物(E-1)；圖4中，A和B表示ACT野生型重組體(rACTwT)及其變體在準(zhǔn)一級(jí)條件下對(duì)hK2抑制作用；準(zhǔn)一級(jí)條件下，使用進(jìn)程曲線方法測(cè)量hK2和重組絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的相互作用；圖5表示通過(guò)SDS-PAGE分析法在還原條件下測(cè)定實(shí)施例1和實(shí)施例2中開(kāi)發(fā)的抑制劑的純度；圖6中，A顯示重組體ACT與人激肽釋放酶(hK2)之間的抑制反應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡分析；B顯示重組體ACT與前列腺特異性抗原(PSA)之間的抑制反應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡分析；圖7A表示MD820的DNA及蛋白質(zhì)序列；圖7B表示MD62的DNA及蛋白質(zhì)序列；圖7C表示MD83的DNA及蛋白質(zhì)序列；圖7D表示MD67的DNA及蛋白質(zhì)序列；圖7E表示MD61的DNA及蛋白質(zhì)序列；圖7F表示MD518的DNA及蛋白質(zhì)序列；圖7G表示MDCI的DNA及蛋白質(zhì)序列；圖8表示ACT和MD抑制劑的RSL序列比較；其中常規(guī)字體的殘基是野生型ACT(ACTWT)共有的，黑體和下劃線標(biāo)注的殘基對(duì)應(yīng)ACT變體在所述RSL上的突變；絲氨酸蛋白酶抑制蛋白上推定的斷裂位點(diǎn)用星號(hào)(*)標(biāo)注在P1-P′1殘基之間；圖9表示pQE9表達(dá)載體圖譜；圖10A顯示MD62對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用；將由人激肽釋放酶2轉(zhuǎn)染的前列腺癌細(xì)胞DU-145(3×106個(gè)細(xì)胞)，植入裸鼠體內(nèi)，然后用MD62治療(5或25微克/注射劑)；圖10B顯示MD67對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用；將由人激肽釋放酶2轉(zhuǎn)染的前列腺癌細(xì)胞DU-145(3×106個(gè)細(xì)胞)，植入裸鼠體內(nèi)，然后用MD67治療(5或25微克/注射劑)；圖11顯示MDCI對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用；將由人激肽釋放酶2轉(zhuǎn)染的前列腺癌細(xì)胞DU-145(3×106個(gè)細(xì)胞)，植入裸鼠體內(nèi)，然后用MDCI治療(5或50微克/注射劑)；具體實(shí)施方式
本發(fā)明是關(guān)于一種蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，該抑制劑蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段對(duì)所述蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點(diǎn)的多肽序列。
所述嵌合抑制劑蛋白是指含有兩種或兩種以上多肽的蛋白。所述多肽來(lái)源不同，即所述多肽在自然界中不共存。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”“多肽”“多肽的(polypeptidic)”“肽”和“肽的(peptidic)”可以互換，用以表示一系列通過(guò)相鄰殘基的α-氨基和羧基之間形成肽鍵而互相連接的氨基酸殘基。
本發(fā)明所述的嵌合蛋白是蛋白酶的抑制劑，包括起抑制作用的多肽序列和至少一段對(duì)所述蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點(diǎn)的多肽序列。所述底物-酶相互作用位點(diǎn)的多肽序列賦予抑制劑對(duì)某一特定蛋白酶表現(xiàn)高度選擇性，該多肽序列根據(jù)所要抑制的蛋白酶進(jìn)行選擇。
典型的所述底物-酶相互作用位點(diǎn)的多肽序列可以是底物活性位點(diǎn)序列。所述“底物活性位點(diǎn)序列”是指底物的一段序列，該序列是蛋白酶優(yōu)先識(shí)別的位點(diǎn)。蛋白酶對(duì)底物活性位點(diǎn)序列的識(shí)別可以導(dǎo)致底物的活化、鈍化或降解。大多數(shù)情況下，這種高度親合作用不僅包括對(duì)特異序列的識(shí)別，而且包括對(duì)該特異序列三維構(gòu)象的識(shí)別。
本發(fā)明還包括底物活性位點(diǎn)序列的分子嵌合體?！胺肿忧逗象w”指多核苷酸序列，該多核苷酸序列可以包含底物活性位點(diǎn)序列的功能部分，并且例如可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)得到。
本發(fā)明還考慮到了底物活性位點(diǎn)序列的特定組合、或其片段或亞組成部分。
所述“片段”是指與底物活性位點(diǎn)的相應(yīng)序列在長(zhǎng)度上至少共有40％的氨基酸的序列。所述序列只要顯示出與其來(lái)源的天然序列相同的性質(zhì)就可以采用。優(yōu)選所述序列為與底物活性位點(diǎn)的相應(yīng)序列在長(zhǎng)度上共有氨基酸超過(guò)70％的序列；優(yōu)選共有氨基酸超過(guò)80％的序列；更優(yōu)選共有氨基酸超過(guò)90％的序列。
所述片段可以用本領(lǐng)域公知的各種方法和技術(shù)(例如化學(xué)合成)制備。
本發(fā)明還包括底物活性位點(diǎn)序列的變體。術(shù)語(yǔ)“變體”是指具有在一定程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽，即經(jīng)過(guò)保守氨基酸取代而與天然序列不同的氨基酸序列；因此一個(gè)或多個(gè)氨基酸可被其它具有相同特性和構(gòu)象作用的氨基酸取代。氨基酸序列變體包括天然氨基酸序列的氨基酸序列的特定位點(diǎn)的取代、缺失和/或插入。保守的氨基酸取代在這里定義為下列五組之一范圍內(nèi)的互換I、小分子脂肪族的非極性或弱極性的殘基丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)
II、帶正電的極性殘基組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)III、帶負(fù)電的極性殘基及其酰胺殘基天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)IV、大分子芳香族殘基苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)V、大分子脂肪族非極性殘基甲硫氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)、半胱氨酸(Cys)本發(fā)明的底物優(yōu)選為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白，在此情況下底物活性位點(diǎn)序列可以是絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應(yīng)環(huán)序列本身、及該序列的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體。
所述“絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應(yīng)環(huán)”或“反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)”或RSL指在絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白上發(fā)現(xiàn)的暴露的柔性反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)，該環(huán)與推定的靶蛋白酶相互作用有關(guān)。按照慣例，從所述易裂鍵氨基端的殘基開(kāi)始，并向遠(yuǎn)離該鍵的方向延伸，將殘基命名為P1、P2、P3等。所述易裂鍵之后的殘基被稱為P′1、P′2、P′3等。所述RSL通常包括6-12個(gè)氨基酸殘基。
所述RSL序列可以選自包含SEQ ID No 16、17、18、19、20、21、22序列的序列、以及它們的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體。
所述RSL序列還可以選自如下列表1中所示的各種可能的序列。
表1RSL中可以變化的位點(diǎn)

對(duì)應(yīng)于潛在的底物肽的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應(yīng)環(huán)(RSL)上的P4-P’3殘基的氨基酸序列空格代表為得到hK2的底物特異性而無(wú)需修飾的位點(diǎn)。
通常所述蛋白酶選自含有激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶(uPA)和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)的組中。所述蛋白酶優(yōu)選為人激肽釋放酶，最優(yōu)選的人激肽釋放酶是hK2(也公知為hGK-1)。
hK2屬于所述激肽釋放酶基因家族，該家族包括15個(gè)成員，但是只有前列腺特異性抗原(PSA或hK3)和hK2被前列腺高水平表達(dá)。hK2潛在的生理作用之一是對(duì)射精后立即形成的包埋精子的凝膠(sperm-entrapping gel)起蛋白水解作用，特別是對(duì)精子凝素(Semenogelin)和纖連蛋白進(jìn)行裂解。此外，體外實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)IGF結(jié)合蛋白水解，hK2能提高胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)的促有絲分裂作用。體外實(shí)驗(yàn)也表明hK2激活尿激酶原，使激肽原(可能通過(guò)B2緩激肽受體存在EGF-受體交叉激活作用)產(chǎn)生緩激肽樣物質(zhì)，并使pro-PSA前體轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?。所述hK2的活性存在爭(zhēng)議，爭(zhēng)議傾向于hK2可能有利于前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解和隨之發(fā)生的前列腺癌細(xì)胞的脫附與轉(zhuǎn)移。另外，hK2能通過(guò)釋放促有絲分裂因子和激活生長(zhǎng)受體，促進(jìn)前列腺癌發(fā)展。
所要抑制的蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的情況下，那么該蛋白酶選自含有組織蛋白酶(K、L和S亞型)、激素原硫醇蛋白酶和胱冬肽酶家族(Caspase)(Caspase-1、Caspase-3、Caspase-49和Caspase-8)的組中。
所述半胱氨酸蛋白酶是利用半胱氨酸殘基催化活性的蛋白水解酶，可以分成至少30個(gè)蛋白家族。每一個(gè)家族所包含的蛋白，具有相似的氨基酸序列和進(jìn)化保守序列模體(motif)，所述模體反映了所述家族成員相似的三維結(jié)構(gòu)。
抑制劑嵌合蛋白中起抑制作用的多肽序列通常為絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶。
所述起抑制作用的多肽序列選自絲氨酸蛋白酶的情況下，那么所述起抑制作用的多肽序列優(yōu)選為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白序列本身、該序列的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體。
所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白序列選自α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、蛋白C抑制劑(PCI)、α-1抗蛋白酶(AAT)、人α-1抗胰蛋白酶相關(guān)蛋白前體(ATR)、α-2-血纖蛋白溶酶抑制劑(AAP)、人抗凝血酶-III前體(ATIII)、蛋白酶抑制劑10(PI10)、人膠原蛋白結(jié)合蛋白2前體(CBP2)、蛋白酶抑制劑7(P17)、亮氨酸絲氨酸(leuserpin)蛋白酶抑制劑2(HLS2)、人血漿蛋白酶Cl抑制劑(C1INH)、單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(M/NEI)、纖溶酶原激活物抑制劑-3(PAI3)、蛋白酶抑制劑4(PI4)、蛋白酶抑制劑5(PI5)、蛋白酶抑制劑12(PI12)、人內(nèi)皮纖溶酶原激活物抑制劑-1前體(PAI-1)、人胎盤纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI2)、人色素上皮衍生因子前體(PEDF)、蛋白酶抑制劑6(PI6)、蛋白酶抑制劑8(PI8)、蛋白酶抑制劑9(PI9)、人鱗狀細(xì)胞癌抗原1(SCCA-1)、人鱗狀細(xì)胞癌抗原2(SCCA-2)、T4-結(jié)合球蛋白(TBG)、Megsin蛋白和蛋白酶抑制劑14(PI14)及其片段、分子嵌合體、組合和/或變體的組中。
鑒于大多數(shù)所述絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的名稱各異，我們?cè)诒?內(nèi)總結(jié)了它們的詳細(xì)說(shuō)明。
表2

根據(jù)本發(fā)明嵌合抑制劑蛋白的實(shí)施例，申請(qǐng)人意外地發(fā)現(xiàn)6種特異性抑制所述蛋白酶hK2的新嵌合抑制劑蛋白，所述新嵌合抑制劑蛋白如表3所示
表3

為了改變所述絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白的特異性，可以通過(guò)修飾所述α1-抗胰凝乳蛋白酶(rACT)的RSL得到所述嵌合抑制劑蛋白。眾所周知，所述α1-抗胰凝乳蛋白酶(rACT)抑制一大組人類酶如胰凝乳蛋白酶、肥大細(xì)胞食糜酶、組織蛋白酶G、前列腺激肽釋放酶hK2和PSA(hK3)。利用實(shí)施例1中詳述的噬菌體展示技術(shù)選出的作為hK2酶的底物的所述肽序列已經(jīng)用于取代所述易裂鍵及所述RSL的相鄰氨基酸殘基。重組抑制劑在細(xì)菌內(nèi)制備，經(jīng)親合層析純化。
野生型rACT對(duì)hK2的抑制很慢(12-16小時(shí))；相比之下，被修飾了的rACTs在幾分鐘之內(nèi)很快形成共價(jià)絡(luò)合物。所述6種rACT變體中的3種以高締合常數(shù)特異結(jié)合hK2(見(jiàn)表5和表6)。用過(guò)量的抑制劑([I]o/[E]o為100∶1)培養(yǎng)30分鐘，hK2被rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7和rACT6.1完全抑制；而rACT8.20抑制95％酶活性，rACT5.18抑制73％酶活性。在上述反應(yīng)條件下，野生型rACT對(duì)hK2沒(méi)有表現(xiàn)出抑制作用。在所有變體中，兩種(rACT8.3和rACT5.18)只特異性抑制hK2，不抑制其它測(cè)試酶。另兩種變體也抑制PK活性，rACT6.7抑制率為36％，rACT6.2抑制率為100％。野生型rACT和變體rACT8.20抑制兩種胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Chtr和PSA活性；但是也能抑制PK和HNE活性。所有所述重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白都沒(méi)有抑制hK1和uPA的活性。
此外，申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)用編碼蛋白C抑制劑的RSL的底物五肽序列取代野生型重組體ACT(rACTWT)所述RSL結(jié)構(gòu)上的殘基P3-P’3，得的嵌合抑制劑(MDCI)產(chǎn)物能抑制激肽釋放酶hK2和hK3。
因此，所述蛋白酶嵌合抑制劑可以選自含有MD820、MD62、MD61、MD67和MDCI的組中。所述嵌合抑制劑優(yōu)選為MD62或MD61。
眾所周知，抑制作用的化學(xué)計(jì)量(SI)值高于1，通?？梢哉J(rèn)為具有絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白底物性質(zhì)。在本方案中，初始米氏(Michaelis)絡(luò)合物形成和所述RSL裂解之后，大多數(shù)所述絡(luò)合物裂解成具有活性的酶，而裂解后的抑制劑明顯失活。通過(guò)使抑制劑與蛋白酶的比達(dá)10∶1，即抑制劑過(guò)量，培養(yǎng)所述樣品，申請(qǐng)人分析了無(wú)絡(luò)合物形成和所述抑制劑裂解的ACT變體-hK2反應(yīng)。上述接近或低于計(jì)算得出的所述被測(cè)ACT變體的SI值的條件通常利于絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白或絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白-蛋白酶絡(luò)合物的蛋白水解(見(jiàn)表6)。申請(qǐng)人意外地觀察到所述假說(shuō)的矛盾之處，因?yàn)椴还躍I值如何高，始終未觀察到hK2對(duì)變體ACT的降解作用。不能用上述理論限定，一種可能的解釋是在測(cè)定SI的條件下，ACT沒(méi)有降解。在體外形成共價(jià)ACTs-hK2絡(luò)合物的速度很慢。這一點(diǎn)和我們觀察到的結(jié)果吻合25℃下培養(yǎng)30分鐘后，未檢測(cè)到野生型ACT對(duì)hK2的抑制作用(表5)，甚至在37℃下延長(zhǎng)培育時(shí)間后，hK2只部分絡(luò)合了野生型ACT(圖3)。
申請(qǐng)人還評(píng)定了所述新抑制劑對(duì)其它蛋白酶的特異性。對(duì)所有蛋白酶的評(píng)定過(guò)程都在同樣條件(模擬生理?xiàng)l件)下進(jìn)行，以確保更好地解釋進(jìn)一步的體內(nèi)應(yīng)用。將噬菌體展示篩選出的底物hK2的RSL裂解位點(diǎn)，置換到野生型ACT中，使該野生型的ACT變成hK2的高靈敏抑制劑。此外，其中兩種所述抑制劑表現(xiàn)出對(duì)hK2的反應(yīng)唯一性，對(duì)進(jìn)行研究的其它類似公知的生物靶底物如血漿激肽釋放酶、hK1、PSA、尿激酶和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)沒(méi)有反應(yīng)性。據(jù)申請(qǐng)人了解，本發(fā)明首次報(bào)道了開(kāi)發(fā)hK2的特異性抑制劑。
令人感興趣的是，rACT8.20(MD820)不僅抑制hK2，還抑制胰凝乳蛋白酶，并輕微地抑制血漿激肽釋放酶和人彈性蛋白酶，表現(xiàn)出一種廣泛的抑制作用特異性。
所述嵌合抑制劑蛋白的起抑制作用的序列還可以選自半胱氨酸蛋白酶，因?yàn)楝F(xiàn)有大量文獻(xiàn)記載的實(shí)例充分證明，絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白對(duì)半胱氨酸蛋白酶也有抑制作用(Gettins P.G.W.，2002″Serpin structure，mechanism，and function″in Chem.Rev，102，4751-4803)。這些實(shí)例包括絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白鱗癌細(xì)胞抗原對(duì)組織蛋白酶K、L及S的抑制作用；所述α-1抗胰凝乳蛋白酶對(duì)激肽原硫醇蛋白酶的抑制作用；病毒絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白crmA對(duì)胱冬肽酶家族成員的抑制作用，所述胱冬肽酶家族成員包括胱冬肽酶1(白細(xì)胞介素13轉(zhuǎn)化酶)、胱冬肽酶3和胱冬肽酶8；人絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白PI19對(duì)胱冬肽酶1、胱冬肽酶4和胱冬肽酶8的抑制作用。
按照本發(fā)明，將重組技術(shù)應(yīng)用于制備蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白時(shí)，優(yōu)選采用編碼所述多肽的核酸分子及其片段。
因此本發(fā)明還涉及一種分離和純化了的DNA序列，該序列編碼上述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。
根據(jù)本發(fā)明“分離和純化了的DNA序列”是指所述編碼本發(fā)明蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的核酸分子，或能編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的核酸所處的狀態(tài)。所述核酸不含或基本不含與之天然相關(guān)的材料如其它的多肽或者核酸，所述與之天然相關(guān)的材料可以在其自然環(huán)境或在通過(guò)在體內(nèi)或體外實(shí)施的重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備(例如細(xì)胞培養(yǎng))的環(huán)境中找到。
這里能用的DNA是任何多脫氧核苷酸，例如包括雙鏈DNA、單鏈DNA、其中一條或者兩條單鏈由兩個(gè)或兩個(gè)以上片段組成的雙鏈DNA、其中一條或者兩條單鏈含有連續(xù)的磷酸二酯主鏈的雙鏈DNA、包含一個(gè)或多個(gè)單鏈部分和一個(gè)或多個(gè)雙鏈部分的DNA、兩條DNA鏈完全互補(bǔ)的雙鏈DNA、兩條DNA鏈只有部分互補(bǔ)的雙鏈DNA、環(huán)狀DNA、共價(jià)閉合DNA、線性DNA、共價(jià)交聯(lián)DNA、cDNA、化學(xué)合成DNA、半合成DNA、生物合成DNA、天然分離出的DNA、酶解后的DNA、剪切后的DNA、標(biāo)記過(guò)的DNA例如放射性標(biāo)記的DNA和熒光染料標(biāo)記的DNA、包含一個(gè)或多個(gè)非自然發(fā)生種的核苷酸的DNA。
編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的DNA序列本身或其片段可用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)技術(shù)合成，例如磷酸三酯法或通過(guò)自動(dòng)合成方法和PCR方法。
根據(jù)本發(fā)明所述分離純化的編碼嵌合抑制劑蛋白的DNA序列還可以通過(guò)酶技術(shù)生產(chǎn)。這樣可以用在預(yù)先確定的核苷酸識(shí)別序列斷裂核苷酸分子的限制酶，去從包含所述核苷酸序列的更長(zhǎng)的核苷酸分子中分離該核苷酸序列。所述核苷酸序列如編碼所述嵌合抑制劑蛋白的DNA(或RNA)，或其片段。
本發(fā)明還包括多核糖核苷酸(RNA)形式的核苷酸，例如包括單鏈RNA、雙鏈RNA、其中一條或者兩條單鏈由兩個(gè)或兩個(gè)以上片段組成的雙鏈RNA、其中一條或者兩條單鏈都含有連續(xù)的磷酸二酯主鏈的雙鏈RNA、包含一個(gè)或多個(gè)單鏈部分和一個(gè)或多個(gè)雙鏈部分的RNA、兩條RNA鏈完全互補(bǔ)的雙鏈RNA、兩條RNA鏈只有部分互補(bǔ)的雙鏈RNA、共價(jià)交聯(lián)RNA、酶解后的RNA、mRNA、剪切后的RNA、化學(xué)合成RNA、半合成RNA、生物合成RNA、天然分離出的RNA、標(biāo)記過(guò)的RNA例如放射性標(biāo)記的RNA和熒光染料標(biāo)記的RNA、包含一個(gè)或多個(gè)非自然發(fā)生種的核苷酸的RNA。
所述分離純化的編碼蛋白酶嵌合抑制劑的DNA序列優(yōu)選選自含有SEQID N°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ ID N°9、SEQID N°11和SEQ ID N°13的組中。
本發(fā)明還包括上述序列的變體，即通過(guò)保守核苷酸取代作用從所涉及序列變化而來(lái)的核苷酸序列。所述保守核苷酸取代作用指一個(gè)或多個(gè)核苷酸被其它同樣性質(zhì)的核苷酸取代。
而本發(fā)明還提供一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有上述分離純化的編碼蛋白酶嵌合抑制劑蛋白的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，表達(dá)載體的選擇直接有賴于想要得到的功能性質(zhì)，例如嵌合抑制劑蛋白表達(dá)和所要轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
此外，表達(dá)載體還可以含有可以與所述分離純化的DNA序列連接的啟動(dòng)子。這意味著連接后的分離純化的編碼本發(fā)明蛋白酶嵌合抑制劑蛋白的DNA序列，可以在適合的調(diào)控序列控制下允許表達(dá)，即插入的所述分離純化的DNA序列得到轉(zhuǎn)錄和翻譯。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指本領(lǐng)域公知的任何附加的調(diào)控序列如常用于多肽表達(dá)或可以包括附加的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的靶序列的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子、聚腺苷酸化位點(diǎn)和剪接點(diǎn)，和任選的編碼選擇性標(biāo)記的序列?？蓱?yīng)用的啟動(dòng)子選自與宿主細(xì)胞相容的啟動(dòng)子，例如從病毒的基因組中得到的啟動(dòng)子和從異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子中得到的啟動(dòng)子。所述病毒可以是多瘤病毒、腺病毒(如腺病毒2)、乳頭狀瘤病毒(牛乳頭狀瘤病毒)、鳥肉瘤病毒、細(xì)胞巨化病毒(如鼠或人細(xì)胞巨化病毒即時(shí)早期啟動(dòng)子)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(如猿猴病毒40早期和晚期啟動(dòng)子)。所述異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子可以是如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子或熱激啟動(dòng)子。
可以使用的增強(qiáng)子例如已知來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列，或真核細(xì)胞病毒中的增強(qiáng)子如所述猿猴病毒40(SV40)增強(qiáng)子、所述細(xì)胞巨化病毒早期啟動(dòng)子的增強(qiáng)子、多瘤病毒和腺病毒的增強(qiáng)子。
多種宿主/表達(dá)載體組合都可以應(yīng)用于表達(dá)本發(fā)明所述的DNA序列。例如有用的表達(dá)載體可以包括染色體片段、非染色體片段和合成的DNA序列片段。合適的載體包括SV40的衍生物和公知的細(xì)菌質(zhì)粒如大腸桿菌質(zhì)粒col E1、pCR1、pBR322和pMB9以及它們的衍生物；質(zhì)粒如RP4；噬菌體DNA，如噬菌體X(phage X)眾多的衍生物(如NM9899)和其它噬菌體(如M13和單鏈絲狀噬菌體DNA)；酵母質(zhì)粒如2μ質(zhì)粒或其衍生物；用于真核細(xì)胞的載體如可用于昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的載體；源于質(zhì)粒和噬菌體DNA組合的載體如經(jīng)修飾應(yīng)用于噬菌體DNA的質(zhì)?；蚱渌磉_(dá)控制序列；及上述物質(zhì)的類似物。
最優(yōu)選的表達(dá)質(zhì)粒是pQE-9。
本發(fā)明還提供一種被所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的真核或原核宿主細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染的細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是指其中導(dǎo)入有胞外DNA并因此為所述胞外DNA提供場(chǎng)所的細(xì)胞。所述DNA被導(dǎo)入細(xì)胞中，因此所述核苷酸能作為染色體的一部分或者作為額外染色體組分被復(fù)制。
可以采用眾所周知的方法將含有根據(jù)本發(fā)明的已分離純化的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到合適的真核或原核細(xì)胞中，所述方法的選用通常取決于所用載體的類型。有關(guān)這些方法見(jiàn)于例如Maniatis等人，1982，MolecularCloning，A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory，以及商業(yè)上提供的方法。
在此公開(kāi)的所述嵌合抑制劑蛋白優(yōu)選在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)里重組制備。
多種單細(xì)胞的宿主細(xì)胞可用于表達(dá)本發(fā)明所述的DNA序列。所述宿主包括公知的真核和原核宿主如大腸桿菌、假單胞菌、枯草桿菌、鏈霉菌等細(xì)菌菌株；真菌如酵母；動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、YB/20、NSO、SP2/0、Rl.1、B-W和L-M細(xì)胞、非洲綠猴(African Green Mobkey)腎細(xì)胞(如COS1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆蟲細(xì)胞(如Sf9)；以及人細(xì)胞和組織培養(yǎng)植入細(xì)胞。優(yōu)選宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，更優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。
本發(fā)明還關(guān)于含有所述嵌合抑制劑蛋白作為活性成分并選擇性地含有一種或多種適合的藥物載體的藥物組合物。
除含有至少一種所述嵌合抑制劑蛋白，藥物組合物還優(yōu)選含有一種或多種適合的藥物載體如賦形劑。載體和/或輔劑有助于將活性化合物制備成藥用劑型。
可選用的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑以一定的劑量和濃度應(yīng)用于受試者時(shí)必須無(wú)毒。所述載體、賦形劑或穩(wěn)定劑包括緩沖液，如磷酸鹽、檸檬酸(citrate)及其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲苯基氯化銨、氯化六甲銨、氯化芐烷銨、苯索氯銨、苯酚、丁醇或芐醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯，如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(約少于10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)；食糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、或山梨糖醇；成鹽反離子如鈉；金屬絡(luò)合物(如鋅蛋白絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑，如吐溫(TWEEN)、PLURONICS、或聚乙二醇(PEG)。
藥物組合物的劑型可以是全身系統(tǒng)型的，也可以是局部型的。比如，此類組合物的劑型可以是各種非腸道給藥途徑，如皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、透皮、口腔途徑，或經(jīng)過(guò)植入裝置，還可以通過(guò)蠕動(dòng)的給藥方式。
所述含有上述嵌合抑制劑蛋白作為活性成分的藥物組合物還可以加入或注入到生物可吸收基質(zhì)中；所述基質(zhì)的給藥形式包括基質(zhì)懸浮體、凝膠或固相載體。此外，所述基質(zhì)可以由生物高聚物組成。
可以制備出常釋劑型。常釋劑型的合適的例子包括含抗體的固態(tài)疏水聚合物半透性基質(zhì)。所述基質(zhì)的形態(tài)為成型粒子，如膜劑或微膠囊劑。常釋劑型基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(如聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯、或聚乙烯醇)、聚交酯(US 3773919)、L-谷氨酸和[γ]乙基-L-谷氨酸鹽共聚物、非可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT(TM)(包括乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林的可注射用微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
應(yīng)用于體內(nèi)給藥的制劑必須無(wú)菌。此要求可以很容易地通過(guò)如無(wú)菌濾膜過(guò)濾達(dá)到。
很容易理解，本發(fā)明嵌合抑制劑蛋白的適當(dāng)劑量取決于受試者的年齡、性別、健康狀況和體重、以及受試者同時(shí)接受治療的種類和預(yù)期效果的性質(zhì)。
最適劑型取決于疾病、嵌合抑制劑蛋白、給藥方式；可能包括片劑、膠囊、糖錠、牙膏、栓劑、吸入劑、液劑、膏劑和注射劑。
本發(fā)明還包括對(duì)所述嵌合抑制劑蛋白氨基酸的氨基酸修飾作用。所述氨基酸修飾作用用于將所述嵌合抑制劑蛋白交聯(lián)到水不溶性基質(zhì)、或所述其它大分子載體上，或提高所述嵌合抑制劑蛋白的溶解度、改善所述嵌合抑制劑蛋白的吸收、及所述嵌合抑制劑蛋白穿過(guò)血腦屏障的滲透性。這類修飾為本領(lǐng)域公知，可以選擇性地消除或削弱任何所述蛋白可能存在的不良副作用及類似作用。
本發(fā)明優(yōu)選的藥物組合物含有作為活性成分的嵌合抑制劑蛋白；選擇性的藥物組合物可以含有分離純化的編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的DNA序列作為活性成分。該藥物組合物既可以含有單獨(dú)的分離純化的DNA序列以及含有所述分離純化的DNA序列的表達(dá)載體，也可以含有事先轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體的所述宿主細(xì)胞。在含有事先轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體的所述宿主細(xì)胞時(shí)，為避免任何抗原性問(wèn)題，宿主細(xì)胞優(yōu)選從接受治療的病人身上分離。這種基因和細(xì)胞治療途徑特別適用于需要反復(fù)給予藥物組合物的病人，因?yàn)樗龇蛛x純化的基因、表達(dá)載體或事先轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體宿主細(xì)胞能并入病人的細(xì)胞，從而內(nèi)源產(chǎn)生所述蛋白。
本發(fā)明還提供了對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)與蛋白水解相關(guān)紊亂的治療或預(yù)防方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物上述藥物組合物。
這里對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)與蛋白水解相關(guān)紊亂的治療或預(yù)防方法，適用于hK2激肽釋放酶活性有害的紊亂情況，包括諸如癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂如良性前列腺肥大，或傳染性紊亂。
所述術(shù)語(yǔ)“癌癥”指代或描述一種哺乳動(dòng)物生理狀況，其典型特征是無(wú)節(jié)制的細(xì)胞增殖?？梢灾斡陌┌Y例子包括但不僅限于前列腺癌、乳腺癌或轉(zhuǎn)移瘤。
在優(yōu)選的方法中，所述哺乳動(dòng)物為人類，所述用于給藥的嵌合抑制劑蛋白選自表3中所列的特異性抑制所述hK2蛋白酶的重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白實(shí)例。
本發(fā)明的范圍還包括上述藥用組合物用于制備治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物體內(nèi)與蛋白水解相關(guān)紊亂的藥劑的用途。所述紊亂hK2激肽釋放酶活性有害的紊亂情況，包括諸如癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂如良性前列腺肥大，或傳染性紊亂。
癌癥的實(shí)例包括但不限于前列腺癌、乳腺癌或轉(zhuǎn)移瘤。
一般情況下，本發(fā)明所述嵌合抑制劑蛋白以達(dá)預(yù)期目的量使用。用于治療和預(yù)防紊亂時(shí)，所述嵌合抑制劑蛋白或其藥物組合物以治療有效量給藥或涂敷。所述治療有效量是指可以改善或防止被治療主體的癥狀、或延長(zhǎng)被治療主體的存活時(shí)間的有效量。治療有效量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，尤其是根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)提供的細(xì)節(jié)。
對(duì)全身系統(tǒng)給藥方式而言，可以根據(jù)體外試驗(yàn)初步估計(jì)治療有效總量或劑量。例如，在動(dòng)物模型中用公式計(jì)算出所要達(dá)到的循環(huán)濃度范圍包括細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定的半數(shù)有效劑量(IC50)的劑量。上述信息可以應(yīng)用于更精確地確定人體使用劑量。
應(yīng)用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，初始劑量也可以從體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)中估算，例如動(dòng)物模型。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很容易地根據(jù)動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)人體給藥進(jìn)行優(yōu)化，并且理所當(dāng)然地會(huì)參考被治療主體本身、該主體的體重、該主體的紊亂嚴(yán)重程度、給藥方式和處方醫(yī)生的診斷。
本發(fā)明還包括制備蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇對(duì)對(duì)蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點(diǎn)進(jìn)行編碼的多核苷酸序列，b)將所述多核苷酸序列引入編碼絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶的抑制劑蛋白序列中，由此得到嵌合序列，c)使所述嵌合序列在適合的條件下在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，以及d)復(fù)性蛋白酶的所述嵌合抑制劑蛋白。
選擇編碼對(duì)蛋白酶具有特異性的酶-底物相互作用位點(diǎn)的多核苷酸序列，可以由以下不同技術(shù)完成。例如，展示底物用蛋白酶選擇，如鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒直接從活細(xì)胞上展示肽，這樣可避免細(xì)菌表達(dá)(Buchholz等人，1998)或類似的方法應(yīng)用嵌合辛德比斯病毒(Sindbis virus)庫(kù)，該庫(kù)也可以應(yīng)用于蛋白酶斷裂位點(diǎn)的體內(nèi)選擇；應(yīng)用轉(zhuǎn)染了感興趣的酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Pacini等人，2000″In vivo selection of protease cleavage sites by usingchimeric Sindbis virus libraries″J Virol.74，2210563-70)。
還可預(yù)見(jiàn)的是酵母系統(tǒng)，特異蛋白水解位點(diǎn)的基因檢驗(yàn)(GASP)包括將隨機(jī)底物融合在完整膜蛋白中，使所述膜酵母附帶有底物；該膜酵母中，細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合報(bào)告基因的啟動(dòng)子(Kang等人，2001″An improvedstrategy for a genetic assay for site-specific proteolysis″Mol.Cell.30；11(2)263-6)。
近來(lái)出現(xiàn)了許多檢測(cè)蛋白酶底物特異性的組合化學(xué)庫(kù)。其中包括組合熒光底物庫(kù)和位置掃描-合成組合庫(kù)。
另外一種名為固定肽庫(kù)的方法，通過(guò)測(cè)量液相的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)庫(kù)中每個(gè)成員的相關(guān)底物特異性，并用Edman測(cè)序法鑒別所述易裂鍵(Hu等人，2002″Rapid determination of substrate specificity of clostridium histolyticumbeta-collagenase using an immobilized peptide library″J.Biol.Chem.8，277(10)8366-71)。
如果用噬菌體展示技術(shù)測(cè)定蛋白酶底物特異性，會(huì)產(chǎn)生具有毫無(wú)遺漏的多樣性的噬菌體-展示隨機(jī)肽庫(kù)，并經(jīng)純化蛋白酶篩選。此公知技術(shù)適于所述特異性的情況，目的在于建立噬菌體-展示隨機(jī)肽庫(kù)，該庫(kù)包括氨基酸長(zhǎng)度一定的所有可能的氨基酸序列組合。這樣大型庫(kù)通過(guò)在絲狀噬菌體末端上展示隨機(jī)序列而建立，并擴(kuò)增后通過(guò)蛋白酶快速檢驗(yàn)其特異性。
根據(jù)實(shí)施例1和2，申請(qǐng)人已經(jīng)建立了五聚物庫(kù)，該庫(kù)包括1.8×108獨(dú)立轉(zhuǎn)化株，可以視為完整，因?yàn)槔碚撋纤锌赡艿?.2×106個(gè)隨機(jī)五聚物序列都被展示出來(lái)了。噬菌體序列進(jìn)一步證實(shí)了所述五聚物插入體的隨機(jī)性。然后將展示有隨機(jī)五肽的噬菌體融合到配體中去(6×His)并使之固定在親合支持物上。所述支持物為Ni-NTA基質(zhì)。用所述蛋白酶(在實(shí)施例1和2中所述蛋白酶是hK2)培養(yǎng)之后，表達(dá)靈敏底物的噬菌體從固相中釋放出來(lái)。釋放出來(lái)的噬菌體用于感染F+(F-positiv)細(xì)菌，可以檢驗(yàn)出其滴度，并進(jìn)行擴(kuò)增。然后通過(guò)沉淀將所述噬菌體純化，擴(kuò)增然后固定在親合支持物上進(jìn)行下一輪的篩選。為了得到高特異性的多核苷酸序列，所述五肽的選擇總共重復(fù)了8次。將最后一輪篩選出的噬菌體克隆涂布到培養(yǎng)皿上，每種噬菌體的DNA編碼底物活性位點(diǎn)的區(qū)域都得到了擴(kuò)增，通過(guò)所述酶裂解檢驗(yàn)所述序列。
然后將編碼底物活性位點(diǎn)的多核苷酸序列引入到編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑的序列中，如引入到編碼rACT的序列中，得到嵌合序列。所述rACT的RSL結(jié)構(gòu)域中P1密碼子上游18bp位置，事先引入了兩個(gè)沉默限制位點(diǎn)Sac II和Mlu I；所述P1密碼子下游18bp位置，分配所述篩選出的編碼底物活性位點(diǎn)的多核苷酸序列的亞克隆。
重組嵌合抑制劑在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，在例如大腸桿菌TG1菌株中產(chǎn)生。所述適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件取決于所要表達(dá)的所述重組嵌合抑制劑，可以包括在10-40℃培養(yǎng)10-30小時(shí)。
正如申請(qǐng)人在實(shí)施例1和實(shí)施例2中所示，令人驚訝的是16℃培養(yǎng)16小時(shí)可實(shí)現(xiàn)表達(dá)，并且得到rACT完全完整的變體產(chǎn)物。
最后，當(dāng)重組嵌合抑制劑分泌出來(lái)時(shí)，可以在培養(yǎng)基中復(fù)性；當(dāng)沒(méi)有分泌出來(lái)時(shí)，可以從細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中提?。蝗缓笥帽绢I(lǐng)域公知技術(shù)如高效液相色譜、凝膠電泳、親合層析、超濾、離子交換等進(jìn)行純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯知道，用于純化特定重組嵌合抑制劑的實(shí)際條件部分取決于下列因素如靜電荷、疏水性、親水性等。
就親合層析純化而言，可以使用任何特異結(jié)合重組嵌合抑制劑或His標(biāo)簽的抗體。其它親合性分子如Ni2+-氨三乙酸交聯(lián)瓊脂糖珠，和特異結(jié)合His標(biāo)簽的親合性分子也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
然后可以根據(jù)嵌合抑制劑蛋白抑制蛋白酶的活性來(lái)進(jìn)一步得到檢驗(yàn)。任何常規(guī)的方法如斯卡查德法(Scatchard method)(Scatclzard，1949 Ann NYAcadSci 51660-669)都可完成該檢驗(yàn)。斯卡查德法描述了一種經(jīng)典的測(cè)量和分析蛋白之間結(jié)合的方法，該法要求相對(duì)純凈的蛋白和區(qū)分結(jié)合蛋白和未結(jié)合蛋白的能力。
另一種適合測(cè)量嵌合抑制劑蛋白與酶親合性的方法是，測(cè)量所述嵌合抑制劑蛋白減緩酶作用的能力。取決于所述酶裂解底物的速度和發(fā)色或產(chǎn)生熒光底物的可用性，此法要求相對(duì)純凈的嵌合抑制劑蛋白。
本發(fā)明優(yōu)選的所述嵌合抑制劑蛋白抑制所述蛋白酶活性，具有比它們的野生型對(duì)應(yīng)體更高的親合性。
這里公開(kāi)的所述嵌合抑制劑蛋白優(yōu)選在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)里重組產(chǎn)生。所述表達(dá)系統(tǒng)可以是真核或者原核宿主細(xì)胞。
多種單細(xì)胞宿主細(xì)胞應(yīng)用于表達(dá)本發(fā)明所述嵌合體抑制劑蛋白。所述宿主可以包括公知的真核和原核宿主，如細(xì)菌菌株大腸桿菌、大腸桿菌、假單胞菌、枯草桿菌、鏈霉菌等細(xì)菌菌株；真菌如酵母；動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、YB/20、NSO、SP2/0、Rl.1、B-W和L-M細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆蟲細(xì)胞(如Sf9)、以及人細(xì)胞和組織培養(yǎng)植入細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為選自分類屬枯草桿菌、埃希氏菌、沙門氏菌和解糖腸球菌(Erwinia)的細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞更優(yōu)選為大腸桿菌細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，用含分離純化的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的真核或原核宿主細(xì)胞，通?？梢愿鶕?jù)所選用載體的類型使用公知的方法予以實(shí)現(xiàn)。有關(guān)這些方法見(jiàn)于例如Maniatis等人，1982，Molecular Cloning，Alaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，以及商業(yè)上提供的方法。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)體內(nèi)或體外樣品中蛋白酶的診斷試劑盒，該試劑盒包括分離純化的DNA序列。所述DNA序列選自SEQ IDN°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ ID N°9、SEQ IDN°11和SEQ ID N°13及它們的互補(bǔ)序列，以及它們的片段和/或它們的變體。
本發(fā)明還選擇性地預(yù)見(jiàn)了一種檢測(cè)樣品中蛋白酶的診斷試劑盒，該試劑盒可以包括根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶嵌合抑制劑蛋白。所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白可以是如選自MD820、MD62、MD61、MD67和MD CI。
上述術(shù)語(yǔ)“樣品”指任何合適的標(biāo)本，可以含有蛋白酶或編碼蛋白酶的序列、或可以結(jié)合所述嵌合抑制劑蛋白或所述編碼所述嵌合抑制劑蛋白的分離純化的DNA序列。
所述診斷試劑盒可以包括能檢測(cè)蛋白酶的系統(tǒng)，其中檢測(cè)信號(hào)取決于蛋白的存在量。所述信號(hào)可以通過(guò)目測(cè)或儀器檢測(cè)?？赡艿男盘?hào)包括有色產(chǎn)物、熒光或發(fā)光產(chǎn)物、檢驗(yàn)成分或產(chǎn)物的吸收或發(fā)射輻射性質(zhì)變更、組成產(chǎn)物的沉淀或凝集。所述檢驗(yàn)成分可以是標(biāo)記，如放射性同位素、熒光團(tuán)、酶、輔酶、酶的底物、電子密集化合物、可凝集離子。所述試劑盒中的所述檢驗(yàn)成分可以結(jié)合嵌合抑制劑蛋白，或者結(jié)合分離純化的DNA序列。
最后，本發(fā)明還公開(kāi)提供了一種對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)與蛋白水解相關(guān)紊亂的治療或預(yù)防方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物服用含有重組野生型絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白作為活性成分的藥物組合物。
以上所述對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)與蛋白水解相關(guān)紊亂的治療或預(yù)防方法，適用于hK2激肽釋放酶活性有害的紊亂情況，包括諸如癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂如良性前列腺肥大或傳染性紊亂。
通過(guò)參考以下實(shí)施例，可以對(duì)上述描述進(jìn)行更全面的理解。然而這些實(shí)施例是實(shí)施本發(fā)明的典型方法，并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1應(yīng)用噬菌體展示篩選底物來(lái)開(kāi)發(fā)特異抑制人hK2的重組ACT抑制劑材料按已有方法從人精液中純化出hK2和hK3(PSA)(Frenette G，Gervais Y，Tremblay RR，Dube JY.1998″Contamination of purified prostate-specific antigenpreparations by kallikrein hK2″J Urol 159，1375-8)，抗hK2和抗PSA單克隆抗體由加拿大Laval大學(xué)RR Tremblay教授惠贈(zèng)。人胰凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化劑(uPA)、人激肽釋放酶hK1、人血漿激肽釋放酶(PK)、人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)和商品ACT(人血漿α1-抗胰凝乳蛋白酶)購(gòu)自Calbiochem公司。Z-Phe-Arg-AMC、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC、Z-Gly-Gly-Arg-AMC、MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC購(gòu)自Calbiochem公司。CFP-TFRSA-YFP熒光底物按已有方法開(kāi)發(fā)出來(lái)(Mahaian NP等人，1999″Novel mutant green fluorescent protein protease substrates reveal theactivation of specific caspases during apoptosis″Cheni Biol 6，401-9)。人血漿α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)的cDNA由賓夕法尼亞大學(xué)Dr.Harvey Rubin教授惠贈(zèng)。
定點(diǎn)誘變將ACT的cDNA亞克隆到pQE-9表達(dá)載體(Qiagen，德國(guó)，圖9)，并在rACTWT的氨基末端(N-terminal)導(dǎo)入HIS6標(biāo)簽后，將兩個(gè)限制酶切位點(diǎn)Sac II和MluI分別接在RSL結(jié)構(gòu)域的PI密碼子的上游18bp處和下游18bp處。根據(jù)Stratagene公司提供的快變(quickchange)突變實(shí)驗(yàn)方案，用寡核苷酸5′-GTGATTTTGACCGCGGTGGCAGCAG-3′對(duì)Sac II進(jìn)行同義突變；用5′-GCACAATGGTACGCGTC TCCACTAATG-3′對(duì)MluI進(jìn)行同義突變。
底物噬菌體展示庫(kù)的構(gòu)建用修飾的pH0508b噬菌粒制備底物噬菌體庫(kù)(Lowrnafi等人，1991，″Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display″Biocheinistry 12，10832-8)。構(gòu)建包括在Gly-Gly-Gly-Ser-重復(fù)-富含區(qū)域(Gly-Gly-Gly-Ser-repeat-rich region)的任意一端存在的HIS6標(biāo)簽，所述富含區(qū)域在噬菌體M13基因III的羧基末端結(jié)構(gòu)域(密碼子249-406)之前。隨機(jī)五肽通過(guò)用5′端被生物素?；囊飳?duì)模板寡核苷酸進(jìn)行PCR延伸而制得。所述模板寡核苷酸在產(chǎn)生的簡(jiǎn)并密碼子兩端都有合適的限制位點(diǎn)。所述簡(jiǎn)并密碼子是5′TGAGCTAGTCTAGATAGGTGGCGGTNNSNNSNNSNNSNNSGGGTCGACGTCGGT CATAGCAGTCGCTGCA-3′(其中N可以是任意核苷酸，S可以是G或C)，所述引物相應(yīng)的側(cè)翼區(qū)域?yàn)?′TGAGCTAGTCTAGATAGGTG-3′和5′-TGCAGCGACTGCTATGA-3′。PCR模板按已有方法進(jìn)行消化和純化(Smitll G.P，Scott J.K.1993″Libraries of peptides and proteins displayed onfilamentous phage″Methods Enzymol.217，228-57)，并被插入到由XbaI/SalI消化好的pH0508b載體中，并電穿孔導(dǎo)入到XL1-Blue(F-)。庫(kù)容量可根據(jù)轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行估計(jì)。所述轉(zhuǎn)化效率可通過(guò)將少部分轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布到含氨芐青霉素(100微克/毫升)和四環(huán)素(15微克/毫升)的Luria-Bertani平板上進(jìn)行檢測(cè)。其余的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于制備噬菌體庫(kù)，加入M13K07輔助噬菌體培養(yǎng)過(guò)夜。所述輔助噬菌體的濃度使感染復(fù)數(shù)達(dá)每毫升100個(gè)空斑形成單位(p.f.u.)。從上清液中收集噬菌體，并通過(guò)聚乙二醇沉淀進(jìn)行純化。從中隨機(jī)選取200個(gè)克隆用于測(cè)序，以驗(yàn)證該庫(kù)的隨機(jī)性。
噬菌體展示五肽庫(kù)的篩選所述新五肽庫(kù)用hK2篩選8輪。用10毫升含1毫克/毫升BSA的氯化鈉/磷酸緩沖液(NaCl/Pi)洗滌100微升Ni2+-氨三乙酸交聯(lián)瓊脂糖珠(Ni2+-氨三乙酸交聯(lián)瓊脂糖樹(shù)脂)。
將噬菌體微粒(1011)加入到平衡好的Ni2+-氨三乙酸交聯(lián)瓊脂糖樹(shù)脂中，4℃下緩慢攪拌3個(gè)小時(shí)使二者結(jié)合。隨后用NaCl/Pi(含1毫克/毫升的BSA，5毫摩爾/升的咪唑和0.1％的吐溫20)洗滌所述樹(shù)脂以去除沒(méi)有結(jié)合的噬菌體微粒，然后在NaCl/Pi中平衡所述樹(shù)脂。所述底物噬菌體在37℃下在27納摩爾/升(nM)(終濃度)的hK2中暴露45分鐘。還進(jìn)行了不含蛋白酶的空白篩選。將裂解的噬菌體釋放到上清液中，用XL1-Blue大腸桿菌擴(kuò)增，然后進(jìn)行下一輪篩選。八輪篩選后，大約15個(gè)單克隆從第五輪、第六輪和第八輪篩選中被挑選出來(lái)，并且分離了質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒上編碼所述底物的區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序。
重組野生型ACT及其變體的構(gòu)建和表達(dá)使用引物通過(guò)模板寡核苷酸的PCR延伸生成相應(yīng)在反應(yīng)活性部位環(huán)上P3和P3′之間(見(jiàn)下表4)的位置有變化的6個(gè)變體rACT8.20，5’-TACCGCGGTCAAAATCACCCTCCCGTTCTCGGAGCAGTGGAGACGCGTGA-3’；rACT6.3，5’-TACCGCGGTCAAAATCACCAGGAGGTCTATCGATGTGGAGACGCGTGA-3’；rACT8.3，5’-TACCGCGGTCAAAATCAGGGGGAGATCTGAGTTAGTGGAGACGCGTGA-3’；rACT6.7，5’-TACCGCGGTCAAAATCAAGCTTAGAACAACATTAGTGGAGACCGCTGA-3’；rACT6.1，5’-TACCGCGGTCAAAATCATGACAAGATCTAACTTAGTGGAGACGCGTGA-3’；rACT5.18，5’-TACCGCGGTCAAAATCACCGAGCGTGTCTCGCCCGTGGAGACGCGTGA-3’(其中劃線序列編碼反應(yīng)活性部位環(huán)的新斷裂位點(diǎn))，所述引物相應(yīng)的側(cè)翼區(qū)是5′-TACCGCGGTCAAAATC-3和5′-TCACGCGTGTCCAC-3′。將PCR產(chǎn)物用Sac II和Mlu I限制酶消化，然后亞克隆到消化好的rACTWT構(gòu)建體中。重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白在大腸桿菌TG1菌株中制備。細(xì)胞在37℃下在含100微克/毫升氨芐青霉素的2xTY培養(yǎng)基(每升含16克胰蛋白胨、10克酵母提取物、5克氯化鈉)中生長(zhǎng)至A600＝0.5。然后加入異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.5毫摩爾/升，使重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白在16℃下表達(dá)16小時(shí)。通過(guò)沉淀收集100毫升培養(yǎng)物里的細(xì)胞，重懸于冷磷酸緩沖液(PBS)中，經(jīng)過(guò)弗氏壓碎器，復(fù)性所有可溶的細(xì)胞質(zhì)蛋白。細(xì)胞碎片通過(guò)離心去除，上清液加入Ni2+-氨三乙酸交聯(lián)瓊脂糖珠，4℃下90分鐘以結(jié)合重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白。隨后用50毫摩爾/升pH值為8.0的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、500毫摩爾/升的NaCl和25毫摩爾/升的咪唑洗滌所述樹(shù)脂；結(jié)合在樹(shù)脂上的蛋白質(zhì)用50毫摩爾/升pH值為8.0的Tris、500毫摩爾/升的NaCl和150毫摩爾/升的咪唑洗脫10分鐘。一旦完成純化，在4℃下將rACT在50毫摩爾/升pH值為8.0的Tris、500毫摩爾/升的NaCl和0.05％Triton X-100中透析16小時(shí)。每種純化物的蛋白濃度用Bradford蛋白質(zhì)分析法(Bradford assay)測(cè)定，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE凝膠光密度測(cè)定使蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化(Laemmli UK.1970″Cleavageof structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4″Nature 227，680-5)。
表4重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)及其變體的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應(yīng)環(huán)(RSL)序列對(duì)比

底物多肽用噬菌體展示隨機(jī)五肽庫(kù)，經(jīng)激肽釋放酶hK2篩選。
常規(guī)字體的殘基是野生型ACT(rACTwT)共有的，黑體和下劃線標(biāo)注的殘基對(duì)應(yīng)ACT變體在所述RSL上的重置底物多肽。hK2底物多肽中的易裂鍵用↓表示，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白上推定的斷裂位點(diǎn)用星號(hào)(*)標(biāo)注在P1-P′1殘基之間。
抑制作用測(cè)定和抑制作用的化學(xué)計(jì)量(SI)用hK2和另外不同的酶測(cè)定rACTWT及其變體的抑制作用的化學(xué)計(jì)量(SI)值。初始測(cè)試時(shí)rACT與蛋白酶摩爾比過(guò)量100倍，所述蛋白酶為激肽釋放酶(hK2)、前列腺特異性抗原(PSA)、人激肽釋放酶(hK1)、胰凝乳蛋白酶(Chtr)、人血漿激肽釋放酶(PK)、尿激酶(uPA)和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)。反應(yīng)在反應(yīng)緩沖液(50毫摩爾/升pH值為7.5的Tris、150毫摩爾/升的NaCl、0.05％Triton X-100和0.01％的BSA)中，25℃下進(jìn)行30分鐘(PSA在37℃下進(jìn)行90分鐘)；殘余的蛋白酶活性通過(guò)加熒光底物檢測(cè)(hKl、hK2和PK加Z-Phe-Arg-AMC；Chtr加Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC；uPA加Z-Gly-Gly-Arg-AMC；HNE加MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC；PSA加CFP-TFRSA-YFP)。將加本發(fā)明的抑制劑的酶活性與未被抑制的反應(yīng)進(jìn)行對(duì)比。觀察加抑制劑的反應(yīng)，通過(guò)培養(yǎng)不同濃度的重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白檢測(cè)SI。用線性回歸分析活性分?jǐn)?shù)(受抑制的酶反應(yīng)速率/未受抑制的酶反應(yīng)速率)與抑制劑對(duì)蛋白酶摩爾比率的關(guān)系曲線，抑制作用的化學(xué)計(jì)量由橫坐標(biāo)截距可得。
動(dòng)力學(xué)在準(zhǔn)一級(jí)條件下，使用進(jìn)程曲線方法測(cè)量，hK2、胰凝乳蛋白酶、人血漿激肽釋放酶(PK)和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)與不同的rACT的相互作用的締合速率常數(shù)(Morrison JF，Walsh CT.1988″The behavior andsignificance of slow-binding enzyme inllibitors″Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol 61，201-301)。在此條件下，將固定量的蛋白酶(2納摩爾/升)與不同濃度的抑制劑(0-800納摩爾/升)和過(guò)量的底物(10微摩爾/升)混合。所有反應(yīng)都在反應(yīng)緩沖液(50毫摩爾/升pH值為7.5的Tris、150毫摩爾/升的NaCl、0.05％Triton X-100和0.01％的BSA)中，25℃下進(jìn)行45分鐘。產(chǎn)物生成速率通過(guò)FLx800熒光96孔微板測(cè)讀儀(Biotek，美國(guó))測(cè)量。在此模型中，抑制作用在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中視為不可逆的，酶活性的進(jìn)程用產(chǎn)物生成(P)表示，酶的起始速率(Vz)，被抑制一段時(shí)間(t)酶的一級(jí)反應(yīng)速率為(kobs)，速率常數(shù)只取決于抑制劑濃度。
P＝(Vz/kobs)×[1-e(-kobs)]方程1對(duì)每種抑制劑的kobs都在4個(gè)不同抑制劑濃度下用方程1計(jì)算非線性回歸的數(shù)據(jù)得到。通過(guò)繪制kobs對(duì)抑制劑濃度[I]測(cè)定二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)k′，k′等于上述曲線的斜率(k′＝Δkobs/Δ[I])。由于抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)，以下方程2用于校正二級(jí)反應(yīng)常數(shù)k′，考慮底物濃度[S]和所述蛋白酶對(duì)其底物的米氏常數(shù)Km，得出ka。
ka＝(1+[S]/Km)×k’方程2hK2對(duì)Z-FR-AMC的Km為67微摩爾/升，胰凝乳蛋白酶對(duì)Suc-AAPF-AMC的Km為145微摩爾/升，PK對(duì)Z-FR-AMC的Km為170微摩爾/升，HNE對(duì)MeOSuc-AAPV-AMC的Km為130微摩爾/升。
絡(luò)合物生成和抑制劑降解的蛋白質(zhì)印跡法分析激肽釋放酶hK2與不同的重組ACT，以[I]o∶[E]o比為100∶1，在50毫摩爾/升的Tris、200毫摩爾/升的NaCl和0.05％Triton X-100中，37℃下培養(yǎng)3小時(shí)。將蛋白樣品在95℃加熱5分鐘，用SDS-PAGE(12％的丙烯酰胺，T∶C比19∶1)分離，然后電印跡轉(zhuǎn)移至Hybond-ECL(Amersham Pharmacia)硝化纖維膜上。游離的hK2和hK2-ACT絡(luò)合物用鼠抗hK2單克隆抗體和堿性磷酸酯酶共軛的羊抗鼠二抗檢測(cè)。蛋白質(zhì)印跡用ECL檢測(cè)試劑盒(Amersham Phannacia Biotech)顯影。hK2還和ACT8.3或ACT6.7在25℃(動(dòng)力學(xué)條件)下，以[I]o∶[E]o比為100∶1，在50毫摩爾/升的Tris、200毫摩爾/升的NaCl和0.05％Triton X-100中，培養(yǎng)30分鐘。蛋白質(zhì)用抗His6單克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)，然后按上述方法檢測(cè)二抗。
可溶性重組野生型及變體ACT的制備野生型絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白α-1抗胰凝乳蛋白酶用于開(kāi)發(fā)激肽釋放酶hK2特異性抑制劑。rACTWTRSL結(jié)構(gòu)中P3-P′3之間的殘基被底物五肽取代。所述底物五肽由上述噬菌體展示技術(shù)選出。6種rACT變體(見(jiàn)表1)得以設(shè)計(jì)并構(gòu)建。根據(jù)絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白的RSL中的Leu-358-Ser-359，排列底物多肽的易裂鍵。rACTWT及其變體作為氨基末端位置含His標(biāo)簽的融合蛋白，由大腸桿菌TG1表達(dá)。所有的融合蛋白都在低溫下制備，使得蛋白主要以活性可溶形式積聚。在自然條件下純化，蛋白生成的水平在1.0-2.5毫克/升之間變化。純化的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白的純度，例如變體6.1(泳道1)和野生型ACT(泳道2)，經(jīng)SDS-PAGE分析評(píng)價(jià)超過(guò)98％(圖1)。
rACT變體的特異性主要針對(duì)激肽釋放酶hK2包括人嗜中性彈性蛋白酶、凝乳蛋白酶樣(Chtr、PSA或hK3)和胰島素樣(hK2、hK1、PK、uPA)蛋白酶在內(nèi)的一系列酶已被篩選出來(lái)，以檢測(cè)rACT變體的抑制特異性(表5)。
表5rACTWT及其變體的抑制性概況

a在對(duì)應(yīng)于由hK2選出的底物多肽的重組ACT的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應(yīng)環(huán)(RSL)上斷裂的氨基酸序列b蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白，以[I]o∶[E]o比為100∶1，25℃下培養(yǎng)30分鐘(PSA在37℃下90分鐘)。
抑制百分率符合100×(1-(抑制劑存在的反應(yīng)速率/未受抑制的空白反應(yīng)速率))
與過(guò)量抑制劑([I]o∶[E]o比為100∶1)培養(yǎng)30分鐘，hK2被rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7和rACT6.1完全抑制，但是rACT8.20和rACT5.18對(duì)酶活性的抑制分別為95％和73％。在此條件下，野生型rACT未表現(xiàn)對(duì)hK2的活性有抑制。在所述變體中，兩種變體(rACT8.3和rACT5.18)特異性抑制hK2，對(duì)其它測(cè)試的酶沒(méi)有抑制作用。另外兩種變體，rACT6.7和rACT6.2對(duì)PK也分別有36％和100％的抑制作用。野生型ACT和變體rACT8.20抑制兩種胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Chtr和PSA，而且還抑制PK和HNE。所述重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白都沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)激肽釋放酶hK1和uPA的抑制活性。
與野生型ACT相比，變體ACT對(duì)hK2的抑制作用化學(xué)計(jì)量明顯改善抑制作用化學(xué)計(jì)量的檢測(cè)是在所有酶的生理?xiàng)l件的pH和離子強(qiáng)度下完成的，以保證最有價(jià)值的比較。重組野生型ACT給出的對(duì)胰凝乳蛋白酶的SI值為2(表6)，與商購(gòu)ACT在相似條件下得到的值相同(數(shù)據(jù)未給出)。
表6rACTWT及其變體與hK2及其它蛋白酶的抑制作用化學(xué)計(jì)量值和反應(yīng)二級(jí)速率常數(shù)(ka)的比較

a用線性回歸分析外推I/E比而檢測(cè)的報(bào)告SI值(見(jiàn)圖1)b如《實(shí)驗(yàn)規(guī)程(Experimental Procedure)》中所述，絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白-蛋白酶反應(yīng)的二級(jí)反應(yīng)常數(shù)通過(guò)在準(zhǔn)一級(jí)或二級(jí)條件下測(cè)定。
c在對(duì)應(yīng)于hK2選出的底物多肽的重組ACT的絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應(yīng)環(huán)(RSL)上P3-P3’殘基的氨基酸序列-，沒(méi)有可檢測(cè)到的抑制活性。
為了檢測(cè)所有重組變體的SI值，申請(qǐng)人將hK2(5納摩爾/升)與濃度不同(6.25-500納摩爾/升)的rACT8.20(×)、rACT6.2(□)、rACT8.3(△)、rACT6.7(◇)、rACT6.1

rACT5.18(○)、rACTWT(+)，在反應(yīng)緩沖液中25℃下培養(yǎng)30分鐘。hK2殘余的活性(速率)通過(guò)加入熒光底物(10微摩爾/升)Z-FR-AMC檢測(cè)。速率分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)受抑制的酶反應(yīng)速率(Vi)/未受抑制的空白酶反應(yīng)速率(vo)之比。所述SI的檢測(cè)通過(guò)線性回歸分析外推I/E比(即x軸截距)。
如圖2所示，所有新構(gòu)建的ACT變體都表現(xiàn)出比野生型ACT低的對(duì)hK2的SI值。所有這些變體中，rACT6.7、rACT6.1和rACT6.2的對(duì)hK2的SI值最低(分別是9、19和25)。然而rACT6.2和rACT6.1還有對(duì)PK的最低SI值(18和16)，rACT6.7對(duì)PK的SI值(277)高很多。兩種對(duì)hK2特異的重組ACT，rACT8.3和rACT5.18具有較高的SI比，分別為34和139。rACT8.20抑制劑對(duì)包括hK2的所有測(cè)試酶的SI值都高達(dá)100。
變體ACT與hK2形成穩(wěn)定絡(luò)合物沒(méi)有降解抑制劑hK2與rACT8.20、rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7、rACT6.1、rACT5.18和野生型ACT，以I∶E比為100∶1，在37℃下培養(yǎng)30分鐘。與酶相互作用后，在還原的條件下，用鼠抗-hK2抗體檢測(cè)抑制劑的衰減，然后用蛋白質(zhì)印跡法分析rACT與hK2(rACT8.20(泳道1)、rACT6.2(泳道2)、rACT8.3(泳道3)、rACT6.7(泳道4)、rACT6.1(泳道5)、rACT5.18(泳道6)和野生型ACT(泳道7))的反應(yīng)產(chǎn)物。圖3A顯示了當(dāng)將hK2與ACT變體培養(yǎng)時(shí)，游離hK2(E)完全消失，形成共價(jià)絡(luò)合物(EI)。該共價(jià)絡(luò)合物表現(xiàn)出高穩(wěn)定性，因?yàn)樗诮?jīng)過(guò)16小時(shí)的培養(yǎng)期后沒(méi)有裂解(數(shù)據(jù)未給出)。野生型的ACT對(duì)hK2的抑制要慢得多，3小時(shí)培養(yǎng)之后多數(shù)還未絡(luò)合。檢測(cè)到的對(duì)hK2的SI值升高不能歸因于非絡(luò)合物促進(jìn)ACT變體抑制劑降解。
進(jìn)一步在非動(dòng)力學(xué)條件(25℃下30分鐘)下，將ACT8.3(泳道1)或ACT6.7(泳道3)與hK2(在蛋白質(zhì)印跡上分別為泳道2和泳道4)以I∶E比為10∶1培養(yǎng)。絡(luò)合物的生成在還原條件下，用鼠抗-His標(biāo)簽單克隆抗體(圖3B)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析。所有的抑制劑蛋白不是和hK2絡(luò)合，就是表現(xiàn)出非斷裂的狀態(tài)，表明可能的底物途徑對(duì)絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白-蛋白酶相互作用不重要。
變體ACT表現(xiàn)出與hK2極高的締合常數(shù)每種蛋白酶表現(xiàn)出的與抑制劑的反應(yīng)性決定了其與變體ACT抑制反應(yīng)的速率。最終hK2和重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白的相互作用在準(zhǔn)一級(jí)條件下，用進(jìn)程曲線測(cè)定。將hK2(2納摩爾/升)和底物Z-FR-AMC(10微摩爾/升)加入到具有變化量(20-800納摩爾/升)的抑制劑rACT8.20(◇)、rACT5.18(+)(圖4A)和抑制劑rACT6.2(○)、rACT8.3(□)、rACT6.7(△)、rACT6.1(×)(圖4B)中。描述進(jìn)程的曲線用方程1非線性回歸分析，以所述絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白濃度對(duì)速率(kobs)作圖。
測(cè)定kobs之后，締合常數(shù)(ka)用蛋白酶對(duì)其相應(yīng)底物(表4)的Km計(jì)算出來(lái)。野生型ACT與胰凝乳蛋白酶的ka值與文獻(xiàn)(Cooley等人，2001″Theserpin MNEI inhibits elastase-like and chymotrypsin-like serine proteasesthrough efficient reactions at two active sites″Biochemistry 40，15762-70)公開(kāi)的數(shù)據(jù)相同。重組rACT6.7表現(xiàn)出與hK2結(jié)合最高的ka(8991M-1s-1)，而它與PK的ka是與hK2的ka的四十五分之一。相反，重組rACT6.2與hK2的ka和與PK的ka相等，該重組rACT表現(xiàn)出缺乏對(duì)這兩種酶的辨別能力。hK2特異重組抑制劑rACT8.3和rACT5.18的ka值很低，分別為2439M-1s-1和595M-1s-1，但是非hK2特異性的rACT8.20表現(xiàn)出與hK2締合的ka為1779M-1s-1，相比之下高于其與Chtr、PK和HNE締合的活性。其中一種重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白rACT6.1，與PK的反應(yīng)速率高于與hK2的反應(yīng)速率。
實(shí)施例2特異性抑制人hK2和hK3蛋白酶的重組ACT抑制劑的開(kāi)發(fā)如實(shí)施例1所述，用編碼蛋白C抑制劑(PCI)的RSL的底物五肽序列(表7)取代野生型重組體ACT(rACTWT)的RSL結(jié)構(gòu)上的殘基P3-P’3。
表7重組絲氨酸蛋白酶抑制劑ACT、PCI和ACTPCI的反應(yīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑環(huán)(RSL)的排列

常規(guī)字體的殘基是和野生型重組rACT(ACTwT)共有的，黑體和下劃線標(biāo)注的殘基對(duì)應(yīng)ACT變體在所述RSL上的重置底物多肽。底物多肽中的易裂鍵用↓表示，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白上推定的斷裂位點(diǎn)用星號(hào)(*)標(biāo)注在P1-P′1殘基之間。
簡(jiǎn)要地講，為制備重組蛋白ACTPCI(MDCI)，TG1細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)之后，用相應(yīng)的構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后促使細(xì)胞達(dá)到最佳密度，在16℃下表達(dá)重組抑制劑16小時(shí)。
重組抑制劑ACTPCI從細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中提取出來(lái)，如前面的實(shí)例所述，用Ni-NTA柱親合層析分離所述重組抑制劑ACTPCI。
通過(guò)SDS-PAGE對(duì)重組ACT表達(dá)的分析在還原條件下，用SDS-PAGE分析實(shí)施例1和2中開(kāi)發(fā)的不同的抑制劑純度，結(jié)果見(jiàn)圖5。
抑制劑的評(píng)價(jià)對(duì)所述抑制劑進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，以評(píng)價(jià)它們的特異性以及它們抑制蛋白酶的親合性。所述蛋白酶為人激肽釋放酶hK2和hK3(圖6)，以及血漿激肽釋放酶、胰島素、尿激酶、彈性蛋白酶、凝血酶、hK14和人激肽釋放酶8(表8)。所述兩種酶具有不同的酶特異性(hK2胰島素樣；hK3胰凝乳蛋白酶樣)，但都被ACT天然抑制。雖然ACT被認(rèn)為是血液循環(huán)中的天然hK3抑制劑，但是它對(duì)hK2的抑制作用較差。
用蛋白質(zhì)印跡法分析rACT和人激肽釋放酶間的抑制反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖6。對(duì)于每一種ACT變體，將1微克抑制劑與100納克hK2或hK3在37℃生理?xiàng)l件下培養(yǎng)1小時(shí)。
用抗hK2 9D5的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖6A。
泳道1只有hK2，2商購(gòu)ACT+hK2，3野生型ACT+hK2，4MD820+hK2，5MDCI+hK2，6MD62+hK2，7MD61+hK2。
圖6B顯示了用抗-His抗體(重組ACT蛋白上帶有的His標(biāo)簽)檢測(cè)hK3-ACT絡(luò)合物的結(jié)果。
泳道1PSA，2PSA+ACT，3野生型ACT+PSA，4MD820+PSA，5MDCI+PSA，6MD62+PSA，7MD61+PSA。
氨基酸在反應(yīng)環(huán)內(nèi)變化，用篩選出的hK2特異性底物序列將ACT改造為對(duì)hK2高度特異性而不抑制hK3的抑制劑(MD820、MD61、MD62)。所述結(jié)果驗(yàn)證了前面表4的內(nèi)容。
只有基于蛋白C抑制劑(PCI)反應(yīng)環(huán)的MDCI能抑制所測(cè)試的兩種激肽釋放酶(hK2和hK3)。
MD61和MD62是對(duì)hK2具有極高親合性的抑制劑，3分鐘內(nèi)抑制所有的hK2蛋白(在同樣條件下)，相比之下，野生型或者商購(gòu)的α-1抗胰凝乳蛋白酶需要培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)以上才能抑制同樣量的hK2(數(shù)據(jù)未給出)。
表8MDCI的抑制概況

實(shí)施例3MD抑制劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用3.1MD62和MD67抑制劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用雄激素依賴的人前列腺癌細(xì)胞系DU-145得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)得到轉(zhuǎn)染有hK2基因的DU-145細(xì)胞(DU145/hK2)。
收集指數(shù)生長(zhǎng)的DU145/hK2細(xì)胞，以7.5×107個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度重懸于含1或10微克抑制劑的DMEM(Invitrogen)培養(yǎng)基中。所述細(xì)胞懸液以1∶2的比例與matrigel基質(zhì)(BD BioSciences)混合，皮下注射(3×106個(gè)細(xì)胞/40微升)到8周齡無(wú)胸腺Swiss裸鼠(兩只鼠/組)的左右脅腹。每只鼠接種兩個(gè)位置。
接種腫瘤后的第6天、第12天和第18天，皮下注射50微克或10微克MD62、MD67或者100微克或10微克ACT-WT。接種腫瘤后的第24天、第30天、第33天、第36天、第39天和第41天，皮下注射25微克或5微克抑制劑(MD62和MD67)或者50微克或5微克ACT-WT。
圖10A顯示出MD62對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。轉(zhuǎn)染了人激肽釋放酶2的前列腺癌細(xì)胞DU-145(3×106個(gè)細(xì)胞)移植到裸鼠體內(nèi)，然后用MD62治療(5或25微克/注射劑)。
圖10B顯示出MD67對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。轉(zhuǎn)染了人激肽釋放酶2的前列腺癌細(xì)胞DU-145(3×106個(gè)細(xì)胞)移植到裸鼠體內(nèi)，然后用MD67治療(5或25微克/注射劑)。
3.2MDCI抑制劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用雄激素依賴的人前列腺癌細(xì)胞系DU-145得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)得到轉(zhuǎn)染有hK2基因的DU-145細(xì)胞(DU145/hK2)。
收集指數(shù)生長(zhǎng)的DU145/hK2細(xì)胞，以7.5×107個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度重懸于含1或10微克抑制劑的DMEM(Invitrogen)培養(yǎng)基中。所述細(xì)胞懸液以1∶2的比例與基質(zhì)matrigel(BD Biosciences)混合，皮下注射(3×106個(gè)細(xì)胞/40微升)到8周齡無(wú)胸腺Swiss裸鼠(兩只鼠/組)的左右脅腹。每只鼠接種兩個(gè)位置。
接種腫瘤后的第6天、第12天和第18天，皮下注射100微克或10微克MDCI或ACT-WT。接種腫瘤后的第24天、第30天、第33天、第36天、第39天和第41天，皮下注射50微克或5微克MDCI或ACT-WT。
圖11顯示出MDCI對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。轉(zhuǎn)染了人激肽釋放酶2的前列腺癌細(xì)胞DU-145(3×106個(gè)細(xì)胞)移植到裸鼠體內(nèi)，然后用MDCI治療(5或50微克/注射劑)。
權(quán)利要求
1.一種蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，該嵌合抑制劑蛋白包括a)起抑制作用的多肽序列和b)至少一段對(duì)所述蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點(diǎn)的多肽序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述底物-酶相互作用位點(diǎn)的多肽序列為底物活性位點(diǎn)序列、該序列的片段、該序列的分子嵌合體、該序列的組合和/或該序列的變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述底物活性位點(diǎn)序列為絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應(yīng)環(huán)序列、該序列的片段、該序列的分子嵌合體、該序列的組合和/或該序列的變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白反應(yīng)環(huán)序列選自包括SEQ ID No 16、17、18、19、20、21、22序列、所述序列的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體的組中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述蛋白酶選自包括激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶(uPA)和人嗜中性彈性蛋白酶(HNE)的組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述激肽釋放酶為hK2激肽釋放酶蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述起抑制作用的多肽序列為對(duì)絲氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶起抑制作用的多肽序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述起抑制作用的多肽序列為絲氨酸蛋白酶抑制劑序列、該序列的片段、該序列的分子嵌合體、該序列的組合和/或該序列的變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求9所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述絲氨酸蛋白酶抑制劑序列選自包括α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、蛋白C抑制劑(PCI)、α-1抗蛋白酶(AAT)、人α-1抗胰蛋白酶相關(guān)蛋白前體(ATR)、α-2-血纖蛋白溶酶抑制劑(AAP)、人抗凝血酶-III前體(ATIII)、蛋白酶抑制劑10(PI10)、人膠原蛋白結(jié)合蛋白2前體(CBP2)、蛋白酶抑制劑7(PI7)、亮氨酸絲氨酸蛋白酶抑制劑2(HLS2)、人血漿蛋白酶Cl抑制劑(C1 INH)、單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(M/NEI)、纖溶酶原激活物抑制劑-3(PAI3)、蛋白酶抑制劑4(PI4)、蛋白酶抑制劑5(PI5)、蛋白酶抑制劑12(PI12)、人內(nèi)皮纖溶酶原激活物抑制劑-1前體(PAI-1)、人胎盤纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI2)、人色素上皮衍生因子前體(PEDF)、蛋白酶抑制劑6(PI6)、蛋白酶抑制劑8(PI8)、蛋白酶抑制劑9(PI9)、人鱗狀細(xì)胞癌抗原1(SCCA-1)、人鱗狀細(xì)胞癌抗原2(SCCA-2)、T4-結(jié)合球蛋白(TBG)、Megsin蛋白、蛋白酶抑制劑14(PI14)、以及它們的片段、它們的分子嵌合體、它們的組合和/或它們的變體的組中。
10.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白選自包括MD820、MD 62、MD 61、MD 67和MD CI的組中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白為MD 62或MD 67。
12.一種對(duì)蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白進(jìn)行編碼的分離純化的DNA序列，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白為前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述分離純化的DNA序列，其特征在于，所述序列選自包括SEQ ID N°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ IDN°9、SEQ ID N°11和SEQ ID N°13的組中。
14.一種表達(dá)載體，其特征在于，該載體包括權(quán)利要求12-13所述分離純化的DNA序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體，其特征在于，該載體還包括能夠連接所述分離純化的DNA序列的啟動(dòng)子。
16.一種真核或原核宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求14或15所述的表達(dá)載體。
17.一種藥物組合物，其特征在于，該組合物含有權(quán)利要求1-11所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白作為活性成分，以及選擇性結(jié)合的一種或多種適合的藥物載體。
18.一種對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)與蛋白水解相關(guān)的紊亂進(jìn)行治療或預(yù)防的方法，該方法包括給所述哺乳動(dòng)物服用權(quán)利要求17所述的藥物組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述紊亂是這樣一種紊亂，在該紊亂中hK2激肽釋放酶的活性是有害的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述紊亂為癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂或傳染性紊亂。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌癥為前列腺癌、乳腺癌或轉(zhuǎn)移瘤。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述炎癥紊亂為良性前列腺肥大。
23.權(quán)利要求17所述藥用組合物的用途，其特征在于，該組合物用于制備對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)與蛋白水解相關(guān)的紊亂進(jìn)行治療或預(yù)防的藥劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用途，其特征在于，所述紊亂是這樣一種紊亂，在該紊亂中hK2激肽釋放酶的活性是有害的。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的用途，其特征在于，所述紊亂為癌癥、自身免疫紊亂、炎癥紊亂或傳染性紊亂。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其特征在于，所述癌癥為前列腺癌、乳腺癌或轉(zhuǎn)移瘤。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其特征在于，所述炎癥紊亂為良性前列腺肥大。
28.一種制備權(quán)利要求1-11所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇對(duì)對(duì)蛋白酶具有特異性的底物-酶相互作用位點(diǎn)進(jìn)行編碼的多核苷酸序列，b)將多核苷酸序列引入編碼絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶的抑制劑蛋白的序列，由此得到嵌合序列，c)使所述嵌合序列在適合的條件下在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，以及d)復(fù)性蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述步驟a)通過(guò)噬菌體展示庫(kù)篩選完成。
30.根據(jù)權(quán)利要求28和29所述的方法，其特征在于，所述適合的條件包括將細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在10-40℃的溫度下培養(yǎng)10-30個(gè)小時(shí)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述適合的條件包括將細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在16℃下培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。
32.根據(jù)權(quán)利要求28-31所述的方法，其特征在于，所述步驟b)通過(guò)從所述細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中提取并分離所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白完成。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的分離通過(guò)親合層析方法完成。
34.根據(jù)權(quán)利要求28-33所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步檢驗(yàn)所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白的抑制所述蛋白酶活性的能力。
35.根據(jù)權(quán)利要求28-34所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)為真核或原核細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述原核細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞。
37.一種檢測(cè)樣品中蛋白酶的診斷試劑盒，其特征在于，該診斷試劑盒包括任意合適的分離純化的DNA序列，所述DNA序列選自包括SEQ IDN°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ ID N°9、SEQID N°11和SEQ ID N°13、它們的互補(bǔ)序列、它們的片段和/或它們的變體的組中。
38.一種檢測(cè)樣品中蛋白酶的診斷試劑盒，其特征在于，該診斷試劑盒含有權(quán)利要求1-11所述的蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白，該抑制劑蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段對(duì)所述蛋白酶具有特異性的底物－酶相互作用位點(diǎn)的多肽序列。本發(fā)明還提供了一種已分離純化的DNA序列，該DNA序列編碼所述蛋白酶的嵌合抑制劑蛋白；一種特征在于其中含有所述已分離純化的DNA序列的表達(dá)載體；一種轉(zhuǎn)化了所述表達(dá)載體的原核或真核宿主細(xì)胞；以及提供了一種制備嵌合抑制劑蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1798838SQ200480015268
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月4日
發(fā)明者D·德佩爾特, S·克盧捷 申請(qǐng)人:洛桑大學(xué)