專利名稱：脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法，尤其涉及不采用抗生素篩選而是通過轉(zhuǎn)化進(jìn)行被孢霉屬(Mortierella)脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種的方法。
背景技術(shù)：
一直以來，人們不斷地開發(fā)并實(shí)際應(yīng)用通過微生物的代謝來生產(chǎn)有用化合物的技術(shù)(廣義的發(fā)酵技術(shù))。具體來說，例如，具有通過代謝大量地生產(chǎn)脂質(zhì)的能力的脂質(zhì)生產(chǎn)菌。作為代表性脂質(zhì)生產(chǎn)菌，可列舉高山被孢霉(Mortierella alpina)等被孢霉屬菌類。已知被孢霉屬菌類可以生產(chǎn)以花生四烯酸為代表的多不飽和脂肪酸(PUFA)，且被孢霉屬菌類是工業(yè)上尤其有用的菌類(例如，參照日本特公平7-34752(公告日1995年4月19日，公開公報(bào)日本特開昭63-44891，
公開日1988年2月25日))。
人們對(duì)各種有用生物也包含上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌等的微生物進(jìn)行育種，即改良(品種改良)有用生物的遺傳性狀，使其具有人們所希望的更好的性狀。尤其在發(fā)酵技術(shù)中，從提高微生物的化合物生產(chǎn)效率、降低該化合物的制造成本等角度出發(fā)，育種是非常重要的。
育種方法基本上包括制備含有遺傳變異的群體的過程(方便起見，稱作群體制備過程)和從該群體中篩選出性狀更優(yōu)良的品種的過程(方便起見，稱作篩選過程)。無論是群體制備過程還是篩選過程，都可以根據(jù)將要進(jìn)行育種的有用生物的種類采用各種各樣的方法，上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌等的微生物的群體制備過程中，主要利用(1)突變處理法和(2)轉(zhuǎn)化法。
(1)突變處理法通過突變處理進(jìn)行群體制備過程時(shí)，用各種各樣的方法使微生物發(fā)生突變來制備群體，但突變本身會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生多種突變。因此，即使通過之后的篩選過程能夠獲得表現(xiàn)目的遺傳特征的品種(株)，與目的遺傳特征相關(guān)的基因以外的其他基因可能發(fā)生預(yù)料之外的損傷。例如上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌，雖然生產(chǎn)得到的脂質(zhì)的種類發(fā)生變化，但增殖或孢子形成能力等可能會(huì)下降。因此，采用通過突變處理來制備群體的過程，并不一定能夠得到生產(chǎn)性能好的菌株。
而且該方法如上所述，形成群體的個(gè)體會(huì)隨機(jī)產(chǎn)生多種突變。因此，在之后的篩選過程中，為了得到表現(xiàn)目的性狀的突變體(株)，當(dāng)沒有適宜的篩選方法時(shí)，必須對(duì)形成上述群體的全部個(gè)體的突變種類進(jìn)行分析，需要耗費(fèi)龐大的勞動(dòng)力。
(2)轉(zhuǎn)化法而通過轉(zhuǎn)化進(jìn)行群體制備過程時(shí)，以將要育種的有用生物為宿主，導(dǎo)入必須的DNA片段(轉(zhuǎn)化)來獲得目的性狀，從而得到轉(zhuǎn)化體的群體。即制備只控制與目的吻合的特定基因的表達(dá)的群體。因此，在之后的篩選過程中，只要從得到的轉(zhuǎn)化體中篩選更優(yōu)良品種(株)即可，不僅篩選變得容易，還可以避免上述其他基因產(chǎn)生預(yù)料之外的損傷。因此，可以明顯減少在育種上花費(fèi)的勞力。
因此，在育種的群體制備過程中，優(yōu)選轉(zhuǎn)化法。例如，報(bào)道了許多與被孢霉屬菌類所屬的絲狀菌的轉(zhuǎn)化方法相關(guān)的技術(shù)。
具體來說，(a)在下述文獻(xiàn)1～3等公開了通過顆粒轟擊法轉(zhuǎn)化鉤巢曲霉(Aspergillus nidulans)或粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)等絲狀菌的技術(shù)。在這些技術(shù)中，采用尿嘧啶缺陷型菌株作為轉(zhuǎn)化的宿主株，同時(shí)采用與尿嘧啶缺陷性互補(bǔ)的基因作為標(biāo)記基因，選擇轉(zhuǎn)化株。
此外，(b)作為上述高山被孢霉(M.alpina)的轉(zhuǎn)化方法，已知有下述文獻(xiàn)4中公開的技術(shù)。在該技術(shù)中，將孢子原生質(zhì)體化，通過電穿孔法將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。而且，轉(zhuǎn)化體的篩選以來自大腸菌的潮霉素B抗性基因(hpt)為標(biāo)記基因。因此可以篩選出能夠在含有潮霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體。
文獻(xiàn)1Fungaro M.H.et al.Fems microbial Lett.，25，293-297，1995文獻(xiàn)2Herzog R.W.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.，45，333-337，1996文獻(xiàn)3Armaleo，D.et al.Curr.Genet.，17，97-103，1990文獻(xiàn)4Mackenzie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4661.2000但是存在這樣的問題利用了上述轉(zhuǎn)化的技術(shù)難以有效且高效地對(duì)生產(chǎn)PUFA的脂質(zhì)生產(chǎn)菌進(jìn)行育種。
具體來說，采用上述(a)通過顆粒轟擊法轉(zhuǎn)化絲狀菌的技術(shù)時(shí)，作為轉(zhuǎn)化對(duì)象的上述A.nidulans或N.crassa等絲狀菌的脂質(zhì)生產(chǎn)性能低，因此不適用于工業(yè)生產(chǎn)PUFA等脂質(zhì)。
而在上述(b)文獻(xiàn)4中公開的技術(shù)是對(duì)公知的可以在工業(yè)上利用的脂質(zhì)生產(chǎn)菌M.alpina進(jìn)行轉(zhuǎn)化的技術(shù)。因此，與上述(a)的技術(shù)相比，可認(rèn)為該技術(shù)更適合在工業(yè)上應(yīng)用。
然而，以M.alpina為代表的被孢霉屬的菌類，并不全是潮霉素敏感性。因此用該技術(shù)進(jìn)行育種時(shí)，當(dāng)作為宿主的被孢霉屬菌是潮霉素抗性時(shí)，就不能用潮霉素抗性作為標(biāo)記。
大多數(shù)PUFA是必須脂肪酸，因參與生物體內(nèi)復(fù)雜的生理功能，近年來作為重要的營(yíng)養(yǎng)素而受到關(guān)注。因此，人們渴求能更加高效地生產(chǎn)PUFA的發(fā)酵技術(shù)，為此，高效且有效地對(duì)可靠性高的脂質(zhì)生產(chǎn)菌被孢霉屬菌類進(jìn)行育種的技術(shù)成為必須。
本發(fā)明鑒于上述課題而完成，其目的在于提供不通過抗生素且可以有效并高效地進(jìn)行被孢霉屬脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種的育種方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人等鑒于上述課題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)若能獲得作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌的被孢霉屬菌類的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，并以與該營(yíng)養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)的基因?yàn)闃?biāo)記基因建立可轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)，那么不僅可以高效且有效地轉(zhuǎn)化被孢霉屬菌類的全部菌株，利用該系統(tǒng)還可以自身克隆，能夠更加高效且有效地進(jìn)行育種，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法是被孢霉屬(Mortierella)脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法，其特征為，其包含具有基因?qū)氩襟E和篩選步驟的轉(zhuǎn)化過程，所述基因?qū)氩襟E以上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為宿主，以與上述營(yíng)養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)的基因?yàn)闃?biāo)記基因，將該標(biāo)記基因?qū)胨拗?；所述篩選步驟以上述宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷性的回復(fù)為標(biāo)記，篩選轉(zhuǎn)化株。
在上述育種方法中，上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌優(yōu)選Mortierella alpina、Mortierella hygrophila或Mortierella chlamydospora，上述營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株優(yōu)選尿嘧啶缺陷型菌株，上述標(biāo)記基因優(yōu)選采用乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因或乳清酸核苷酸焦磷酰酶基因。
而且，在上述育種方法中，基因?qū)氩襟E可以采用電穿孔法或顆粒轟擊法。
進(jìn)而，在上述育種方法中，還可以包含從原種的脂質(zhì)生產(chǎn)菌中獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株獲得過程。
本發(fā)明的其他目的、特征及優(yōu)點(diǎn)，可以通過以下說明而充分理解。而且，通過以下結(jié)合附圖
的說明，可以明白本發(fā)明的有益效果。
具體實(shí)施例方式
下面說明本發(fā)明的實(shí)施方式之一，但本發(fā)明并不限于此。
在本發(fā)明中，作為育種中制備含有遺傳變異的群體的過程(群體制備過程)，實(shí)施以營(yíng)養(yǎng)缺陷性為標(biāo)記的轉(zhuǎn)化過程。具體為獲得作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌的被孢霉屬菌類的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，將其作為宿主，導(dǎo)入與上述營(yíng)養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)的基因(轉(zhuǎn)化)。然后，以上述宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷性的回復(fù)為標(biāo)記，從上述群體中篩選轉(zhuǎn)化株。
下面，對(duì)作為本發(fā)明對(duì)象的被孢霉屬的菌類、本發(fā)明涉及的育種方法及其利用，分別詳細(xì)地進(jìn)行說明(1)被孢霉屬的菌類作為本發(fā)明育種方法的對(duì)象的被孢霉屬菌類，沒有特殊限制，可以是歸類于被孢霉屬的各種絲狀菌。被孢霉屬可分為Mortierella和Micromucor兩個(gè)亞屬。Mortierella亞屬的菌類均生產(chǎn)花生四烯酸等碳原子數(shù)為20的脂肪酸，而Micromucor亞屬只生產(chǎn)碳原子數(shù)為18或18以下的脂肪酸。作為本發(fā)明的對(duì)象的被孢霉屬菌類，可以是上述兩個(gè)亞屬中的任何一種。
作為被孢霉屬的菌類，具體來說，已知有M.alpina、M.elongata、M.exigua、M.hygrophila、M.isabelina、M.turficola、M.gamsii、M.cogitans、M.capitata、M.vinacea、M.chlamydospora等，當(dāng)然并不限于這些。其中，在本發(fā)明中，可優(yōu)選采用作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌被廣泛使用的M.alpina。已知M.alpina在菌體內(nèi)蓄積以花生四烯酸(ARA)為代表的PUFA，而且M.alpina不僅被用于PUFA生物合成的研究，還被廣泛地用于PUFA的工業(yè)生產(chǎn)。
對(duì)包含上述M.alpina的被孢霉屬菌類的獲得方法，沒有特殊限制，可以從財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所或ATCC(American Type Culture Collection)等的微生物等的寄存機(jī)關(guān)獲得?；蛘?，如果是進(jìn)行了專利申請(qǐng)的菌株，可以從獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄存中心獲得。此外，還可以使用從自然環(huán)境中通過公知的篩選方法獲得的被孢霉屬的未知菌株。
(2)本發(fā)明涉及的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法本發(fā)明涉及的育種方法，優(yōu)選包含在上述群體制備過程中實(shí)施轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化過程，更優(yōu)選包含營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株獲得過程。當(dāng)然，還可以包含其他的過程。下面，對(duì)各個(gè)過程進(jìn)行詳細(xì)說明。
<營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株獲得過程>
對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株獲得過程沒有特殊限制，只要是從原種的被孢霉屬菌中獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株)的過程即可，可以采用用于獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的公知技術(shù)。特別是，當(dāng)與營(yíng)養(yǎng)缺陷性相關(guān)的基因明了時(shí)(例如，全長(zhǎng)基因組解讀等)，通過破壞其基因就可以容易地獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，因此成為優(yōu)選方法。
對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的具體種類沒有特殊限制，例如，可以列舉亮氨酸、組氨酸、蛋氨酸、精氨酸、色氨酸、賴氨酸等的氨基酸缺陷型菌株；尿嘧啶、腺嘌呤等的核酸堿基缺陷型菌株；維生素缺陷型菌株等。在本發(fā)明中，如后述實(shí)施例中所述，采用尿嘧啶缺陷型菌株。尿嘧啶缺陷型菌株具有以下優(yōu)點(diǎn)特別是被孢霉屬菌類，可實(shí)施以5-氟乳清酸(5-FOA)抗性為正篩選標(biāo)記的篩選。
因此，在營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株獲得過程中，可以只通過得到在缺損特定營(yíng)養(yǎng)素的合成培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)的菌株，獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，也可以通過實(shí)施限定突變基因的篩選，獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。例如尿嘧啶缺陷型菌株的獲得，其采用上述5-FOA實(shí)施篩選，可以獲得URA3基因或URA5基因發(fā)生了突變的尿嘧啶缺陷型菌株。同樣地例如賴氨酸缺陷型菌株的獲得，其采用氨基己二酸實(shí)施篩選，可以獲得LYS2基因或LYS5基因發(fā)生了突變的賴氨酸缺陷型菌株。按上述方法，只要獲得限定了突變基因的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，就可以確定在之后的轉(zhuǎn)化過程中使用的標(biāo)記基因，因此成為優(yōu)選方法。
<轉(zhuǎn)化過程1·基因?qū)氩襟E>
轉(zhuǎn)化過程如上所述，其為在育種的群體制備過程中實(shí)施轉(zhuǎn)化的過程，至少包括基因?qū)氩襟E和篩選步驟這兩個(gè)步驟。當(dāng)然，根據(jù)需要，還可以包括除了這些步驟以外的其他步驟。
對(duì)本發(fā)明中的基因?qū)氩襟E沒有特殊限制，只要是以被孢霉屬菌類(脂質(zhì)生產(chǎn)菌)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為宿主，采用與上述營(yíng)養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)的基因作為標(biāo)記基因，將該標(biāo)記基因?qū)胨拗鞯牟襟E即可。
對(duì)上述標(biāo)記基因沒有特殊限制，只要是與營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的突變(營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變)互補(bǔ)的基因即可。具體可列舉亮氨酸缺陷型菌株時(shí)可采用leu2基因；組氨酸缺陷型菌株時(shí)可采用his3基因；賴氨酸缺陷型菌株時(shí)可采用lys2基因；色氨酸缺陷型菌株時(shí)可采用trp1基因；尿嘧啶缺陷型菌株時(shí)可采用ura3基因或ura5基因；腺嘌呤缺陷型菌株時(shí)可采用ade2基因等。在本發(fā)明中，如后述實(shí)施例中所述，以尿嘧啶缺陷型菌株為宿主，用ura5基因作為標(biāo)記基因。
對(duì)上述各標(biāo)記基因的獲得方法也沒有特殊限制，可以采用公知的方法從酵母等異種(微)生物中獲得，也可以利用市售的標(biāo)記基因。此外，在本發(fā)明中，可以自身克隆，因此還可以從作為宿主的被孢霉屬菌中獲得標(biāo)記基因。例如，在后述的實(shí)施例中，利用三種酵母中ura5基因的堿基序列，從作為宿主的M.alpina中獲得ura5基因。
對(duì)上述基因?qū)氩襟E中使用的基因?qū)敕椒?轉(zhuǎn)化方法)沒有特殊限制，可采用電穿孔法或顆粒轟擊法等以往公知的方法。采用電穿孔法轉(zhuǎn)化被孢霉屬的菌類時(shí)，優(yōu)選先將菌體原生質(zhì)體化。另外，作為上述顆粒轟擊法的具體例子之一，可以是基因槍法，當(dāng)然并不限于此。
上述標(biāo)記基因只要以能夠表達(dá)的方式被導(dǎo)入被孢霉屬菌體內(nèi)即可，因此對(duì)其具體結(jié)構(gòu)沒有特殊限制。在本發(fā)明中，構(gòu)建至少連有啟動(dòng)子的表達(dá)盒，進(jìn)而在該表達(dá)盒上連接與染色體重組的區(qū)域(稱為重組區(qū)域)，構(gòu)建成基因構(gòu)建物。因此，上述基因構(gòu)建物可以插入載體后再被導(dǎo)入上述宿主，也可以以原樣被直接導(dǎo)入。
上述基因構(gòu)建物中含有的標(biāo)記基因的表達(dá)盒，在標(biāo)記基因上游至少連有啟動(dòng)子，優(yōu)選還在標(biāo)記基因的下游連有終止子。而且，在上述基因構(gòu)建物中，除了上述標(biāo)記基因的表達(dá)盒以及重組區(qū)域外，可以導(dǎo)入使各種基因表達(dá)的表達(dá)盒，因此還可以含有多克隆位點(diǎn)。在上述基因構(gòu)建物中還可以含有除了上述標(biāo)記基因的表達(dá)盒(啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、終止子)、重組區(qū)域或多克隆位點(diǎn)以外的DNA片段，對(duì)上述基因構(gòu)建物的更加具體的結(jié)構(gòu)沒有特殊限制。
對(duì)上述各DNA片段的具體種類也沒有特殊限制。例如，啟動(dòng)子只要能使標(biāo)記基因有效地表達(dá)即可，對(duì)其沒有特殊限制，可以采用適宜的公知啟動(dòng)子。在后述的實(shí)施例中，采用hisH4.1啟動(dòng)子，當(dāng)然并不限于此。同樣地，對(duì)終止子也沒有特殊限制，只要其具有轉(zhuǎn)錄終止部位的功能即可，可以是公知的終止子。在后述的實(shí)施例中，采用trpC終止子，當(dāng)然并不限于此。此外，對(duì)重組區(qū)域也沒有特殊限制，只要是把被導(dǎo)入到被孢霉屬菌體內(nèi)的標(biāo)記基因整合到染色體內(nèi)的DNA片段即可。在后述的實(shí)施例中，采用18S核糖體DNA(18Sr)。
對(duì)上述基因構(gòu)建物整合到載體中構(gòu)成表達(dá)載體，也沒有特殊限制，一般的重組表達(dá)載體即可。可采用質(zhì)粒、噬菌體或黏粒等制備重組表達(dá)載體，并沒有特殊限制。而且，可以采用公知的方法制備重組表達(dá)載體。通常，可以優(yōu)選使用質(zhì)粒。
<轉(zhuǎn)化過程2·篩選步驟>
對(duì)轉(zhuǎn)化過程中的篩選步驟沒有特殊限制，只要是以上述宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷性的回復(fù)為標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化體的步驟即可，可以采用適宜的公知方法。即，基于營(yíng)養(yǎng)缺陷性標(biāo)記，除去合成培養(yǎng)基中特定的營(yíng)養(yǎng)素，將經(jīng)上述基因?qū)氩襟E后得到的轉(zhuǎn)化體在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可。按上述方法，可以容易且高效地篩選轉(zhuǎn)化體。
如上所述，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化過程中，采用營(yíng)養(yǎng)缺陷性作為標(biāo)記。營(yíng)養(yǎng)缺陷性標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、背景低、能夠利用來自作為宿主的被孢霉屬菌的基因等優(yōu)點(diǎn)。而且，與抗生素抗性標(biāo)記相比，營(yíng)養(yǎng)缺陷性標(biāo)記還具有適用于食品開發(fā)等優(yōu)點(diǎn)。
具體來說，例如以背景技術(shù)中所述上述文獻(xiàn)4的技術(shù)即以潮霉素抗性作標(biāo)記為例，為了使篩選得到的轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定地生長(zhǎng)，須在培養(yǎng)基中添加潮霉素。因此，用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)得到的脂質(zhì)中有可能混入潮霉素，但當(dāng)脂質(zhì)在食品中使用時(shí)，應(yīng)該避免潮霉素的混入。
在此以營(yíng)養(yǎng)缺陷性為尿嘧啶缺陷性的尿嘧啶缺陷型菌株為例，在實(shí)際生產(chǎn)中，采用尿嘧啶缺損的培養(yǎng)基實(shí)施培養(yǎng)，因此在篩選導(dǎo)入了與ura5基因等的營(yíng)養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)的基因的菌體的同時(shí)，可以生產(chǎn)脂質(zhì)。即，如果以營(yíng)養(yǎng)缺陷性作為標(biāo)記，不僅可以避免潮霉素的混入，還可以在培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常地進(jìn)行篩選。因此，更優(yōu)選如本發(fā)明這樣采用營(yíng)養(yǎng)缺陷性標(biāo)記。
<篩選過程>
在本發(fā)明涉及的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法中，上述轉(zhuǎn)化過程以營(yíng)養(yǎng)缺陷性為標(biāo)記，通過導(dǎo)入各種各樣的基因，可以獲得表現(xiàn)各種性狀的菌株的群體。因此，在本發(fā)明中，在上述轉(zhuǎn)化過程后，可以實(shí)施篩選過程，即從獲得的群體中篩選性狀更優(yōu)良的品種。另外，這里所謂的“篩選過程”與上述轉(zhuǎn)化過程中的“篩選步驟”不同，這里所謂的“篩選過程”不是以營(yíng)養(yǎng)缺陷性為標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化株，是從得到的多株轉(zhuǎn)化株中篩選性狀更優(yōu)良的轉(zhuǎn)化株。
對(duì)篩選過程的具體方法沒有特別限制，根據(jù)育種的目的，設(shè)定能夠篩選出性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)化株的條件，通過公知的方法篩選優(yōu)良的轉(zhuǎn)化株即可。
(3)本發(fā)明的利用本發(fā)明涉及的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法如上所述，以營(yíng)養(yǎng)缺陷性為標(biāo)記，從含有遺傳變異的群體中篩選性狀更優(yōu)良的品種。因此，以被孢霉屬的脂質(zhì)生產(chǎn)菌為原種，可以高效且有效地生產(chǎn)新品種(新菌株)。被孢霉屬菌類作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌而廣為人知，因其包含M.alpina這樣可靠性高的菌類，可以容易且高效地生產(chǎn)脂質(zhì)生產(chǎn)性能進(jìn)一步提高的菌株。
而且，在本發(fā)明涉及的育種方法中，只采用將要進(jìn)行轉(zhuǎn)化的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的基因就可以轉(zhuǎn)化，因而可以自身克隆。因此，在本發(fā)明中，從原種的被孢霉屬菌類中獲得適宜的DNA片段，將該DNA片段導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，可以調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)(高表達(dá)、調(diào)節(jié)表達(dá)的時(shí)期、抑制表達(dá)等)，可以獲得新菌株即獲得能使脂質(zhì)生產(chǎn)量增加、生產(chǎn)的脂質(zhì)的種類改變、組成改變等的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)然，本發(fā)明也可以不通過自身克隆，將來自其他種的DNA片段導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。
在本發(fā)明涉及的育種方法中，例如在自身克隆時(shí)，對(duì)從原種(宿主)被孢霉屬菌類中獲得適宜的DNA片段的方法沒有特殊限制，可以采用公知的方法。而且，對(duì)這里所述的適宜的DNA片段(例如，想要導(dǎo)入的基因等)沒有特殊限制，只要是在被孢霉屬宿主菌中可以表現(xiàn)更優(yōu)良的目的性狀的DNA片段，或有可能表現(xiàn)該性狀的DNA片段即可。
該DNA片段與上述ura5基因一樣，至少與啟動(dòng)子連接、優(yōu)選還與終止子連接構(gòu)建表達(dá)盒后，插入到重組表達(dá)載體中，但并不限于此。在后述的實(shí)施例中，采用GLELO基因作為上述DNA片段，當(dāng)然，本發(fā)明并不限于此。
下面，結(jié)合實(shí)施例更加具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。
在本實(shí)施例中，對(duì)本發(fā)明涉及的育種方法的例子之一即獲得尿嘧啶缺陷型菌株、將其轉(zhuǎn)化后實(shí)施篩選的具體例子進(jìn)行說明。
(1)尿嘧啶缺陷型菌株的獲得(營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株獲得過程)為了形成M.alpina的孢子，將本菌植菌到Czapek-Dox培養(yǎng)基(3％蔗糖、0.2％NaNO3、0.1％KH2PO4、0.05％KCl、0.05％MgSO4·7H2O、0.001％FeSO4·7H2O、2％瓊脂、pH值調(diào)至6.0)，在28℃下，培養(yǎng)約2周。將其懸浮在吐溫80水溶液中(1drop/100mL H2O)，通過玻璃過濾器(GlassFilter)(巖城硝子公司制造，商品號(hào)3G1)除去菌絲，制成孢子液。采用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，按照J(rèn)areonkitmongkol等的方法(S.Jareonkitmongkol et al.JAOCS，69，939-944，1992)，對(duì)1×108～1×109個(gè)孢子進(jìn)行突變處理。
將經(jīng)突變處理后的孢子涂布在含有1.0mg/mL 5-FOA和0.05mg/mL尿嘧啶的GY培養(yǎng)基上(2％葡萄糖、1％酵母提取物、2％瓊脂、pH值調(diào)至6.0)，在28℃下，培養(yǎng)4天，得到6株5-FOA抗性株。對(duì)這些菌株進(jìn)行尿嘧啶缺陷性的評(píng)價(jià)。
即，比較這些菌株在SC培養(yǎng)基(無氨基酸無硫酸銨酵母氮源(Difco公司制造)5.0g、(NH4)2SO41.7g、葡萄糖20g、瓊脂20g、腺嘌呤20mg、酪氨酸30mg、蛋氨酸1.0mg、精氨酸2.0mg、組氨酸2.0mg、賴氨酸4.0mg、色氨酸4.0mg、蘇氨酸5.0mg、異亮氨酸6.0mg、亮氨酸6.0mg、苯基丙氨酸6.0mg/L)和添加了尿嘧啶的SC培養(yǎng)基(尿嘧啶50mg/L)上的生長(zhǎng)情況。
其結(jié)果為，6株5-FOA抗性株與親株一樣均可以在含尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況不好，其中有2株完全不能生長(zhǎng)。將這兩株分別命名為Δura-1株、Δura-2株。
(2)酶活性的測(cè)定可以認(rèn)為當(dāng)表現(xiàn)5-FOA抗性且尿嘧啶缺陷性這樣的表型時(shí)，乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(由ura3基因編碼的酶，略寫為ura3p)或乳清酸核苷酸焦磷酰酶(由ura5基因編碼的酶，略寫為ura5p)失活。因此，測(cè)定了上述Δura-1株以及Δura-2株中這些酶的活性。
將各菌株在添加了尿嘧啶的GY培養(yǎng)基中在28℃下振蕩培養(yǎng)4天。改良Wynn等的方法(J.P.Wynn et al.Microbiology，146，2325-2331，2000)制備菌體的無細(xì)胞提取液。
即，把在含有0.05mg/mL尿嘧啶的GY液體培養(yǎng)基中在28℃下培養(yǎng)了4天的菌體，懸浮在含有5mMβ-巰基乙醇的0.1M Tris緩沖液(pH 7.5)中。然后，在35MPa下用弗氏壓碎器(French press)破碎細(xì)胞，離心。得到的上清液作為無細(xì)胞提取液。再于100,000×g超離心60min除去細(xì)胞器，得到可溶性組分。
用得到的可溶性組分，根據(jù)Yoshimoto等的方法(A.Yoshimoto etal.Methods in Enzymology Vol 51，74-79，ACADEMIC PRESS 1978)，測(cè)定了ura3p的活性。用同樣得到的可溶性組分，根據(jù)Umezu等的方法(K.Umezu et al.J.Biochem.，70，249-262，1971)，測(cè)定了ura5p的活性。其結(jié)果即與嘧啶生物合成相關(guān)的酶的活性的比較在表1中顯示。表1的結(jié)果表明，這兩株任何一株的ura3p的活性都與親株相同，但均未檢測(cè)出ura5p的活性。
進(jìn)而又對(duì)另外制備好的108～109個(gè)孢子進(jìn)行了同樣的突變處理，得到5株5-FOA抗性株，其中，有3株在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中完全不生長(zhǎng)。


※-不被查出(3)M.alpina的基因組DNA的獲得以及cDNA文庫的制作分別將M.alpina和以此為原種(wild type)誘導(dǎo)的尿嘧啶缺陷型菌株(上述Δura-1株及Δura-2株)在GY液體培養(yǎng)基中在28℃下培養(yǎng)5天，按照Sakuradani等的方法(E.Sakuradani etal.Eur.J.Biochem.，260，208-216，1999)，從得到的菌體中制備基因組DNA。
將M.alpina的孢子植菌到液體培養(yǎng)基(2％葡萄糖、1％酵母提取物、pH值調(diào)至6.0)，在28℃下培養(yǎng)4天?；厥站w，用鹽酸胍/氯化銫法制備總RNA。用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(From TotalRNA)(商品名，TAKARABIO公司制造)從總RNA中純化mRNA，用ZAP-cDNASynhesis Kit(商品名、STRATAGENE公司制造)制作cDNA文庫。
(4)從M.alpina中獲得ura5cDNA關(guān)于三種酵母Glomerella graminicola、Saccharomyces cerevisiae以及Sordaria macrospora的ura5p的氨基酸序列，基于其同源性極高的兩個(gè)區(qū)域的以下氨基酸序列，區(qū)域1FGPAYKGIP(參照序列號(hào)1)區(qū)域2KEAKDHGEG(參照序列號(hào)2)合成了含有以下堿基序列的正義引物和反義引物。另外，下述引物中的I表示次黃苷(inosine)。此外，在序列表中，與次黃苷相當(dāng)?shù)牟课挥胣表不。
正義引物5’-TTYGGHCCIGCITAYAARGGHATYCC-3’(序列號(hào)3)反義引物5’-CCCTCDCCRTGRTCYTTIGCYTCYTT-3’(序列號(hào)4)
接著，通過T Gradient Thermocycler(商品名，Biometra公司制造)，以M.alpina的基因組DNA為模板，采用上述兩個(gè)引物，采用Ex Taqpolymerase(TAKARABIO公司制造)進(jìn)行PCR。此時(shí)的PCR條件為以94℃下1分鐘、52℃下1分鐘以及72℃下2分鐘為一個(gè)循環(huán)，35個(gè)循環(huán)后，在72℃下延伸10分鐘。
結(jié)果得到約130bp的DNA片段，并確定了該DNA片段的堿基序列。該DNA片段顯示出了與已知ura5基因的高同源性。以該DNA片段為探針，通過噬菌斑雜交篩選(3)中制備的M.alpina的cDNA文庫，從而獲得了質(zhì)粒pBMAURA5，該質(zhì)粒含有M.alpina的ura5基因的eDNA。
另外，ura5基因的cDNA含有序列號(hào)5所示的堿基序列，由該ura5基因所編碼的ura5p含有序列號(hào)6所示的氨基酸序列。
(5)ura5基因組DNA的克隆基于上述ura5基因的cDNA序列(序列號(hào)5)，合成了以下所示引物CRON1和CRON2，引物CRON1CTTCTCTTCAGCCCCCAGCCGCATCGGTCC(序列號(hào)7)引物CRON2GAGTCCACGAAAACTGCTGATGAGCAGCAC(序列號(hào)8)以M.alpina的基因組DNA為模板，通過PCR克隆了ura5基因組DNA。此時(shí)的PCR條件為以94℃下1分鐘、55℃下1分鐘以及72℃下2分鐘為一個(gè)循環(huán)，30個(gè)循環(huán)后，在72℃下延伸10分鐘。其結(jié)果表明，在ura5基因組基因上不存在內(nèi)含子。
(6)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的突變部位的確定用上述引物CRON1以及CRON2，分別以尿嘧啶缺陷型菌株Δura-1株以及Δura-2株的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR，克隆了各菌株的ura5基因組基因。此時(shí)的PCR條件為以94℃下1分鐘、55℃下1分鐘以及72℃下2分鐘為一個(gè)循環(huán)，30個(gè)循環(huán)后，在72℃下延伸10分鐘。其結(jié)果為，在Δura-1株中，從啟始密碼子開始數(shù)的第93位堿基位點(diǎn)插入了一個(gè)腺嘌呤堿基，在ORF內(nèi)引起移碼突變(frame shift)。而在Δura-2株中，第398位的鳥嘌呤被腺嘌呤取代，基序內(nèi)第133位的甘氨酸被天冬氨酸取代。這些突變的結(jié)果說明上述兩株菌株的ura5p已經(jīng)失活。
(7)重組表達(dá)載體pDura5的構(gòu)建用限制酶NcoI以及BamHI酶解質(zhì)粒pD4(D.B.Archer等轉(zhuǎn)讓，參照前述文獻(xiàn)4)，用DNA Blunting Kit(商品名，TAKARABIO公司制造)將末端平滑化后，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(商品名、AMERSHAM BIOSCIENCE公司制造)純化除去潮霉素B抗性基因hptmod片段的5.4kbp DNA片段。用限制酶EcoRI以及XhoI酶解在(4)中得到的上述pBMAURA5，末端平滑化后，純化含有ura5 cDNA的約0.65kbp的片段。將上述兩個(gè)片段用ligation high(商品名，東洋紡公司制造)連接。確認(rèn)ura5基因的方向，選擇ura5基因的5’上游連有his H 4.1啟動(dòng)子且3’下游連有trpC終止子的作為質(zhì)粒pDura5。
(8)pDura5的轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化過程)用SC瓊脂培養(yǎng)基作為轉(zhuǎn)化株的選擇培養(yǎng)基。將作為宿主的Δura-1株的108個(gè)孢子涂布在SC瓊脂培養(yǎng)基上。通過顆粒轟擊法將上述pDura5導(dǎo)入(轉(zhuǎn)化)宿主。PDS-1000/He Particle Delivery System(商品名，BIO RAD公司制造)的基因?qū)朐诤鈮毫?590kPa(1100psi)、轟擊室(chamber)內(nèi)真空且為28英寸汞柱、目標(biāo)距離為3cm、鎢顆粒的粒徑為1.1μm的條件下進(jìn)行?；?qū)牒?，?8℃下，培養(yǎng)2～3天，長(zhǎng)出4個(gè)菌落，即得到轉(zhuǎn)化株。另外，為方便起見，對(duì)這些轉(zhuǎn)化株編號(hào)，編為#1～#4。
通過PCR確認(rèn)了在轉(zhuǎn)化株#1～#4中有無導(dǎo)入基因。即，制備各轉(zhuǎn)化株的基因組DNA，以此作為模板，采用以下所示引物RDNA1以及RDNA2引物RDNA1ACAGGTACACTTGTTTAGAG(序列號(hào)9)引物RDNA2CGCTGCGTTCTTCATCGATG(序列號(hào)10)和Ex Taq polymerase(TAKARABIO公司制造)進(jìn)行PCR。此時(shí)的PCR條件為以94℃下1分鐘、54℃下1分鐘以及72℃下1分鐘為一個(gè)循環(huán)，35個(gè)循環(huán)后，在72℃下延伸10分鐘。另外，作為對(duì)比，同樣地通過PCR確認(rèn)了Δura-1株中有無導(dǎo)入基因。
其結(jié)果為，在Δura-1宿主株中沒有發(fā)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增，而在轉(zhuǎn)化株#1～#4中均發(fā)現(xiàn)有1.5kbp的DNA片段的擴(kuò)增。由此可證實(shí)，上述#1～#4的18SrDNA區(qū)域發(fā)生了與質(zhì)粒pDura5的重組，ura5基因被導(dǎo)入。
此外，將上述轉(zhuǎn)化株#1～#4在SC液體培養(yǎng)基中在28℃下振蕩培養(yǎng)4天，測(cè)定ura5p酶活性。其結(jié)果即ura5p酶活性的比較在表2中顯示。表2的結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)化株#1～#4中，ura5p酶活性回復(fù)到與野生型(wildtype)相同或是其數(shù)倍，導(dǎo)入的ura5基因有效地起作用。


進(jìn)而又對(duì)約108個(gè)Δura-1株的孢子進(jìn)行了兩次相同的基因?qū)氩僮鳎?8℃下培養(yǎng)2～3天，分別長(zhǎng)出3個(gè)及4個(gè)菌落，證實(shí)了轉(zhuǎn)化具有再現(xiàn)性。
在本實(shí)施例中，對(duì)通過利用了實(shí)施例1中構(gòu)建的尿嘧啶缺陷型菌株的育種方法而研制出新菌株即GLELO基因?qū)刖甑睦舆M(jìn)行說明。
(1)pDura5GLELO載體的構(gòu)建將γ-亞麻酸轉(zhuǎn)化成雙高-γ-亞麻酸的脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)酶的編碼基因，基于J.M.Parker-Barnes et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97(15)，8284-8289，2000上記載的序列GB的ID為AF206662的堿基序列，以M.alpina的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得。此時(shí)，采用以下所示引物MAGLELO1和MAGLELO2。
引物MAGLELO1CCATGGATGGAGTCGATTGCGCCATTCC(序列號(hào)11)
引物MAGLELO2GGATCCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(序列號(hào)12)擴(kuò)增后的GLELO基因用限制酶NcoI以及BamHI酶解，得到約1kb的片段。用限制酶NcoI以及BamHI酶解pD4，得到約7.7kb的片段。用ligation high(商品名，東洋紡公司制造)連接上述各片段，得到質(zhì)粒pDGLELO。
另一方面，用EcoRI部分酶解pDura5，純化得到在兩個(gè)EcoRI位點(diǎn)中只有一個(gè)被切割的約6.2kb的DNA片段。通過DNA Bluntiong Kit(商品名，TAKARABIO公司制造)將該片段末端平滑化后，用ligation high(商品名，東洋紡公司制造)讓其自連(self ligation)，選擇只留有成為組蛋白4.1啟動(dòng)子的5’上游的位點(diǎn)的作為pDura5’。此外，用EcoRI酶解上述pDGLELO，得到2.7kb的片段，將該片段插入上述pDura5’的EcoRI位點(diǎn)。從中選擇GLELO表達(dá)盒和ura5表達(dá)盒在相同方向上排列的質(zhì)粒，以此作為重組表達(dá)載體pDura5GLELO。
(2)pDura5GLELO的轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化過程)通過與實(shí)施例1中的(8)相同的方法，轉(zhuǎn)化Δura-1株，獲得3株轉(zhuǎn)化株。另外，為方便起見，對(duì)這些轉(zhuǎn)化株編號(hào)，編為#5～#7。
與實(shí)施例1中的(8)一樣，用引物RDNA1以及RDNA2通過PCR確認(rèn)了這些轉(zhuǎn)化株#5～#7中是否導(dǎo)入了pDura5GLELO。其結(jié)果為，3株均有1.5kbp的DNA片段的擴(kuò)增。由此可知，在上述3株的18SrDNA區(qū)域與發(fā)生了與pDura5GLELO的重組，ura5基因被導(dǎo)入。
(3)GLELO基因的表達(dá)分析從實(shí)施例1中得到的兩種ura5基因?qū)胫?1·#2和上述(2)中得到的GLELO基因?qū)胫?5～#7(與進(jìn)行了脂質(zhì)分析的菌株同樣的培養(yǎng)條件的菌體)中，用RNeasy plant mini kit(商品名，QIAGEN公司制造)提取總RNA。通過SuperScript First-Strand Synthesis System forRT-PCR(商品名，Invitrogen公司制造)，以6堿基隨機(jī)引物(randomhexamer)為引物，對(duì)1μg的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成了cDNA。以1μL合成的cDNA(1/20量)為模板，采用以下所示引物MAGLELO5以及MAGLELO6
引物MAGLELO5CTTTGTGGGCATGCAGATCA(序列號(hào)13)引物MAGLELO6TGAAGATGGAGCTGTGGTGGTA(序列號(hào)14)和Ex Taq polymerase(TAKARABIO公司制造)進(jìn)行PCR。此時(shí)的PCR條件為94℃下1分鐘、55℃下1分鐘以及72℃下2分鐘為一個(gè)循環(huán)，20個(gè)循環(huán)后，在72℃下延伸10分鐘。
對(duì)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，比較了約300bp片段的條帶的熒光濃度。其結(jié)果可知，在ura5基因?qū)胫曛?，兩株條帶的熒光濃度均非常稀薄，而在GLELO基因?qū)胫曛校?株均有明確濃度的條帶。另一方面，同樣地進(jìn)行了30個(gè)PCR循環(huán)后，在任何一株中均可以檢出明確濃度的條帶。由此可知，在GLELO基因?qū)胫曛?，GLELO基因的表達(dá)量增加。
(4)GLELO基因?qū)胫甑闹|(zhì)分析分別將實(shí)施例1中得到的兩種ura5基因?qū)胫?1·#2和上述(2)中得到的GLELO基因?qū)胫?5～#7的孢子植菌到液體培養(yǎng)基上(5％葡萄糖、1％酵母提取物、pH值調(diào)至6.0)，在28℃下，振蕩培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后，通過過濾收集菌體，干燥，稱量。用鹽酸甲醇法使菌體內(nèi)的脂肪酸殘基甲酯化后，用己烷提取，餾去己烷，用氣相色譜法分析得到的脂肪酸甲酯。結(jié)果即上述各基因?qū)胫?轉(zhuǎn)化體)培育后的干燥菌體重量、各株菌體內(nèi)的脂肪酸組成及總脂質(zhì)生產(chǎn)量在表3中顯示。
另外，表中的16:0表示棕櫚酸，18:0表示硬脂酸，18:1表示油酸，18:2表示亞油酸，18:3表示γ-亞麻酸，20:3表示雙高-γ-亞麻酸，20:4表示花生四烯酸，24:0表示二十四烷酸。


表3的結(jié)果表明，導(dǎo)入GLELO基因使干燥菌體的重量增加、雙高-γ-亞麻酸和花生四烯酸在總脂肪酸中所占的比例增加、同時(shí)γ-亞麻酸的比例減少。而且，總脂質(zhì)生產(chǎn)量和總脂質(zhì)含量也增加了，此外，雙高-γ-亞麻酸和花生四烯酸的生產(chǎn)量及含量也增加了。碳鏈延長(zhǎng)反應(yīng)的產(chǎn)物雙高-γ-亞麻酸與其底物γ-亞麻酸的比(20:3/18:3的比)，或雙高-γ-亞麻酸與雙高-γ-亞麻酸的代謝產(chǎn)物花生四烯酸的和與γ-亞麻酸的比((20:3+20:4)/18:3的比)，在GLELO基因?qū)胫曛酗@示出了很大的值。
在本實(shí)施例中，對(duì)將本發(fā)明涉及的育種方法適用于M.alpina以外的被孢霉屬菌類的具體例子進(jìn)行說明。
(1)尿嘧啶缺陷型菌株的獲得(營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株獲得過程)為了形成M.hygrophila和M.chlamydospora的孢子，將這些菌分別植菌到Czapek-Dox培養(yǎng)基(3％蔗糖、0.2％NaNO3、0.1％KH2PO4、0.05％KCl、0.05％MgSO4·7H2O、0.001％ FeSO4·7H2O、2％瓊脂、pH值調(diào)至6.0)，在28℃下，培養(yǎng)約2周。將其懸浮在吐溫80溶液中(1drop/100mL H2O)，通過玻璃過濾器(Glass Filter)(巖城硝子公司制造，商品號(hào)3G1)除去菌絲，制成孢子液。用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，按照J(rèn)areonkitmongkol等的方法(S.Jareonkitmongkol etal.JAOCS，69，939-944，1992)，對(duì)1×108～109個(gè)孢子進(jìn)行突變處理。
將突變處理后的孢子涂布在含有1.0mg/mL 5-FOA和0.05mg/mL尿嘧啶的GY培養(yǎng)基上(2％葡萄糖、1％酵母提取物、2％瓊脂、pH值調(diào)至6.0)，在28℃下培養(yǎng)4天，可以生長(zhǎng)的5-FOA抗性株中有2株來自M.hygrophila，有1株來自M.chlamydospora。對(duì)這些菌株進(jìn)行尿嘧啶缺陷性的評(píng)價(jià)。
即，比較這些菌株在SC培養(yǎng)基(無氨基酸無硫酸銨酵母氮源(Difco公司制造)5.0g、(NH4)2SO41.7g、葡萄糖20g、瓊脂20g、腺嘌呤20mg、酪氨酸30mg、蛋氨酸1.0mg、精氨酸2.0mg、組氨酸2.0mg、賴氨酸4.0mg、色氨酸4.0mg、蘇氨酸5.0mg、異亮氨酸6.0mg、亮氨酸6.0mg、苯基丙氨酸6.0mg/L)以及添加了尿嘧啶的SC培養(yǎng)基(尿嘧啶50mg/L)上的生長(zhǎng)情況。
其結(jié)果為，在含有尿嘧啶的培養(yǎng)基上，獲得的5-FOA抗性株與親株一樣均可以生長(zhǎng)，而在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況不好，其中1株M.hygrophila(命名為MH-Δura-1)和1株M.chlamydospora(命名為MC-Δura-1)完全不能生長(zhǎng)。
(2)酶活性的測(cè)定將上述2株菌株在添加有尿嘧啶的GY培養(yǎng)基中在28℃下振蕩培養(yǎng)4天。改良Wynn等的方法(J.P.Wynn et al.Microbiology，146，2325-2331，2000)制備菌體的無細(xì)胞提取液。
即，把在含有0.05mg/mL尿嘧啶的GY液體培養(yǎng)基中在28℃下培養(yǎng)了4天的菌體，懸浮在含有5mMβ-巰基乙醇的0.1M Tris緩沖液(pH 7.5)中。然后，在35MPa下用弗氏壓碎器(French press)破碎細(xì)胞，離心。得到的上清液作為無細(xì)胞提取液。再于100,000×g超離心60min除去細(xì)胞器，得到可溶性組分。
用得到的可溶性組分，按照Umezu等的方法(K.Umezu etal.J.Biochem.，70，249-262，1971)，測(cè)定乳清酸核苷酸焦磷酰酶(ura5p)活性。其結(jié)果為，任意一株的ura5p活性均在檢出限以下。
(3)pDura5的轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化過程)將M.hygrophila MH-Δura-1或M.chlamydospora MC-Δura-1植菌到Czapek-Dox培養(yǎng)基，在28℃下培養(yǎng)2周，形成孢子。根據(jù)上述(1)中所述的方法，回收孢子。
用SC瓊脂培養(yǎng)基作為轉(zhuǎn)化株的選擇培養(yǎng)基。用顆粒轟擊法將pDura5導(dǎo)入(轉(zhuǎn)化)宿主。采用PDS-1000/He Particle Delivery System(商品名，BIO RAD公司制造)進(jìn)行基因?qū)?，基因?qū)氲臈l件為氦氣壓力為7590kPa(1100psi)、轟擊室內(nèi)真空28英寸汞柱、目標(biāo)距離為3cm、鎢顆粒的粒徑為1.1μm?；?qū)牒?，?8℃下，培養(yǎng)2～3天，分別長(zhǎng)出十多個(gè)菌落，即獲得轉(zhuǎn)化株。
另外，實(shí)施發(fā)明的最佳方案中的具體實(shí)施方式
或?qū)嵤├芡耆f明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，但不應(yīng)局限于那樣具體的例子被狹義地解釋，可根據(jù)本發(fā)明的精神和所述權(quán)利要求項(xiàng)，進(jìn)行各種改變后實(shí)施。
本發(fā)明涉及的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法如上所述，包括轉(zhuǎn)化過程，該轉(zhuǎn)化過程以上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為宿主，采用與所述營(yíng)養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)的基因作為標(biāo)記基因，將該標(biāo)記基因?qū)胨拗?基因?qū)氩襟E)，以上述宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷性的回復(fù)作為標(biāo)記，篩選轉(zhuǎn)化株(篩選步驟)。由此，本發(fā)明可以得到以下效果以被孢霉屬的脂質(zhì)生產(chǎn)菌為原種，可以高效且有效地生產(chǎn)新品種(新菌株)。本發(fā)明還可以得到以下效果因可以自身克隆，從原種的被孢霉屬菌中獲得適宜的DNA片段，將其導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，可以調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)(高表達(dá)、調(diào)節(jié)表達(dá)的時(shí)期、抑制表達(dá)等)，可以獲得新菌株即獲得可以使脂質(zhì)生產(chǎn)量增加、改變生產(chǎn)的脂質(zhì)的種類、改變組成等的轉(zhuǎn)化體。
被孢霉屬的菌類作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌而廣為人知，而且還包含M.alpina這樣可靠性高的菌類。由此，通過本發(fā)明可以容易且高效地生產(chǎn)脂質(zhì)生產(chǎn)性能進(jìn)一步提高的菌株等。
因此，本發(fā)明可以應(yīng)用在與利用了被孢霉屬菌類的各種發(fā)酵技術(shù)相關(guān)的工業(yè)、采用了該發(fā)酵技術(shù)的食品工業(yè)、醫(yī)藥品工業(yè)上。
序列表<110>三得利株式會(huì)社(SUNTORY LIMITED)<120>脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法(Breeding method of Lipid product mold)<130>SU0410/PCT<150>JP 2003-299345<151>2003-08-22<160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述引物序列的基序(Description of Artificial SequenceMotif for Primer Sequence)<400>1Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Ile Pro1 5<210>2
<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述引物序列的基序(Description of Artificial SequenceMotif for Primer Sequence)<400>2Lys Glu Ala Lys Asp His Gly Glu Gly1 5<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<221>n<222>9<220>
<221>n<222>12<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>3
ttygghccng cntayaargg hatycc 26<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<221>n<222>18<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>4ccctcdccrt grtcyttngc ytcytt 26<210>5<211>925<212>DNA<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)<400>5acaaccttct cctcagcccc cagccgcatc ggtcccaccg ccgcaaccca tcagcacaca 60atggccatca aggattacca gcgcgagttc attgagtttg ccatcaagaa cgaggtcttg 120aagtttggag agttcaccct caagtccggc cgtatctccc cctacttcct gaacgcgggt 180ctcttcaaca ctggcgcttc gctctccaag atcggaaagt tctacgccgc tgccgtcaac 240gactcgggca ttgagcacga catcatcttt ggccccgctt acaagggtgt ccctcttgcc 300tgcaccaccg tcattgcctt ggccgaggcc ccctacaaca aggacacgcc ttactgcttc 360aaccgcaagg aaaagaagga ccatggcgag ggtggcacga ttgtcggatc ggcgttggag 420
ggcaaggtcc tggtcattga cgatgttatc accgccggta ccgccatccg cgagtctgtt 480caaatcatcg aggactgcaa ggcccaattg gccggtgttt tggtggcggt ggatcgtcag 540gagactggca agaacggcga catgtctgct atccaggagg tcgagaggga tttcggtgtc 600cctgtcaagg ccattgtgac catgacccac atcatgcagt acatggagga gaagggtacc 660tatggcgagc acttgactca gatgcgcacc taccgcgaga agtacggtgt ttaaggcaaa 720tctaaatggg ataaggtccg gtataatgcg gcgagggaag gttctgttgg aaaatctcat 780aatgcgggga gattgacatc ggggaacgat gtgctgctca tcagcagttt tcgtggactc 840tcgggacagg ccttcctggg aatccagaca ataatcatta ataaatacca ataacaatca 900aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 925<210>6<211>217<212>PRT<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)<400>6Met Ala Ile Lys Asp Tyr Gin Arg Glu Phe Ile Glu Phe Ala Ile Lys1 5 10 15Asn Glu Val Leu Lys Phe Gly Glu Phe Thr Leu Lys Ser Gly Arg Ile20 25 30Ser Pro Tyr Phe Leu Asn Ala Gly Leu Phe Asn Thr Gly Ala Ser Leu35 40 45Ser Lys Ile Gly Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Val Asn Asp Ser Gly Ile50 55 60Glu His Asp Ile Ile Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Val Pro Leu Ala65 70 75 80Cys Thr Thr Val Ile Ala Leu Ala Glu Ala Pro Tyr Asn Lys Asp Thr85 90 95
Pro Tyr Cys Phe Asn Arg Lys Glu Lys Lys Asp His Gly Glu Gly Gly100 105 110Thr Ile Val Gly Ser Ala Leu Glu Gly Lys Val Leu Val Ile Asp Asp115 120 125Val Ile Thr Ala Gly Thr Ala Ile Arg Glu Ser Val Gln Ile Ile Glu130 135 140Asp Cys Lys Ala Gln Leu Ala Gly Val Leu Val Ala Val Asp Arg Gln145 150 155 160Glu Thr Gly Lys Asn Gly Asp Met Ser Ala Ile Gln Glu Val Glu Arg165 170 175Asp Phe Gly Val Pro Val Lys Ala Ile Val Thr Met Thr His Ile Met180 185 190Gln Tyr Met Glu Glu Lys Gly Thr Tyr Gly Glu His Leu Thr Gln Met195 200 205Arg Thr Tyr Arg Glu Lys Tyr Gly Val210 215<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)
<400>7cttctcttca gcccccagcc gcatcggtcc 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>8gagtccacga aaactgctga tgagcagcac 30<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>9acaggtacac ttgtttagag20<210>10<211>20
<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>10cgctgcgttc ttcatcgatg20<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>11ccatggatgg agtcgattgc gccattcc 28<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>12ggatccttac tgcaacttcc ttgccttctc 30<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>13ctttgtgggc atgcagatca20<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)<400>14tgaagatgga gctgtggtgg ta 2權(quán)利要求
1.脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法，其為被孢霉屬(Mortierella)脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法，其特征為，其包含具有基因?qū)氩襟E和篩選步驟的轉(zhuǎn)化過程，所述基因?qū)氩襟E，以所述脂質(zhì)生產(chǎn)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為宿主，以與所述營(yíng)養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)的基因作為標(biāo)記基因，將該標(biāo)記基因?qū)胨拗?；所述篩選步驟，以所述宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷性的回復(fù)為標(biāo)記，篩選轉(zhuǎn)化株。
2.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法，其特征為，所述脂質(zhì)生產(chǎn)菌為Mortierella alpina、Mortierella hygrophila或Mortierella chlamydospora。
3.如權(quán)利要求1或2所述的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法，其特征為，所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為尿嘧啶缺陷型菌株。
4.如權(quán)利要求3所述的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法，其特征為，所述標(biāo)記基因采用乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因或乳清酸核苷酸焦磷酰酶基因。
5.如權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)所述的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法，其特征為，所述基因?qū)氩襟E采用電穿孔法(Electroporation)或顆粒轟擊法(Particle Delivery)。
6.如權(quán)利要求1～5任意一項(xiàng)所述的脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法，其特征為，還包含從原種的脂質(zhì)生產(chǎn)菌中獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株獲得過程。
全文摘要
本發(fā)明提供不通過抗生素且可以有效并高效地進(jìn)行被孢霉屬脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種的育種方法。該方法以被孢霉屬(Mortierella)脂質(zhì)生產(chǎn)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株例如尿嘧啶缺陷型菌株為宿主，進(jìn)行轉(zhuǎn)化過程。具體來說，采用與此營(yíng)養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)的基因作為標(biāo)記基因，將該標(biāo)記基因?qū)胨拗?基因?qū)氩襟E)。然后，以上述宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷性的回復(fù)為標(biāo)記，篩選轉(zhuǎn)化株(篩選步驟)。作為上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌，可以是高山被孢霉(M.alpina)。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1839199SQ20048002394
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月22日
發(fā)明者落合美佐, 河島洋, 清水昌 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社