專利名稱：顆粒淀粉水解酶在木霉菌中的表達(dá)和從顆粒淀粉底物產(chǎn)生葡萄糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
2本發(fā)明涉及絲狀真菌宿主細(xì)胞，其可用于具有葡糖淀粉酶活性的異源顆粒淀粉水解酶(GSHE)的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及GSHE在由顆粒淀粉底物產(chǎn)生葡萄糖糖漿和其它終產(chǎn)物的方法中的用途，所述方法包括在顆粒淀粉的膠凝化溫度(gelatinization temperature)或者低于該溫度的溫度，同時用淀粉液化淀粉酶(starchliquefying amylase)和GSHE接觸顆粒淀粉底物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括GSHE和淀粉液化淀粉酶的酶組合物。
背景技術(shù)：
3工業(yè)發(fā)酵主要使用葡萄糖作為產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、醇、有機(jī)酸、藥物和其它化學(xué)品的原料。在許多應(yīng)用中，葡萄糖是從碳底物如生物材料(biomass)和淀粉的酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。淀粉在綠色植物中很豐富，以顯微顆粒累積，直徑在0.5到175微米之間變化。這些淀粉顆粒的部分結(jié)晶性質(zhì)使得其在冷水中具有不溶解性。結(jié)果，淀粉顆粒在水中的溶解需要大量的熱能，以破壞顆粒的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致部分地水解的淀粉的溶解。各種增溶方法已經(jīng)被使用，這些方法包括直接和間接的加熱體系，如通過蒸氣注入(stream injection)的直接加熱。(參見例如STARCH CHEMISTRY AND TECHNOLOGY，由R.L.Whistler等人編著，第二版，1984 Academic Press Inc.，Orlando，F(xiàn)L；STARCH CONVERSION TECHNOLOYGY，由G.M.A.Van Beynum等人編著，F(xiàn)ood Science and Technology Series，Marcel DekkerInc.，NY；以及THE ALCOHOL TEXTBOOK，第三版，由K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall編著，1999，Nottingham University Press，UK)。
4一般地，為了將淀粉水解為葡萄糖，使用兩個酶步驟。第一個步驟是液化步驟，第二個步驟是糖化步驟。在液化步驟中，在存在已經(jīng)加入的鈣的情況下，使不可溶的淀粉顆粒在水中成為漿狀物，通過加熱使其凝膠化，通過熱穩(wěn)定α淀粉酶(EC 3.2.1.1，α-(1-4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)進(jìn)行水解，產(chǎn)生糊精醪液(a mash ofdextrins)。所得到的醪液通常冷卻到大約60-65℃。在糖化步驟中，可溶的糊精(糖)通過具有葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3，α-(1-4)-葡聚糖葡糖水解酶)活性的酶被進(jìn)一步水解為右旋糖(葡萄糖)。然后葡萄糖可以被用作最終產(chǎn)品或用作前體，被轉(zhuǎn)化為其它在商業(yè)上重要的期望的最終產(chǎn)品，如果糖、山梨糖醇、醇、乳酸、抗壞血酸(ASA)中間產(chǎn)物和1，3-丙二醇。
5在20世紀(jì)50年代晚期，來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶就已經(jīng)商業(yè)化，這些酶顯著地改進(jìn)了淀粉到葡萄糖的轉(zhuǎn)化。另一個重要的改進(jìn)發(fā)生在20世紀(jì)70年代。從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)得到了一種熱穩(wěn)定的α淀粉酶，并且已經(jīng)商業(yè)化，該熱穩(wěn)定的α淀粉酶具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和較低的鈣依賴性(USP 3,912,590)。
進(jìn)一步的工業(yè)工藝已經(jīng)為淀粉甜味劑行業(yè)采納，用于酶液化過程(USP5,322,778)。這些工藝中的一些工藝包括，具有較低蒸氣需求的低溫工藝(105-110℃，5-8分鐘)，和高溫工藝(148℃+/-5℃，5-8秒)，該工藝改進(jìn)了淀粉顆粒的膠凝化作用，從而導(dǎo)致改進(jìn)的過濾特性以及液化淀粉底物的品質(zhì)(Shetty等人，(1988)Cereal Foods World 33929-934)。
6盡管酶淀粉液化過程已經(jīng)很好地被建立，但在產(chǎn)量損失、加工成本、能量消耗、pH調(diào)節(jié)、溫度閾值、鈣需求以及回生淀粉(retrograded amylase)水平方面的改進(jìn)將是被期望的。尤其是，已知液化步驟殘余的α淀粉酶，在糖化條件下，對工藝效率具有負(fù)面影響，并且殘余的α淀粉酶在通過葡糖淀粉酶進(jìn)行糖化之前必須被滅活。滅活通常通過在95℃將液化淀粉的pH降低到pH 4.2到4.5來實現(xiàn)。液化過程的另一個缺點(diǎn)是還原基團(tuán)的堿性異構(gòu)化。堿性異構(gòu)化導(dǎo)致形成一種二糖，即maltulose(4-α-D-吡喃葡萄糖基-D-果糖)的形成。Maltulose降低了葡萄糖的產(chǎn)量，這是由于它對葡糖淀粉酶和α淀粉酶的水解具有抗性。進(jìn)一步地，很難對在高葡萄糖濃度下由活性葡糖淀粉酶催化的逆轉(zhuǎn)反應(yīng)產(chǎn)物的形成進(jìn)行控制。來自黑曲霉的葡糖淀粉酶，在典型的糖化條件下，通常是熱穩(wěn)定的。因此，顯著數(shù)量的葡糖淀粉酶活性可以保留到糖化反應(yīng)后。此處討論的一些問題的解決方案已經(jīng)由不同研究者提出建議。
7例如，Leach等人(USP 4,113,509和USP 3,922,196)公開了一種方法，該方法通過用細(xì)菌α淀粉酶在低于淀粉膠凝化溫度的溫度溫育顆粒淀粉，將顆粒淀粉(精制的)轉(zhuǎn)化為可溶解的水解產(chǎn)物。然后將β淀粉酶用于水解，以產(chǎn)生高麥芽糖糖漿。
8歐洲專利申請0350737A2公開了一種產(chǎn)生麥芽糖糖漿的方法，該方法通過使用來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的α淀粉酶，在60℃水解來自玉米、小麥、馬鈴薯和甜薯的顆粒(純化的)淀粉，沒有傳統(tǒng)的液化步驟(膠凝化作用之后是高溫下的液化)。
9以前已經(jīng)描述了使用葡糖淀粉酶將顆粒(粗)淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的多步驟工藝，該葡糖淀粉酶顯示出粗淀粉水解能力(USP 4,618,579)。然而，只有60％的淀粉被水解，這因而導(dǎo)致大量的循環(huán)過程。
10改進(jìn)顆粒淀粉轉(zhuǎn)化的傳統(tǒng)方法不僅是有利的，而且提供可使得由此所使用的酶的表達(dá)和產(chǎn)量增加的方法將是被期望的。例如，具有顆粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶——其具有改進(jìn)的特性如增加的比活性、不同的pH范圍和/或不同的糖基化水平，對于在工業(yè)淀粉轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用可能是特別有利的。本發(fā)明不僅滿足這些需求中的一些需求，而且導(dǎo)致了通過淀粉水解獲得的各種最終產(chǎn)品的生產(chǎn)效率有所增加。
發(fā)明概述11本發(fā)明的一個實施方案涉及一種一步驟工藝，其用于將顆粒淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，這是通過在顆粒淀粉底物的膠凝化溫度或低于該溫度的溫度水解顆粒淀粉，同時用內(nèi)切作用的(endo-acting)α淀粉酶和具有葡糖淀粉酶活性的糖化酶——更特別地是具有顆粒淀粉水解活性的糖化酶，接觸未膠凝化的淀粉底物來實現(xiàn)。
12相對于現(xiàn)有技術(shù)工藝，本發(fā)明在以下方面中的至少一個方面有益處和改進(jìn)a)α淀粉酶和具有顆粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶在糖化作用中都有活性；b)淀粉底物以顆粒形式被使用，并且淀粉被水解；c)顆粒淀粉的溶解和糖化使用單一pH；d)相對于使用液化的淀粉底物的目前的糖化時間，使用顆粒淀粉的糖化時間要更短；e)與從液化的淀粉底物獲得的葡萄糖糖漿相比，獲得了具有降低的高級糖(higher sugar)含量的高葡萄糖糖漿；f)由于maltulose形成而造成的葡萄糖損失被降低；g)Milliard反應(yīng)被消除或被降至最低程度；h)糖化后由于噴射蒸煮(jetcooking)所致的回生淀粉形成而形成碘陽性淀粉聚合物(Blue-Sac)的風(fēng)險更低；i)省去了向淀粉漿狀物中加入鈣；和i)由于水解的淀粉不會堵塞過濾系統(tǒng)，過濾得到了改進(jìn)。本發(fā)明所包括的方法和組合物提供了一種更加經(jīng)濟(jì)和有效的手段，來生產(chǎn)用于工業(yè)和特種化學(xué)品的葡萄糖供給料。
13在本發(fā)明的一個方面，提供了絲狀真菌菌株，其用編碼具有葡糖淀粉酶活性的顆粒淀粉水解酶(GSHE)的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的絲狀真菌菌株是木霉菌菌株，更特別的是里氏木霉(T.reesei)菌株，其表達(dá)GSHE并且將GSHE分泌到培養(yǎng)基中。
14在該方面的一些實施方案中，本發(fā)明涉及在絲狀宿主細(xì)胞中產(chǎn)生GSHE的方法，該方法包括用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化絲狀真菌宿主細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建物包括一個啟動子，啟動子在該絲狀真菌宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性，并可操作性地連接(operably linked)到編碼GSHE的異源多核苷酸上；在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的絲狀真菌宿主細(xì)胞，以允許表達(dá)GSHE；并產(chǎn)生GSHE。在其它實施方案中，編碼GSHE的異源多核苷酸來源于灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)的菌株或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌株。在一些實施方案中，GSHE與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性，或者與SEQ ID NO6具有至少90％同一性。在進(jìn)一步的實施方案中，回收由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的GSHE。
15在第二個方面，本發(fā)明包括由重組的里氏木霉(Trichoderma reesei)的培養(yǎng)物所產(chǎn)生的發(fā)酵液(fermentation broth)，其中里氏木霉包含編碼與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性或與SEQ ID NO6具有至少90％序列同一性的GSHE的異源多核苷酸。
16在第三個方面，本發(fā)明涉及用于由顆粒淀粉底物產(chǎn)生葡萄糖糖漿的一步工藝，所述工藝包括(a)在等于或低于淀粉底物的膠凝化溫度的溫度，同時用α淀粉酶和具有葡糖淀粉酶活性的顆粒淀粉水解酶(GSHE)接觸干固體含量(ds)為10-55％的顆粒淀粉底物漿狀物，和(b)允許α淀粉酶和GSHE發(fā)揮作用一段足夠的時間，以水解顆粒淀粉，得到葡萄糖糖漿。在一個實施方案中，至少95％的顆粒淀粉被水解。在第二個實施方案中，葡萄糖糖漿的產(chǎn)率按重量計是至少90％。在第三個實施方案中，顆粒淀粉底物的干固體含量在大約15到40％之間。在第四個實施方案中，水解顆粒淀粉的時間在大約5小時到100小時的范圍內(nèi)。在第五個實施方案中，α淀粉酶是具有EC 3.2.1.1的酶。在第六個實施方案中，α淀粉酶來源于芽孢桿菌(Bacillus)，尤其是嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株。在進(jìn)一步的實施方案中，α淀粉酶來源于重組的芽孢桿菌菌株。在第七個實施方案中，GSHE是來源于灰腐質(zhì)霉高溫變種(Humicola grisea var.thermoidea)菌株或泡盛曲霉河內(nèi)變種(Aspergillus awamori var.kawachi)菌株的葡糖淀粉酶。在第八個實施方案中，GSHE是來源于重組的木霉菌菌株的葡糖淀粉酶，尤其是里氏木霉菌株，其表達(dá)編碼灰腐質(zhì)霉GSHE或泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE的異源基因。在第九個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括分離葡萄糖糖漿，尤其是通過過濾進(jìn)行分離。在第十個實施方案中，來自葡萄糖糖漿的葡萄糖被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為果糖。在第十一個實施方案中，該一步工藝的溫度為大約50到大約70℃。在第十二個實施方案中，該工藝的pH為pH 4.5到6.5。
17在第四個方面，本發(fā)明涉及用于由顆粒谷物淀粉底物產(chǎn)生葡萄糖糖漿的一步工藝，所述工藝包括(a)在大約55-65℃的溫度和大約5.0到6.0的pH，用來源于芽孢桿菌的α淀粉酶和來源于真菌的具有顆粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶，同時接觸干固體含量(ds)為25-45％的顆粒淀粉底物漿狀物，并且允許α淀粉酶和具有顆粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶作用一段足夠的時間，以水解顆粒淀粉，獲得葡萄糖糖漿。在一個實施方案中，至少80％的顆粒淀粉被水解，葡萄糖糖漿的產(chǎn)率按重量計是至少90％。在第二個實施方案中，葡糖淀粉酶是來源于重組的里氏木霉的GSHE，其表達(dá)編碼灰腐質(zhì)霉GSHE或泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE的異源多核苷酸。
18在第五個方面，本發(fā)明涉及水解顆粒淀粉的方法，該方法包括用α淀粉酶和來源于木霉菌菌株的具有顆粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶，同時接觸干固體含量為20-55％的顆粒淀粉漿狀物，其中木霉菌菌株包含編碼來源于灰腐質(zhì)霉的GSHE的異源多核苷酸；并且允許α淀粉酶和葡糖淀粉酶作用一段足夠的時間，以水解顆粒淀粉。在一個實施方案中，至少90％的顆粒淀粉被水解。在第二個實施方案中，顆粒淀粉是玉米淀粉或小麥淀粉。在第三個實施方案中，GSHE以大約0.5到1.0GSHE單位的Humicola GA/克淀粉的濃度提供給漿狀物；α淀粉酶以大約0.1到0.5kg/MT淀粉的濃度提供給漿狀物，漿狀物的pH被調(diào)節(jié)到大約pH 4.5到6.0；漿狀物的溫度被調(diào)節(jié)到大約55到65℃。
19在第六個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生葡萄糖糖漿的方法，所述方法包括用α淀粉酶和顆粒淀粉水解酶(GSHE)同時接觸顆粒淀粉底物，以得到葡萄糖糖漿，其中GSHE是由絲狀真菌菌株分泌的，所述真菌菌株包含異源多核苷酸，其編碼來源于腐質(zhì)霉菌株的GSHE，并且其氨基酸序列與SEQ ID NO3具有至少90％同一性。在一個實施方案中，葡萄糖被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為期望的終端產(chǎn)物。
20在第七個方面，本發(fā)明涉及酶組合物，該酶組合物包括α淀粉酶和具有顆粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶。在一個實施方案中，α淀粉酶來源于芽孢桿菌屬某種，GSHE來源于灰腐質(zhì)霉GSHE。在第二個實施方案中，GSHE來源于木霉菌屬菌株，該菌株通過遺傳工程被改造，以包含編碼灰腐質(zhì)霉GSHE的多核苷酸。在第三個實施方案中，該組合物的pH介于4.5和6.5之間。在第四個實施方案中，α淀粉酶來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株。在進(jìn)一步的實施方案中，該酶組合物中α淀粉酶與GSHE的比率是15∶1到1∶15。
21在第八個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生高果糖淀粉基糖漿(high fructose starchbased syrup)的工藝，包括將通過本發(fā)明所包括的方法獲得的葡萄糖糖漿轉(zhuǎn)化為果糖基糖漿。
22在第九個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生終端產(chǎn)物(end product)的方法，其中對通過本發(fā)明所包括的方法獲得的葡萄糖糖漿進(jìn)行發(fā)酵。在該方面的一些實施方案中，終端產(chǎn)物是醇，優(yōu)選地是乙醇。在該方面的進(jìn)一步的實施方案中，發(fā)酵與接觸步驟同時進(jìn)行，在其它實施方案中，相對于接觸步驟，發(fā)酵被獨(dú)立地隨后予以進(jìn)行。在仍然進(jìn)一步的實施方案中，發(fā)酵產(chǎn)物從發(fā)酵液中分離出來。
23在第十個方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生殘余淀粉(residual starch)的方法，該方法通過分離根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的葡萄糖糖漿，并保留包括殘余淀粉的組合物來實現(xiàn)。在一個實施方案中，該殘余淀粉被用于終端產(chǎn)物的生產(chǎn)。在第二個實施方案中，殘余淀粉被循環(huán)，與GSHE和α淀粉酶在低于顆粒淀粉的膠凝化溫度的溫度同時接觸。


24圖1提供了基因組DNA序列，其編碼具有葡糖淀粉酶活性的天然的灰腐質(zhì)霉高溫變種顆粒淀粉水解酶(GSHE)(SEQ ID NO1)。推定的內(nèi)含子是黑體字并且加有下劃線。
25圖2A提供了灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE的信號序列和成熟氨基酸序列(SEQID NO2)。推定的信號序列內(nèi)含子是黑體字并且加有下劃線。
26圖2B提供了灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO3)。
27圖3提供了pTrex3g N13質(zhì)粒的示意性說明，其被用于表達(dá)編碼灰腐質(zhì)霉GSHE的核酸，并且其含有真菌表達(dá)載體側(cè)翼的Xbal位點(diǎn)，其中a)cbh1啟動子是里氏木霉纖維二糖水解酶啟動子，b)H.grisea gla1是編碼SEQ ID NO3的灰腐質(zhì)霉GSHE的多核苷酸，c)cbh1終止子是里氏木霉纖維二糖水解酶終止子，和d)amdS是構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶標(biāo)記基因。
28圖4提供了圖3的pTrex3g_N13質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO11)(bp)。
29圖5提供了SDS-PAGE凝膠，說明了灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE在一個代表性發(fā)酵程序中的表達(dá)，用里氏木霉克隆進(jìn)行，正如實施例1中所描述的。泳道1代表商業(yè)來源分子量標(biāo)記物，SeeBlue(Invitrogen)；泳道2是空白組；泳道3表示在48小時時的rGSHE表達(dá)；泳道4表示在56小時時的rGSHE表達(dá)；泳道5表示在64小時時的rGSHE表達(dá)。
30圖6提供了編碼泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE的基因組DNA序列(SEQ IDNO4)。推定的內(nèi)含子是黑體字并且加有下劃線。
31圖7A提供了泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE的信號序列和成熟氨基酸序列(SEQID NO5)。信號序列是黑體字并且加有下劃線。
32圖7B提供了泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
33圖8A和8B示意性說明了pH穩(wěn)定性，以天然灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE(nGSHE)和在里氏木霉宿主中表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE(RGSHE)(SEQID NO3)的％殘余活性表示，正如實施例1中所描述的。
34圖9示意性說明了天然的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE和在重組里氏木霉宿主中表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE對玉米淀粉的水解，在一段時間內(nèi)進(jìn)行測量，表示為mg葡萄糖/mg蛋白質(zhì)，正如實施例1中所描述的。
35圖10提供了SDS-PAGE凝膠，說明了泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE在一個代表性發(fā)酵程序中的表達(dá)，用里氏木霉克隆進(jìn)行，正如實施例2中所描述的。泳道1代表商業(yè)來源的分子量標(biāo)記物，SeeBlue(Invitrogen)；泳道2描繪在162小時時的rGSHE表達(dá)；泳道3是對照組，描繪在162小時時的未轉(zhuǎn)化的里氏木霉宿主。
36圖11是一般性示意圖，該圖示意性說明了利用顆粒淀粉底物的低能量葡萄糖生產(chǎn)的本發(fā)明工藝的一個實施方案。
37圖12圖示了，在進(jìn)行本發(fā)明的工藝之前，典型的玉米淀粉顆粒的掃描電子顯微照片(a)；以及在進(jìn)行本發(fā)明所包含的工藝之后，殘余淀粉的掃描電子顯微照片(b-d)。
發(fā)明詳述38在一些方面，本發(fā)明依賴于在遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域所使用的常規(guī)技術(shù)和方法。下述來源包括了在本發(fā)明中有用的一般技術(shù)的描述Sambrook等人，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL(2ndEd.，1989)；Kreigler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)；和Ausubel等人編著，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。
39除非本文另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，具有與本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，JohnWiley and Sons，New York(1994)，和Hale & Markham，THE HAPPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)為普通技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般詞義。盡管與本文描述的那些方法和材料類似或等價的任何方法和材料可以在本發(fā)明的實踐或?qū)嶒炛惺褂?，但還是描述了優(yōu)選的方法和材料。
40現(xiàn)在，將通過僅僅使用下述定義和實施例的參考方式，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本文中參考的所有專利和公開文獻(xiàn)，包括這些專利和公開文獻(xiàn)中所公開的所有序列，都被特別地明確地引入作為參考。
41數(shù)字范圍包括定義該范圍的數(shù)值在內(nèi)。
42除非另有指明，核酸以5’到3’方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基到羧基方向從左到右書寫。
43本文提供的標(biāo)題不是對本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤┓桨傅南薅?，通過參考作為整體的說明書，可以得到本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤┓桨浮?br> A.定義44正如此處所用，術(shù)語“淀粉”是指由植物的復(fù)合多糖碳水化合物構(gòu)成的任何材料，包括具有式(C6H10O5)x的直鏈淀粉和/或支鏈淀粉，其中X可以是任何數(shù)目。尤其是，該術(shù)語指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、塊莖和根，更特別地是植物小麥、大麥、玉米、黑麥、大米、高梁、豆類、木薯、黍、馬鈴薯、甜薯和木薯粉(tapioca)。
45術(shù)語“顆粒淀粉”指未蒸煮(粗)淀粉，其還沒有進(jìn)行膠凝化作用。
46術(shù)語“淀粉膠凝化作用”意指淀粉分子的溶解，形成粘性懸液。
47術(shù)語“膠凝化溫度”指淀粉底物開始發(fā)生膠凝化的最低溫度。確切溫度取決于具體的淀粉底物，進(jìn)一步可能依賴于獲得該淀粉的植物種類的特定品種以及生長條件。
48術(shù)語“DE”或“葡萄糖當(dāng)量(dextrose equivalent)”是測量總還原糖濃度的一個行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，基于干重量以D-葡萄糖進(jìn)行計算。未水解的顆粒淀粉的DE基本上為0，D-葡萄糖的DE為100。
49術(shù)語“葡萄糖糖漿”指含有葡萄糖固體的含水組合物。在一個實施方案中，葡萄糖糖漿將包括至少90％的D-葡萄糖，在另一個實施方案中，葡萄糖糖漿將包括至少95％的D-葡萄糖。在一些實施方案中，術(shù)語“葡萄糖”、“葡萄糖糖漿”和“右旋糖”可被交替使用。
50術(shù)語“總糖含量(total sugar content)”指在淀粉組合物中存在的總糖含量。
51術(shù)語“干固體含量(ds)”指漿狀物的總固體(以％表示)，基于干重量來計算。
52“白利(Brix)”指一種熟知的液體比重計標(biāo)度，用于量度在給定溫度下溶液的糖含量。白利標(biāo)度測量的是每100克含水糖溶液中存在的蔗糖的克數(shù)(總的溶解固體含量)。白利測量值通常通過使用液體比重計或折光計來獲得。
53術(shù)語“淀粉液化酶(starch-liquefying enzyme)”指可實現(xiàn)顆粒淀粉液化的酶。例證性的淀粉液化酶包括α淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。
54術(shù)語“淀粉酶(amylases)”指催化淀粉水解的酶。
55術(shù)語“α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1類)”指催化α-1，4-糖苷鍵水解的酶。這些酶也已經(jīng)被描述為在含有1，4-α-連接的D-葡萄糖單元的多糖中實現(xiàn)1，4-α-D-糖苷鍵的外切或內(nèi)切水解的那些酶。用于描述這些酶的另一個術(shù)語是糖原酶(glycogenase)。例證性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α-1，4-glucan4-glucanohydrase glucanohydrolase)。
56在此處可被交替使用的術(shù)語“糖化酶(saccharification enzyme)”和“葡糖淀粉酶(glucoamylase)”指淀粉葡糖苷酶類別的酶(E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶，α-1，4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些是外切作用的酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原末端釋放葡糖殘基。這些酶也水解α-1，6和α-1，3-鍵，盡管是以比α-1，4-鍵低得多的速率水解。
57正如此處所用，術(shù)語“顆粒淀粉水解酶(GSHE)”或“具有顆粒淀粉水解活性的酶”特別地指這樣的酶，其具有葡糖淀粉酶活性，并且具有水解顆粒形式的淀粉的能力。優(yōu)選的GSHE是那些來源于絲狀真菌的GSHE，其中對絲狀真菌細(xì)胞而言，GSHE是內(nèi)源或外源的。一種優(yōu)選的GSHE是來源于灰腐質(zhì)霉高溫變種的天然GSHE。另一種優(yōu)選的GSHE來源于泡盛曲霉河內(nèi)變種。特別優(yōu)選的GSHE是重組的GSHE，其是在宿主菌株中表達(dá)的GSHE，所述宿主菌株已經(jīng)被進(jìn)行了遺傳工程改造，以便包含編碼GSHE的異源多核苷酸。在一些優(yōu)選的實施方案中，GSHE作為胞外酶而被表達(dá)。
58術(shù)語“淀粉的水解”指在加入水分子的情況下糖苷鍵的裂解。
59術(shù)語“聚合度(degrss of polymerization，DP)”是指，在給定的糖中脫水吡喃型葡萄糖單位的數(shù)量。DP1的實例是單糖，如葡萄糖和果糖。DP2的實例是二糖，如麥芽糖和蔗糖。DP4+(＞DP3)表示聚合度大于3的聚合物。
60術(shù)語“接觸”指將各酶放置到與各自的底物足夠接近的位置，以便使該酶能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化為終端產(chǎn)物。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，酶與各自底物的混合溶液能實現(xiàn)接觸。
61術(shù)語“酶促轉(zhuǎn)化”通常指通過酶作用進(jìn)行的底物修飾。正如此處所用，該術(shù)語也指通過酶的作用對顆粒淀粉底物進(jìn)行修飾。在優(yōu)選的實施方案中，顆粒淀粉底物的酶促轉(zhuǎn)化將產(chǎn)生葡萄糖糖漿。
62術(shù)語“漿狀物(slurry)”指含有不可溶淀粉顆粒的含水混合物。
63術(shù)語“糖基化(glycosylation)”指通過加入碳水化合物部分(moieties)對蛋白質(zhì)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄后修飾，其中碳水化合物是N-連接的或者O-連接的，由此產(chǎn)生糖蛋白。糖蛋白的N-連接碳水化合物部分通過糖苷鍵連接到天冬酰胺殘基的β-氨基氮上。通過絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基，O-連接碳水化合物通過糖苷鍵連接到蛋白質(zhì)上。
64術(shù)語“重組的”，當(dāng)它的使用涉及例如細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時，表示細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已經(jīng)通過引入異源核酸或蛋白質(zhì)或者通過改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或者表明細(xì)胞是來源于如此而被修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組的細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的天然(非重組的)形式中不存在的基因；或者表達(dá)天然基因，但這些天然基因以別的方式被異常表達(dá)、不足地表達(dá)或者根本不表達(dá)。
65術(shù)語“重組GSHE”、“重組表達(dá)的GSHE”和“重組產(chǎn)生的GSHE”指成熟GSHE蛋白質(zhì)序列，其是在宿主細(xì)胞中由異源多核苷酸產(chǎn)生。符號“r”可以用于表示重組子。rGSHE的蛋白序列不包括信號序列。在一個實施方案中，在里氏木霉的菌株中所表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE，用“rH-GSHE”表示。
66術(shù)語“天然GSHE”和“nGSHE”指GSHE，其來源于微生物宿主生物，不是來源于需要表達(dá)重組GSHE的真菌宿主。優(yōu)選的天然GSHE來源于灰腐質(zhì)霉菌株，或者泡盛曲霉菌株。
67術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在此處可被交替使用。本文對于氨基酸殘基，使用了傳統(tǒng)的單字母或三字母代碼。
68“信號序列”指與蛋白質(zhì)的N末端部分結(jié)合的氨基酸的序列，其有助于成熟形式的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外。信號序列的定義是功能性定義。胞外蛋白質(zhì)的成熟形式缺乏信號序列，其在分泌過程中被切割掉。
69“基因”指在產(chǎn)生多肽中所涉及的DNA片段，包括該編碼區(qū)域之前的區(qū)域和之后的區(qū)域，以及在各編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
70術(shù)語“核酸”包括DNA、RNA、單鏈或雙鏈及其化學(xué)修飾。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”在此處可以被交替使用。由于遺傳密碼是簡并的，所以不止一種密碼子可以被用于編碼特定氨基酸，本發(fā)明包括多核苷酸，其編碼特定的氨基酸序列。
71“載體”是指被設(shè)計用于將核酸引入到一種或多種細(xì)胞類型中的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、序列盒及類似物。
72正如此處所用，“表達(dá)載體”指DNA構(gòu)建物，其包括可操作地連接到適當(dāng)?shù)目刂菩蛄猩系腄NA序列，所述適當(dāng)?shù)目刂菩蛄心軐崿F(xiàn)DNA在適當(dāng)宿主中的表達(dá)。這樣的控制序列可以包括啟動子以實施轉(zhuǎn)錄、任選的操縱子序列以控制轉(zhuǎn)錄、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。
73“啟動子”是在結(jié)合RNA聚合酶中以啟動基因的轉(zhuǎn)錄中所涉及的調(diào)節(jié)序列。啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。本發(fā)明中使用的優(yōu)選啟動子是里氏木霉cbh1，其是誘導(dǎo)型啟動子。
74“在轉(zhuǎn)錄控制下(under transcriptional control)”是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的一個術(shù)語，該術(shù)語表明，多核苷酸序列——通常是DNA序列——的轉(zhuǎn)錄依賴于其被可操作地連接到對轉(zhuǎn)錄的啟動有貢獻(xiàn)或者促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的元件上。
75“在翻譯控制下(under translational control)”是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的一個術(shù)語，該術(shù)語表明在mRNA已經(jīng)形成后發(fā)生的調(diào)節(jié)過程。
76正如此處所用，當(dāng)描述蛋白質(zhì)和編碼它們的基因時，用于該基因的術(shù)語不是大寫字母，并且是斜體字，例如編碼灰腐質(zhì)霉GSHE的基因可以表示為gla1。用于該蛋白質(zhì)的術(shù)語通常不是斜體字，第一個字母是大寫的，例如由gla1基因編碼的蛋白質(zhì)可以表示為Gla1。
77術(shù)語“可操作地連接”是指并列關(guān)系，其中元件以可允許它們在功能上相關(guān)的方式排列。例如，如果啟動子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動子就是可操作地連接到該編碼序列上。
78術(shù)語“選擇性標(biāo)記”指能在宿主中表達(dá)的基因，其可以使得含有被引入的核酸或載體的那些宿主的選擇容易一些。選擇性標(biāo)記的實例包括但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博來霉素或氯霉素)或賦予代謝優(yōu)勢例如營養(yǎng)優(yōu)勢給宿主細(xì)胞的基因。
79術(shù)語“來源(derived)”包括術(shù)語“源自(originated from)”、“得自或可獲自”以及“分離自”。
80“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”指用于表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的適當(dāng)宿主，其包含編碼根據(jù)本發(fā)明的GSHE的多核苷酸。特別地，宿主菌株是絲狀真菌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，“宿主細(xì)胞”指從絲狀真菌菌株的細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞和原生質(zhì)體，尤其是木霉菌屬某種或曲霉菌屬某種。
81術(shù)語“絲狀真菌”指所有絲狀形式的所有絲狀形式的真菌亞門(Eumycotina)(參見Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY，New YorkWiley)。這些真菌是以營養(yǎng)菌絲為特征，其具有由幾丁質(zhì)、纖維素和其它復(fù)合多糖組成的細(xì)胞壁。本發(fā)明的絲狀真菌與酵母在形態(tài)上、生理上以及遺傳上不同。絲狀真菌的營養(yǎng)生長通過菌絲延長進(jìn)行，碳代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親本細(xì)胞可以是如下種類的細(xì)胞，但不限于它們木霉菌屬，例如里氏木霉(以前被分類為T.longibrachiatum，現(xiàn)在被稱為紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、綠色木霉(Trichoderma viride)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；青霉屬某種(Penicillium sp.)；腐質(zhì)霉屬某種(Humicolasp.)，包括異常腐質(zhì)霉(Humicola insolens)和灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)；金孢菌某種(Chrysosporium sp.)，包括拉克淖金孢菌(C.lucknowense)；粘帚霉某種(Gliocladium sp.)；曲霉屬某種，包括米曲霉、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)；鐮孢菌屬某種(Fusarium sp.)、脈孢菌屬某種(Neurosporasp.)、肉座菌屬某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)。也參考Innis等人，(1995)Sci.22821-26。
82正如此處所用，術(shù)語“木霉菌”或“木霉菌屬某種”指之前已被歸入木霉屬的任何真菌菌株或目前被歸入木霉屬的任何真菌菌株。。
83術(shù)語“培養(yǎng)”指，在液體或固體培養(yǎng)基中、在合適的條件下，培養(yǎng)微生物細(xì)胞群。在一個實施方案中，培養(yǎng)指顆粒淀粉底物到葡萄糖糖漿或其它期望的終端產(chǎn)物的發(fā)酵型生物轉(zhuǎn)化(通常是在容器或反應(yīng)器中)。
84談及多核苷酸或蛋白質(zhì)時，術(shù)語“異源的”或“外源的”，是指在宿主細(xì)胞中不天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，該蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)。這意味著，該術(shù)語包括由天然發(fā)生的基因、突變的基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。關(guān)于多核苷酸或蛋白質(zhì)，術(shù)語“同源的”或“內(nèi)源的”，指在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質(zhì)。
85術(shù)語“回收的”、“分離的”和“分開的”，正如此處所用，指分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸、氨基酸或碳水化合物，其與同其天然相關(guān)的至少一個成分是分離的。
86正如此處所用，術(shù)語“被轉(zhuǎn)化的”、“被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)基因的”，在涉及細(xì)胞時，是指該細(xì)胞具有非天然的(異源的)核酸序列，其被整合到它的基因組中或者作為在多個世代中被維持的附加型質(zhì)粒而存在。
87正如此處所用，術(shù)語“表達(dá)”指這樣的過程，通過該過程，基于基因的核酸序列，產(chǎn)生出多肽。該過程既包括轉(zhuǎn)錄也包括翻譯。
88術(shù)語“被引入”，在將核酸序列插入到細(xì)胞中的上下文中，意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，包括指將核酸序列導(dǎo)入到真核或原核細(xì)胞中，其中核酸序列可以被摻入到細(xì)胞的基因組中(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，被轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子，或者被短暫地表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
89正如此處所用，術(shù)語“比活性”指酶的單位，定義為在特定條件下，每單位時間內(nèi)通過酶制劑轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物摩爾數(shù)。比活性表示為單位(U)/mg蛋白質(zhì)。
90正如此處所用，“酶活性”指酶對其底物的作用。
91正如此處所用，術(shù)語“酶單位”指在最適測定條件下，每分鐘將1mg底物轉(zhuǎn)化為底物產(chǎn)物的酶數(shù)量。例如，在一個實施方案中，術(shù)語顆粒淀粉水解酶單位(GSHE U)被定義為在測定條件下，例如50℃和pH4.5，每分鐘由顆粒淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖所需要的GSHE的量。例如，在一個實施方案中，術(shù)語α淀粉酶酶單位(AU)被定義為在pH 5.2和40℃的標(biāo)準(zhǔn)測定條件下，在1分鐘時間內(nèi)水解1微摩爾淀粉底物的α淀粉酶的量。
92術(shù)語“終端產(chǎn)物”或“期望的終端產(chǎn)物”指衍生自任何碳來源的分子產(chǎn)物，該產(chǎn)物是從顆粒淀粉底物酶促轉(zhuǎn)化而來的。優(yōu)選地，終端產(chǎn)物是葡萄糖或葡萄糖糖漿。然后葡萄糖可以被用作其它期望的終端產(chǎn)物的前體。
93術(shù)語“殘余淀粉”，正如此處所用，指當(dāng)包括葡萄糖糖漿或其它終端產(chǎn)物的組合物被分離時，本發(fā)明的顆粒淀粉水解工藝的副產(chǎn)物或剩余的組分。殘余淀粉包括剩余的不可溶的淀粉，其在分離后留在組合物中。
94“殘余淀粉的循環(huán)步驟”指殘余淀粉循環(huán)回到容器或反應(yīng)器中，其中包括GSHE和α淀粉酶。
95術(shù)語“產(chǎn)量(yield)”指使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的終端產(chǎn)物或期望的終端產(chǎn)物的量。在一些優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)量大于使用本技術(shù)領(lǐng)域已知方法所產(chǎn)生的產(chǎn)量。在一些實施方案中，該術(shù)語指終端產(chǎn)物的體積，在其它實施方案中，該術(shù)語指終端產(chǎn)物的濃度。
96正如此處所用，“產(chǎn)乙醇微生物”指有能力將糖或寡糖轉(zhuǎn)化為乙醇的微生物。由于其表達(dá)一種或多種酶的能力，產(chǎn)乙醇微生物是乙醇生成型的，所述酶單獨(dú)地或合起來將糖轉(zhuǎn)化為乙醇。
97在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“基本上純的多肽(substantially pure polypeptide)”指這樣的多肽制劑，按重量計其含有最多10％的與之天然聯(lián)系的其它多肽物質(zhì)(更低百分比的其它多肽物質(zhì)是優(yōu)選的，例如最多8wt％，最多6wt％，最多5wt％，最多4wt％，最多3wt％，最多2wt％，最多1wt％，以及最多1/2wt％)。因此，優(yōu)選地，基本上純的多肽是至少92％純度，即，該多肽構(gòu)成在制劑中存在的總多肽材料的至少92wt％，更高百分比是優(yōu)選的，如至少94％純度，至少95％純度，至少96％純度，至少96％純度，至少97％純度，至少98％純度，至少99％純度，和至多99.5％純度。此處公開的多肽優(yōu)選地是基本上純的形式。尤其是，優(yōu)選地，此處公開的多肽是“實質(zhì)上純的形式(essentially pure form)”，即多肽制劑基本上不含與其天然相關(guān)的其它多肽材料。這是可以實現(xiàn)的，例如通過用熟知的重組方法制備多肽來實現(xiàn)。
98“ATCC”指美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，位于Manassas，VA 20108(ATCC，www/atcc.org)。
99“NRRL”指Agricultural Research Service Culture Collection，National Center，Agricultural Utilization Research(以前被稱為USDA Northern Regional ResearchLaboratory)，Peoria，ILL。
100“一個(A)”、“一個(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代，除非文中另外清楚地指明。
101正如此處所用，術(shù)語“包括(comprising)”及其同源詞在本文中被使用時，它們具有包含的意思；也就是，相當(dāng)于術(shù)語“包含(including)”及其對應(yīng)的同源詞。
B.優(yōu)選的實施方案淀粉底物-102在本發(fā)明的方法中，將被加工的顆粒淀粉底物可以從包括莖干、谷粒、根和塊莖的任何植物部分獲得。尤其優(yōu)選的植物來源包括玉米；小麥；黑麥；高梁；大米；黍；大麥；木薯；豆類，如蠶豆和豌豆；馬鈴薯；甜薯；香蕉；和木薯粉。淀粉可以是高度精制的粗淀粉或者來自淀粉精制過程的原料。尤其預(yù)期到的淀粉底物是玉米淀粉和小麥淀粉。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道，用于制備在本發(fā)明所包括的方法中使用的顆粒淀粉底物的有效方法。這些有效方法中的一些方法包括使用錘磨機(jī)(hammer mills)和輥磨機(jī)(roller mills)的全谷類谷物(whole cerealgrains)干磨，以及濕磨。
103各種淀粉可通過商業(yè)途徑獲得。例如，玉米淀粉可以從Cerestar、Sigma和Katayama Chemistry Industry Co.(Japan)獲得；小麥淀粉可以從Sigma獲得；甜薯淀粉可以從Wako Pure Chemistry Industry Co.(Japan)獲得；馬鈴薯淀粉可以從Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.(Japan)獲得。
104盡管目的不在于以任何方式限制本發(fā)明，但下面的表1提供了在一些常見的谷類谷物中存在的淀粉含量的一般性指南。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知，谷物中的淀粉含量可能依賴于如基因型這樣的因素和環(huán)境。
表1各種谷物的淀粉含量

The Alcohol Textbook，第3版，K.Jacques等人編著，1999，Nottingham University Press，第11頁。
105在本發(fā)明所包括的方法的一些實施方案中，顆粒淀粉底物被漿體化(通常是用水)，所述漿狀物包括i)大約10％-大約55％干固體含量，ii)大約20％-大約50％干固體含量；iii)大約25％-大約45％干固體含量；iv)大約30％-大約45％干固體含量；v)大約30％-大約40％干固體含量；和vi)大約30％-大約35％干固體含量。
α淀粉酶-106在本發(fā)明所包括的一些實施方案中，α淀粉酶是微生物酶，其E.C.號為E.C.3.2.1.1-3，尤其是E.C.3.2.1.1。在一些實施方案中，α淀粉酶是熱穩(wěn)定的細(xì)菌α淀粉酶。合適的α淀粉酶可以是天然發(fā)生的、重組的和突變的α淀粉酶。在尤其優(yōu)選的實施方案中，α淀粉酶來源于桿菌種類。優(yōu)選的桿菌種類包括枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)和淀粉液化芽孢桿菌(USP 5,763,385；USP 5,824,532；USP 5,958,739；USP 6,008,026和USP 6,361,809)。特別優(yōu)選的α淀粉酶來源于桿菌菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。也可以參考具有如下ATCC編號的菌株ATCC 39709；ATCC 11945；ATCC 6598；ATCC 6634；ATCC 8480；ATCC 9945A和NCIB 8059。
107預(yù)期可以在本發(fā)明的組合物和方法中使用的可商購獲得的α淀粉酶包括SPEZYME AA；SPEZYME FRED；GZYME G997(Genencor International Inc.)和TERMAMYL 120-L，LC，SC和SUPRA(Novozyme Biotech)。
108正如本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，在本發(fā)明的組合物和方法中所使用的α淀粉酶的數(shù)量將依賴于α淀粉酶的酶活性。通常，每公噸(MT)原材料(顆粒淀粉底物)中加入大約0.01-5.0kg的α淀粉酶。該數(shù)量大約相當(dāng)于0.06AU/g ds到30AU/g ds的GZYME 997。在一些實施方案中，每公噸中α淀粉酶的加入量為大約0.05-5.0kg；大約0.05-2.5kg；大約0.1-2.5kg；大約0.1-2.0kg；大約0.1-1.5kg；大約0.1-1.0kg；大約0.5-5.0kg以及大約0.5-2.0kg。這些數(shù)值大約等于0.3-30AU/gds；0.3-15AU/g ds；0.6-15AU/g ds；0.6-12AU/g ds；0.6-9AU/g ds；0.6-6AU/g ds；3-30AU/g ds以及3-12AU/g ds的GZYME 997。在進(jìn)一步的實施方案中，可以使用其它數(shù)量，例如通常大約0.01-1.0kg之間的GZYME 997或SPEZYME FRED(Genencor International Inc.)被加入到1公噸淀粉中。在其它實施方案中，每公噸淀粉中加入的酶的量為大約0.05-1.0kg之間；大約0.1-0.6kg之間；大約0.2-0.6kg之間；和大約0.4-0.6kg之間的GZYME 997或SPEZYME FRED。
具有葡糖淀粉酶活性的顆粒淀粉水解酶-109葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)是從淀粉的非還原末端去除連續(xù)的葡萄糖單元的酶。該酶能水解淀粉，直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈和支鏈糖苷鍵。盡管葡糖淀粉酶可以是細(xì)菌、植物和真菌來源的，但本發(fā)明所包括的優(yōu)選的葡糖淀粉酶是真菌菌株來源的。
110從曲霉菌屬、根霉菌屬、腐質(zhì)霉屬和毛霉菌屬的真菌分泌的葡糖淀粉酶是真菌菌株來源的，包括黑曲霉、泡盛曲霉、雪白根霉(Rhizopus niveus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、米黑毛霉(Mucor miehe)、灰腐質(zhì)霉、Aspergillus shirousami和Humicola(Thermomyces)laniginosa(參見Boel等人(1984)EMBO J.31097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136；Chen等人(1996)Prot.Eng.9499-505；Taylor等人，(1978)Carbohydrate Res.61301-308和Jensen等人(1988)Can.J.Microbiol. 34218-223)。
111商業(yè)上使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶是從，例如黑曲霉(商標(biāo)名為OPTIDEX L-400和G ZYME G990 4X，來自Genencor International Inc.)或根霉菌種類(商標(biāo)名為CU.CONC.，來自Shin Nihon Chemicals，Japan；商標(biāo)名為GLUCZYME，來自Amano Pharmaceuticals，Japan)產(chǎn)生的。
112一組特定的具有葡糖淀粉酶活性的酶是顆粒淀粉水解酶GSHE(參見Tosi等人，(1993)Can.J.Microbiol.39846-855)。GSHE不僅具有葡糖淀粉酶活性，而且能水解顆粒(生的)淀粉。GSHE已經(jīng)從真菌細(xì)胞如腐質(zhì)霉屬某種、曲霉菌屬某種和根霉菌屬某種回收。米根霉GSHE已經(jīng)在Ashikari等人(1986)Agric.Biol.Chem.50957-964和USP 4,863,864中描述?；腋|(zhì)霉GSHE已經(jīng)在Allison等人(1992)Curr.Genet.21225-229和歐洲專利171218中描述。編碼該酶的基因在本技術(shù)領(lǐng)域也是已知的，已知為gla1。泡盛曲霉河內(nèi)變種(Aspergillus awaomori var.kawachi)GSHE已經(jīng)由Hayashida等人(1989)Agric.Biol.Chem 53923-929描述。Aspergillusshirousami GSHE已經(jīng)由Shibuya等人(1990)Agric.Biol.Chem.541905-1914描述。
113在一個實施方案中，GSHE可以來源于灰腐質(zhì)霉菌株，尤其是灰腐質(zhì)霉高溫變種的菌株(參見USP 4,618,579)。
114在一些優(yōu)選的實施方案中，GSHE是從包括ATCC 16453、NRRL 15219、NRRL 15220、NRRL 15221、NRRL 15222、NRRL 15223、NRRL 15224和NRRL15225及其遺傳上被改變的菌株的真菌中回收的。(EP 0171218)。
115在一個實施方案中，GSHE可以來源于泡盛曲霉菌株，尤其是泡盛曲霉河內(nèi)變種菌株(參見Hayashida等人(1989)Agric.Biol.Chem.53923-929)。
116在另一個實施方案中，GSHE可以在4至7.5的pH范圍內(nèi)、5.0至7.5的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大的pH活性，在50-60℃的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大活性。
117在一個實施方案中，GSHE與SEQ ID NO3中所示的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在另一個實施方案中，GSHE包括與SEQ ID NO3中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在其它實施方案中，包括SEQ IDNO3的氨基酸序列的GSHE或與SEQ ID NO3的序列具有至少80％序列同一性的GSHE，由與SEQ ID NO1具有至少70％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％序列同一性的多核苷酸編碼。
118在另一個實施方案中，GSHE與SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列具有至少 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在另一個實施方案中，GSHE包括與SEQ ID NO6中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在其它實施方案中，包括SEQID NO6的氨基酸序列的GSHE或與SEQ ID NO6的序列具有至少80％序列同一性的GSHE，由與SEQ ID NO4具有至少70％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％序列同一性的多核苷酸編碼。
119與另一個序列具有一定的序列同一性百分比(例如80％、85％、90％或99％)的多核苷酸或多肽是指當(dāng)聯(lián)配時，在兩個序列的比較中所述百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。該聯(lián)配和同源性或同一性百分比可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何合適的軟件程序確定，例如在Current Protocols in Molecular Biology中描述的那些程序(Ausubel等人編著，1987，Supplement 30，7.7.18部分)。優(yōu)選的程序包括GCG Pileup程序，F(xiàn)ASTA和BLAST。另一個優(yōu)選的聯(lián)配程序是ALIGN Plus和TFASTA。
120本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，本發(fā)明中所包括的序列也可以由在嚴(yán)緊雜交條件下與例證性GSHE序列(例如SEQ ID NO1或SEQ ID NO4)雜交的能力進(jìn)行定義。在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度條件下，當(dāng)單鏈形式的核酸可以退火到另一核酸上時，則該核酸是能與該另一核酸序列進(jìn)行雜交的。雜交和洗滌條件在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的(例如參見Sambrook(1989)見上文，尤其是第9和11章)。在一些實施方案中，嚴(yán)緊條件對應(yīng)于Tm 65℃，0.1xSSC，0.1％SDS。在進(jìn)一步的實施方案中，GSHE酶可以來源于根霉菌菌株。如來源于雪白根霉(R.niveus)的Koji菌株的酶(其銷售商標(biāo)名為“CU CONC”)，或者來源于商標(biāo)名為GLUCZYME的根霉菌的酶。
121在一個優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明所包括的方法或組合物中使用的GSHE是從絲狀真菌菌株獲得的重組表達(dá)的GSHE，所述絲狀真菌菌株已經(jīng)被進(jìn)行了遺傳工程改造以便表達(dá)異源多核苷酸，所述異源多核苷酸編碼GSHE，該GSHE的來源并非該宿主菌株。
122在一些實施方案中，絲狀真菌菌株是曲霉菌屬某種、木霉菌屬某種、鐮刀霉菌屬某種(Fusarium sp.)或青霉菌屬某種(Penicillium sp.)的菌株。尤其優(yōu)選的真菌宿主包括構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉、綠色木霉(T.viride)、尖鐮孢霉(F.oxysporum)和F.solani。曲霉菌菌株公開在Ward等人(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743和Goedegebuur等人(2002)Curr.Gene 4189-98中。在一個最優(yōu)選的實施方案中，宿主是木霉菌屬菌株，尤其是里氏木霉菌株。里氏木霉的菌株是已知的，非限定性實例包括ATCC No.13631，ATCC No.26921，ATCC No.56764，ATCCNo.56765，ATCC No.56767和NRRL 15709。在一些優(yōu)選的實施方案中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公開在Sheir-Neiss等人(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol.2046-53中。
123表達(dá)rGSHE的宿主菌株可能已經(jīng)通過遺傳工程進(jìn)行過操作。在一些實施方案中，真菌宿主的多種基因已經(jīng)失活。這些基因包括，例如編碼纖維素分解酶例如內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和外切纖維二糖水解酶(CBH)的基因(例如cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)。美國專利5,650,322公開了在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37衍生菌株。
124在一些實施方案中，真菌菌株已經(jīng)被進(jìn)行了遺傳工程，以包括編碼來自灰腐質(zhì)霉的GSHE的多核苷酸。在一個實施方案中，rGSHE將與SEQ ID NO3中所示的氨基酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在其它實施方案中，編碼SEQ ID NO3的GSHE的多核苷酸將與SEQ ID NO1的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％和98％的序列同一性。在特別優(yōu)選的實施方案中，GSHE在里氏木霉菌株中表達(dá)，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO3的序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％和98％的序列同一性。
125在其它實施方案中，真菌宿主已經(jīng)被進(jìn)行了遺傳工程，以表達(dá)編碼來自泡盛曲霉的GSHE的多核苷酸。在一個實施方案中，rGSHE將與SEQ ID NO6中所示的氨基酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。在其它實施方案中，編碼SEQ ID NO6的GSHE的多核苷酸將與SEQ ID NO4的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、97％和98％的序列同一性。在特別優(yōu)選的實施方案中，GSHE在里氏木霉菌株中表達(dá)，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO6的序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％和98％的序列同一性。
126在一些實施方案中，重組表達(dá)的GSHE的糖基化水平與對應(yīng)的天然GSHE的糖基化水平不同(例如原始來源于灰腐質(zhì)霉或泡盛曲霉的GSHE具有與木霉菌中表達(dá)的GSHE的糖基化水平不同的糖基化水平)。在一個實施方案中，糖基化水平是不同的，即使rGSHE與相應(yīng)的天然GSHE具有至少80％、85％、90％、95％氨基酸同一性。在一些實施方案中，在木霉菌特別是里氏木霉的菌株中表達(dá)的rGSHE，具有與相應(yīng)的nGSHE中的水平不同的糖基化水平。在其它實施方案中，糖基化水平要更高，而在其它實施方案中糖基化水平則更低。
127例如，rGSHE的糖基化水平可以比相應(yīng)的nGSHE的糖基化水平低至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。在其它實施方案中，被表達(dá)的rGSHE的糖基化水平可以比相應(yīng)的nGSHE的糖基化水平高至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％。
128在另一個實施方案中，與相應(yīng)的天然GSHE相比，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的重組產(chǎn)生的GSHE在最適溫度水平可以在更低pH水平具有更高的穩(wěn)定性。更特別地，在木霉菌中表達(dá)的最初來源于灰腐質(zhì)霉高溫變種的GSHE，與相應(yīng)nGSHE相比，在45-55℃的溫度在3.5-4.0的pH水平具有更高的穩(wěn)定性。在一些條件下，rGSHE的穩(wěn)定性，特別是在里氏木霉中表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種SEQ ID NO1，比nGSHE的穩(wěn)定性水平的兩倍還要高。
載體和真菌轉(zhuǎn)化129根據(jù)本發(fā)明，構(gòu)建DNA構(gòu)建物，其包括編碼本發(fā)明所包括的GSHE的多核苷酸，以便將GSHE轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。因此，可以以酶形式被表達(dá)的GSHE多核苷酸可以使用載體被引入到宿主細(xì)胞中，所述載體尤其是包括可操作地連接到GSHE編碼序列上的調(diào)節(jié)序列的表達(dá)載體。
130載體可以是任何載體，當(dāng)被引入到真菌宿主細(xì)胞中時，所述載體被整合到宿主細(xì)胞基因組中并且被復(fù)制。對于載體的列表，可參考Fungal Genetics StockCenter Catalogue of Strains(www.FGSC.net)。而且，合適的表達(dá)載體的實例可以在Sambrook等人(1989)見上文，和Ausubel(1987)見上文中發(fā)現(xiàn)，更特別地參考van den Hondel等人(1991)，Bennett和Lasure編著，MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press 396-428頁。特別有用的載體包括pFB6，pBR322，PUC18，pUC100和pENTR/D。
131在一些實施方案中，編碼GSHE的核酸可操作地連接到合適的啟動子上，該啟動子在真菌宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性。啟動子可以來源于編碼與宿主細(xì)胞同源或者異源的蛋白質(zhì)的基因。優(yōu)選地，啟動子在木霉菌宿主中有用，啟動子的合適的非限定性實例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2。在一個實施方案中，對宿主細(xì)胞而言，啟動子是天然的啟動子。例如，當(dāng)里氏木霉是宿主時，啟動子將是天然的里氏木霉啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，啟動子是里氏木霉cbh1，該啟動子是誘導(dǎo)型啟動子，已經(jīng)存檔在GenBank中，其登記號為D86235。誘導(dǎo)型啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動子。在另一個實施方案中，啟動子是與真菌宿主細(xì)胞異源的啟動子。有用的啟動子的其它實例包括來自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子(參見Nunberg等人，(1984)Mol.Cell Biol.42306-2315，和Boel等人(1984)EMBO J.31581-1585)。而且，里氏木霉xln1基因和纖維二糖水解酶1基因的啟動子可以是有用的(EPA 137280A1)。
132在一些實施方案中，GSHE編碼序列可操作地連接到信號序列上。編碼信號序列的DNA優(yōu)選是與將被表達(dá)的GSHE基因天然相關(guān)。優(yōu)選地，信號序列由編碼GSHE的灰腐質(zhì)霉或泡盛曲霉基因編碼。更優(yōu)選地，信號序列與圖2A和6A中描述的信號序列具有至少90％、至少95％、至少97％和至少99％序列同一性。在其它實施方案中，包括將被引入到真菌宿主細(xì)胞中的DNA構(gòu)建物或載體的信號序列和啟動子序列來源于相同的來源。例如，在一些實施方案中，信號序列是cdh1信號序列，其可操作地連接到cdh1啟動子上。
133在一些實施方案中，表達(dá)載體也包括終止序列。在一個實施方案中，終止序列和啟動子序列來源于相同的來源。在另一個實施方案中，終止序列與宿主細(xì)胞同源。特別合適的終止序列是cbh1，其來源于木霉菌菌株，尤其是里氏木霉。其它有用的真菌終止子包括來自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子(Nunberg等人(1984)見上文，和Boel等人，(1984)見上文)。
134在一些實施方案中，表達(dá)載體包括選擇性標(biāo)記。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記的實例包括賦予抗微生物抗性的標(biāo)記(例如潮霉素和腐草霉素)。營養(yǎng)選擇性標(biāo)記也在本發(fā)明中可以使用，包括本技術(shù)領(lǐng)域已知的那些標(biāo)記物，如amdS、argB和pyr4。在用于木霉菌的轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)中有用的標(biāo)記物描述在Finkelstein，第6章，BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI，F(xiàn)inkelstein等人編著，Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章，和Kinghorn等人(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI，BlackieAcademic and Professional，Chapman and Hall，London。在優(yōu)選的實施方案中，選擇性標(biāo)記是amdS基因，其編碼乙酰胺酶，其允許被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以乙酰胺作為氮源生長。(參見Kelley等人(1985)EMBO J.4475-479和Penttila等人(1987)Gene 61155-164。
135包括編碼GSHE的多核苷酸的表達(dá)載體可以是任何載體，其能在給定的真菌宿主生物體中自我復(fù)制，或者能整合到宿主的DNA中。在一些實施方案中，表達(dá)載體是質(zhì)粒。在優(yōu)選的實施方案中，預(yù)期使用用于獲得基因表達(dá)的兩種類型的表達(dá)載體。
136第一種表達(dá)載體包括DNA序列，其中的啟動子、GSHE編碼區(qū)以及終止子都來源于將被表達(dá)的基因。在一些實施方案中，基因通過刪除不需要的DNA序列(例如，編碼不需要的結(jié)構(gòu)域)而被截短，留下將要被表達(dá)的結(jié)構(gòu)域置于其本身的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列的控制下。
137第二種類型的表達(dá)載體是預(yù)裝配的，含有高水平轉(zhuǎn)錄所需要的序列和選擇性標(biāo)記物。在一些實施方案中，GSHE基因的編碼區(qū)域或其部分被插入到該通用的表達(dá)載體中，以便其在表達(dá)構(gòu)建物啟動子和終止序列的轉(zhuǎn)錄控制下。在一些實施方案中，基因或其部分被插入到強(qiáng)cbh1啟動子的下游。
138用于裝配載體并且將它們插入到合適的載體中的方法在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的，所述載體包括編碼GSHE的多核苷酸、啟動子、終止子和其它序列。連接通常通過在合適的限制位點(diǎn)處的裝配來實現(xiàn)。如果這樣的位點(diǎn)不存在，那么就根據(jù)傳統(tǒng)實踐使用合成的寡核苷酸連接子。(參見Sambrook(1989)見上文，Bennett和Lasure，MORE GENE MANIPULATIONA IN FUNGI，Academic Press，San Diego(1991)70-76頁)。另外，載體可以使用已知的重組技術(shù)來構(gòu)建(例如Invitrogen LifeTechnologies，Gateway Technology)。
139在期望獲得具有一個或多個失活基因的真菌宿主細(xì)胞的情況下，可以使用已知的方法(參見美國專利5,246,853；美國專利5,475,101和WO 92/06209)。基因滅活可以通過完全或部分缺失、通過插入失活或通過可使基因?qū)τ谄淦谕康亩宰優(yōu)闊o功能的任何其它方法來實現(xiàn)(這樣就可以阻止基因表達(dá)功能蛋白)。已經(jīng)被克隆的、來自木霉菌某種或其它絲狀真菌宿主的任何已被克隆的基因，可以被刪除，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2。在一些實施方案中，基因缺失通過使用已知的方法將欲被滅活的期望基因的一種形式插入到質(zhì)粒中來實現(xiàn)。然后，在適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)切割缺失質(zhì)粒，限制酶位點(diǎn)是在期望基因編碼區(qū)域的內(nèi)部，基因編碼序列或其部分用選擇性標(biāo)記予以代替，將要被刪除的基因位的側(cè)翼DNA序列保留在標(biāo)記的兩側(cè)(優(yōu)選地在大約0.5-2.0kb)。適當(dāng)?shù)娜笔з|(zhì)粒通常在其中存在有獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)，這使得含有缺失了的基因的片段——包括側(cè)翼DNA序列和選擇性標(biāo)記基因，可以作為單一的線性片段而被移除。
140將DNA構(gòu)建物或載體引入到宿主細(xì)胞中包括如下技術(shù)，如轉(zhuǎn)化；電穿孔；細(xì)胞核微注射；轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)染，包括脂轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和DEAE-Dextrin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；磷酸鈣DNA沉淀溫育；使用DNA包被的微射彈的高速轟擊；以及原生質(zhì)體融合。一般的轉(zhuǎn)化技術(shù)在Ausubel等人(1987)見上文，第9章，和Sambrook(1989)見上文中有所教導(dǎo)。更特別的，絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法公開在Campbell等人(1989)Curr.Genet.1653-56中。特別地，為了實施異源蛋白質(zhì)在木霉菌中的表達(dá)，參考USP 6,022,725；USP 6,268,328；Harkki等人(1991)；Enzyme Mcirob.Technol.13227-233；Hakki等人，(1989)Bio Technol.7596-603；EP 244,234；和EP 215,594。也參考Nevalainen等人，“The Molecular Biology of Trichoderma and its Applicationto the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes”，在MOLECULARINDUSTRIAL MYCOLOGY，Leong和Berka編著，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)129-148頁。對于曲霉菌菌株的轉(zhuǎn)化，也參考Cao等人(2000)Sci.9991-1001。
141優(yōu)選地，遺傳上穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子可以用載體系統(tǒng)構(gòu)建，從而編碼GSHE的核酸被穩(wěn)定地整合到宿主菌株染色體中。然后可以通過已知技術(shù)純化轉(zhuǎn)化子。
142在一個非限定性實例中，包含amdS標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子與不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子不同，其不同在于它們在含有乙酰胺的固體培養(yǎng)基上更快的生長速率，以及形成具有平滑的而不是粗糙的輪廓的環(huán)狀集落。另外，在一些情況下，穩(wěn)定性的進(jìn)一步測試通過在固體非選擇性培養(yǎng)基(即缺乏乙酰胺)上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子來進(jìn)行，從該培養(yǎng)基收獲孢子，并且確定隨后將發(fā)芽并在含有乙酰胺的選擇性培養(yǎng)基上生長的這些孢子的百分比。另外，本技術(shù)領(lǐng)域已知的其它方法可以用于選擇轉(zhuǎn)化子。
143在一個特定的實施方案中，用于轉(zhuǎn)化的木霉菌屬某種的制備涉及從真菌菌絲制備原生質(zhì)體。(參見Campbell等人(1989)Curr.Genet.1653-56)。在一些實施方案中，菌絲是從萌發(fā)的營養(yǎng)孢子獲得的，并且用消化細(xì)胞壁的酶處理，從而產(chǎn)生原生質(zhì)體。然后原生質(zhì)體通過在懸浮的培養(yǎng)基中存在的滲透穩(wěn)定劑得到保護(hù)。這些穩(wěn)定劑包括山梨糖醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂及其類似物。通常這些穩(wěn)定劑的濃度在0.8M和1.2M之間變化。優(yōu)選地在懸浮培養(yǎng)基中使用大約1.2M的山梨糖醇溶液。
144將DNA攝取到宿主木霉菌屬某種菌株中是依賴于鈣離子濃度。在攝取溶液中通常使用大約10mM和50mM之間的CaCl2。在攝取溶液中除了需要鈣離子，通常所包括的其它項目是緩沖體系，如TE緩沖液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH 6.0緩沖液(嗎啉代丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。據(jù)信，聚乙二醇發(fā)揮融合細(xì)胞膜的作用，從而允許培養(yǎng)基中的物質(zhì)被傳遞到木霉菌屬某種菌株的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并且質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到核中。該融合常常使得質(zhì)粒DNA的多個拷貝溫和地整合到宿主染色體中。
145通常在轉(zhuǎn)化中使用含有木霉菌屬某種原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液，其已經(jīng)以105到107/mL，優(yōu)選地2×106/mL的密度進(jìn)行了滲透處理。將100μL體積的含有這些原生質(zhì)體或細(xì)胞的適當(dāng)溶液(例如1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)與期望的DNA混合。通常將高濃度的PEG加入到攝取溶液中。0.1到1體積的25％PEG 4000可以被加入到原生質(zhì)體懸液中。然而，優(yōu)選地將大約0.25體積加入到原生質(zhì)體懸液中。添加劑如二甲基亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀及其類似物也可以被加入到攝取溶液中，以便有助于轉(zhuǎn)化。對于其它真菌宿主細(xì)胞，類似方法是可以獲得的。例如參見美國專利6,022,725和6,268,328，其內(nèi)容通過引用方式被并入。
146通常，混合物然后在大約0℃被培養(yǎng)10到30分鐘。然后在混合物中再次加入PEG，以進(jìn)一步增強(qiáng)期望基因或DNA序列的攝取。25％PEG 4000通常以轉(zhuǎn)化混合物體積的5到15倍體積加入；然而，更大或更小的體積也可以是合適的。25％PEG 4000優(yōu)選地是轉(zhuǎn)化混合物體積的大約10倍。在加入PEG后，在加入山梨糖醇和CaCl2溶液之前，在室溫或在冰上溫育轉(zhuǎn)化混合物。原生質(zhì)體懸液然后被進(jìn)一步加入到融化的生長培養(yǎng)基等份中。該生長培養(yǎng)基僅僅允許轉(zhuǎn)化子生長。
細(xì)胞培養(yǎng)物-147適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞通常在含有生理鹽分和營養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如下述文獻(xiàn)中所描述的Pourquie，J等人，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OFCELLULOSE DEGRADATION，Aubert，J.P.等人編著，Academic Press，71-86頁，1988，和Ilmen，M.等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.631298-1306。也可以參考普通的商業(yè)上制備的培養(yǎng)基，如Yeast Malt Extract(YM)培養(yǎng)基，Luria Bertani(LB)培養(yǎng)基和Sabouraud Dextrose(SD)培養(yǎng)基。
148培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的，例如培養(yǎng)物在大約28℃，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，在振蕩培養(yǎng)器或發(fā)酵桶中培養(yǎng)，直到實現(xiàn)期望的GSHE表達(dá)水平。給定的絲狀真菌的優(yōu)選的培養(yǎng)條件可以在科學(xué)文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，和/或從真菌的來源發(fā)現(xiàn)，如AmericanType Culture Collection和Fungal Genetics Stock Center(www.FGSC.net)。
149在真菌生長已經(jīng)建立后，將細(xì)胞暴露于可以有效地導(dǎo)致或允許GSHE尤其是本文所定義的GSHE表達(dá)的條件下。在GSHE編碼序列處于誘導(dǎo)型啟動子的控制下的情況下，誘導(dǎo)劑，例如糖、金屬鹽或抗生素，以可以有效地誘導(dǎo)GSHE表達(dá)的濃度加入到培養(yǎng)基中。
rGSHE的工業(yè)應(yīng)用-發(fā)酵-150在本發(fā)明的一些實施方案中，在分批或連續(xù)發(fā)酵條件下培養(yǎng)表達(dá)異源GSHE的真菌細(xì)胞。典型的分批發(fā)酵(batch fermentation)是一個封閉的系統(tǒng)，其中在發(fā)酵的起點(diǎn)將培養(yǎng)基的成分設(shè)置好，在發(fā)酵過程中不進(jìn)行人工變化。因此，在發(fā)酵的開始，用期望的生物體接種培養(yǎng)基。在該方法中，發(fā)酵被允許在不向系統(tǒng)中加入任何組分的情況下發(fā)生。通常，分批發(fā)酵中“分批”的限定是針對碳源的添加而言的，同時常常也在對諸如pH和氧濃度的因素的控制方面進(jìn)行嘗試。分批體系的代謝物和生物材料組分不斷地變化，直到發(fā)酵被終止的時刻。在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞從靜止遲滯期(static lag phase)發(fā)展到高生長的對數(shù)期，最后到穩(wěn)定期，此時生長速率被降低或者停止。如果不被處理，穩(wěn)定期中的細(xì)胞最終會死亡。通常，處在對數(shù)期的細(xì)胞負(fù)責(zé)大量地產(chǎn)生終端產(chǎn)物。
151標(biāo)準(zhǔn)的分批體系的一個變型是“補(bǔ)料-分批發(fā)酵”體系，該體系也在本發(fā)明中有用。在典型的分批體系的這一變型中，底物隨著發(fā)酵的進(jìn)展以增量加入。當(dāng)分解代謝物抑制(catabolite repression)有抑制細(xì)胞的代謝的傾向時，并且期望培養(yǎng)基中具有有限量的底物的情況下，補(bǔ)料-分批系統(tǒng)是有用的。補(bǔ)料-分批系統(tǒng)中的實際底物濃度的測量是很困難的，因此基于可測量因素的變化來估計，所述因素例如pH、溶解氧和廢氣如CO2的分壓。分批和補(bǔ)料-分批發(fā)酵在本技術(shù)領(lǐng)域是常見的，并且是熟知的。
152連續(xù)發(fā)酵是一個開放式系統(tǒng)，其中，對于加工過程，確定成分的發(fā)酵培養(yǎng)基被連續(xù)地加入到生物反應(yīng)器，等量的條件培養(yǎng)基被同時取出。連續(xù)發(fā)酵通常將培養(yǎng)物維持在一個固定的高密度，其中細(xì)胞主要處于對數(shù)生長期。
153連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)制影響細(xì)胞生長和/或終端產(chǎn)物濃度的一個因素或任意數(shù)量的因素。例如，在一個實施方案中，限制性營養(yǎng)物如碳源或氮源被維持在固定的比率，所有其它參數(shù)允許調(diào)節(jié)。在其它系統(tǒng)中，影響生長的許多因素可以被連續(xù)地改變，而通過培養(yǎng)基濁度測量的細(xì)胞濃度被維持在常量。連續(xù)系統(tǒng)努力維持穩(wěn)定態(tài)生長條件。因此，針對發(fā)酵中的細(xì)胞生長率，必須平衡由于培養(yǎng)基被移除所導(dǎo)致的細(xì)胞損失。調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵過程的營養(yǎng)物和生長因子的方法，以及最大化產(chǎn)物形成速率的技術(shù)，在工業(yè)微生物領(lǐng)域是熟知的。
GSHE活性的鑒定-154為了通過評價細(xì)胞系對GSHE的表達(dá)，測定可以在蛋白質(zhì)水平、RNA水平進(jìn)行，或通過使用功能性生物測定法進(jìn)行，尤其是針對葡糖淀粉酶活性和/或產(chǎn)生，所述細(xì)胞系已經(jīng)用編碼本發(fā)明所包括的GSHE的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化。一般來說，用于分析GSHE表達(dá)的測定法包括，Northern印跡、點(diǎn)印跡(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))或原位雜交，使用適當(dāng)標(biāo)記的探針(基于核酸編碼序列)和傳統(tǒng)的Southern印跡和放射自顯影。此外，GSHE的產(chǎn)生和/或表達(dá)可以直接在樣品中測量，例如通過直接測量在培養(yǎng)基中的還原糖如葡萄糖的測定法，通過測量葡糖淀粉酶活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生的測定法?？梢杂糜跍y定GSHE活性的底物包括顆粒淀粉底物。例如，葡萄糖濃度可以通過任何便利的方法來確定，如通過使用葡萄糖試劑盒No 15-UV(Sigma Chemical Co.)，或設(shè)備如Technicon Autoanalyzer。也可以參考葡萄糖氧化酶試劑盒和葡萄糖己糖試劑盒，它們可從Instrumentation Lab.(Lexington，MA)商購。葡糖淀粉酶活性可以通過3，5-二硝基水楊酸(DNS)方法測定(參見Goto等人，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.5849-54)。在非限定性例子中，rGSHE有能力在水中的15％淀粉固體懸液中水解顆粒淀粉，水解為至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％wt葡萄糖的糖溶液，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)進(jìn)行計算。
155在本發(fā)明的一個實施方案中，由重組宿主表達(dá)的GSHE將大于1克蛋白質(zhì)每升培養(yǎng)物(g/L)。優(yōu)選地，在一些實施方案中，宿主是木霉菌或曲霉菌宿主。在一些實施方案中，由重組的木霉菌宿主表達(dá)的GSHE的量將大于2g/L培養(yǎng)物。在其它實施方案中，由重組的木霉菌宿主表達(dá)的GSHE的量將大于5g/L培養(yǎng)物。仍然在其它實施方案中，由重組的木霉菌宿主表達(dá)的GSHE的量將大于10g/L培養(yǎng)物。表達(dá)的GSHE的量在一些例子中可為大于20g/L、大于25g/L、大于30g/L和大于50g/L培養(yǎng)基。
156此外，蛋白質(zhì)表達(dá)可以通過免疫學(xué)方法評價，如細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色、組織切片或組織培養(yǎng)基的免疫測定法，例如通過Western印跡或ELISA。這樣的免疫測定法可以用于定性地和定量地評價GSHE的表達(dá)。這樣的方法的細(xì)節(jié)對本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，實踐這樣的方法的許多試劑可以商購獲得。
157例證性的測定法包括ELISA、競爭免疫測定法、放射免疫測度法、Western印跡、間接免疫熒光測定法及其類似方法。一般地，商購的抗體和/或試劑盒可以用于GSHE的表達(dá)水平的定量免疫測定。
純化GSHE的方法-158一般地，在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的GSHE(nGSHE或rGSHE)被分泌到培養(yǎng)基中，并且可以被純化或分離，例如通過從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除不需要的組分。在一些情況下，GSHE可以以細(xì)胞內(nèi)形式產(chǎn)生，從而必須從細(xì)胞裂解物進(jìn)行回收。在這樣的情況下，從細(xì)胞中純化該酶，其中它是使用本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的技術(shù)產(chǎn)生。實例包括但不限于，親和層析(Tibeurgh等人，(1984)FEBS Lett.16215)；離子交換層析方法(Goyal等人(1991)Biores.Technol.3637；Fliess等人(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17314；Bhikhabhai等人(1984)J.Appl.Biochem.6336；和Ellouz等人(1987)Chromatography 396307)，包括使用具有高分辨能力材料的離子交換(Medve等人(1998)J.Chromatography A 808153；疏水相互作用層析(Tomaz和Queiroz，(1999)J.Chromatography A 865123；兩相分離(Brumbauer等人(1999)Bioseparation 7287)；乙醇沉淀；反相HPLC；硅或陽離子交換樹脂上的層析，如DEAE；層析聚焦(chromatofocusing)；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；和膠凝過濾，使用例如Sephadex G-75。所期望的純化程度依賴于GSHE的用途。在一些實施方案中，純化并不是必須的。
159在一些實施方案中，重組表達(dá)的GSHE來自木霉菌宿主。在其它實施方案中，木霉菌宿主表達(dá)異源多核苷酸，其編碼來自灰腐質(zhì)霉菌株的GSHE，尤其是灰腐質(zhì)霉高溫變種菌株的GSHE。在其它實施方案中，木霉菌表達(dá)重組的GSHE，其中異源多核苷酸編碼與SEQ ID NO3的序列具有至少50％序列同一性的GSHE。
160在一些實施方案中，木霉菌宿主表達(dá)異源多核苷酸，其編碼來自泡盛曲霉菌株的GSHE，尤其是泡盛曲霉河內(nèi)變種菌株的GSHE。在其它實施方案中，木霉菌表達(dá)重組的GSHE，其中異源多核苷酸編碼與SEQ ID NO6的序列具有至少50％序列同一性的GSHE。
組合物以及工藝條件-161不論GSHE是以不含細(xì)胞的提取物形式被供應(yīng)，還是在包括表達(dá)和分泌GSHE的真菌細(xì)胞的培養(yǎng)基(發(fā)酵液)中供應(yīng)，將顆粒淀粉底物——優(yōu)選地以漿狀物形式——與GSHE和α淀粉酶基本上同時(本文被稱作同時)接觸，從而水解顆粒淀粉，產(chǎn)生葡萄糖糖漿。顆粒淀粉的水解是一步驟(one-step)過程。
162GSHE可以被加入到包括α淀粉酶和顆粒淀粉底物的組合物中，加入量為大約0.01-10.0GSHE U/g淀粉干固體的漿狀物，該漿狀物被調(diào)節(jié)至10-55％干固體。在一些實施方案中，GSHE的加入量的范圍為大約0.01-5.0GSHE U/g；大約0.01-2.0GSHE U/g；大約0.01-1.5GSHE U/g；大約0.05-1.5GSHE U/g；大約0.1-5.0GSHEU/g；大約0.1-1.0GSHE U/g；大約0.25-2.5GSHE U/g；大約0.5-5.0GSHE U/g；大約0.5-1.0GSHE U/g這樣的溶液。而且在一些優(yōu)選的實施方案中，GSHE的加入量為大約0.05-1.5GSHE U/g這樣的溶液，也可為大約0.1-2.0GSHE U/g這樣的溶液，也可為大約0.1-1.0GSHE U/g這樣的溶液。
163在進(jìn)一步的實施方案中，GSHE基本上同時與α淀粉酶被加入到顆粒淀粉漿組合物中，其中漿狀物被調(diào)節(jié)到10％至大約55％ds，優(yōu)選地20-45％ds，以及25-45％ds。在某些實施方案中，構(gòu)成該組合物的α淀粉酶的加入量在每公噸淀粉大約0.01-1.0kg GZYME 997的范圍內(nèi)。
164在一個實施方案中，將顆粒淀粉底物與GSHE接觸，其中GSHE可以以無細(xì)胞的過濾物形式獲得(這樣，GSHE從培養(yǎng)基中分離出來)。在另一個實施方案中，將顆粒淀粉底物與GSHE接觸，其中GSHE可以以含有分泌的GSHE和真菌細(xì)胞的培養(yǎng)基形式獲得。優(yōu)選地，GSHE將由里氏木霉分泌，里氏木霉含有編碼多肽的異源多核苷酸，所述多肽具有顆粒淀粉水解活性，并且與SEQ ID NO3或SEQID NO6的序列具有至少90％、至少95％和至少98％序列同一性。
165本發(fā)明的方法在等于或低于底物的顆粒淀粉的膠凝溫度的溫度下進(jìn)行。在一些實施方案中，該方法在至少大約25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃的溫度下進(jìn)行。在其它實施方案中，該方法在低于大約65℃的溫度下進(jìn)行，也在低于大約60℃的溫度下進(jìn)行。在其它實施方案中，該方法在大約30℃到65℃之間的溫度下進(jìn)行；也在大約35℃到65℃之間；大約40℃到65℃之間；大約45℃到65℃之間；大約50℃到65℃之間的溫度下進(jìn)行。在本發(fā)明中使用的精確溫度依賴于具體的淀粉底物，進(jìn)一步地可能依賴于特定的植物品種。在一些實施方案中，當(dāng)玉米是顆粒淀粉底物時，溫度是大約55℃到65℃之間，更特別地在大約60℃到65℃之間。
166表2說明了對多種淀粉的一般性的淀粉膠凝化溫度范圍。該表遵從多個來源，這不意味著限制本發(fā)明，而是提供作為指導(dǎo)。
表2淀粉膠凝化的溫度范圍

(J.J.M Swinkels 32-38頁，STARCH CONVERSIONTECHNOLOGY，Van Beynum等人編著，(1985)MarcelDekker Inc.New York和The Alcohol Textbook 3rdED。A reference for the beverage，fuel and industrial alcoholindustries，Jacques等人編著，(1999)NottinghamUniversity Press，UK)
167實施本發(fā)明所述方法時的pH范圍在大約pH 3.0到pH 6.5的范圍；在pH 3.5到pH 6.5的范圍；pH 4.0到pH 6.5的范圍；pH 4.5到pH 6.0的范圍，這些范圍在這些方法中可被使用。pH范圍有些依賴于具體的酶，本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員將能確定進(jìn)行這些方法的最佳pH范圍，而不需要過多的實驗。在一些實施方案中，當(dāng)玉米是底物時，pH范圍是大約pH 4.5-pH 6.0，大約pH 5.0-pH 5.5。
168在一些實施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的顆粒淀粉干固體被轉(zhuǎn)化為葡萄糖糖漿的組分。在一些實施方案中，顆粒淀粉底物被完全水解。在某些實施方案中，至少90％的顆粒淀粉底物在24小時的時間期間內(nèi)被水解。在其它實施方案中，至少95％的顆粒淀粉底物在24小時的時間期間內(nèi)被水解。在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的右旋糖糖漿將是含有至少90％葡萄糖的大約32％至46％ds糖漿。
169在一些實施方案中，水解顆粒淀粉以產(chǎn)生葡萄糖糖漿所需要的時間期間為大約2-100小時。在一些實施方案中，該時間期間是大約5-100小時。在其它實施方案中，該時間期間是大約10-100小時。仍然在其它實施方案中，該時間期間是大約5-50小時。在其它實施方案中，該時間期間是至少大約10小時，但低于大約50小時。在優(yōu)選的實施方案中，該一步工藝將在2-100小時內(nèi)進(jìn)行，在一些實施方案中，該工藝將在5到50小時內(nèi)進(jìn)行。
170優(yōu)選地，溶解的組合物中的葡萄糖產(chǎn)率(總?cè)芙獾母晒腆w中的葡萄糖百分比)是至少大約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％和99.5％。更優(yōu)選地，該產(chǎn)率是至少大約95％，最優(yōu)選地，該產(chǎn)率是至少大約96％。
171本發(fā)明的組合物和方法所包括的組分的精確量依賴于所應(yīng)用的酶的組合，以及所加工的顆粒淀粉的類型。在一些實施方案中，α淀粉酶單位與GSHE單位的比(α淀粉酶∶GSHE)在15∶1到1∶15之間，在一些實施方案中，在10∶1到1∶10之間。在其它實施方案中，該比率在5∶1到1∶5之間，在進(jìn)一步的實施方案中，α淀粉酶∶GSHE將在4∶1到1∶4之間。在優(yōu)選的實施方案中，該比率將在大約2∶1到1∶4之間，最優(yōu)選地在大約2∶1到1∶2之間。
172本發(fā)明所包括的一步工藝可以包括加入進(jìn)一步的成分，而不降低顆粒淀粉水解的效果。這些進(jìn)一步的成分包括但不限于其它酶，如纖維素酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、半纖維素酶、木聚糖酶及其類似物。
173根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的葡萄糖可以通過本領(lǐng)域已知的方法從反應(yīng)混合物中分離。這些方法中的一些方法包括離心、傳統(tǒng)的過濾方法和優(yōu)選的膜分離方法。也可以使用超濾膜系統(tǒng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，葡萄糖糖漿使用分子量截留(MWCO)超濾膜，通過過濾來分離。這些膜在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的。在一些實施方案中，該膜可以是1,000到1,000,000的MWCO。在其它實施方案中，該分離膜可以是0.1-1.0微升型膜。
葡萄糖到期望的終端產(chǎn)物的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化-174在本發(fā)明所包括的方法中，葡萄糖糖漿是優(yōu)選的終端產(chǎn)物。然而，葡萄糖可以被進(jìn)一步純化，以便通過已知方法產(chǎn)生結(jié)晶右旋葡萄糖。
175葡萄糖也可以被轉(zhuǎn)化為其它期望的終端產(chǎn)物。葡萄糖到其它期望的終端產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化可以通過任何合適的方法實現(xiàn)，如酶方法或化學(xué)方法。在一個實施方案中，通過用能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為終端產(chǎn)物的微生物接觸根據(jù)本發(fā)明獲得的葡萄糖，通過葡萄糖的生物轉(zhuǎn)化實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。接觸步驟可以是連續(xù)步驟，其中本發(fā)明的方法產(chǎn)生的葡萄糖糖漿接著用微生物接觸，以產(chǎn)生終端產(chǎn)物，或者接觸步驟可以是同時的步驟，其中顆粒淀粉底物用GSHE和α淀粉酶以及能將通過酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的葡萄糖糖漿轉(zhuǎn)化為終端產(chǎn)物的微生物接觸。微生物可以是野生型、突變的或者重組的微生物。在一些實施方案中，期望的終端產(chǎn)物是果糖、抗壞血酸(ASA)中間產(chǎn)物，如葡萄糖酸酯、2-酮-D-葡萄糖酸酯、2，5-二酮-D-葡萄糖酸酯、2-酮-L-古洛糖酸酯、艾杜糖酸、異抗壞血酸和抗壞血酸；乙醇、1，3-丙二醇、谷氨酸一鈉、氨基酸、糖醇、有機(jī)酸和靛藍(lán)。
176當(dāng)果糖是期望的終端產(chǎn)物時，根據(jù)本發(fā)明獲得的葡萄糖糖漿可以通過葡萄糖異構(gòu)酶被酶促轉(zhuǎn)化為果糖糖漿。在一些實施方案中，葡萄糖異構(gòu)酶被固定化。預(yù)期的葡萄糖異構(gòu)酶包括那些可商購的酶，如G ZYMETMG993液體和GENSWEETTM(Genencor International，Inc.)和SWEETZYME T(Novozyme)。(例如參見美國專利3,939,041和美國專利4,687,742)。
177當(dāng)ASA中間產(chǎn)物和ASA是期望的終端產(chǎn)物時，根據(jù)本發(fā)明獲得的葡萄糖糖漿可以被酶促生物轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸酯，使用例如葡萄糖脫氫酶(或者葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶。葡萄糖酸酯可以通過DKG還原酶被氧化為2，5-二酮-D-葡萄糖酸酯(DKG)。DKG可以通過KLG還原酶還原為2-酮-L-古洛糖酸(KLG)。KLG然后可以被轉(zhuǎn)化為ASA。將葡萄糖轉(zhuǎn)化為ASA和ASA中間產(chǎn)物的方法是熟知的(例如參見美國專利4,945,052，美國專利5,008,193；美國專利5,817,490和美國專利6,358,715)。
178當(dāng)1，3-丙二醇是期望的終端產(chǎn)物時，根據(jù)本發(fā)明獲得的葡萄糖可以與大腸桿菌或其它重組的微生物接觸(例如參見美國專利6,013,494，美國專利5,356,812)。
179當(dāng)乙醇是期望的終端產(chǎn)物時，葡萄糖可以后續(xù)地或者同時與產(chǎn)乙醇微生物如釀酒酵母接觸，以得到乙醇。(例如參見美國專利4,316,956)?？梢栽诒景l(fā)明的方法中使用的產(chǎn)乙醇微生物的進(jìn)一步實例，是那些表達(dá)醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的產(chǎn)乙醇微生物例如Zymomonas mobillis(例如參見美國專利5,028,539；5,424,202；5,487,989和5,514,583)。一旦用酵母完成發(fā)酵，就可以回收乙醇，例如通過蒸餾，并且應(yīng)用于可飲用產(chǎn)品、燃料和工業(yè)乙醇產(chǎn)品。發(fā)酵的副產(chǎn)物包括液體和固體物質(zhì)，其可以被分離并進(jìn)一步使用。例如，回收的固體材料可以被用作動物飼料，所述固體材料例如干酒糟(DDG)和DDS與液體副產(chǎn)物的混合物，這形成了帶有可溶物的干酒糟(DDGS)。在發(fā)酵和乙醇生產(chǎn)過程中應(yīng)用酵母產(chǎn)生乙醇，在THEALCOHOL TEXTBOOK，A REFERENCE FOR THE BEVERAGE，F(xiàn)UEL ANDINDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES，第3版，K.A.Jacques等人編著，1999，Nottingham University Press，UK中有進(jìn)一步的討論。
180在本發(fā)明的一些實施方案中，當(dāng)葡萄糖糖漿通過例如離心或過濾從反應(yīng)混合物中分離時，正如上面所提及的，剩余的組分將包括殘余淀粉。殘余淀粉副產(chǎn)物可以在多種應(yīng)用中使用。例如，殘余淀粉可以被再利用，用作根據(jù)本發(fā)明的方法中的組分；殘余淀粉可以被用作進(jìn)一步發(fā)酵中的碳原料；殘余淀粉可以被用在傳統(tǒng)的淀粉水解工藝中；殘余淀粉可以被用作食物制劑的成分。本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案包括，在低于顆粒淀粉膠凝的溫度，用GSHE和α淀粉酶同時接觸顆粒淀粉底物，以水解顆粒淀粉，得到葡萄糖糖漿，從反應(yīng)混合物分離葡萄糖糖漿，得到葡萄糖糖漿組分和包括殘余淀粉的副產(chǎn)物組分。
181在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)殘余淀粉在循環(huán)步驟中被再利用并且在本發(fā)明所包括的方法中使用時，殘余淀粉將在低于顆粒淀粉底物的膠凝化溫度的溫度與包括GSHE和α淀粉酶的組合物同時接觸。殘余淀粉組分可以包括通過分離膜而被保留下來的酶和/或最新加入到反應(yīng)器中的GSHE和α淀粉酶。在一些實施方案中，循環(huán)步驟聯(lián)合同時的接觸步驟可以被重復(fù)多次，進(jìn)一步地可以在連續(xù)的循環(huán)條件下發(fā)生，其中葡萄糖糖漿通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法分離。反應(yīng)器或容器中各種組分的接觸時間將與上面列出的時間相同，即2-100小時。在一些優(yōu)選的實施方案中，駐留時間將在5-50小時之間。
182在循環(huán)步驟實施方案中，殘余淀粉可以被循環(huán)，以獲得葡萄糖糖漿。在一個非限定性實例中，顆粒淀粉漿體(即，具有38-42％ds的玉米淀粉漿狀物)可以用腐質(zhì)霉GSHE(即1.0GSHE U/g)和SPEZYME乙基(即0.6AU/g)在大約58-62℃的溫度和pH 5.0-6.0下水解20-24小時，其中至少55％的玉米淀粉被水解，產(chǎn)生了具有至少90％葡萄糖的葡萄糖糖漿。殘余淀粉可以被回收，被重懸，與第二輪GSHE和α淀粉酶組合。在第二輪中，大約90％的淀粉被水解，產(chǎn)生了至少90％葡萄糖。葡萄糖糖漿然后可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法蒸發(fā)，例如真空蒸發(fā)，然后被用作葡萄糖供給料。
183在循環(huán)步驟實施方案中，殘余淀粉可以被再利用，以獲得除葡萄糖之外的終端產(chǎn)物。例如，當(dāng)終端產(chǎn)物是乙醇時，顆粒淀粉底物與GSHE、α淀粉酶和產(chǎn)乙醇微生物或者獨(dú)立地并且連續(xù)地，或者同時地接觸，以水解顆粒淀粉并且產(chǎn)生乙醇，乙醇可以通過蒸餾回收，包括含有殘余淀粉的固體和液體材料的剩余材料可以被再利用，與GSHE和α淀粉酶在進(jìn)一步的步驟中使用，從而再利用在連續(xù)的循環(huán)條件下發(fā)生。
實驗184在隨后的公開和實驗部分，使用了如下縮寫rH-GSHE(在里氏木霉中表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE)；wt％(重量百分比)；℃(攝氏溫度)；rpm(每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù))；H2O(水)；dH2O(去離子水)；bp(堿基對)；kb(千堿基對)；kD(千道爾頓)；gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；μl(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；μm(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；μM(微摩爾)；U(單位)；V(伏)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時)；PAGE(聚丙烯酰胺膠凝電泳)；Di(去離子的)；鄰苯二甲酸緩沖液(水中的鄰苯二甲酸鈉，20mM，pH 5.0)；Cerestar(Cerestar，Inc.，a Cargill Inc.，Minneapolis，MN)；AVICELL(FMC公司)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)；w/v(重量與體積之比)；v/v(體積與體積之比)；Genencor(GenencorInternational，Inc.，Palo Alto，CA)；Shin Nihon(Shin Nihon，Japan)。
一般方法185淀粉底物—純化的和/或精制的玉米淀粉、小麥淀粉和木薯淀粉被用于下面提供的實施例中。
寡糖分析—寡糖反應(yīng)產(chǎn)物的組成通過高壓液相色譜法測定(Beckman System Gold32 Karat Fullerton，California，USA)，配備有HPLC柱(Rezex 8 u8％H，單糖)，保持在50℃，裝配有折射率(RI)檢測器(ERC-7515A，RI Detector，The AnspecCompany，Inc.)。稀釋的硫酸(0.01N)以每分鐘0.6ml的流速被用作流動相。20微升的4.0％溶液被注射到柱子上。柱子基于糖的分子量進(jìn)行分離。例如DP1表示單糖，如葡萄糖；DP2表示二糖，如麥芽糖；DP3表示三糖，如麥芽三糖，“DP4+”指定為聚合度(DP)為4或更高的寡糖。
固體的相對溶解—用傳統(tǒng)的低溫噴射蒸煮(jet cooking)方法來溶解淀粉(USP3,912,590)。在淀粉與水比率的限定參數(shù)下，測定的BRIX被視作淀粉的100％溶解。在典型的噴射蒸煮方法中，在350克水中懸浮150克淀粉產(chǎn)生30％的淀粉漿狀物。然后用10％NaOH將pH調(diào)節(jié)到pH 5.8。熱穩(wěn)定的α淀粉酶，SPEZYME FRED(Genencor International Inc.)以0.4Kg/MT，ds加入，在維持于105℃的噴射蒸煮器中加熱8分鐘。膠凝化的淀粉于95℃進(jìn)一步水解90分鐘。取出等份水解產(chǎn)物，并且離心。將清澈的上清液用于測量BRIX(ABBE Refractometer，American OpticalCorporation，Scientific Instrument Division，Buffalo，New York)。表3中給出了在30％ds的不同淀粉底物的100％溶解淀粉的BRIX，這些BRIX值用于計算不同處理條件下淀粉的相對溶解百分比?？晒┻x擇地，不同條件下100％溶解的BRIX通過在95℃用10微升SPEZYME FRED(Genencor International Inc，)與5ml的等份樣品溫育5分鐘來確定。將高溫處理的樣品于85℃保持2小時。通過離心分離不溶解的固體，測量清澈上清液的BRIX。
表3酶噴射蒸煮的淀粉底物在30％漿狀物時的BRIX

實施例186提供下述實施例，以便證明并且進(jìn)一步示意性說明本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案和方面，不應(yīng)該認(rèn)為是限定其范圍。實際上，應(yīng)該預(yù)期到這些教導(dǎo)將在進(jìn)一步優(yōu)化此處描述的工藝系統(tǒng)中有用。
實施例187里氏木霉中灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE基因的表達(dá)A.灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE基因的克隆從冷凍的Scytalidium thermophilum(ATCC 16453，anamorph，灰腐質(zhì)霉高溫變種)菌絲體提取基因組DNA(SEQ ID NO1)。用干冰在咖啡豆研磨器中研磨冷凍的菌絲體，用EasyDNA方法(Invitrogen)提取DNA。在標(biāo)準(zhǔn)方法中加入額外的氯仿/苯酚/異戊基醇提取物。基于NCBI數(shù)據(jù)庫登記號#M89475序列，設(shè)計PCR引物。正向引物含有一個用于定向克隆到pENTR/D載體(Invitrogen)中的基序。
188RSH003f引物的序列是CAACATGCATACCTTCTCCAAGCTCCTC(SEQ ID NO7)，RSH004r引物的序列是TTAACGCCACGAATCATTCA CCGTC(SEQ ID NO.8)。
189根據(jù)Invitrogen Gateway系統(tǒng)方法，將PCR產(chǎn)物克隆到pENTR/D中。然后將載體轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)Top 10大腸桿菌(Invitrogen)中，卡那霉素選擇。來自幾個克隆的質(zhì)粒DNA被限制性消化，以確認(rèn)正確尺寸的插入物。隨后從幾個克隆對gla1插入物進(jìn)行測序(Sequetech，Mountain View，CA)。來自一個克隆的質(zhì)粒DNA，pENTR/D_N13，被加入到帶有pTrex3g/amdS目的載體DNA的LR克隆酶反應(yīng)(Invitrogen Gateway系統(tǒng))中。在LR克隆酶反應(yīng)中，通過重組，目的載體的CmR和ccdB基因被來自pENTR/D載體的灰腐質(zhì)霉gla1代替。該重組在目的載體的cbh1啟動子和終止子之間定向插入gla1。48bp和50bp的重組位點(diǎn)序列分別保持在gla1的上游和下游。將等份的LR克隆酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)Top 10大腸桿菌中，過夜培養(yǎng)，用羧芐青霉素選擇。將來自幾個克隆的質(zhì)粒DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼赶源_認(rèn)正確的插入物大小。用Xba1消化來自克隆的質(zhì)粒DNA，pTrex3g_N13(參見圖3和4)，以釋放包含cbh1啟動子gla1∶cbh1終止子amdS的表達(dá)盒子。該6.6kb盒子使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過瓊脂糖凝膠提取方法進(jìn)行純化，并轉(zhuǎn)化到源自可公開獲得的菌株QM6a的里氏木霉菌株中，正如下面進(jìn)一步描述的。
190通過Sequetech，Mountain View，CA對盒子進(jìn)行測序，圖1中描述了GSHE的DNA(SEQ ID NO1)，圖2中描述了氨基酸序列(SEQ ID NO2和3)。
B.里氏木霉的轉(zhuǎn)化-191將大約2cm2的形成孢子的菌絲體(在PDA平板上在30℃生長5天)平板接種到置于250ml的、帶有4個擋板的振蕩燒瓶中的50mM YEG(5g/L酵母提取物加上20g/L葡萄糖)培養(yǎng)液中，37℃在200rpm下培養(yǎng)16-20小時。通過將液體體積轉(zhuǎn)移到50ml錐形管中并且于2500rpm旋轉(zhuǎn)離心10分鐘，回收菌絲體。棄去上清液。將菌絲體沉淀物轉(zhuǎn)移到250ml的、0.22微米CA Corning過濾瓶中，CACorning過濾瓶中含有40ml的、經(jīng)濾過的β-D-葡聚糖酶溶液，30℃、200rpm下培養(yǎng)2小時，以便產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。
192通過用無菌miracloth進(jìn)行過濾，原生質(zhì)體被收獲到50ml錐形管中。通過以2000rpm旋轉(zhuǎn)離心5分鐘將它們沉淀，并抽吸掉液體。用50ml的1.2M山梨糖醇將原生質(zhì)體沉淀物洗滌一次，旋轉(zhuǎn)沉淀下來，抽吸掉液體，用25ml的山梨糖醇/CaCl2洗滌。對原生質(zhì)體計數(shù)，然后以2000rpm 5分鐘沉淀，倒盡上清液，將原生質(zhì)體沉淀物重懸在足夠量的山梨糖醇/CaCl2中，以獲得每毫升含1.25×108個原生質(zhì)體的原生質(zhì)體濃度，從而產(chǎn)生原生質(zhì)體溶液。
193將最多20μg的表達(dá)載體DNA(體積不超過20μl)的等份物放置到15ml錐形管中，將管子置于冰上。然后在每份轉(zhuǎn)化等份物中加入200μl的原生質(zhì)體懸液，以及50μl PEG溶液。輕輕地混合管子，冰上溫育20分鐘。將PEG溶液(2ml)加入到轉(zhuǎn)化等份物管子中，室溫下將這些管子溫育5分鐘。加入山梨糖醇/CaCl2溶液(4ml)至管子中(得到的總體積為6.2ml)。將轉(zhuǎn)化混合物分為3個等份，每份含有大約2ml。通過將這三份等份物中的每一份加入到含有融化的頂層瓊脂的三個管子中(通過維持在50℃而保持融化狀態(tài))，形成覆蓋混合物(overlay mixture)；并將該覆蓋混合物傾倒到轉(zhuǎn)化平板上。然后在30℃將轉(zhuǎn)化平板培養(yǎng)4到7天。
194實施轉(zhuǎn)化，用amdS進(jìn)行選擇。對于轉(zhuǎn)化，使用乙酰胺/山梨糖醇平板和頂層瓊脂。制備頂層瓊脂的配方是與平板一樣的山梨糖醇/乙酰胺瓊脂配方，除了使用低熔點(diǎn)瓊脂糖代替Noble瓊脂。通過將分離出的克隆轉(zhuǎn)移到含有乙酰胺的新鮮選擇性培養(yǎng)基(即，山梨糖醇/乙酰胺瓊脂，沒有山梨糖醇)中，來純化轉(zhuǎn)化子。
195關(guān)于實施例，如下所述地制備溶液。
1)在1.2M山梨糖醇中配制40ml β-D-葡聚糖酶溶液，含有600mg β-D-葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，San Mateo，CA)和400mg MgSO4·7H2O。
2)200ml PEG混合物，含有50g PEG 4000(BDH Laboratory Supplies Poole，England)和1.47g CaCl2·2H2O，配制在dH2O中。
3)山梨糖醇/CaCl2，含有1.2M山梨糖醇和50mM CaCl2。
4)乙酰胺/山梨糖醇瓊脂
第I部分-0.6g乙酰胺(Aldrich，99％純度.)，1.68g CsCl，20g葡萄糖，20gKH2PO4，0.6g MgSO4·7H2O，0.6g CaCl2·2H2O，1ml 1000x鹽(見下文)，調(diào)節(jié)到pH 5.5，用dH2O補(bǔ)足體積(300mls)，無菌過濾。
第II部分-20g Noble瓊脂和218g山梨糖醇，用dH2O補(bǔ)足體積(700mls)，高壓滅菌。
將第II部分加入到第I部分，至終體積為1L。
5)1000x鹽-將5g FeSO4·7H2O，1.6g MnSO4·H2O，1.4g ZnSO4·7H2O，1g CoCl2·6H2O混合，用dH2O將體積補(bǔ)足到1L。將溶液無菌過濾。
196C.用灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE基因轉(zhuǎn)化的里氏木霉的發(fā)酵197一般地，遵照如Foreman等人所描述的發(fā)酵方法(Foreman等人(2003)J.Biol.Chem 27831988-31997)。更具體地，對圖5中所示的每一菌株進(jìn)行雙份發(fā)酵。用1.5ml冷凍的孢子懸液接種含有5％葡萄糖的0.8L的Vogels基本培養(yǎng)基(Davis等人(1997)Methods in Enzymology 17A，第79-143頁；和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORAGNISM，Oxford UniversityPress，(2000))。48小時后，將每一培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到14L Biolafitte發(fā)酵罐中的6.2L的相同培養(yǎng)基中。發(fā)酵罐在25℃、750 RPM和每分鐘8個標(biāo)準(zhǔn)升的空氣流中運(yùn)行。在初始葡萄糖消耗完畢后1小時，開始進(jìn)行25％(w/w)的乳糖供給，以碳限制方式供給，以阻止乳糖累積。用葡萄糖氧化酶測定試劑盒或者葡萄糖己糖激酶測定試劑盒(Instrumentation Laboratory Co.，Lexington，MA)分別監(jiān)控葡萄糖和乳糖的濃度，其中β-半乳糖苷酶被加入以分解乳糖。以規(guī)律的時間間隔獲得樣品，以便監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程。收集的樣品用International Equipment Company(Needham Heights，MA)的臨床離心機(jī)在50ml離心管中以3/4速率旋轉(zhuǎn)離心。
198樣品上清液在4-12％的BIS-TRIS SDS-PAGE凝膠上跑膠，在還原條件下采用MOPS(嗎啉代丙烷磺酸)SDS跑膠緩沖液和LDS樣品緩沖液進(jìn)行。結(jié)果被提供在圖5中。泳道3、4和5說明了在不同時間的68kD rGSHE條帶。
199D.測定來自轉(zhuǎn)化的里氏木霉克隆的GSHE活性200酶活性—GSHE活性被確定為將0.1M醋酸鹽緩沖液，pH 4.5中的5ml的10％顆粒玉米淀粉與酶制劑等份在50℃溫育，在這個過程中每分鐘(min)釋放出的還原糖(以葡萄糖當(dāng)量測量)的毫克數(shù)(mg)。一個單位的GSHE被定義為在測定條件下，每分鐘釋放1.0mg的還原糖。
201來自灰腐質(zhì)霉高溫變種的天然GSHE(nGSHE)和從里氏木霉產(chǎn)生的重組體GSHE，是通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化的，其中采用使用了苯基-瓊脂糖凝膠的疏水相互作用色譜(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，隨后采用使用了SP-瓊脂糖凝膠的離子交換色譜法(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。由里氏木霉克隆最初表達(dá)的重組GSHE包括兩個蛋白峰組分，以大約相等的濃度存在。這些峰被標(biāo)記為rGSHE1和rGSHE2。這兩個峰值在質(zhì)量上相差1500D，且相差0.3個pH單位，正如通過基質(zhì)輔助激光解吸附法和離子化法(MALDI-TOF)所測量的，這是在voyageur質(zhì)譜儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)和等電聚焦凝膠(SERVAElectrophoresis，GmbH，Heidelberg，Germany)上根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行的。rGSHE1和rGSHE2都具有相同的比活性，如通過生淀粉水解測定和蛋白質(zhì)測定來測量的，所述測定使用了MicroBCA蛋白測定試劑盒(Pierce，Rockford，IL)和百分溶液消光系數(shù)(A2800.1％＝1.963)。在一段時間后，在初始的rGSHE表達(dá)后的大約72小時時進(jìn)行測量，只有一種形式的rGSHE被呈現(xiàn)(rGSHE3)(參見表4)。
表4

202GSHEs的％碳水化合物(CHO)是通過使用4N三氟乙酸在100℃酸水解5小時來確定的，測量值由使用對羥基苯甲酸酰肼時釋放的還原糖獲得。
203當(dāng)最初被表達(dá)時，rGSHE1和rGSHE2的糖基化是總碳水化合物的2.70％。然而，在72小時后，在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的rGSHE3的糖基化水平是0.57％總CHO。天然GSHE的糖基化水平是1.12％。
E.來自灰腐質(zhì)霉高溫變種的天然GSHE和里氏木霉中重組表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE的比較(1)在pH 3到7確定pH穩(wěn)定性204用pH 4.5的20mM乙酸鹽緩沖液，將上面描述的重組產(chǎn)生的GSHE的收集樣品以及天然GSHE的樣品稀釋到相等的蛋白質(zhì)濃度。然后，在100mM檸檬酸鹽/NaOH緩沖液中，在50℃在pH 3到7的pH水平，進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。
205然后，將1.0ml的反應(yīng)物加入到樣品管中，樣品管中含有處于100mM乙酸鹽，pH 4.5之中的5ml 10％玉米淀粉(Cargill Foods，Minneapolis，MN)。在50℃將管子振蕩20分鐘。然后加入0.5ml的2.0％NaOH。旋轉(zhuǎn)離心管子，使用二硝基水楊酸(Dinitro Salicylic acid，DNS)測定法測定0.5ml上清液的還原糖(Goto等人，(1994)見上文)。
206測定結(jié)果描述在圖8A中。重組產(chǎn)生的GSHE在pH 3.5表現(xiàn)出大約80％的殘余活性。作為比較，相應(yīng)的天然GSHE表現(xiàn)出僅僅大約20％的殘余活性。在pH4.0，重組產(chǎn)生的GSHE和天然GSHE都表現(xiàn)出大約82％的殘余活性；在pH 5.5，兩種酶表現(xiàn)出大約90到100％之間的殘余活性。
207也在pH 7.5到10.5，使用上面描述的方法測量穩(wěn)定性。然而，緩沖液是100mM的硼酸/NaOH緩沖液。正如圖8B中所表現(xiàn)的，在pH 7.5，兩種酶表現(xiàn)出大約100％的殘余活性。在pH 8.5，重組產(chǎn)生的GSHE表現(xiàn)出大約82％的殘余活性，天然GSHE表現(xiàn)出大約90％的殘余活性。在pH 9.5，重組產(chǎn)生的GSHE的％殘余活性實質(zhì)性地低于天然GSHE(分別地，10％相對于72％)。
(2)作為溫度的函數(shù)的活性曲線208在pH 5.75，確定溫度穩(wěn)定性。使用與上面針對pH穩(wěn)定性研究所描述的程序基本上相同的程序，將酶樣品在100mM乙酸鹽緩沖液中稀釋到相等的蛋白質(zhì)濃度，然后將1.0ml的稀釋酶在溫度為40℃、50℃、60℃和70℃的水浴中暴露10分鐘，按照上面在pH穩(wěn)定性研究中的描述進(jìn)行測定。結(jié)果如表5中所示。
表5

％殘余活性是指，參考于pH 4.0時的100％的差異百分?jǐn)?shù)209重組產(chǎn)生的GSHE的活性關(guān)于溫度的函數(shù)曲線，類似于相應(yīng)的天然GSHE的曲線。
(3)通過nGSHE和rGSHE進(jìn)行的顆粒玉米淀粉的水解210將來自灰腐質(zhì)霉高溫變種的天然GSHE(nGSHE)和里氏木霉中重組表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE(rGSHE)，在pH 4.5的乙酸鹽緩沖液中稀釋到相等的蛋白質(zhì)濃度。將lml的稀釋物加入到處于20mM pH 4.5乙酸鹽緩沖液中的10％玉米淀粉(Cargill Foods，Minneapolis，MN)漿狀物中，在50℃以350rpm振蕩。以指定的時間間隔，取出100μL的漿狀物，加入到10μL的2％NaOH中。旋轉(zhuǎn)離心樣品，使用葡萄糖氧化酶試劑，用Monarch臨床分析儀器(Instrumentation Laboratory，Lexington，MA)測定上清液的葡萄糖(mg葡萄糖/mg蛋白)。正如圖9中所示，與nGSHE相比，rGSHE的玉米淀粉水解略微低一些。
實施例211里氏木霉中泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE基因的表達(dá)
A.克隆泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE基因212根據(jù)實施例1中描述的方法，從泡盛曲霉河內(nèi)變種菌株的冷凍菌絲體中提取基因組DNA?；谂菔⑶购觾?nèi)變種葡糖淀粉酶GAI的公開序列(Hayashida等人(1989)Agric.Biol.Chem.53923-929)，設(shè)計PCR引物序列。這一GAI是GSHE。使用了下述引物具有序列CAC CAT GTC GTT CCG ATC TCT TCT C(SEQ IDNO9)的RSH10f引物，其包括Gateway(Invitrogen)定向克隆基序CACC；和具有序列CTA CCG CCA GGT GTC GGT CAC(SEQ ID NO10)的RSH11r引物。
213圖6提供了DNA序列(SEQ ID NO4)。所編碼的GSHE多肽序列，包括信號肽，提供在圖7A中(SEQ ID NO5)，成熟蛋白質(zhì)序列提供在圖7B中(SEQID NO6)。
214根據(jù)Gateway系統(tǒng)方法，2.16kb PCR產(chǎn)物被凝膠純化(Gel Purification試劑盒，Qiagen)，并克隆進(jìn)pENTR/D中。然后將載體轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)Top 10大腸桿菌(Invitrogen)中，卡那霉素選擇。來自幾個克隆的質(zhì)粒DNA被限制性消化，以確認(rèn)正確大小的插入物。來自幾個克隆的GAI基因插入物(SEQ ID NO4)被測序(Sequetech，Mountain View，CA)。來自一個克隆的質(zhì)粒DNA，pENTR/D_Ak33xx#1，被加入到帶有pTrex3g/amdS目的載體DNA的LR克隆酶反應(yīng)(Invitrogen Gateway system)中。在LR克隆酶反應(yīng)中發(fā)生的重組，將目的載體的CmR和ccdB基因替換為來自pENTR/D載體的河內(nèi)曲霉(A.kawachi)GAI。該重組將GAI定向插入到目的載體的cbh1啟動子和終止子之間。48bp和50bp的AttB重組位點(diǎn)序列分別保留在葡糖淀粉酶的上游和下游。參考圖3，其中灰腐質(zhì)霉gla1已經(jīng)在該實施例被河內(nèi)曲霉GAI替換。將2微升的LR克隆酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入化學(xué)感受態(tài)Top 10大腸桿菌中，過夜培養(yǎng)，用羧芐青霉素選擇。用XbaI消化來自幾個克隆的質(zhì)粒DNA，以確認(rèn)插入物的大小。來自克隆的質(zhì)粒DNA，pTrex3g_Akxx#3，用XbaI消化，以釋放包括cbh1啟動子GAIcbh1終止子amdS的表達(dá)盒子。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過瓊脂糖提取，純化該6.7kb表達(dá)盒子，并且將其轉(zhuǎn)化到源自可公開獲得的菌株QM6a的里氏木霉菌株中。
B.用泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE基因轉(zhuǎn)化里氏木霉215將里氏木霉孢子懸液涂布到MABA轉(zhuǎn)化平板的中心～6cm直徑(150μl的5×107-5×108孢子/ml懸液)。然后，將平板在生物學(xué)通風(fēng)櫥(biological hood)中風(fēng)干。將stopping screen(BioRad 165-2336)和macrocarrier holder(BioRad 1652322)浸入到70％乙醇中，并風(fēng)干。將DriRite干燥劑放置到小的培養(yǎng)皿中(6cm Pyrex)，用Whatman濾紙覆蓋。將含有macrocarrier(BioRad 165-2335)的macrocarrier holder平放在濾紙上面，代替培養(yǎng)皿的蓋子。
216通過在微量離心管中加入60mg鎢M-10顆粒(microcarrier，0.7微米，Biorad#1652266)，制備鎢顆粒懸液。加入1ml乙醇(100％)。將鎢在乙醇溶液中渦旋振蕩，允許其浸泡15分鐘。以最大速度將微量離心管進(jìn)行短暫離心，以使鎢發(fā)生沉淀。傾倒出乙醇，用無菌蒸餾水洗滌三次。在第三次水洗滌被倒出之后，將鎢重新懸浮在1ml的無菌50％甘油中。每兩周一次，制備新鮮的鎢。
217對于每一次轉(zhuǎn)化，通過將25μl的懸浮鎢加入到1.5ml微量離心管中，制備轉(zhuǎn)化反應(yīng)物。隨后，按次序加入0.5-5μl DNA(0.2-1μg/μl)，25μl 2.5M CaCl2，10μl0.1M亞精胺。將反應(yīng)物連續(xù)地渦旋振蕩5-10分鐘，使鎢保持懸浮。然后，短暫地微量離心(microfuge)微量離心管，并且倒空液體。用200μl的70％乙醇洗滌鎢沉淀，短暫地微量離心，以形成沉淀，并倒出液體。用200μl的100％乙醇洗滌沉淀物，短暫微量離心以發(fā)生沉淀，并倒出液體。通過在24μl 100％乙醇中進(jìn)行吹打，將鎢沉淀重新懸浮。將微量離心管放置到超聲波水浴中，時間15秒；將8μl等份試樣轉(zhuǎn)移到干燥的macrocarriers的中心。讓macrocarriers在干燥的培養(yǎng)皿干燥。
218將氦罐(He tank)打開到1500psi。1100psi rupture discs(BioRad 165-2329)被用于Model PDS-1000/氦生物彈射顆粒傳送系統(tǒng)(Model PDS-1000/He BiolisticParticle Delivery System(BioRad))。當(dāng)鎢溶液干時，將stopping screen和macrocarrierholder插入到PDS-1000中。MABA平板，其含有靶里氏木霉孢子，被放置到stoppingscreen下面6cm處。將29英寸Hg柱的真空施加到該腔上，并且予以保持。發(fā)射氦生物彈射顆粒傳送系統(tǒng)。排空該腔，取出MABA平板，在28℃溫育5-7天。
219關(guān)于實施例2，如下地制備溶液。

pH到4.5，0.2微米過濾除菌；置于50℃烤箱中加熱，加入到部分I中，混合，倒平板

0.2微米過濾除菌220依照如上在實施例1中針對灰腐質(zhì)霉高溫變種的表達(dá)所進(jìn)行的描述，確定rGSHE的表達(dá)(在里氏木霉中表達(dá)的泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE)。表達(dá)水平被確定大于1g/L(數(shù)據(jù)沒有示出)。圖10提供了SDS-PAGE凝膠結(jié)果，說明了里氏木霉宿主中泡盛曲霉河內(nèi)變種GSHE的表達(dá)情況。
實施例221通過α淀粉酶進(jìn)行的不同顆粒淀粉底物的溶解和水解。
222在典型的實驗中，將150克顆粒淀粉懸浮在350克的蒸餾水中。在混合后，用6N NaOH將pH調(diào)節(jié)到pH 5.5。將α淀粉酶(GZYME G997，以1.0kg/MT淀粉，ds的量使用)加入到淀粉漿狀物中，在維持在60℃的水浴中溫育，同時進(jìn)行不斷的攪拌。在不同的時間點(diǎn)取出樣品，測量Brix。使用HPLC，在24小時時取出的樣品被用來確定糖組成(表6)。
表6

223表6中所示的結(jié)果表明在顆粒淀粉底物的溶解上，存在顯著性差異。小麥具有最高的溶解固體百分?jǐn)?shù)，玉米具有最低百分?jǐn)?shù)。24小時后，在糖組成上沒有觀察到顯著性差異。
實施例4α淀粉酶(G ZYME G 997)和rH-GSHE所致的顆粒淀粉底物的溶解和水解224在典型的實驗中，將350g水分別地加入到150g的顆粒玉米淀粉、顆粒小麥淀粉和顆粒木薯淀粉中的每一種中，使用6N NaOH將pH調(diào)節(jié)到pH 5.5。將漿狀物保持在水浴中，水浴保持在60℃，同時連續(xù)地攪拌以便均勻混合。在溫度穩(wěn)定后，將α淀粉酶如GZyme G 997(0.1Kgs/MT淀粉ds)和rH-GSHE(1.0GSHE單位/克淀粉ds)加入到每一種淀粉漿狀物中，繼續(xù)溫育。在不同的時間取出樣品，離心，檢查Brix。分析24小時樣品的糖組成。通過與噴射蒸煮(jet cooking)工藝的Brix進(jìn)行比較，計算顆粒淀粉的相對溶解，參考表7。
表7

225與目前的高溫噴射蒸煮工藝相比，在溫和條件下，G Zyme G 997和rH-GSHE的聯(lián)合作用導(dǎo)致顆粒淀粉底物的幾乎完全的溶解。24小時樣品的分析顯示葡萄糖產(chǎn)率高于96.5％。
實施例226通過具有顆粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶進(jìn)行的顆粒玉米淀粉的溶解和水解。
227將來自黑曲霉(OPTIDEX L-400和G Zyme G 990 4X，來自GenencorInternational Inc)和雪白根霉(Rhizopus niveus)(CU.CONC.，來自Shin NihonChemicals，Japan)的表現(xiàn)出顆粒淀粉水解活性的可商購獲得的葡糖淀粉酶，與上面實施例1中所描述的rH-GSHE進(jìn)行比較。使用上面描述的測定法，測量這些產(chǎn)品的顆粒淀粉水解活性。
表8

228在一個典型的實驗中，處于蒸餾水中的30％顆粒玉米淀粉漿狀物(350g蒸餾水中有150克淀粉)被制備，使用6N NaOH將pH調(diào)節(jié)到pH 5.5。G Zyme G997以0.1kg/MT淀粉ds的量加入，將淀粉漿狀物保持在維持于60℃的水浴中。向含有G Zyme G 997的每種淀粉漿狀物中，以相等劑量加入不同的葡糖淀粉酶，即1.5個GSHE單位/克淀粉，ds；在60℃溫育。在不同的時間取出等份試樣，并離心。將清澈的上清液用于測量Brix。通過HPLC分析溫育了2、6、22.5和49小時的樣品的總糖組成，結(jié)果如表9所示。
表9


葡糖淀粉酶以1.5GSHEU/g的劑量加入到具有0.1kG/MT ds的α淀粉酶的起始漿狀物中。
實施例229在用α淀粉酶(G Zyme G 997)和rH-GSHE溫育的過程中，pH對顆粒玉米淀粉(35％漿狀物)的溶解的影響.
230在一個典型的實驗中，372g水加入到178g玉米淀粉中。充分?jǐn)嚢铦{狀物以便混勻，使用6N NaOH將漿狀物的pH調(diào)節(jié)到pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0。然后將樣品保持在維持于60℃的水浴中。在溫度平衡后，將Zyme G997以0.1kg/MT淀粉的量和rH-GSHE如實施例1中所描述地(1.0 GSHE單位/g淀粉)加入到漿狀物中。在溫育過程中，連續(xù)地攪拌漿狀物，1小時后取出樣品，測量brix(表10)。
表10

231最大溶解發(fā)生在pH 5.0和pH 5.6。在60℃時顆粒玉米淀粉溶解性的顯著性降低發(fā)生在低于pH 5.0和pH 5.5時，這表明酶的活性較低或者失活。
實施例232用α淀粉酶和rH-GSHE溫育的過程中，溫度對顆粒玉米淀粉(32％漿狀物)溶解的影響233在一個典型的實驗中，372g水加入到178g玉米淀粉中。充分?jǐn)嚢铦{狀物以便混勻，使用6N NaOH將漿狀物的pH調(diào)節(jié)到pH 5.5。然后將漿狀物保存在維持于55℃、60℃和65℃的水浴中。在溫度平衡后，將Zyme G997以0.1kgs/MT淀粉的量和rH-GSHE如實施例1中所述地(1.0GSHE單位/g淀粉)加入。在溫育過程中，連續(xù)地攪拌漿狀物，1小時后測量brix(表11)。
表11

234在存在G Zyme G 997和rH-GSHE的情況下，顆粒玉米淀粉的溶解度隨著溫度的升高而增加。然而，高于65℃時，對溶解的碳水化合物進(jìn)行的HPLC分析表明rH-GSHE發(fā)生失活，這是以較低水平的葡萄糖含量為證據(jù)的。在較高的溫度(＞65℃)，溶解的固體含量的增加主要是由于G Zyme G 997在較高溫度下對顆粒玉米淀粉的液化作用。
實施例8235G Zyme G 997和rH-GSHE濃度對顆粒玉米淀粉的溶解和水解的影響236在不同的燒杯中，將372g水中的顆粒玉米淀粉(178g)充分?jǐn)嚢?，以便混勻。將漿狀物的pH調(diào)節(jié)到pH 5.5。將兩種不同水平的G Zyme G 997，即0.1Kgs/MT淀粉和0.5Kgs/MT，與0.25、0.5和1.0 GSHE單位/g ds淀粉的rH-GSHE在60℃溫育。在不同的時間取出樣品，用于測量brix和總糖組成(表12A和12B)。
表12A

237表12A中的結(jié)果表明將G Zyme G 997的劑量從0.1Kgs/MT淀粉增加到0.5Kg/MT淀粉，導(dǎo)致顆粒淀粉更快速溶解。但對于兩種水平，在存在1.0 GSHE單位的rH-GSHE的情況下，都在24小時內(nèi)發(fā)生了大于95％的顆粒淀粉溶解。在存在G Zyme G 997的情況下，rH-GSHE濃度對顆粒淀粉溶解的影響隨著濃度的劑量增加而顯著增加。上述結(jié)果清楚地表明這些酶中的任何一個，G Zyme G 997或rH-GSHE，都不能單獨(dú)地將顆粒淀粉溶解至完全。然而，當(dāng)這些酶一起加入時，顆粒淀粉發(fā)生了完全的溶解。
238在pH 5.5和60℃，在用G ZYME G 997和rH-GSHE溫育顆粒玉米淀粉的過程中，在12、24和30小時時，用HPLC分析溶解的顆粒(32％漿狀物)玉米淀粉的碳水化合物(糖)組成，參考表12B。
表12B

239表12B中的結(jié)果表明嗜熱脂肪芽孢桿菌α淀粉酶和rH-GSHE的適當(dāng)摻合物，在由顆粒淀粉直接進(jìn)行糖甜味劑和生化制品的商業(yè)生產(chǎn)中，將滿足多種需求，而不必使用傳統(tǒng)的高溫蒸煮過程。高水平的α淀粉酶加快顆粒淀粉的溶解速率，但更高水平的rH-GSHE導(dǎo)致高水平的轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物，從而導(dǎo)致高級糖的顯著低水平。
實施例9240通過葡糖淀粉酶制劑進(jìn)行的酶液化玉米淀粉底物(可溶的淀粉底物)和顆粒玉米淀粉(不可溶的)的水解的比較。
241在一個典型的實驗中，玉米淀粉(32％ ds)采用低溫噴射蒸煮工藝(105℃，8分鐘)在pH 5.6液化，接著在95℃水解90分鐘。在液化工藝中，將SPEZYMEFRED(Genencor International Inc)以0.4Kgs/MT淀粉，ds加入。將SPEZYME FRED液化淀粉底物的pH值調(diào)到pH 4.2，以0.22GAU/g ds加入葡糖淀粉酶(OPTIDEXL-400)。水解在60℃進(jìn)行。在不同的時間取出樣品，通過HPLC分析確定達(dá)到最大葡萄糖產(chǎn)率所需要的時間。
242制備蒸餾水中的32％ ds顆粒玉米淀粉漿，使用1N NaOH將漿的pH調(diào)節(jié)到pH 5.5。然后將燒杯保持在維持于60℃的水浴中，以0.1Kgs/MT ds加入G ZymeG 997，以1.0 GSHE單位/克ds加入rH-GSHE，將樣品于60℃溫育，同時不斷地攪拌。在不同時間取出樣品，測量BRIX和葡萄糖產(chǎn)率(表13)。
表13

243與不可溶的顆粒淀粉的水解相比，液化的可溶性淀粉通過葡糖淀粉酶進(jìn)行的水解需要更長的時間來達(dá)到最大葡萄糖產(chǎn)率。在達(dá)到最大葡萄糖產(chǎn)率的峰值時刻，與液化可溶性淀粉相比，顆粒淀粉的葡萄糖水平更高，DP4+糖明顯更少(96.8和0.2，與95.2和1.3相比)。
244更高的葡萄糖產(chǎn)率、更短糖化時間的潛能、總體避免了高溫噴射蒸煮步驟，將本發(fā)明的α淀粉酶和GSHE酶摻合物的應(yīng)用區(qū)分出來。
實施例10245在用G Zyme G 997(0.1Kgs/MT)和rH-GSHE(1.0 GSHE單位/g)進(jìn)行的溫育中，顆粒玉米淀粉濃度對淀粉溶解和水解的影響246在蒸餾水中制備不同濃度的顆粒玉米淀粉漿，即32％、35％、38％、40％和42％。漿的pH調(diào)節(jié)到pH 5.5。然后將樣品保持在維持于60℃的水浴中，連續(xù)地攪拌，以便混勻。將G Zyme G 997(0.1Kgs/MT的ds)和從實施例1獲得的rH-GSHE(1.0 GSHE單位/g ds)加入到漿中。在溫育過程中，在不同的時間取出等份樣品，測量brix和糖組成(表14)。
表14


247結(jié)果表明，對于高達(dá)36％的溶解固體，在24小時的糖化期間內(nèi)能達(dá)到超過96％的葡萄糖糖漿。當(dāng)在糖化工藝中使用不可溶的顆粒淀粉時，對于高于35％的固體水平，實現(xiàn)了大于96％的葡萄糖產(chǎn)率。
實施例1248正如上面所教導(dǎo)的以及本技術(shù)領(lǐng)域已知的，高葡萄糖糖漿的酶-酶淀粉轉(zhuǎn)化工藝包括通過使用熱穩(wěn)定α淀粉酶對不可溶的淀粉底物進(jìn)行高溫液化，產(chǎn)生可溶性液化物(liquefact)。在商業(yè)上，通常的實踐是在用葡糖淀粉酶進(jìn)行糖化之前，滅活殘余的α淀粉酶活性，以降低由于存在活性α淀粉酶而造成的葡萄糖產(chǎn)率的損失。殘余的α淀粉酶活性的滅活通常是通過在95℃將液化物降低到pH 4.2來進(jìn)行的。高溫和pH 4.5導(dǎo)致α淀粉酶完全滅活。因此，我們研究了在pH 5.5時，在液化淀粉的糖化過程中，存在和不存在活性α淀粉酶對葡萄糖產(chǎn)率的影響。
249在一個典型的實驗中，使用G Zyme G 997(0.4Kgs/MT淀粉)作為液化酶，在噴射蒸煮工藝條件下(32％ ds淀粉，在105℃，8分鐘，隨后是95℃ 90分鐘)，從玉米淀粉產(chǎn)生可溶性液化物。將液化淀粉的一部分進(jìn)一步加熱，以滅活殘余α淀粉酶活性。存在和不存在殘余α淀粉酶活性的情況下的液化淀粉的糖化，在pH5.5，60℃，使用實施例1中描述的rH-GSHE以0.5 GSHE單位/g進(jìn)一步糖化(32％ds)。在不同時間取出樣品，使用HPLC分析葡萄糖產(chǎn)率(表15)。
表15


250表15中的結(jié)果表明，在通過葡糖淀粉酶進(jìn)行可溶性淀粉底物(液化物)的糖化過程中，存在G Zyme G 997α淀粉酶活性導(dǎo)致更低的葡萄糖產(chǎn)率。然而，α淀粉酶增強(qiáng)了葡糖淀粉酶進(jìn)行的不可溶(顆粒)淀粉底物的水解，從而導(dǎo)致實質(zhì)上高水平的葡萄糖。
實施例1251從玉米淀粉的水解產(chǎn)生葡萄糖糖漿和殘余淀粉252在反應(yīng)器容器中，將1200g水中的顆粒玉米淀粉(800g)充分?jǐn)嚢瑁员慊靹?，得到漿狀物。用4N NaOH將漿狀物的pH調(diào)節(jié)到pH 5.5。將G Zyme G 997(0.1Kgs/MT淀粉)和在里氏木霉中表達(dá)的灰腐質(zhì)霉高溫變種GSHE(rH-GSHE)以1.0 GSHE U/g淀粉的量，在60℃加入。在不同的時間取出樣品，用于測量Brix和總的糖組成(表16)。
表16

在10小時的反應(yīng)時間內(nèi)，得到超過90％的顆粒淀粉溶解后，獲得了如表17所示的溶解顆粒玉米淀粉糖組成，這是用HPLC測量的。
表17

253在10小時反應(yīng)時間后，用4N H2SO4將pH調(diào)節(jié)到3.5，從而終止水解。糖漿混合物含有大于96％的右旋糖，以大于30％溶解固體存在。使用500,000分子量截留(MWCO)超濾膜元件(AG Technology，MA)在60℃過濾混合物。該254將殘余淀粉的樣品干燥，通過掃描電子顯微鏡(Hitachi S-5000 cold fieldemission SEM(Tokyo，Japan))檢查其結(jié)構(gòu)，并與在根據(jù)本發(fā)明的方法暴露于酶之前的典型的淀粉顆粒進(jìn)行比較(圖12)。使用雙面粘合劑碳膠帶將干燥樣品固定在SEM樣品樁上。通過用壓縮空氣掃塵(dusting)，去除任何過量的樣品。然后以大約30°的角度，將樣品安裝在Bal-Tec Med 020 Modular High Vacuum Coating System(Liechtenstein)中，在以60rpm旋轉(zhuǎn)的同時，用10nn鉑(Pt)噴濺涂覆。這些設(shè)置確保顆粒均勻地在所有面上被涂覆。與淀粉顆粒的酶促作用所導(dǎo)致的特征的尺寸相比，涂層的厚度是可以忽略的。加速電壓在2-5kV之間變化，放大倍數(shù)在500-15,000x之間。
255顯微鏡照片圖12a描述了暴露于本發(fā)明的酶組合物和方法之前的典型淀粉顆粒。表面是光滑且均勻的，僅有的可觀察到的特征是細(xì)小裂紋，這是由鉑金屬涂覆所致。一旦暴露于本發(fā)明的酶摻合物和方法，顆粒的表面形態(tài)學(xué)就會變化。正如在圖12的顯微照片b-d中所看到的，大的圓孔鉆入顆粒中，這是由于酶消化淀粉顆粒底物?？自谥睆缴鲜怯凶儎拥?，并且在深度上也有變化，反映出處于酶促反應(yīng)的不同動力學(xué)階段的淀粉顆粒群體。一些顆粒具有僅僅一些數(shù)量的孔，而一些幾乎布滿了孔(顯微鏡照片b)。一些顆粒還被分成兩半，顯示了經(jīng)消化的內(nèi)部的橫截面(顯微鏡照片c和d)。顯微鏡照片d揭示了顆粒消化至完全，顯示了中空外殼的片斷。
權(quán)利要求
1.用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有葡糖淀粉酶活性的顆粒淀粉水解酶(GSHE)的方法，所述方法包括a)用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化絲狀真菌宿主細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建物包括在絲狀真菌宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動子，啟動子可操作地連接到編碼GSHE的異源多核苷酸上，b)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的絲狀真菌宿主細(xì)胞，以允許所述GSHE表達(dá)，和c)產(chǎn)生GSHE。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法進(jìn)一步包括回收產(chǎn)生的GSHE。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中編碼GSHE的異源多核苷酸來源于灰腐質(zhì)霉菌株或泡盛曲霉菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中GSHE與SEQ ID NO3或SEQ ID NO6的序列具有至少90％序列同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中絲狀真菌宿主細(xì)胞是木霉菌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中由轉(zhuǎn)化的絲狀真菌宿主細(xì)胞所表達(dá)的GSHE的糖基化水平低于在天然真菌宿主中所表達(dá)的GSHE的糖基化水平。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中轉(zhuǎn)化的絲狀真菌宿主細(xì)胞中所產(chǎn)生的GSHE在3.0到4.0的pH水平下的酶活性大于相應(yīng)的從天然真菌宿主所產(chǎn)生的GSHE。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中轉(zhuǎn)化的真菌宿主細(xì)胞在連續(xù)發(fā)酵條件下培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中轉(zhuǎn)化的真菌宿主在分批發(fā)酵條件下培養(yǎng)。
10.重組的木霉菌細(xì)胞，其包括編碼具有葡糖淀粉酶活性的顆粒淀粉水解酶(GSHE)的異源多核苷酸。
11.權(quán)利要求10的重組的木霉菌細(xì)胞，其中所述異源多核苷酸源自灰腐質(zhì)霉菌株或者來自泡盛曲霉菌株。
12.發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含由里氏木霉的培養(yǎng)物所產(chǎn)生的具有葡糖淀粉酶活性的顆粒淀粉水解酶(GSHE)，其中里氏木霉包括編碼與SEQ ID NO3或SEQ IDNO6具有至少90％氨基酸序列同一性的GSHE的異源多核苷酸。
13.用于從顆粒淀粉漿產(chǎn)生葡萄糖糖漿的方法，所述方法包括在低于顆粒淀粉的膠凝化溫度的溫度，用權(quán)利要求12所述的發(fā)酵培養(yǎng)基和來自芽孢桿菌菌株的α淀粉酶同時接觸顆粒淀粉底物；和允許α淀粉酶和GSHE作用2至100小時之間的一段時間，以水解顆粒淀粉，得到葡萄糖糖漿。
14.具有顆粒淀粉水解活性的酶組合物，所述酶組合物包括α淀粉酶和具有顆粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶(GSHE)，其中α淀粉酶與GSHE的比率在15∶1到1∶15之間。
15.權(quán)利要求14的酶組合物，其中α淀粉酶與GSHE的比率在10∶1到1∶10之間。
16.用于從顆粒淀粉漿產(chǎn)生葡萄糖糖漿的單步驟方法，所述方法包括在等于或低于顆粒淀粉的膠凝化溫度的溫度，用α淀粉酶和具有顆粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶(GSHE)同時接觸獲自顆粒淀粉底物的顆粒淀粉漿，和允許α淀粉酶和GSHE作用一段時間，足以水解顆粒淀粉，得到含有葡萄糖糖漿的組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中顆粒淀粉底物來自玉米、小麥、大麥或大米。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中顆粒淀粉底物是從全谷物獲得的玉米淀粉。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中顆粒淀粉底物是干磨或濕磨的。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中顆粒淀粉漿的干固體含量為15-55％。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中顆粒淀粉漿的干固體含量為15-45％。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述溫度低于65℃，并且大于50℃。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述溫度低于65℃，并且大于55℃。
24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中足以水解顆粒淀粉的時間期間是2至100小時。
25.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中接觸步驟在5.0到6.0之間的pH進(jìn)行。
26.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中α淀粉酶源自芽孢桿菌。
27.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中每公噸淀粉的α淀粉酶的量在0.05-5.0kg的范圍內(nèi)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中每公噸淀粉的α淀粉酶的量在0.05-2.0kg的范圍內(nèi)。
29.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中GSHE是由編碼與SEQ ID NO3或SEQ IDNO6的序列具有至少90％序列同一性的GSHE的多核苷酸的異源表達(dá)獲得的。
30.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中GSHE的量在0.01-10.0 GSHE U/g淀粉干固體的范圍內(nèi)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中GSHE的量在0.1-5.0 GSHE U/g淀粉干固體的范圍內(nèi)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中GSHE的量在0.25-2.5 GSHE U/g淀粉干固體的范圍內(nèi)。
33.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中顆粒淀粉的至少90％在24小時內(nèi)被水解。
34.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括回收葡萄糖糖漿。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中葡萄糖糖漿通過過濾分離被回收。
36.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括將葡萄糖糖漿轉(zhuǎn)化為期望的終產(chǎn)物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中期望的終產(chǎn)物是果糖糖漿。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中期望的終產(chǎn)物是乙醇。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中期望的終產(chǎn)物是結(jié)晶葡萄糖。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中殘余淀粉作為葡萄糖糖漿分離的副產(chǎn)物被獲得。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括通過用GSHE和α淀粉酶在低于顆粒淀粉的膠凝化溫度的溫度接觸殘余淀粉來再利用殘余淀粉。
42.殘余淀粉，其根據(jù)權(quán)利要求40的方法獲得。
43.用于產(chǎn)生高果糖的淀粉基糖漿的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求16的方法所獲得的葡萄糖糖漿酶促轉(zhuǎn)化為果糖糖漿。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中轉(zhuǎn)化步驟包括使用葡萄糖異構(gòu)酶。
45.用于生產(chǎn)殘余淀粉組合物的方法，所述方法包括接觸權(quán)利要求16所述的顆粒淀粉底物，以產(chǎn)生包括葡萄糖糖漿的組合物，以及從組合物分離葡萄糖糖漿，從而獲得包括殘余淀粉的混合物。
46.一種方法，在淀粉糖化工藝中使用根據(jù)權(quán)利要求45而獲得的殘余淀粉。
47.用于生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括用產(chǎn)乙醇微生物對根據(jù)權(quán)利要求16而產(chǎn)生的葡萄糖糖漿進(jìn)行發(fā)酵。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中發(fā)酵獨(dú)立于并且跟隨著接觸步驟進(jìn)行。
49.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中發(fā)酵與接觸步驟同時進(jìn)行。
50.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，所述方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵中回收乙醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及絲狀真菌宿主細(xì)胞，尤其是用于產(chǎn)生具有葡糖淀粉酶活性的異源顆粒淀粉水解酶(GSHE)的木霉菌宿主細(xì)胞。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生葡萄糖糖漿的方法，所述方法包括使用α淀粉酶和GSHE，在等于或低于顆粒淀粉的膠凝化溫度的溫度，同時接觸從顆粒淀粉底物獲得的顆粒淀粉漿，以得到葡萄糖糖漿的組合物。
文檔編號C12P19/24GK1875099SQ200480032375
公開日2006年12月6日 申請日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者T·L·鮑德文, B·S·鮑爾, G·K·肖塔尼, N·鄧恩－科勒曼, Jr·O·蘭特羅, S·E·蘭茨, M·J·佩珀森, J·K·謝蒂, B·A·斯托姆, 王華明 申請人:金克克國際有限公司