專(zhuān)利名稱(chēng)：體液的直接核酸檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供將靶擴(kuò)增反應(yīng)與信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)相組合以達(dá)到快速且靈敏地檢測(cè)少量核酸，特別是未純化的體液(例如血液)中的少量核酸的方法。本發(fā)明還提供優(yōu)化多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的方法。本發(fā)明還提供進(jìn)行高度多重PCR組合INVADER試驗(yàn)(assay)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供不需要干預(yù)性操作或加入試劑，而在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行PCR組合INVADER試驗(yàn)的方法(例如使用未純化的體液，如血液)。
背景技術(shù)：
隨著人類(lèi)基因組核酸測(cè)序的完成，基因組學(xué)研究和相關(guān)藥物設(shè)計(jì)工作對(duì)快速、可靠、節(jié)省費(fèi)用、用戶友好的檢測(cè)的需求大大增加。大量機(jī)構(gòu)積極地挖掘可以獲得的基因序列信息，來(lái)確定基因、基因表達(dá)和表型(例如疾病狀態(tài)、代謝反應(yīng)等)之間的相關(guān)性。這些分析包括表征個(gè)體和群體中基因突變和遺傳及基因表達(dá)異質(zhì)性的作用的工作。
核酸提取和擴(kuò)增的進(jìn)展大大擴(kuò)展了可以從中獲得遺傳物質(zhì)的生物樣品的類(lèi)型。特別是，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)能夠從一位數(shù)的固定組織標(biāo)本、考古學(xué)標(biāo)本和大量多種類(lèi)型的細(xì)胞中獲得足夠量的DNA。同樣，大規(guī)模SNP基因分型計(jì)劃也需要大量基因組DNA，它們可能難以從標(biāo)準(zhǔn)生物樣品中獲得。解決這一問(wèn)題的一種方法依賴(lài)于基于PCR的靶擴(kuò)增。
盡管PCR使得微量核酸的分析成為可能，但是其在大量設(shè)置中的實(shí)際應(yīng)用仍然存在多種類(lèi)型的問(wèn)題。因?yàn)樯倭堪泻怂崛菀淄ㄟ^(guò)該反應(yīng)擴(kuò)增，所以PCR應(yīng)用非常容易受試驗(yàn)與試驗(yàn)之間攜帶污染的影響。這個(gè)缺點(diǎn)通常需要建立專(zhuān)用設(shè)施或設(shè)置工作流程，使擴(kuò)增后操作的數(shù)量減至最少。在一些情況下，使用不打開(kāi)反應(yīng)容器就可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的專(zhuān)門(mén)儀器。
因此，需要的是通過(guò)使少量擴(kuò)增序列產(chǎn)生的信號(hào)最大化來(lái)限制對(duì)靶擴(kuò)增的需求的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了開(kāi)發(fā)和優(yōu)化用于基礎(chǔ)研究、臨床研究以及用于開(kāi)發(fā)臨床檢測(cè)試驗(yàn)的核酸檢測(cè)試驗(yàn)的方法和程序。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如下方法，其包括a)提供至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含i)足跡區(qū)，ii)位于足跡區(qū)直接上游的5′區(qū)，和iii)位于足跡區(qū)直接下游的3′區(qū)，和b)處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組(primerset)，其中該引物組包含用于該至少Y個(gè)靶序列中每一個(gè)的正向和反向引物序列，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N[1]是核苷酸A或C，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)。
在另外一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如下方法，其包括a)提供至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含i)足跡區(qū)，ii)位于足跡區(qū)直接上游的5′區(qū)，和iii)位于足跡區(qū)直接下游的3′區(qū)，和b)處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組，其中該引物組包含用于該至少Y個(gè)靶序列中每一個(gè)的正向和反向引物序列，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N[1]是核苷酸G或T，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)。
在特定實(shí)施方案中，提供一種方法，包括a)提供至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含i)足跡區(qū)，ii)位于足跡區(qū)直接上游的5′區(qū)，和iii)位于足跡區(qū)直接下游的3′區(qū)，和b)處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組，其中該引物組包含i)與該Y個(gè)靶序列各自5′區(qū)的至少一部分相同的正向引物序列，和ii)與該至少Y個(gè)靶序列各自3′區(qū)互補(bǔ)序列的至少一部分相同的反向引物序列，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N[1]是核苷酸A或C，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)。
在另外一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如下方法，其包括a)提供至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含i)足跡區(qū)，ii)位于足跡區(qū)直接上游的5′區(qū)，和iii)位于足跡區(qū)直接下游的3′區(qū)，和b)處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組，其中該引物組包含i)與該Y個(gè)靶序列各自5′區(qū)的至少一部分相同的正向引物序列，和ii)與該至少Y個(gè)靶序列各自3′區(qū)互補(bǔ)序列的至少一部分相同的反向引物序列，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N[1]是核苷酸G或T，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如下方法，其包括a)提供至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含單核苷酸多態(tài)性，b)為了檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，確定一個(gè)或多個(gè)測(cè)定探針將雜交于各個(gè)靶序列上的何處，從而使足跡區(qū)位于各個(gè)靶序列上，和c)處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組，其中該引物組包含i)正向引物序列，其與位于該Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接5′方向的靶序列的至少一部分相同，和ii)反向引物序列，其與位于該至少Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接3′方向的靶序列的互補(bǔ)序列的至少一部分相同，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N[1]是核苷酸A或C，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如下方法，其包括a)提供至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含單核苷酸多態(tài)性，b)為了檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，確定一個(gè)或多個(gè)測(cè)定探針將雜交于各個(gè)靶序列上的何處，從而使足跡區(qū)位于各個(gè)靶序列上，和c)處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組，其中該引物組包含i)正向引物序列，其與位于該Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接5′方向的靶序列的至少一部分相同，和ii)反向引物序列，其與位于該至少Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接3′方向的靶序列的互補(bǔ)序列的至少一部分相同，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N[1]是核苷酸T或G，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)。
在某些實(shí)施方案中，該引物組設(shè)置用于進(jìn)行擴(kuò)增至少Y個(gè)擴(kuò)增子的多重PCR反應(yīng)，其中各個(gè)擴(kuò)增子由正向和反向引物的位置限定。在另外一些實(shí)施方案中，該引物組生成為數(shù)字化或打印的序列信息。在一些實(shí)施方案中，該引物組生成為物理引物寡核苷酸。
在某些實(shí)施方案中，各正向和反向引物的N[3]-N[2]-N[1]-3′均不與引物組中任何正向和反向引物的N[3]-N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)。在另外一些實(shí)施方案中，所述處理包括最初選擇各正向引物的N[1]為5′區(qū)中最3′的A或C。在某些實(shí)施方案中，所述處理包括最初選擇各正向引物的N[1]為5′區(qū)中最3′的G或T。在一些實(shí)施方案中，所述處理包括最初選擇各正向引物的N[1]為5′區(qū)中最3′的A或C，并且其中所述處理進(jìn)一步包括，對(duì)于不能滿足各正向引物的N[2]-N[1]-3′不與引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)這一條件的正向引物序列，將其N(xiāo)[1]改變?yōu)?′區(qū)中下一個(gè)最3′的A或C。
在另外一些實(shí)施方案中，所述處理包括最初選擇各反向引物的N[1]為3′區(qū)互補(bǔ)序列中最3′的A或C。在一些實(shí)施方案中，所述處理包括最初選擇各反向引物的N[1]為3′區(qū)互補(bǔ)序列中最3′的G或G。在另外的實(shí)施方案中，所述處理包括最初選擇各反向引物的N[1]為3′區(qū)中最3′的A或C，并且其中所述處理進(jìn)一步包括，對(duì)于不能滿足各反向引物的N[2]-N[1]-3′不與引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)這一條件的反向引物序列，將其N(xiāo)[1]改變?yōu)?′區(qū)中下一個(gè)最3′的A或C。
在特定實(shí)施方案中，足跡區(qū)包含單核苷酸多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，足跡區(qū)包含突變。在一些實(shí)施方案中，各靶序列的足跡區(qū)包含該靶序列的一部分，該部分可與用來(lái)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的一種或多種測(cè)定探針雜交。在某些實(shí)施方案中，足跡區(qū)是探針在此雜交的區(qū)域。在另外一些實(shí)施方案中，足跡區(qū)進(jìn)一步在任一末端包含額外的核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，所述處理進(jìn)一步包括對(duì)正向和反向引物均選擇N[5]-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′，使其與測(cè)定成分序列有低于80％的同源性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)定成分是FRET探針序列。在某些實(shí)施方案中，靶序列長(zhǎng)度為約300-500個(gè)堿基對(duì)，或者長(zhǎng)度為約200-600個(gè)堿基對(duì)。在某些實(shí)施方案中，Y是介于2-500或2-10,000之間的整數(shù)。
在某些實(shí)施方案中，所述處理包括為各正向和反向引物選擇x，使得正向和反向引物相對(duì)于靶序列均具有大約50攝氏度的解鏈溫度(例如50攝氏度，或者至少50攝氏度，且不超過(guò)55攝氏度)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，引物(當(dāng)與靶序列雜交時(shí))的解鏈溫度為至少50攝氏度，但是與所選檢測(cè)試驗(yàn)的最佳反應(yīng)溫度有至少10度的差距。
在一些實(shí)施方案中，確定引物組中正向和反向引物對(duì)的最佳濃度。在其他一些實(shí)施方案中，該處理是自動(dòng)進(jìn)行的。在另外一些實(shí)施方案中，該處理是用處理器自動(dòng)進(jìn)行的。
在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含用本發(fā)明方法制備的引物組，和至少一種其他成分(例如切割劑、聚合酶、INVADER寡核苷酸)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含用本發(fā)明方法制備的引物和引物組的組合物。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括如下步驟的方法a)提供i)用來(lái)接收序列數(shù)據(jù)的用戶界面，ii)在其中存儲(chǔ)多重PCR引物應(yīng)用軟件的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，和b)將序列數(shù)據(jù)從該用戶界面?zhèn)魉徒o該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中該序列數(shù)據(jù)包含至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含i)足跡區(qū)，ii)位于足跡區(qū)直接上游的5′區(qū)，和iii)位于足跡區(qū)直接下游的3′區(qū)，和c)用多重PCR引物對(duì)應(yīng)用軟件處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組，其中該引物組包含i)正向引物序列，其與位于該Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接5′方向的靶序列的至少一部分相同，和ii)反向引物序列，其與位于該至少Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接3′方向的靶序列的互補(bǔ)序列的至少一部分相同，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N [1]是核苷酸A或C，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括如下步驟的方法a)提供i)用來(lái)接收序列數(shù)據(jù)的用戶界面，ii)在其中存儲(chǔ)多重PCR引物應(yīng)用軟件的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，和b)將序列數(shù)據(jù)從該用戶界面?zhèn)魉徒o該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中該序列數(shù)據(jù)包含至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含i)足跡區(qū)，ii)位于足跡區(qū)直接上游的5′區(qū)，和iii)位于足跡區(qū)直接下游的3′區(qū)，和c)用多重PCR引物對(duì)應(yīng)用軟件處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組，其中該引物組包含i)正向引物序列，其與位于該Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接5′方向的靶序列的至少一部分相同，和ii)反向引物序列，其與位于該至少Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接3′方向的靶序列的互補(bǔ)序列的至少一部分相同，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N[1]是核苷酸G或T，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括如下部件的系統(tǒng)a)用于從用戶界面接收數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中該用戶界面設(shè)置為接收序列數(shù)據(jù)，其中該序列數(shù)據(jù)包含至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含i)足跡區(qū)，ii)位于足跡區(qū)直接上游的5′區(qū)，和iii)位于足跡區(qū)直接下游的3′區(qū)，和b)與該用戶界面可操作連接的多重PCR引物對(duì)應(yīng)用軟件，其中該多重PCR引物對(duì)應(yīng)用軟件用來(lái)處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組，其中該引物組包含i)正向引物序列，其與位于該Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接5′方向的靶序列的至少一部分相同，和ii)反向引物序列，其與位于該至少Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接3′方向的靶序列的互補(bǔ)序列的至少一部分相同，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N[1]是核苷酸A或C，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N [2]-N[1]-3′互補(bǔ)，和c)在其中存儲(chǔ)多重PCR引物應(yīng)用軟件的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器和計(jì)算機(jī)處理器。
在另外一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括如下部件的系統(tǒng)a)用于從用戶界面接收數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中該用戶界面設(shè)置為接收序列數(shù)據(jù)，其中該序列數(shù)據(jù)包含至少Y個(gè)靶序列的靶序列信息，其中各個(gè)靶序列均包含i)足跡區(qū)，ii)位于足跡區(qū)直接上游的5′區(qū)，和iii)位于足跡區(qū)直接下游的3′區(qū)，和b)與該用戶界面可操作連接的多重PCR引物對(duì)應(yīng)用軟件，其中該多重PCR引物對(duì)應(yīng)用軟件用來(lái)處理該靶序列信息，產(chǎn)生引物組，其中該引物組包含i)正向引物序列，其與位于該Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接5′方向的靶序列的至少一部分相同，和ii)反向引物序列，其與位于該至少Y個(gè)靶序列各自足跡區(qū)直接3′方向的靶序列的互補(bǔ)序列的至少一部分相同，其中各正向和反向引物序列均包含由5′-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′代表的核酸序列，其中N代表核苷酸堿基，x至少為6，N[1]是核苷酸G或T，各正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′均不與該引物組中任何正向和反向引物的N[2]-N[1]-3′互補(bǔ)，和c)在其中存儲(chǔ)多重PCR引物應(yīng)用軟件的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器和計(jì)算機(jī)處理器。在某些實(shí)施方案中，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)設(shè)置為將該引物組返回用戶界面。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行靶標(biāo)和信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)的方法。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，該靶擴(kuò)增反應(yīng)是PCR反應(yīng)。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)是侵入切割(INVADER)試驗(yàn)。在另一些實(shí)施方案中，在開(kāi)始任一反應(yīng)之前加入用于組合靶標(biāo)和信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。在某些實(shí)施方案中，該靶擴(kuò)增反應(yīng)在20個(gè)循環(huán)后終止。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，該靶擴(kuò)增反應(yīng)在15個(gè)循環(huán)后終止。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該靶擴(kuò)增反應(yīng)在11個(gè)循環(huán)后終止。在一些實(shí)施方案中，預(yù)先將一些成分加入到反應(yīng)容器中，之后加入其余的試驗(yàn)成分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)先加入的試劑在反應(yīng)容器中干燥。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)先加入的試劑包括一種或多種INVADER試驗(yàn)試劑。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)容器包括微觀流體卡。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該反應(yīng)容器包括用于離心或向心分配或操作流體反應(yīng)和反應(yīng)成分的微觀流體卡。
在另外一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供例如在單一反應(yīng)或反應(yīng)容器中進(jìn)行多染料多重FRET INVADER試驗(yàn)的方法和組合物。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)合成的靶標(biāo)進(jìn)行該多重FRET試驗(yàn)。在另外一些優(yōu)選實(shí)施方案，對(duì)核酸片段靶標(biāo)，例如PCR擴(kuò)增子，進(jìn)行該多重FRET試驗(yàn)。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)基因組DNA靶標(biāo)進(jìn)行該多重FRET試驗(yàn)。在另外一些優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)RNA靶標(biāo)進(jìn)行多重FRET試驗(yàn)。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多重FRET試驗(yàn)是四重反應(yīng)。
在一些實(shí)施方案中，可以以預(yù)先分配的形式提供一種或多種INVADER試驗(yàn)試劑(即，預(yù)先確定用于該程序的一個(gè)步驟，而不需再確定或再分配)。在一些實(shí)施方案中，將選擇的INVADER試驗(yàn)試劑成分混合，并預(yù)先分配在一起。在另外一些實(shí)施方案中，預(yù)先分配的試驗(yàn)試劑成分被預(yù)先分配，并且在反應(yīng)容器(包括但不限于反應(yīng)管或孔，例如微量滴定板的孔)中提供。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)先分配的INVADER試驗(yàn)試劑成分在反應(yīng)容器中干燥(例如脫水或凍干)。
在一些實(shí)施方案中，INVADER試驗(yàn)試劑以試劑盒形式提供。本文使用的術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指用于遞送材料的任何遞送系統(tǒng)。在關(guān)于反應(yīng)試驗(yàn)的內(nèi)容中，這樣的遞送系統(tǒng)包括可以貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)或?qū)⒎磻?yīng)試劑(例如適當(dāng)容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如用于進(jìn)行該試驗(yàn)的緩沖液、書(shū)面說(shuō)明書(shū)等)或?qū)⑵鋸囊粋€(gè)位置遞送到另一個(gè)位置的系統(tǒng)。例如，試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)外殼(例如盒子)，該外殼中包含相關(guān)的反應(yīng)試劑和/或支持材料。本文使用的術(shù)語(yǔ)“分區(qū)試劑盒”是指包含兩個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的容器的遞送系統(tǒng)，每個(gè)容器中含有總試劑盒組分的亞部分。這些容器可以一起或分開(kāi)遞送到目標(biāo)受體。例如，第一個(gè)容器可以含有在試驗(yàn)中使用的酶，而第二個(gè)容器含有寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)“分區(qū)試劑盒”包括含有《聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法》第520(e)部分規(guī)定的分析純?cè)噭?ASR′s)的試劑盒，但是不限于這些。實(shí)際上，術(shù)語(yǔ)“分區(qū)試劑盒”包括包含兩個(gè)或多個(gè)分開(kāi)容器的任何遞送系統(tǒng)，其中每個(gè)容器含有總試劑盒組分的亞部分。相反，“組合試劑盒”是指在一個(gè)容器中含有反應(yīng)試驗(yàn)的所有組分(例如在一個(gè)盒子中包含所有需要的組分)的遞送系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“試劑盒”既包括分區(qū)試劑盒也包括組合試劑盒。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供INVADER試驗(yàn)試劑盒，其中含有實(shí)施本發(fā)明所必需的一種或多種組分。例如，本發(fā)明提供用于儲(chǔ)存或遞送實(shí)施INVADER試驗(yàn)所必需的酶和/或反應(yīng)組分的試劑盒。該試劑盒可以包括試驗(yàn)必需的或需要的任何及全部組分，包括但不限于試劑本身、緩沖液、對(duì)照試劑(例如組織標(biāo)本、正和負(fù)對(duì)照靶寡核苷酸等)、固體支持體、標(biāo)記物、文字和/或圖示說(shuō)明書(shū)和產(chǎn)品信息、抑制劑、標(biāo)記和/或檢測(cè)試劑、包裝環(huán)境控制物(例如冰、干燥劑等)等等。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒提供所需組分的一部分，使用者預(yù)期將提供其余的組分。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括兩個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的容器，其中每個(gè)容器都容納有將要遞送的組分的一部分。例如，第一個(gè)容器(例如盒子)可含有酶(例如置于適當(dāng)貯存緩沖液和容器中的結(jié)構(gòu)特異性切割酶)，而第二個(gè)盒子可以含有寡核苷酸(例如INVADER寡核苷酸、探針寡核苷酸、對(duì)照靶寡核苷酸等)。


以下附圖構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分，在此用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案。參照這些附圖中的一張或多張，結(jié)合此處提供的具體實(shí)施方案的描述，可以更好地理解本發(fā)明。
圖1顯示INVADER試驗(yàn)的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。在第一反應(yīng)中，靶分子(陰影線矩形)與侵入探針(空白矩形)和包含靶特異性區(qū)的第一探針(空白矩形)和5′翼(flap)(填充矩形)形成重疊-翼結(jié)構(gòu)。該重疊-翼結(jié)構(gòu)被結(jié)構(gòu)特異性5′核酸酶切割。該重疊-翼結(jié)構(gòu)的酶切位點(diǎn)用箭頭示出，位于第一探針的靶特異性區(qū)的5′端核苷酸之后。為了鑒定SNP，探針之間的重疊定位相對(duì)于多態(tài)位點(diǎn)(X)。如果X核苷酸不與第一探針互補(bǔ)，則不發(fā)生特異性切割。在第二反應(yīng)中，切下的5′翼與染料(D)和猝滅劑(Q)標(biāo)記的FRET盒(灰線)形成重疊-翼結(jié)構(gòu)，5′核酸酶切割FRET盒釋放出未猝滅的染料。半圓形箭頭指示了信號(hào)擴(kuò)增關(guān)鍵的寡核苷酸轉(zhuǎn)換過(guò)程。在雙重INVADER試驗(yàn)中對(duì)另一SNP核苷酸的檢測(cè)使用類(lèi)似的級(jí)聯(lián)(未示出)。
圖2顯示PCR 5中擴(kuò)增倍數(shù)的對(duì)數(shù)lgF與PCR循環(huán)數(shù)n的相關(guān)性。
圖3A顯示PCR 1(●)、PCR 2(○)、PCR 4(■)和PCR 5(□)中引物濃度c對(duì)lgF的影響。
圖3B顯示使用圖3A所示數(shù)據(jù)得出的ln(2-F0.05)和c之間的關(guān)系。
圖4顯示如實(shí)施例7所述的反應(yīng)中8個(gè)基因組DNA樣品的凈FAM和RED INVADER測(cè)定信號(hào)的散布圖。
圖5顯示如實(shí)施例7所述的反應(yīng)中，隨PCR靶標(biāo)長(zhǎng)度變化的每個(gè)等位基因?qū)τ?61個(gè)成功INVADER試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的凈RED熒光信號(hào)。
圖6顯示如實(shí)施例7所述的反應(yīng)中8個(gè)基因組DNA樣品的凈FAM和RED信號(hào)的散布圖。
圖7顯示根據(jù)實(shí)施例8的方法的組合靶標(biāo)和信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。
圖8顯示為了制備可用于多重PCR的引物組而進(jìn)行的步驟的流程圖。
圖9顯示根據(jù)實(shí)施例8的方法的組合多重靶標(biāo)和信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。
圖10顯示如實(shí)施例9所述的四重INVADER試驗(yàn)的結(jié)果。
圖11A-11G顯示在微觀流體卡中對(duì)多重PCR擴(kuò)增的靶DNA的INVADER試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。
圖12A-12G顯示微觀流體卡中組合多重PCR和INVADER測(cè)定信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。
定義為了便于理解本發(fā)明，下面定義了大量術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)本文使用的術(shù)語(yǔ)“SNP”、“SNPs”或“單核苷酸多態(tài)性”是指生物體(例如人)基因組中特定位置處單個(gè)堿基的改變?！癝NP”可以位于不編碼基因的基因組部分中?；蛘?，“SNP”可以位于基因的編碼區(qū)中。在這種情況中，“SNP”可以改變RNA或其相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“等位基因”是指特定序列的變異形式(例如，包括但不限于含有一個(gè)或多個(gè)SNP的基因)。在一個(gè)群體中大量基因以多等位基因的形式存在。攜帶一個(gè)基因的兩個(gè)不同等位基因的二倍體生物被認(rèn)為是該基因雜合的，而純合子攜帶同一等位基因的兩個(gè)拷貝。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“連接”是指兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)記(例如基因)在染色體上相鄰。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“等位基因頻率”是指特定群體(例如特定性別、人種或種族的組)中特定等位基因(例如含有SNP的序列)的發(fā)生頻率。某些群體可能比其他群體有更高百分比的成員含有特定等位基因。例如，發(fā)現(xiàn)在猶太人總?cè)巳旱?％中存在被稱(chēng)為BRCA1的乳腺癌基因的特定突變。通過(guò)比較，估計(jì)在美國(guó)總?cè)巳褐?，在BRCA1中具有任何突變者的百分比為0.1-0.6％。另外兩個(gè)突變，一個(gè)存在于BRCA1基因中，另一個(gè)存在于被稱(chēng)為BRCA2的另一種乳腺癌基因中，在德裔猶太人群中較廣泛地存在，攜帶這三個(gè)突變之一的總危險(xiǎn)性達(dá)到2.3％。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)分析”是指用計(jì)算機(jī)處理器和計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器進(jìn)行的分析。例如，“計(jì)算機(jī)SNP分析”是指用計(jì)算機(jī)處理器和存儲(chǔ)器對(duì)SNP數(shù)據(jù)的分析。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因型”是指生物體的實(shí)際基因構(gòu)成(例如在基因座處攜帶的特定等位基因)?；蛐偷谋磉_(dá)產(chǎn)生生物體的物理外觀和特征—“表型”。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因座”是指一個(gè)基因或任何其他表征的序列在染色體上的位置。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“疾病”或“疾病狀態(tài)”是指與視為正常的狀況或與物種成員的平均水平的偏差，在對(duì)該物種大多數(shù)個(gè)體沒(méi)有害處的條件下，它對(duì)累及的個(gè)體是有害的(例如痢疾、惡心、發(fā)熱、疼痛和炎癥等)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“處理”在醫(yī)療操作過(guò)程中是指由于懷疑、預(yù)期或存在疾病狀態(tài)，或者具有或懷疑具有疾病狀態(tài)的危險(xiǎn)，而對(duì)累及個(gè)體進(jìn)行的步驟或操作。可以在預(yù)料到或響應(yīng)疾病狀態(tài)或懷疑疾病狀態(tài)時(shí)進(jìn)行處理，該處理包括但不限于預(yù)防性、改善、緩解或治愈性步驟。術(shù)語(yǔ)“治療”是指處理的一個(gè)具體過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“基因”是指核酸(例如DNA)序列，其含有產(chǎn)生多肽、RNA(例如rRNA、tRNA等)或前體所必需的編碼序列。多肽、RNA或前體可以由全長(zhǎng)編碼序列編碼，或者由該編碼序列的任一部分編碼，只要該部分保留全長(zhǎng)序列或片段的所需的活性或功能性質(zhì)(例如配體結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等)。該術(shù)語(yǔ)也包括結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)，包含的序列鄰近5′和3′末端上的編碼區(qū)，在任一端上距離約為1kb，因此該基因?qū)?yīng)于全長(zhǎng)mRNA的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)5′并且存在于mRNA上的序列被稱(chēng)為5′非翻譯序列。位于編碼區(qū)3′或下游并且存在于mRNA上的序列被稱(chēng)為3′非翻譯序列。術(shù)語(yǔ)“基因”包括基因的cDNA和基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆含有被非編碼序列打斷的編碼區(qū)，該非編碼序列被稱(chēng)為“內(nèi)含子”或“間插區(qū)”或“間插序列”。內(nèi)含子是當(dāng)基因被轉(zhuǎn)錄為不均一核RNA(hnRNA)時(shí)包含在其中的片段；內(nèi)含子可以含有調(diào)節(jié)元件，如增強(qiáng)子。內(nèi)含子從核或初級(jí)轉(zhuǎn)錄物上除去或“剪切下來(lái)”；因此內(nèi)含子一般不存在于信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中。在翻譯過(guò)程中mRNA的功能是確定新生多肽中氨基酸的序列或順序。在產(chǎn)生的RNA(例如hnRNA，mRNA，rRNA，tRNA)的相應(yīng)部分中反映出，并且通常能夠檢測(cè)到基因轉(zhuǎn)錄部分的變異(例如突變、SNPS、插入、缺失)。
本文使用的短語(yǔ)“氨基酸序列”是指天然發(fā)生的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列，氨基酸序列和類(lèi)似的術(shù)語(yǔ)，例如多肽或蛋白質(zhì)，不是將氨基酸序列限制為與引用的蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整、天然氨基酸序列。
除了含有內(nèi)含子以外，基因的基因組形式還可含有位于RNA轉(zhuǎn)錄物上存在的序列的5′和3′末端的序列。這些序列被稱(chēng)為“側(cè)翼”序列或區(qū)(這些側(cè)翼序列位于mRNA轉(zhuǎn)錄物上存在的非翻譯序列的5′或3′)。5′側(cè)翼區(qū)可含有控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。3′側(cè)翼區(qū)可含有引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后切割和聚腺苷酸化的序列。
術(shù)語(yǔ)“野生型”是指這樣一種基因或基因產(chǎn)物當(dāng)從天然存在的來(lái)源中分離時(shí)，它具有該基因或基因產(chǎn)物的特征。野生型基因是在群體中最常見(jiàn)的基因，因此被隨意稱(chēng)為基因的“正常”或“野生型”形式。相反，術(shù)語(yǔ)“修飾的”、“突變的”或“變異的”是指與野生型基因或基因產(chǎn)物相比，顯示序列和/或功能性質(zhì)改變(即特征改變)的基因或基因產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)指出，天然存在的突變體可以分離；根據(jù)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比具有改變特征的事實(shí)，可以鑒定它們。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“編碼核酸分子”、“編碼DNA序列”和“編碼DNA”是指脫氧核糖核苷酸沿脫氧核糖核酸鏈的順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定了氨基酸沿多肽(蛋白質(zhì))鏈的順序。在這種情況中，該DNA序列編碼該氨基酸序列。
DNA和RNA分子被認(rèn)為具有“5′末端”和“3′末端”，因?yàn)閱魏塑账岱磻?yīng)形成寡核苷酸或多核苷酸，使得一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5′磷酸通過(guò)磷酸二酯鍵以一個(gè)方向連接到其相鄰單核苷酸的3′氧上。因此，如果寡核苷酸或多核苷酸的5′磷酸不與單核苷酸戊糖環(huán)的3′氧連接，則其末端被稱(chēng)為“5′末端”，如果其3′氧不與下一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5′磷酸連接，則被稱(chēng)為“3′末端”。本文使用的核酸序列，即使在較大寡核苷酸或多核苷酸的內(nèi)部，也可以認(rèn)為具有5′和3′末端。在線性或環(huán)狀DNA分子中，不連續(xù)的元件被稱(chēng)為“下游”或3′元件的“上游”或“5′”。該術(shù)語(yǔ)反映了轉(zhuǎn)錄沿DNA鏈以5′至3′方向前進(jìn)的事實(shí)。引導(dǎo)連接基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件通常位于編碼區(qū)的5′或上游。但是，增強(qiáng)子元件甚至在位于啟動(dòng)子元件和編碼區(qū)的3′時(shí)也可以發(fā)揮它的作用。轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號(hào)位于編碼區(qū)的3′或下游。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“具有編碼一種基因的核苷酸序列的寡核苷酸”和“具有編碼一種基因的核苷酸序列的多核苷酸”是指包含基因的編碼區(qū)的核酸序列，即編碼基因產(chǎn)物的核酸序列。該編碼區(qū)可以以cDNA、基因組DNA或RNA的形式存在。當(dāng)以DNA形式存在時(shí)，寡核苷酸或多核苷酸可以是單鏈(即有義鏈)或雙鏈的。適當(dāng)?shù)目刂圃?，如增?qiáng)子/啟動(dòng)子、剪切點(diǎn)、聚腺苷酸化信號(hào)等，需要時(shí)可以與該基因的編碼區(qū)密切相鄰，以允許轉(zhuǎn)錄的正確啟動(dòng)和/或初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物的正確加工?；蛘?，本發(fā)明表達(dá)載體中使用的編碼區(qū)可含有內(nèi)源性增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、剪切點(diǎn)、間插序列、聚腺苷酸化信號(hào)等，或內(nèi)源性和外源性控制元件的組合。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)性”用于根據(jù)堿基配對(duì)原則關(guān)聯(lián)的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“5′-A-G-T-3′”與序列“3′-T-C-A-5”互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可以是“部分″的，其中只有一些核酸堿基根據(jù)堿基配對(duì)原則匹配?；蛘撸怂嶂g可以“完全”或“整體”互補(bǔ)。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度對(duì)核酸鏈之間的雜交效率和強(qiáng)度有顯著影響。這在擴(kuò)增反應(yīng)以及依靠核酸之間結(jié)合的檢測(cè)方法中特別重要。
術(shù)語(yǔ)“同源性”是指互補(bǔ)性的程度。可以是部分同源或全部同源(即同一性)。部分互補(bǔ)序列是至少部分抑制完全互補(bǔ)序列與靶核酸雜交的序列，用功能術(shù)語(yǔ)“基本同源”來(lái)提及。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合的抑制”當(dāng)用于核酸結(jié)合時(shí)，是指同源序列競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶序列引起的對(duì)結(jié)合的抑制。完全互補(bǔ)序列與靶序列雜交的抑制可以用雜交試驗(yàn)(Southern或Northern印跡、溶液雜交等)在低嚴(yán)格性條件下檢測(cè)。基本同源的序列或探針在低嚴(yán)格性條件下將競(jìng)爭(zhēng)并抑制完全同源序列與靶標(biāo)的結(jié)合(即雜交)。這不是說(shuō)低嚴(yán)格性條件允許非特異性結(jié)合；低嚴(yán)格性條件需要兩種序列的彼此結(jié)合是特異性(即選擇性)的相互作用。非特異性結(jié)合的不存在可以用甚至缺乏部分程度互補(bǔ)性(例如低于約30％的同一性)的第二靶標(biāo)來(lái)檢測(cè)；在沒(méi)有非特異性結(jié)合的情況下，探針將不與第二個(gè)非互補(bǔ)性靶標(biāo)雜交。
本領(lǐng)域公知可以使用大量相當(dāng)?shù)臈l件獲得低嚴(yán)格性條件；要考慮如下因素，如探針的長(zhǎng)度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)，靶標(biāo)的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液中或者被固定，等等)，鹽和其他成分的濃度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)，并且可以改變雜交溶液來(lái)產(chǎn)生與上述條件不同但是相當(dāng)?shù)牡蛧?yán)格性雜交條件。另外，本領(lǐng)域也知道促進(jìn)在高嚴(yán)格性條件下雜交的條件(例如提高雜交溫度和/或增加洗滌步驟，在雜交溶液中使用甲酰胺，等等)。
當(dāng)用于雙鏈核酸序列如cDNA或基因組克隆時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本同源”是指在上述低嚴(yán)格性條件下能夠與該雙鏈核酸序列的任一條或兩條鏈雜交的任何探針。
一個(gè)基因可以產(chǎn)生多個(gè)RNA類(lèi)型，它們是通過(guò)初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物的不同剪切而產(chǎn)生的。是同一基因的剪接變體的cDNA含有序列同一性或完全同源性區(qū)域(代表兩個(gè)cDNA上存在相同外顯子或相同外顯子的一部分)和完全非同一性區(qū)域(例如，表示cDNA 1上存在外顯子“A”，而不同的是，cDNA 2含有外顯子“B”)。由于兩個(gè)cDNA含有序列同一性區(qū)域，它們都將與來(lái)源于含兩個(gè)cDNA上序列的完整基因或基因部分的探針雜交；兩個(gè)剪接變體因此與該探針基本同源，并且彼此基因同源。
當(dāng)用于單鏈核酸序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本同源”是指在上述低嚴(yán)格性條件下能夠與該單鏈核酸序列雜交(即互補(bǔ))的任何探針。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“雜交”是指互補(bǔ)核酸的配對(duì)。雜交和雜交強(qiáng)度(即核酸之間的結(jié)合強(qiáng)度)受如下因素影響核酸之間的互補(bǔ)程度，有關(guān)條件的嚴(yán)格性，形成的雜合體的Tm，和核酸的G∶C比。
如本文使用的術(shù)語(yǔ)“Tm”是指“解鏈溫度”。解鏈溫度是一群雙鏈核酸分子有一半解離為單鏈時(shí)的溫度。用來(lái)計(jì)算核酸Tm的幾個(gè)方程式在本領(lǐng)域中公知。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所述，當(dāng)核酸存在于1M NaCl水溶液中時(shí)，Tm值的簡(jiǎn)單估計(jì)可以用如下方程式計(jì)算Tm＝81.5+0.41(％G+C)(參見(jiàn)，例如Anderson和Young，“定量濾膜雜交”，Nucleic Acid Hybridization )。其它參考文獻(xiàn)包括更復(fù)雜的計(jì)算，它們計(jì)算Tm考慮結(jié)構(gòu)及序列特征。
如本文使用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格性”用于指在該條件下進(jìn)行核酸雜交的溫度、離子強(qiáng)度和存在其他化合物如有機(jī)溶劑的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，通過(guò)改變分別或共同描述的參數(shù)可以改變“嚴(yán)格性”條件。在“高嚴(yán)格性”條件下，核酸堿基配對(duì)只在具有高頻率互補(bǔ)堿基序列的核酸片段之間發(fā)生(例如，在“高嚴(yán)格性”條件下，雜交可以在具有大約85-100％同一性，優(yōu)選大約70-100％同一性的同源物之間發(fā)生)。在中嚴(yán)格條件下，核酸堿基配對(duì)將在具有中等頻率互補(bǔ)堿基序列的核酸之間發(fā)生(例如，在“中嚴(yán)格性”條件下，雜交可以在具有大約50-70％同一性的同源物之間發(fā)生)。因此，對(duì)于來(lái)源于具有遺傳多樣性的生物的核酸，由于互補(bǔ)序列的頻率通常較低，因此常常需要“弱”或“低”嚴(yán)格性條件。
“高嚴(yán)格性條件”當(dāng)用于核酸雜交時(shí)，包括與下列條件相當(dāng)?shù)臈l件當(dāng)使用長(zhǎng)度約為500個(gè)核苷酸的探針時(shí)，在42℃下，在包含5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH調(diào)節(jié)為7.4)，0.5％SDS，5×Denhardt試劑和100μg/ml變性鮭精DNA的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在42℃下用包含0.1×SSPE，1.0％SDS的溶液洗滌。
“中嚴(yán)格性條件”當(dāng)用于核酸雜交時(shí)，包括與下列條件相當(dāng)?shù)臈l件當(dāng)使用長(zhǎng)度約為500個(gè)核苷酸的探針時(shí)，在42℃下，在包含5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH調(diào)節(jié)為7.4)，0.5％SDS，5×Denhardt試劑和100μg/ml變性鮭精DNA的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在42℃下用包含1.0×SSPE，1.0％SDS的溶液洗滌。
“低嚴(yán)格性條件”當(dāng)用于核酸雜交時(shí)，包括與下列條件相當(dāng)?shù)臈l件當(dāng)使用長(zhǎng)度約為500個(gè)核苷酸的探針時(shí)，在42℃下，在包含5×SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH調(diào)節(jié)為7.4)，0.1％SDS，5×Denhardt試劑[50×Denhardt試劑，每500ml含有5g Ficoil(400型，Pharamcia)，5g BSA(組分V；Sigma)]和100μg/ml變性鮭精DNA的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在42℃下用包含5×SSPE，0.1％SDS的溶液洗滌。
下列術(shù)語(yǔ)用來(lái)描述兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸之間的序列關(guān)系“參照序列”、“序列同一性”、“序列百分同一性”和“基本同一性”?！皡⒄招蛄小笔怯米餍蛄斜容^基礎(chǔ)的確定序列；參照序列可以是較大序列的一部分，例如，序列表中給出的全長(zhǎng)cDNA序列的片段，或者可以含有全部基因序列。參照序列的長(zhǎng)度通常為至少20個(gè)核苷酸，經(jīng)常至少25個(gè)核苷酸，常常至少50個(gè)核苷酸。由于兩個(gè)多核苷酸可能均(1)含有這兩個(gè)多核苷酸之間相似的序列(即，整個(gè)多核苷酸序列的一部分)，和(2)可進(jìn)一步含有在這兩個(gè)多核苷酸之間不同的序列，因此兩個(gè)(或多個(gè))多核苷酸之間的序列比較一般通過(guò)在“比較窗口”上比較兩個(gè)多核苷酸的序列來(lái)進(jìn)行，以鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域。本文使用的“比較窗口”是指概念化的至少20個(gè)相鄰核苷酸位點(diǎn)的片段，其中一種多核苷酸序列可以與至少20個(gè)相鄰核苷酸的參照序列進(jìn)行比較，并且其中該多核苷酸序列在比較窗口中的部分可含有與參照序列(不含添加或缺失)相比20％或更低的添加或缺失(即缺口)，用于兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。為了對(duì)準(zhǔn)比較窗口，最佳序列比對(duì)可以通過(guò)以下方法進(jìn)行Smith和Waterman的局部同源性算法[Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)]，Needleman和Wunsch的同源性比對(duì)算法[Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)]，Pearson和Lipman的相似性檢索法[Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)852444(1988)]，這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(Wisconsin遺傳軟件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，或者通過(guò)檢查，并且選擇通過(guò)各種方法產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即在比較窗口上導(dǎo)致最高的百分同源性)。術(shù)語(yǔ)“序列同一性”是指兩個(gè)多核苷酸序列在比較窗口上相同(即基于核苷酸與核苷酸一一比較)。術(shù)語(yǔ)“序列百分同一性”是如下計(jì)算的在比較窗口上比較兩個(gè)最佳排列的序列，確定在兩個(gè)序列中存在相同核酸堿基(例如A、T、C、G、U或I)的位點(diǎn)數(shù)，從而獲得匹配位點(diǎn)數(shù)，將匹配位點(diǎn)數(shù)除以比較窗口中位點(diǎn)的總數(shù)(即窗口大小)，再將結(jié)果乘以100，得到序列百分同一性。
當(dāng)用于多核苷酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本同一性”是指多核苷酸序列的一個(gè)特征，其中該多核苷酸含有的序列與參照序列相比，在至少20個(gè)核苷酸位點(diǎn)的比較窗口上，通常在至少25-50個(gè)核苷酸的窗口上，具有至少85％的序列同一性，優(yōu)選至少90-95％的序列同一性，更通常至少99％的序列同一性，其中該序列百分同一性是如下計(jì)算的將參照序列與可能含有占該參照序列20％或更少的缺失或添加的多核苷酸序列在比較窗口上進(jìn)行比較。參照序列可以是一個(gè)較大序列的一部分，例如，全長(zhǎng)序列的剪切變體。
當(dāng)用于多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本同一性”是指兩個(gè)肽序列，當(dāng)最佳比對(duì)時(shí)，例如使用程序GAP或BESTFIT使用缺省缺口權(quán)重時(shí)，具有至少80％的序列同一性，優(yōu)選至少90％的序列同一性，更優(yōu)選至少95％的序列同一性，或者更高(例如99％的序列同一性)。優(yōu)選地，不相同的殘基位點(diǎn)的差別在于保守氨基酸置換。保守氨基酸置換是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可交換性。例如，具有脂族側(cè)鏈的一組氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸包括絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸包括天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的一組氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸包括賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸包括半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸置換組包括纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴(lài)氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。
“擴(kuò)增”是核酸復(fù)制的一種特殊情況，與模板特異性有關(guān)。它與非特異性模板復(fù)制(即依賴(lài)于模板但是不依賴(lài)于特異性模板的擴(kuò)增)不同。模板特異性在此不同于復(fù)制的保真度(即正確多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)特異性。模板特異性通常以“靶標(biāo)”特異性的方式描述。靶序列是試圖從其他核酸中分選出的“靶標(biāo)”。已經(jīng)設(shè)計(jì)了主要用于這種分選的擴(kuò)增技術(shù)。
模板特異性在大多數(shù)擴(kuò)增技術(shù)中通過(guò)酶的選擇來(lái)實(shí)現(xiàn)。擴(kuò)增酶是在使用條件下只處理不均一核酸混合物中特定核酸序列的酶。例如，對(duì)于Q復(fù)制酶，MDV-1 RNA是該復(fù)制酶的特異性模板(D.L.Kacian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 693038 )。其他核酸將不被該擴(kuò)增酶復(fù)制。同樣，對(duì)于T7RNA聚合酶，該擴(kuò)增酶對(duì)其自己的啟動(dòng)子有嚴(yán)格特異性(M.Chamberlin等人，Nature 228227 )。對(duì)于T4 DNA連接酶，當(dāng)寡核苷酸或多核苷酸底物與模板之間在連接點(diǎn)處存在錯(cuò)配時(shí)，該酶不連接這兩個(gè)寡核苷酸或多核苷酸(D.Y.Wu和R.B.Wallace，Genomics 4560 )。最后，發(fā)現(xiàn)Taq和Pfu聚合酶由于在高溫下起作用的能力而顯示對(duì)引物結(jié)合的、因而被引物限定的序列具有高特異性；高溫導(dǎo)致有利于引物與靶序列雜交，而不與非靶序列雜交的熱動(dòng)力學(xué)條件(H.A.Erlich(編)，PCR Technology，Stockton Press )。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“可擴(kuò)增的核酸”用于指可被任何擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸。預(yù)期“可擴(kuò)增的核酸”通常包含“樣品模板”。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“樣品模板”是指來(lái)源于樣品、分析其中是否存在“靶標(biāo)”(下文定義)的核酸。相反，“背景模板”是指不同于樣品模板的核酸，它們可能存在于樣品中，或者可能不存在于樣品中。背景模板最通常是疏忽造成的。它可能是遺留(carryover)的結(jié)果，或者可能是由于存在試圖從樣品中提純出去的核酸污染物。例如，來(lái)源于所檢測(cè)生物之外的生物的核酸可以作為試驗(yàn)樣品的背景。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“引物”是指可以作為純化的限制酶切消化物天然存在，或者可以合成產(chǎn)生的寡核苷酸，當(dāng)置于誘導(dǎo)合成與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的條件下時(shí)(即在核苷酸和誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶的存在下，和適當(dāng)溫度和pH下)，它能夠作為合成的起點(diǎn)。為了擴(kuò)增效率最高，引物優(yōu)選是單鏈，但是也可以是雙鏈。如果是雙鏈，首先處理該引物使其鏈分開(kāi)，之后才用于制備延伸產(chǎn)物。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物應(yīng)當(dāng)足夠長(zhǎng)，以便在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的準(zhǔn)確長(zhǎng)度取決于許多因素，包括溫度、引物來(lái)源和方法的使用。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“探針”或“雜交探針”是指可以作為純化的限制酶切消化物天然存在，或者可以合成、重組或通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的寡核苷酸(即核苷酸序列)，它能夠與另一目標(biāo)寡核苷酸雜交，至少部分雜交。探針可以是單鏈或雙鏈的。探針在特定序列的檢測(cè)、鑒定和分離中有用。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的探針用“報(bào)道分子”標(biāo)記，使其可以在任何檢測(cè)系統(tǒng)中檢測(cè)，這些系統(tǒng)包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的組織化學(xué)試驗(yàn))、熒光、放射性和發(fā)光系統(tǒng)。本發(fā)明并非只限于任何具體檢測(cè)系統(tǒng)或標(biāo)記物。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶”是指所要檢測(cè)或表征的核酸序列或結(jié)構(gòu)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈反應(yīng)”(“PCR”)是指K.B.Mullis的方法(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利4,683,195、4,683,202和4,965,188號(hào)，在此引用作為參考)，其描述了不需克隆或純化而提高基因組DNA混合物中靶序列片段濃度的方法。這種用于擴(kuò)增靶序列的方法包括向含有所需靶序列的DNA混合物中引入大大過(guò)量的兩種寡核苷酸引物，然后在DNA聚合酶存在下以精確的順序進(jìn)行熱循環(huán)。這兩種引物與雙鏈靶序列的各自鏈互補(bǔ)。為了實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，變性該混合物，然后引物與靶分子內(nèi)各自的互補(bǔ)序列退火。退火后，用聚合酶延伸引物，從而形成新的一對(duì)互補(bǔ)鏈。變性、引物退火、聚合酶延伸的步驟可以重復(fù)多次(即變性、退火、延伸構(gòu)成一個(gè)“循環(huán)”；可以有多個(gè)“循環(huán)”)，從而獲得高濃度的所需靶序列的擴(kuò)增片段。所需靶序列的擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度取決于引物彼此的相對(duì)位置，因此，該長(zhǎng)度是一個(gè)可控制的參數(shù)。由于該過(guò)程是重復(fù)進(jìn)行的，因此該方法被稱(chēng)為“聚合酶鏈反應(yīng)”(下文稱(chēng)為“PCR”)。由于所需靶序列擴(kuò)增片段成為混合物中的主要序列(在濃度上)，它們被稱(chēng)為“PCR擴(kuò)增的”。
利用PCR，能夠?qū)⒒蚪MDNA中一個(gè)拷貝的特定靶序列擴(kuò)增至可以用幾種不同的方法檢測(cè)到的水平(例如與標(biāo)記探針雜交；摻入生物素化引物，之后進(jìn)行親和素-酶偶聯(lián)物檢測(cè)；向擴(kuò)增的片段中摻入32P-標(biāo)記的脫氧核苷酸三磷酸，如dCTP或dATP)。除了基因組DNA以外，任何寡核苷酸或多核苷酸序列也可以用適當(dāng)?shù)囊唤M引物分子擴(kuò)增。特別是，PCR方法本身產(chǎn)生的擴(kuò)增片段本身即是后續(xù)PCR擴(kuò)增的有效模板。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“PCR產(chǎn)物”、“PCR片段”和“擴(kuò)增產(chǎn)物”是指在完成兩個(gè)或多個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸的PCR步驟后產(chǎn)生的化合物的混合物。這些術(shù)語(yǔ)包括擴(kuò)增一種或多種靶序列的一個(gè)或多個(gè)片段的情況。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增試劑”是指除了引物、核酸模和擴(kuò)增酶之外，擴(kuò)增所需的那些試劑(脫氧核苷板酸三磷酸、緩沖液等)。一般地，擴(kuò)增試劑與其他反應(yīng)組分一起被放置在和包含于反應(yīng)容器(試管、微孔等)中。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)容器”是指可以在其中進(jìn)行反應(yīng)的系統(tǒng)，包括但不限于試管、孔、微孔(例如微量滴定板如96孔、384孔和1536孔測(cè)定板中的孔)、毛細(xì)管、纖維如光纖的端部、微觀流體裝置如流體芯片、柱和卡(包括但不限于例如Woudenberg等人的美國(guó)專(zhuān)利6,126,899號(hào)，Bedingham等人的美國(guó)專(zhuān)利6,627,159、6,720,187和6,734,401號(hào)，Mian等人的美國(guó)專(zhuān)利6,319,469和6,709,869號(hào)，Wilding等人的美國(guó)專(zhuān)利5,587,128和6,660,517號(hào)所述)，或任何表面(包括但不限于玻璃、塑料或硅表面、珠、微芯片，或非固體表面，如凝膠或樹(shù)狀聚體)上的試驗(yàn)部位。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“重組DNA分子”是指由利用分子生物學(xué)方法連接在一起的DNA片段組成的DNA分子。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“反義”是指與特定RNA序列(例如mRNA)互補(bǔ)的RNA序列。術(shù)語(yǔ)“反義鏈”是指與“有義”鏈互補(bǔ)的核酸鏈。符號(hào)(-)(即“負(fù)”)有時(shí)用來(lái)指反義鏈，符號(hào)(+)有時(shí)用于有義(即“正”)鏈。
術(shù)語(yǔ)“分離的”當(dāng)用于核酸時(shí)，如“分離的寡核苷酸”或“分離的多核苷酸”，是指從在天然來(lái)源中通常與之結(jié)合的至少一種污染核酸中鑒定和分離出的核酸序列。分離的核酸以不同于天然所見(jiàn)的形式或狀態(tài)存在。相反，未分離的核酸是以天然存在的狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的核酸，如DNA和RNA。例如，發(fā)現(xiàn)特定DNA序列(例如基因)在宿主細(xì)胞染色體上接近相鄰的基因；在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)RNA序列，如編碼特定蛋白質(zhì)的特定mRNA序列，是與編碼多種蛋白質(zhì)的大量其他mRNA的混合物。但是，分離的編碼多肽的核酸包括，例如，在細(xì)胞中通常表達(dá)該多肽的核酸，其中該核酸在染色體上的位置不同于天然細(xì)胞，或者其側(cè)翼為不同于天然所見(jiàn)的核酸序列。分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以單鏈或雙鏈形式存在。當(dāng)使用分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，該寡核苷酸或多核苷酸至少含有有義或編碼鏈(即，該寡核苷酸或多核苷酸可以是單鏈)，但是也可含有有義和反義鏈(即，該寡核苷酸或多核苷酸可以是雙鏈)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“部分”當(dāng)用于核苷酸序列時(shí)(如“特定核苷酸序列的一部分”，是指該序列的片段。該片段的大小可以是從4個(gè)核苷酸到整個(gè)核苷酸序列減一個(gè)核苷酸(例如10個(gè)核苷酸，11個(gè)，...，20個(gè)，...)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“純化”是指從樣品中除去污染物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“純化的”是指從天然環(huán)境中提取、分離或分開(kāi)的分子(例如核酸或氨基酸序列)。因此，“分離的核酸序列”是純化的核酸序列。“基本純化的”分子至少60％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少90％地不含與它們天然結(jié)合的其他成分。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“重組蛋白”或“重組多肽”是指由重組DNA分子表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“天然蛋白質(zhì)”是指一種蛋白質(zhì)不含載體序列所編碼的氨基酸殘基；即，該天然蛋白質(zhì)只含該蛋白質(zhì)在天然存在時(shí)所含的氨基酸。天然蛋白質(zhì)可以通過(guò)重組方法產(chǎn)生，或者可以從天然存在的來(lái)源中分離。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“部分”當(dāng)用于蛋白質(zhì)時(shí)(“特定蛋白質(zhì)的一部分”)，是指該蛋白質(zhì)的片段。該片段的大小可以是從4個(gè)連續(xù)氨基酸殘基到整個(gè)氨基酸序列減一個(gè)氨基酸。
術(shù)語(yǔ)“Southern印跡分析”是指在瓊脂糖或丙稀酰胺凝膠上分析DNA，以根據(jù)大小分離該DNA，隨后將該DNA從凝膠轉(zhuǎn)移至固體支持體，如硝酸纖維素或尼龍膜上。然后用標(biāo)記探針探查固定的DNA，以檢測(cè)與所用探針互補(bǔ)的DNA類(lèi)型。該DNA可以用限制性?xún)?nèi)切酶酶切，之后進(jìn)行電泳。電泳后，該DNA可以在向固體支持體轉(zhuǎn)移之前或過(guò)程中部分脫嘌呤及變性。Southern印跡分析是分子生物學(xué)家的標(biāo)準(zhǔn)工具(J.Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，NY，pp 9.31-9.58 )。
術(shù)語(yǔ)“Western印跡分析”是指對(duì)固定在支持體如硝酸纖維素或膜上的蛋白質(zhì)(或多肽)的分析。蛋白質(zhì)在丙稀酰胺凝膠上電泳，以分離該蛋白質(zhì)，然后將該蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固體支持體，如硝酸纖維素或尼龍膜上。固定的蛋白質(zhì)然后暴露于對(duì)目標(biāo)抗原具有反應(yīng)性的抗體。抗體的結(jié)合可以用多種方法檢測(cè)，包括使用標(biāo)記的抗體。
術(shù)語(yǔ)“測(cè)試化合物”是指在針對(duì)任何所需活性(例如，包括但不限于治療或預(yù)防疾病或機(jī)體功能紊亂，或者改變樣品的生理或細(xì)胞狀態(tài)的能力)的試驗(yàn)(例如藥物篩選試驗(yàn))中檢測(cè)的任何化學(xué)個(gè)體、藥物等。測(cè)試化合物包括已知的和潛在的治療性化合物。通過(guò)用本發(fā)明的篩選方法進(jìn)行篩選，可以確定一種測(cè)試化合物是治療性的?！耙阎闹委熜曰衔铩笔侵敢呀?jīng)證明(例如通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)或已有的人體施用經(jīng)驗(yàn))在這種治療或預(yù)防中有效的治療性化合物。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“樣品”為其最寬的含義。懷疑含有人染色體或人染色體相關(guān)序列的樣品可包括細(xì)胞、從細(xì)胞中分離的染色體(例如中期染色體分散)、基因組DNA(存在于溶液中或者與固體支持體結(jié)合，例如用于Southern印跡分析)、RNA(存在于溶液中或者與固體支持體結(jié)合，例如用于Northern印跡分析)、cDNA(存在于溶液中或者與固體支持體結(jié)合)等。懷疑含有蛋白質(zhì)的樣品可包括細(xì)胞、組織的一部分、含有一種或多種蛋白質(zhì)的提取物等。樣品包括但不限于組織切片、血液、血液組分(例如血清、血漿、細(xì)胞)、唾液、腦脊液、胸膜液、奶、淋巴、痰、精液、尿、糞便、羊水、絨膜絨毛樣品(CVS)、子宮頸拭子和腮拭子。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”是指可用來(lái)提供可檢測(cè)(優(yōu)選可定量)效應(yīng)并且能夠與核酸或蛋白質(zhì)連接的任何原子或分子。標(biāo)記物包括但不限于染料；放射性標(biāo)記，如32P；結(jié)合部分，如生物素；半抗原，如洋地黃毒苷；發(fā)光、磷光或熒光部分；單獨(dú)的熒光染料，或與通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)能夠抑制或轉(zhuǎn)移發(fā)射光譜的部分相組合的熒光染料。標(biāo)記物可以提供通過(guò)熒光、放射性、比色法、比重法、X-射線衍射或吸收、磁學(xué)、酶活性等可檢測(cè)到的信號(hào)。標(biāo)記物可以是帶電荷的部分(正或負(fù)電荷)，或者也可以帶中性電荷。標(biāo)記物可以包含核酸或蛋白質(zhì)序列或由其組成，只要含有該序列的標(biāo)記物是可以檢測(cè)的。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“信號(hào)”是指任何可檢測(cè)的效應(yīng)，如標(biāo)記物或測(cè)定反應(yīng)引起或產(chǎn)生的效應(yīng)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)器”是指一種系統(tǒng)或系統(tǒng)的部件，例如一種儀器(例如照相機(jī)、熒光計(jì)、電荷耦合裝置、閃爍計(jì)數(shù)器等)或一種反應(yīng)介質(zhì)(X-射線或照相機(jī)膠片、pH指示劑等)，它們能夠?qū)⑿盘?hào)或效應(yīng)的存在傳遞給用戶或系統(tǒng)的另一部件(例如計(jì)算機(jī)或控制器)。檢測(cè)器可以是光度計(jì)或分光光度計(jì)系統(tǒng)，其能夠檢測(cè)紫外線、可見(jiàn)光或紅外線，包括熒光或化學(xué)發(fā)光；輻射檢測(cè)系統(tǒng)；光譜系統(tǒng)，如核磁共振光譜、質(zhì)譜或表面增強(qiáng)的拉曼光譜系統(tǒng)；諸如凝膠或毛細(xì)管電泳或凝膠排阻層析的系統(tǒng)；或本領(lǐng)域公知的其他檢測(cè)系統(tǒng)，或者它們的組合。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“分配系統(tǒng)”是指能夠?qū)⑽镔|(zhì)從一個(gè)實(shí)體轉(zhuǎn)移和/或遞送至另一個(gè)實(shí)體，或者從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移和/或遞送至另一個(gè)位置的系統(tǒng)。例如，用于將檢測(cè)板(detection panel)從廠商或分銷(xiāo)商轉(zhuǎn)移給用戶的分配系統(tǒng)可以包括但不限于包裝室、郵件室和郵遞系統(tǒng)?；蛘?，該分配系統(tǒng)可以包括但不限于一個(gè)或多個(gè)遞送運(yùn)載工具和相關(guān)的遞送人員、陳列柜和分配中心。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利益方(例如檢測(cè)板廠商)使用分配系統(tǒng)將檢測(cè)板免費(fèi)、補(bǔ)貼費(fèi)用或低費(fèi)用地轉(zhuǎn)移給用戶。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“以低費(fèi)用”是指以降低的直接費(fèi)用將貨物或服務(wù)轉(zhuǎn)移給接收者(例如用戶)。在一些實(shí)施方案中，“以低費(fèi)用”是指免費(fèi)向接收者轉(zhuǎn)移貨物或服務(wù)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“以補(bǔ)貼費(fèi)用”是指貨物或服務(wù)的轉(zhuǎn)移，其中接收者的至少一部分費(fèi)用推遲或由另一方支付。在一些實(shí)施方案中，“以補(bǔ)貼費(fèi)用”是指免費(fèi)向接收者轉(zhuǎn)移貨物或服務(wù)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“免費(fèi)”是指無(wú)直接資金費(fèi)用地向接收者轉(zhuǎn)移貨物或服務(wù)。例如，當(dāng)檢測(cè)板由廠商或分銷(xiāo)商免費(fèi)提供給用戶(例如研究人員)時(shí)，用戶沒(méi)有直接為該試驗(yàn)付費(fèi)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”是指定量或定性地鑒定樣品中的分析物(例如DNA、RNA或蛋白質(zhì))。本文使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)試驗(yàn)”是指為了檢測(cè)樣品內(nèi)的核酸分析物的試劑盒、進(jìn)行的試驗(yàn)或程序。當(dāng)在存在目標(biāo)分析物的情況下進(jìn)行時(shí)，檢測(cè)試驗(yàn)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)或效應(yīng)，包括但不限于引入雜交過(guò)程、核酸切割(例如外切或內(nèi)切核酸酶)、核酸擴(kuò)增、核苷酸測(cè)序、引物延伸或核酸連接的試驗(yàn)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“功能性檢測(cè)寡核苷酸”是指用作檢測(cè)試驗(yàn)組分的寡核苷酸，其中當(dāng)該功能性檢測(cè)寡核苷酸作為檢測(cè)試驗(yàn)的寡核苷酸組分時(shí)，該檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)軌虺晒Φ貦z測(cè)(即產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào))目標(biāo)靶核酸。它與非功能性檢測(cè)寡核苷酸不同，當(dāng)非功能性檢測(cè)寡核苷酸作為檢測(cè)試驗(yàn)的寡核苷酸組分時(shí)，它在對(duì)特定靶核酸的檢測(cè)試驗(yàn)中不能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。確定一種寡核苷酸是否是功能性寡核苷酸可以利用檢測(cè)試驗(yàn)通過(guò)在特定靶核酸存在下檢測(cè)該寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“來(lái)自不同受試者”，如來(lái)自不同受試者的樣品或核酸，是指來(lái)自多個(gè)不同個(gè)體的樣品。例如，來(lái)自第一人的含基因組DNA血樣和來(lái)自第二人的含基因組DNA血樣都被認(rèn)為是來(lái)自不同受試者的血樣和基因組DNA樣品。含有來(lái)自不同受試者的5種靶核酸的樣品是包括來(lái)自5個(gè)不同個(gè)體的至少5種樣品的樣品。但是，該樣品可進(jìn)一步包括來(lái)自特定個(gè)體的多個(gè)樣品。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“一起處理”當(dāng)用于實(shí)驗(yàn)或測(cè)定時(shí)，是指同時(shí)或順序地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中實(shí)驗(yàn)結(jié)果一起(即在同一時(shí)間段內(nèi))產(chǎn)生、收集或分析。例如，位于多孔板單獨(dú)的孔中或位于微陣列不同部分中的多個(gè)不同的靶序列在檢測(cè)試驗(yàn)中一起處理，其中同時(shí)或順序地對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)，并且從該試驗(yàn)采集的數(shù)據(jù)也一起分析。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“試驗(yàn)數(shù)據(jù)”和“測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)”是指從試驗(yàn)進(jìn)行中采集的數(shù)據(jù)(例如用來(lái)檢測(cè)或定量基因、SNP或RNA)。測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)可以是任何形式，即，它可以是原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)或分析的試驗(yàn)數(shù)據(jù)(例如以前用不同方法分析的)。采集的還沒(méi)有進(jìn)一步處理或分析的數(shù)據(jù)在此被稱(chēng)為“原始”試驗(yàn)數(shù)據(jù)(例如對(duì)應(yīng)于信號(hào)測(cè)量值的數(shù)字，例如來(lái)自芯片上或反應(yīng)容器中斑點(diǎn)的熒光信號(hào)，或?qū)?yīng)于峰測(cè)量值的數(shù)字，例如峰高度或面積，例如來(lái)自質(zhì)譜儀、HPLC或毛細(xì)管分離裝置)，而已經(jīng)通過(guò)進(jìn)一步的步驟或分析(例如標(biāo)準(zhǔn)化、比較或通過(guò)計(jì)算處理)處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)被稱(chēng)為“分析的試驗(yàn)數(shù)據(jù)”或“輸出試驗(yàn)數(shù)據(jù)”。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“數(shù)據(jù)庫(kù)”是指為便于檢索而排列的，例如存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中的信息(例如數(shù)據(jù))的集合?！盎蚪M信息數(shù)據(jù)庫(kù)”是包含基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，該基因組信息包括但不限于多態(tài)性信息(即關(guān)于遺傳多態(tài)性的信息)，基因組信息(即基因組的信息)，連鎖信息(即關(guān)于例如染色體上一個(gè)核酸序列相對(duì)于另一核酸序列的物理位置的信息)，和疾病相關(guān)信息(即，將疾病的存在或易感性與受試者的物理性狀例如受試者的等位基因相關(guān)聯(lián)的信息)?！皵?shù)據(jù)庫(kù)信息”是指將要傳送給數(shù)據(jù)庫(kù)、存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中、在數(shù)據(jù)庫(kù)中處理或者從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索的信息。“序列數(shù)據(jù)庫(kù)信息”是指關(guān)于核酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)信息。本文使用的術(shù)語(yǔ)“不同的序列數(shù)據(jù)庫(kù)”是指兩個(gè)或多個(gè)含有彼此不同的信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，dbSNP和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)是不同的序列數(shù)據(jù)庫(kù)，因?yàn)樗鼈兏髯园硗庖粋€(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有的信息。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“處理器”和“中央處理器”或“CPU”可以替換使用，是指能夠從計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器(例如ROM或其他計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器)中讀取程序并且根據(jù)該程序運(yùn)行一組步驟的裝置。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器”和“計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)裝置”是指計(jì)算機(jī)處理器可讀的任何存儲(chǔ)介質(zhì)。計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器的例子包括但不限于RAM、ROM、計(jì)算機(jī)芯片、數(shù)字視頻盤(pán)(DVD)、光盤(pán)(CD)、硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器(HDD)和磁帶。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)”是指用于存儲(chǔ)及向計(jì)算機(jī)處理器提供信息(例如數(shù)據(jù)和指令)的任何裝置或系統(tǒng)。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的例子包括但不限于DVD、CD、硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器、磁帶和用于在網(wǎng)絡(luò)上傳播媒體的服務(wù)器。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“超鏈接”是指從一個(gè)文件到另一個(gè)文件，或者從文件的一個(gè)部分(或組分)到另一個(gè)部分(或組分)的導(dǎo)航鏈接。一般地，超鏈接顯示為突出顯示的文字或詞語(yǔ)，能夠通過(guò)用鼠標(biāo)點(diǎn)擊來(lái)選擇跳至相關(guān)的文件或文件部分。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“超文本系統(tǒng)”是指一種基于計(jì)算機(jī)的信息系統(tǒng)，其中文件(以及可能其他類(lèi)型的數(shù)據(jù)實(shí)體)通過(guò)超鏈接連接在一起，構(gòu)成用戶可導(dǎo)航的“網(wǎng)”。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“因特網(wǎng)”是指應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議的網(wǎng)絡(luò)的任何集合。例如，該術(shù)語(yǔ)包括通過(guò)一組標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議(如TCP/IP、HTTP和FTP)連接在一起構(gòu)成全球分布網(wǎng)絡(luò)的互聯(lián)的(公共的和/或私人的)網(wǎng)絡(luò)。盡管該術(shù)語(yǔ)是指現(xiàn)在通稱(chēng)為因特網(wǎng)的網(wǎng)絡(luò)，但是也包括未來(lái)可能形成的變化形式，包括對(duì)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議的改變和增加，或與其他媒體(例如電視、廣播等)的集成。該術(shù)語(yǔ)也包括非公共的網(wǎng)絡(luò)，如私有的(例如公司)內(nèi)聯(lián)網(wǎng)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“萬(wàn)維網(wǎng)”或“web”一般是指(i)互聯(lián)的、用戶可瀏覽的超文本文件(通稱(chēng)為Web文件或Web頁(yè))的分布式集合，它可以通過(guò)因特網(wǎng)訪問(wèn)，和(ii)客戶和服務(wù)器軟件組件，它使用戶可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的因特網(wǎng)協(xié)議訪問(wèn)這些文件。當(dāng)前，允許應(yīng)用程序定位和獲取Web文件的主要標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議是HTTP，而且Web頁(yè)是用HTML編碼的。但是，術(shù)語(yǔ)“Web”和“萬(wàn)維網(wǎng)”也包括未來(lái)可以代替(或補(bǔ)充)HTML和HTTP使用的標(biāo)注語(yǔ)言和傳輸協(xié)議。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“萬(wàn)維網(wǎng)站”是指使用萬(wàn)維網(wǎng)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議在網(wǎng)絡(luò)上提供信息內(nèi)容的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。一般地，萬(wàn)維網(wǎng)站對(duì)應(yīng)于特定的因特網(wǎng)域名，并且包括與特定組織有關(guān)的內(nèi)容。本文使用的該術(shù)語(yǔ)通常包括(i)在網(wǎng)絡(luò)上提供信息內(nèi)容的硬件/軟件服務(wù)器組件，和(ii)“后端”硬件/軟件組件，包括任何非標(biāo)準(zhǔn)的或?qū)Ｓ玫慕M件，它們與服務(wù)器組件交互作用，為萬(wàn)維網(wǎng)站用戶進(jìn)行服務(wù)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“HTML”是指超文本標(biāo)注語(yǔ)言，它是用于為文件中的信息內(nèi)容附加顯示和鏈接屬性的標(biāo)準(zhǔn)編碼約定和一組編碼。HTML基于SGML，標(biāo)準(zhǔn)通用標(biāo)注語(yǔ)言。在文件編輯階段，HTML編碼(稱(chēng)為“標(biāo)記”)被嵌入該文件的信息內(nèi)容內(nèi)。當(dāng)Web文件(或HTML文件)后來(lái)從Web服務(wù)器傳送到瀏覽器時(shí)，該瀏覽器解釋這些編碼，用來(lái)分析和顯示該文件。另外，在指定Web瀏覽器如何顯示文件時(shí)，可以用HTML標(biāo)記產(chǎn)生通向其他Web文件的鏈接(通稱(chēng)為“超鏈接”)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“XML”是指可擴(kuò)展標(biāo)記語(yǔ)言，這是一種類(lèi)似于HTML，基于SGML的應(yīng)用簡(jiǎn)檔文件。XML與HTML的不同在于信息提供方可以任意定義新的標(biāo)記和屬性名稱(chēng)；文件結(jié)構(gòu)可以嵌套為任意復(fù)雜性水平；任何XML文件可含有任選的對(duì)其語(yǔ)法的說(shuō)明，以供需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)的應(yīng)用程序使用。XML文件由被稱(chēng)為存儲(chǔ)單元的實(shí)體組成，這些存儲(chǔ)單元含有解析的或未解析的數(shù)據(jù)。解析的數(shù)據(jù)由字符組成，其中一些字符構(gòu)成字符數(shù)據(jù)，而其中一些構(gòu)成標(biāo)注。標(biāo)注編碼文件存儲(chǔ)布局和邏輯結(jié)構(gòu)的描述。XML提供了對(duì)存儲(chǔ)布局和邏輯結(jié)構(gòu)施加約束的機(jī)制，以限定對(duì)邏輯結(jié)構(gòu)的約束，以及支持預(yù)先限定的存儲(chǔ)單元的使用。利用一種被稱(chēng)為XML處理器的軟件模塊讀取XML文件，并提供對(duì)其內(nèi)容和結(jié)構(gòu)的訪問(wèn)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“HTTP”是指超文本傳輸協(xié)議，它是用于瀏覽器和Web服務(wù)器之間交換信息(如HTML文件，和客戶對(duì)這些文件的請(qǐng)求)的標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)維網(wǎng)客戶-服務(wù)器協(xié)議。HTTP包括大量不同類(lèi)型的信息，它們可以從客戶發(fā)送到服務(wù)器，以請(qǐng)求不同類(lèi)型的服務(wù)器動(dòng)作。例如，具有GET格式的“GET”信息使服務(wù)器返回位于指定URL處的文件或文檔。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“URL”是指統(tǒng)一資源定位符，它是完全指定文件或其他資源在因特網(wǎng)上的位置的獨(dú)特地址。URL的一般格式是協(xié)議//機(jī)器地址端口/路徑/文件名。端口說(shuō)明是任選的，如果用戶未輸入，則瀏覽器對(duì)于指定作為協(xié)議的服務(wù)默認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)端口。例如，如果指定HTTP作為協(xié)議，則瀏覽器使用HTTP的默認(rèn)端口80。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“PUSH技術(shù)”是指用來(lái)將數(shù)據(jù)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)傳送給用戶的信息傳送技術(shù)。在萬(wàn)維網(wǎng)(“pull”技術(shù))中，客戶瀏覽器在傳送之前應(yīng)當(dāng)請(qǐng)求Web頁(yè)，與之不同，PUSH協(xié)議是將信息內(nèi)容自動(dòng)傳送給用戶計(jì)算機(jī)，一般是基于用戶預(yù)先指定的信息。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“通訊網(wǎng)絡(luò)”是指使信息可從一個(gè)位置傳送到另一個(gè)位置的任何網(wǎng)絡(luò)。例如，用于將信息從一臺(tái)計(jì)算機(jī)傳送到另一臺(tái)計(jì)算機(jī)的通訊網(wǎng)絡(luò)包括使用電、光、衛(wèi)星傳送等傳遞信息的任何公共或?qū)Ｓ玫木W(wǎng)絡(luò)。兩個(gè)或多個(gè)裝置，作為通訊網(wǎng)絡(luò)的一部分，能夠直接或間接地將信息從一個(gè)傳送到另一個(gè)，則認(rèn)為它們彼此“電子通訊”。包括多臺(tái)計(jì)算機(jī)的計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)可以具有一臺(tái)中央計(jì)算機(jī)(“中央結(jié)點(diǎn)”)，該中央計(jì)算機(jī)處理信息，傳送給一臺(tái)或多臺(tái)執(zhí)行特定任務(wù)的子計(jì)算機(jī)(“子結(jié)點(diǎn)”)。一些網(wǎng)絡(luò)包括彼此位于“不同地理位置”的計(jì)算機(jī)，意思是這些計(jì)算機(jī)位于不同的物理位置(即，在物理學(xué)上不是同一臺(tái)計(jì)算機(jī)，例如，位于不同國(guó)家、州、城市、房間等)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)試驗(yàn)組分”是指能夠進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)的系統(tǒng)的組分。檢測(cè)試驗(yàn)組分包括但不限于雜交探針、緩沖液等。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“用于靶標(biāo)檢測(cè)的檢測(cè)試驗(yàn)”是指當(dāng)用靶核酸實(shí)施時(shí)能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的試驗(yàn)組分的集合。例如，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)證明的用來(lái)檢測(cè)特定單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)試驗(yàn)被認(rèn)為是用于靶標(biāo)檢測(cè)的檢測(cè)試驗(yàn)。
本文使用的短語(yǔ)“獨(dú)特檢測(cè)試驗(yàn)”是指與位于同一檢測(cè)板上的其他檢測(cè)試驗(yàn)相比，具有不同檢測(cè)試驗(yàn)組分集合的檢測(cè)試驗(yàn)。獨(dú)特試驗(yàn)不是必須與同一檢測(cè)板上的其他試驗(yàn)檢測(cè)不同的靶標(biāo)(例如SNP)，但是它在用來(lái)檢測(cè)特定靶標(biāo)的組分集合中具有至少一個(gè)差異(例如，與同一檢測(cè)板上的其他試驗(yàn)相比，一種獨(dú)特檢測(cè)試驗(yàn)可以使用在長(zhǎng)度上更短或更長(zhǎng)的探針序列)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“候選物”是指懷疑具有特定特征或性質(zhì)的測(cè)定或分析物，例如核酸。“候選序列”是指懷疑含有特定序列的核酸，而“候選寡核苷酸”是指懷疑具有一種性質(zhì)的寡核苷酸，例如這種性質(zhì)是包含特定序列，或者具有與靶核酸雜交或在檢測(cè)試驗(yàn)中進(jìn)行的能力?！昂蜻x檢測(cè)試驗(yàn)”是指懷疑是有效檢測(cè)試驗(yàn)的檢測(cè)試驗(yàn)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)板”是指一種基底或裝置，其包括至少兩個(gè)用于靶標(biāo)檢測(cè)的獨(dú)特候選檢測(cè)試驗(yàn)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“有效檢測(cè)試驗(yàn)”是指已經(jīng)證實(shí)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)靶標(biāo)檢測(cè)與表型(例如醫(yī)學(xué)狀況)之間關(guān)系的檢測(cè)試驗(yàn)。有效檢測(cè)試驗(yàn)的例子包括但不限于，當(dāng)檢測(cè)靶標(biāo)時(shí)，95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或99.9％精確預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)表型的檢測(cè)試驗(yàn)。有效檢測(cè)試驗(yàn)的其他例子包括但不限于，作為分析物特異性試劑(即由FDA規(guī)章確定的)或體外診斷劑(即FDA批準(zhǔn)的)合格和/或銷(xiāo)售的檢測(cè)試驗(yàn)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指用來(lái)遞送物質(zhì)的任何遞送系統(tǒng)。在反應(yīng)測(cè)定中，這樣的遞送系統(tǒng)包括可以貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)試劑(例如適當(dāng)容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如進(jìn)行試驗(yàn)的緩沖液、書(shū)面說(shuō)明書(shū)等)或?qū)⑵鋸囊粋€(gè)位置遞送到另一個(gè)位置的系統(tǒng)。例如，試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)外殼(例如盒子)，該外殼中包含相關(guān)的反應(yīng)試劑和/或支持材料。本文使用的術(shù)語(yǔ)“分區(qū)試劑盒″是指包含兩個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的容器的遞送系統(tǒng)，每個(gè)容器中含有總試劑盒組分的亞部分。這些容器可以一起或分開(kāi)遞送到目標(biāo)受體。例如，第一個(gè)容器可以含有在試驗(yàn)中使用的酶，而第二個(gè)容器含有寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)“分區(qū)試劑盒”包括含有《聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法》第520(e)部分規(guī)定的分析純?cè)噭?ASR′s)的試劑盒，但是不限于這些。實(shí)際上，術(shù)語(yǔ)“分區(qū)試劑盒”包括包含兩個(gè)或多個(gè)分開(kāi)容器的任何遞送系統(tǒng)，其中每個(gè)容器含有總試劑盒組分的亞部分。相反，“組合試劑盒”是指在一個(gè)容器中含有反應(yīng)試驗(yàn)的所有組分(例如在一個(gè)盒子包含所有需要的組分)的遞送系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“試劑盒”既包括分區(qū)試劑盒也包括組合試劑盒。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“信息”是指事實(shí)或數(shù)據(jù)的任何集合。對(duì)于用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包括但不限于因特網(wǎng)，存儲(chǔ)或處理的信息，該術(shù)語(yǔ)是指以任何格式(例如模擬、數(shù)字、光等)存儲(chǔ)的任何數(shù)據(jù)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“與受試者有關(guān)的信息”是指關(guān)于受試者(例如人、植物或動(dòng)物)的事實(shí)或數(shù)據(jù)。術(shù)語(yǔ)“基因組信息”是指關(guān)于基因組的信息，包括但不限于核酸序列、基因、等位基因頻率、RNA表達(dá)水平、蛋白質(zhì)表達(dá)、與基因型相關(guān)的表型等?！暗任换蝾l率信息”是指關(guān)于等位基因頻率的事實(shí)或數(shù)據(jù)，包括但不限于等位基因身份，等位基因的存在與受試者(例如人類(lèi)受試者)特征之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，個(gè)體或群體中等位基因的存在或不存在，等位基因在具有一個(gè)或多個(gè)特定特征的個(gè)體中存在的百分可能性，等等。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“試驗(yàn)確認(rèn)信息”是指處理試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)(例如借助于計(jì)算機(jī)處理)獲得的基因組信息和/或等位基因頻率信息。例如，可以利用試驗(yàn)確認(rèn)信息來(lái)確定特定候選檢測(cè)試驗(yàn)為有效檢測(cè)試驗(yàn)。
發(fā)明詳述生物樣品的檢測(cè)分子診斷的一個(gè)目的是用盡可能少的勞動(dòng)和步驟，在盡可能短的時(shí)間內(nèi)，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、靈敏的分析物檢測(cè)。一種實(shí)現(xiàn)方法是對(duì)樣品中分析物的多重檢測(cè)，其允許多個(gè)檢測(cè)事件在單一反應(yīng)容器或溶液中發(fā)生。但是，許多現(xiàn)有的診斷方法，包括多重反應(yīng)，仍然需要許多步驟，包括樣品制備步驟，這延長(zhǎng)了進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)間，增加了復(fù)雜性和費(fèi)用。本發(fā)明在一些實(shí)施方案中通過(guò)提供可以對(duì)未純化或未處理的生物樣品(例如血液)直接進(jìn)行的試驗(yàn)，提供了這些問(wèn)題的解決方案。
生物樣品(例如血液、唾液、尿等)的直接檢測(cè)難以進(jìn)行的，因?yàn)樘烊粯悠分写嬖诘拇罅可镆蜃涌筛蓴_診斷反應(yīng)的運(yùn)行、準(zhǔn)確度和一致性。例如，許多核酸檢測(cè)技術(shù)使用對(duì)特定鹽和pH濃度敏感的，或者遭受蛋白水解或被天然因子抑制的酶或其他試劑。本發(fā)明提供用于INVADER試驗(yàn)的系統(tǒng)和方法，其單獨(dú)或與PCR或有關(guān)技術(shù)組合，用于直接檢測(cè)未純化的體液中的核酸靶序列。下面的實(shí)施例12提供了一個(gè)這樣的實(shí)施例。這些方法可以用作單獨(dú)反應(yīng)，或者可以用作多重反應(yīng)。下文詳細(xì)描述了幾個(gè)多重實(shí)施方案。
因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)未純化的(或部分純化的)體液中的一種或多種靶核酸的系統(tǒng)、組合物、試劑盒和方法，包括在可以檢測(cè)靶核酸(如果存在的話)的條件下將未純化的體液暴露于檢測(cè)試驗(yàn)試劑的步驟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法在一步反應(yīng)中進(jìn)行。例如，一旦樣品暴露于試劑，則在檢測(cè)步驟之前不需要加入其他試劑。因此，該方法可以在反應(yīng)容器(例如封閉的反應(yīng)容器)中進(jìn)行，而不需要人工添加或其他干預(yù)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括侵入切割反應(yīng)，組合或不組合聚合酶鏈反應(yīng)。由于在應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)時(shí)，使用侵入切割反應(yīng)獲得的信號(hào)擴(kuò)增、靈敏度和定量信號(hào)的能力，只需使用有限的循環(huán)(例如20、15、12、10個(gè)或更少)。用于進(jìn)行或輔助這些方法的試劑盒可以包含任意一種或多種在該方法中有用的試劑。例如，在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包含聚合酶、5′核酸酶(例如FEN-1內(nèi)切核酸糖)和緩沖液，其允許可檢測(cè)地?cái)U(kuò)增未純化的體液中的靶核酸。
多重反應(yīng)由于1988年的介紹(Chamberlain等人.Nucleic Acids Res.，1611141(1988))，多重PCR已經(jīng)成為在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增多個(gè)基因座的常規(guī)手段。該方法已經(jīng)用于大量研究應(yīng)用，以及臨床應(yīng)用。已經(jīng)記載多重PCR尤其用于診斷病毒學(xué)(Elnifro等人.Clinical MicrobiologyReviews，13559(2000))、親系測(cè)驗(yàn)(Hidding和Schmitt，F(xiàn)orensicSci.Int.，11347(2000)；Bauer等人，Int.J.Legal Med.11639(2002))、著床前胚胎遺傳學(xué)診斷(Ouhibi等人，Curr WomensHealth Rep.1138(2001))、環(huán)境和食物樣品中的微生物分析(Rudi等人，Int J Food Microbiology，78171(2002))和獸醫(yī)學(xué)(Zarlenga和Higgins，Vet Parasitol.101215(2001))研究。最近，遺傳分析擴(kuò)展到全基因組水平，特別是用于單核苷酸多態(tài)性，或SNP，已經(jīng)產(chǎn)生了對(duì)高度多重PCR能力的需要?；蚪M寬度的比較相關(guān)性和候選基因研究需要對(duì)每個(gè)個(gè)體100,000-500,000個(gè)SNP進(jìn)行基因分型的能力(Kwok，Molecular Medicine Today，5538-5435(1999)；Kwok，Pharmacogenomics，1231(2000)；Risch和Merikangas，Science，2731516(1996))。而且，編碼區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)中的SNP改變重要途徑中的基因功能(Cargill等人Nature Genetics，22231(1999)；Halushka等人，Nature Genetics，22239(1999))，使這些SNP成為在個(gè)體醫(yī)學(xué)中有用的診斷工具(Hagmann，Science，28521(1999)；Cargill等人.Nature Genetics，22231(1999)；Halusbka等人，Nature Genetics，22239(1999))。同樣，作為診斷系列的一部分，確認(rèn)以前曾鑒定其潛在臨床相關(guān)性的一組SNP的醫(yī)學(xué)相關(guān)性，將意味著一次檢測(cè)上千個(gè)個(gè)體的上千個(gè)標(biāo)記物。
盡管具有巨大的吸收力和廣泛的應(yīng)用，但是有幾個(gè)因素使多重PCR擴(kuò)增變得復(fù)雜。主要是PCR或擴(kuò)增偏好現(xiàn)象，其中某些基因座比其他基因座得到程度更高的擴(kuò)增。已經(jīng)描述了兩種類(lèi)型的擴(kuò)增偏好。一種被稱(chēng)為PCR漂移，其原因是反應(yīng)早期引物退火等步驟中的隨機(jī)變化(Polz和Cavanaugh，Applied and Environmental Microbiology，643724(1998))，是不可再現(xiàn)的，當(dāng)極少量靶分子被擴(kuò)增時(shí)可能更加普遍(Walsh等人，PCR Methods and Applications，1241(1992))。另一種被稱(chēng)為PCR選擇，是由于根據(jù)引物特性、擴(kuò)增子長(zhǎng)度、G-C含量和基因組的其他性質(zhì)，某些基因座優(yōu)先擴(kuò)增(Polz，同上)。
影響PCR反應(yīng)可被多重化的程度的另一種因素是PCR反應(yīng)所固有的達(dá)到平臺(tái)期的趨勢(shì)。平臺(tái)期見(jiàn)于后面的PCR循環(huán)中，反映了如下發(fā)現(xiàn)，即擴(kuò)增子的產(chǎn)生從指數(shù)向假線性積累轉(zhuǎn)化，最終停止增加。這種效果似乎是由于DNA聚合酶和雙鏈產(chǎn)物本身之間的非特異性相互作用。對(duì)于幾種DNA聚合酶，平臺(tái)期的產(chǎn)物與酶的摩爾比通常一致，甚至當(dāng)反應(yīng)中包含不同量的酶同樣如此時(shí)，大約為30∶1的產(chǎn)物酶。該效應(yīng)從而限制了PCR反應(yīng)中可以產(chǎn)生的雙鏈產(chǎn)物的總量，因此擴(kuò)增的不同基因座的數(shù)量必須與后續(xù)分析例如凝膠電泳、引物延伸等所需的各種擴(kuò)增子的總量相平衡。
由于這些及其他的考慮，盡管已經(jīng)報(bào)道了包括50個(gè)基因座的多重PCR(Lindblad-Toh等人，Nature Genet.4381(2000))，但是多重化一般僅限于少于10個(gè)不同的產(chǎn)物。但是，假如需要從一個(gè)基因組DNA樣品中分析多達(dá)100,000至450,000個(gè)SNP，則顯然需要擴(kuò)展PCR反應(yīng)的多重化能力的手段。
本發(fā)明提供了使PCR反應(yīng)實(shí)質(zhì)性多重化的方法，例如，通過(guò)組合INVADER試驗(yàn)與多重PCR擴(kuò)增。INVADER試驗(yàn)提供檢測(cè)步驟和信號(hào)擴(kuò)增，使得極大量的靶標(biāo)可以在一個(gè)多重反應(yīng)中檢測(cè)。如所希望的，數(shù)百個(gè)至數(shù)千個(gè)至數(shù)十萬(wàn)個(gè)靶標(biāo)可以在一個(gè)多重反應(yīng)中檢測(cè)。
通過(guò)INVADER試驗(yàn)進(jìn)行直接基因分型根據(jù)檢測(cè)平臺(tái)不同一般每個(gè)SNP使用5-100ng人基因組DNA。對(duì)于少量試驗(yàn)，該反應(yīng)可以用基因組DNA直接進(jìn)行，而不需要預(yù)擴(kuò)增靶標(biāo)，但是，隨著超過(guò)100,000個(gè)INVADER試驗(yàn)的發(fā)展，甚至基因組寬度相關(guān)性研究所期望的更大量試驗(yàn)，樣品DNA的量可能成為限制因素。
因?yàn)镮NVADER試驗(yàn)提供106-107倍的信號(hào)擴(kuò)增，與典型PCR相比，多重PCR組合INVADER試驗(yàn)將只使用有限的靶標(biāo)擴(kuò)增。結(jié)果，低靶標(biāo)擴(kuò)增水平減輕了混合物中各反應(yīng)之間的干擾，減少了產(chǎn)物積累對(duì)PCR的抑制，從而提供更廣泛的多重化。另外，預(yù)期低擴(kuò)增水平降低了靶標(biāo)交叉污染的可能性，減少了PCR誘導(dǎo)的突變的數(shù)量。
不同基因座的不均勻擴(kuò)增是多重PCR開(kāi)發(fā)中最大的挑戰(zhàn)之一。兩個(gè)基因座之間擴(kuò)增倍數(shù)的差異可能導(dǎo)致使用慢擴(kuò)增基因座的INVADER反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)低于該試驗(yàn)的檢測(cè)下限，而來(lái)自快擴(kuò)增基因座的信號(hào)超出該試驗(yàn)飽和水平的情況。這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)幾種方法解決。在一些實(shí)施方案中，INVADER反應(yīng)可以在不同的時(shí)間點(diǎn)讀取，例如實(shí)時(shí)讀取，從而顯著擴(kuò)大了該檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍。在另外一些實(shí)施方案中，多重PCR可以在使不同基因座達(dá)到比較相似的擴(kuò)增水平的條件下進(jìn)行。例如，可以限制引物濃度，從而使各個(gè)基因座都達(dá)到比較均一的擴(kuò)增水平。在另外其他一些實(shí)施方案中，可以調(diào)節(jié)PCR引物的濃度，以平衡不同基因座的擴(kuò)增倍數(shù)。
本發(fā)明提供了高度多重PCR的設(shè)計(jì)和特征，包括在一個(gè)反應(yīng)中產(chǎn)生幾百至幾千的產(chǎn)物。例如，數(shù)百重PCR引起的靶標(biāo)預(yù)擴(kuò)增使基于INVADER的SNP基因分型所需的人基因組DNA的量降至每個(gè)試驗(yàn)不到0.1ng。高度多重PCR優(yōu)化和用于引物設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序的詳細(xì)說(shuō)明在下文中提供。
除了提供高度多重PCR的方法以外，本發(fā)明還提供了在單一反應(yīng)容器進(jìn)行靶標(biāo)和信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)的方法，該方法在最初的反應(yīng)設(shè)置之外不需要后續(xù)操作或添加試劑。這些組合反應(yīng)適于在極短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)定量分析有限量的靶標(biāo)。
下面的內(nèi)容提供了對(duì)本發(fā)明某些優(yōu)選說(shuō)明性實(shí)施方案的描述，并非限制本發(fā)明的范圍。
1.多重PCR引物設(shè)計(jì)INVADER試驗(yàn)可以使用少至100-10ng的基因組DNA檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，而不需預(yù)擴(kuò)增靶標(biāo)。但是，隨著開(kāi)發(fā)了超過(guò)50,000種INVADER試驗(yàn)，并且全基因組相關(guān)性研究的能力涉及數(shù)十萬(wàn)個(gè)SNP，樣品DNA的量成為大規(guī)模分析的限制因素。由于INVADER試驗(yàn)不需要靶標(biāo)擴(kuò)增即對(duì)人基因組DNA(hgDNA)具有靈敏性，與需要大量擴(kuò)增(109-1012)進(jìn)行常規(guī)凝膠檢測(cè)方法的典型多重PCR反應(yīng)相比，多重PCR組合INVADER試驗(yàn)只需有限的靶標(biāo)擴(kuò)增(103-104)。用于INVADERTM檢測(cè)的低水平靶標(biāo)擴(kuò)增通過(guò)避免靶標(biāo)積累通常產(chǎn)生的擴(kuò)增抑制提供了更廣泛的多重化。
本發(fā)明提供可產(chǎn)生用于多重PCR的引物組的方法和選擇標(biāo)準(zhǔn)(例如可以與檢測(cè)試驗(yàn)如INVADER試驗(yàn)組合)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的應(yīng)用軟件使多重PCR引物選擇自動(dòng)化，從而允許用這樣設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行高度多重PCR。使用INVADER醫(yī)學(xué)相關(guān)檢測(cè)板(MedicallyAssociated Panel)(MAP)作為SNP檢測(cè)的相應(yīng)平臺(tái)，如實(shí)施例2所述，本發(fā)明的方法、軟件和選擇標(biāo)準(zhǔn)允許對(duì)來(lái)自一個(gè)PCR反應(yīng)的101個(gè)可能擴(kuò)增子中的94個(gè)(～93％)進(jìn)行精確基因分型。原PCR反應(yīng)只使用10ng hgDNA作為模板，相當(dāng)于每個(gè)INVADER試驗(yàn)不到150pg hgDNA。
INVADER試驗(yàn)允許使用等溫、單次添加的形式在同一反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)兩種不同的等位基因。等位基因的區(qū)別通過(guò)探針的“結(jié)構(gòu)特異性”切割來(lái)進(jìn)行，釋放對(duì)應(yīng)于特定多態(tài)性的5′翼。在第二個(gè)反應(yīng)中，釋放的5′翼介導(dǎo)適當(dāng)FRET盒切割引起的信號(hào)產(chǎn)生。
對(duì)于使用本發(fā)明應(yīng)用軟件的一個(gè)實(shí)施方案在INVADER醫(yī)學(xué)組合板上進(jìn)行分析可用的序列的101個(gè)引物組，一個(gè)引物對(duì)(正向和反向引物)的產(chǎn)生涉及單一入口的樣品輸入文件(例如用本發(fā)明的方法和軟件處理的含SNP單靶序列的靶序列信息)。靶序列信息包括第三次浪潮技術(shù)公司(Third Wave Technologies)的SNP號(hào)、短名標(biāo)識(shí)符和在括號(hào)中標(biāo)出SNP位置的序列。同一入口的樣品輸出文件(例如顯示使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法和軟件處理后的靶序列)包括足跡區(qū)序列(位于SNP位點(diǎn)之側(cè)的大寫(xiě)字母，為了檢測(cè)靶序列中的SNP，顯示INVADER試驗(yàn)探針與該靶序列雜交的區(qū)域)，正向和反向引物序列(粗體)，以及它們相應(yīng)的Tm。
在一些實(shí)施方案中，為制備能夠進(jìn)行多重PCR的引物組的引物選擇以自動(dòng)化方式進(jìn)行(例如通過(guò)應(yīng)用軟件)。用于多重PCR的自動(dòng)化引物選擇可以用如圖8流程圖所示設(shè)計(jì)的軟件程序?qū)崿F(xiàn)。
多重PCR通常需要廣泛優(yōu)化來(lái)避免所選擴(kuò)增子的偏好擴(kuò)增，和引物-二聚體形成導(dǎo)致的假產(chǎn)物的擴(kuò)增。為了避免這些問(wèn)題，本發(fā)明提供了方法和應(yīng)用軟件，它們?yōu)楫a(chǎn)生用于多重PCR的引物組提供選擇標(biāo)準(zhǔn)，然后在檢測(cè)試驗(yàn)(例如INVADER檢測(cè)試驗(yàn))中使用。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和應(yīng)用軟件開(kāi)始于用戶確定的序列和相應(yīng)的SNP位置。在某些實(shí)施方案中，方法和/或應(yīng)用軟件確定各個(gè)序列的靶序列內(nèi)的足跡區(qū)(INVADER檢測(cè)所需的最小擴(kuò)增子)。足跡區(qū)包括測(cè)定探針雜交的區(qū)域，以及用戶確定的向外延伸的任何其他堿基(例如在測(cè)定探針雜交處每側(cè)包含另外5個(gè)堿基)。其次，引物從足跡區(qū)向外設(shè)計(jì)，并且根據(jù)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)，包括在當(dāng)前多重化組中與以前設(shè)計(jì)的引物形成引物二聚體的可能性。該過(guò)程可以通過(guò)同一組序列的多重迭代繼續(xù)，直到能夠設(shè)計(jì)出針對(duì)當(dāng)前多重化組中所有序列的引物。
一旦設(shè)計(jì)了引物組，即可以進(jìn)行多重PCR，例如在標(biāo)準(zhǔn)條件下，只使用10ng的hgDNA作為模板進(jìn)行。95℃10分鐘后，可向50μl反應(yīng)體系中加入Taq(2.5單位)，PCR進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)物可以稀釋?zhuān)⒅苯蛹訕拥絀NVADER MAP板上(3μl/孔)?？上騃NVADER MAP板上的每個(gè)反應(yīng)中加入另外3μl 15mM MgCl2，并用6μl礦物油覆蓋。然后整個(gè)板可以加熱至95℃保持5分鐘，并在63℃下溫育40分鐘。然后可以用Cytofluor 4000熒光讀板儀測(cè)量FAM和RED熒光，計(jì)算每個(gè)擴(kuò)增子的“零以上倍數(shù)”(Fold Over Zero)(FOZ)值。各個(gè)SNP的結(jié)果可以在表中用顏色編碼為“通過(guò)”(綠色)、“錯(cuò)誤呼叫(mis-call)”(粉紅色)或“無(wú)呼叫(no-call)”(白色)(參見(jiàn)下面的實(shí)施例2)。
在一些實(shí)施方案中，PCR反應(yīng)的數(shù)量為約1個(gè)至約10個(gè)反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，PCR反應(yīng)的數(shù)量為約10個(gè)至約50個(gè)反應(yīng)。在另一些實(shí)施方案中，PCR反應(yīng)的數(shù)量為約50個(gè)至約100個(gè)。在另一些實(shí)施方案中，PCR反應(yīng)的數(shù)量為約100個(gè)至約1000個(gè)。在另一些實(shí)施方案中，PCR反應(yīng)的數(shù)量大于1000個(gè)。
本發(fā)明也提供優(yōu)化多重PCR反應(yīng)的方法(例如一旦產(chǎn)生引物組，即可以?xún)?yōu)化各個(gè)引物或引物對(duì)的濃度)。例如，一旦產(chǎn)生引物組并且在多重PCR中以等摩爾濃度使用，即可以分別評(píng)價(jià)該引物，從而確定最佳引物濃度，使多重引物組表現(xiàn)更好。
與標(biāo)準(zhǔn)的單重PCR反應(yīng)相比，多重PCR反應(yīng)在科學(xué)、研究、臨床和生物技術(shù)工業(yè)上被認(rèn)為是可能節(jié)省時(shí)間且費(fèi)用較低的獲得核酸信息的方法。不是每個(gè)反應(yīng)容器(例如管或多孔板的孔)只進(jìn)行一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)，而是大量擴(kuò)增反應(yīng)在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行。
在試驗(yàn)設(shè)置和數(shù)據(jù)分析中通過(guò)節(jié)省技術(shù)人員的時(shí)間，以及通過(guò)大大節(jié)約試劑(特別是酶的成本)，在理論上降低了每個(gè)靶標(biāo)的成本。多重方法的另一優(yōu)點(diǎn)是只需要極少量的靶標(biāo)樣品。在涉及數(shù)十萬(wàn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的全基因組相關(guān)性研究中，靶標(biāo)或檢測(cè)樣品的量是大規(guī)模分析的限制因素，因此使用一個(gè)樣品等份進(jìn)行一個(gè)反應(yīng)獲得例如100個(gè)結(jié)果的概念，相對(duì)于使用100個(gè)樣品等份獲得同樣的數(shù)據(jù)組，是一個(gè)有吸收力的選擇。
為了設(shè)計(jì)用于成功多重PCR反應(yīng)的引物，應(yīng)當(dāng)解決引物之間的異常相互作用問(wèn)題。引物二聚體的形成，即使只有幾個(gè)堿基的長(zhǎng)度，也可抑制兩條引物與靶序列的正確雜交。另外，如果在引物3′末端處或附近形成二聚體，將不發(fā)生擴(kuò)增或發(fā)生極低水平的擴(kuò)增，因?yàn)橐l(fā)事件需要3′末端。顯然，每個(gè)多重反應(yīng)使用的引物越多，異常引物相互作用的可能性越大。本發(fā)明的方法、系統(tǒng)和應(yīng)用有助于防止大引物組中形成引物二聚體，從而使該引物組適合于高度多重PCR。
當(dāng)對(duì)大量位點(diǎn)(例如一個(gè)多重PCR反應(yīng)中的100個(gè)位點(diǎn))設(shè)計(jì)引物對(duì)時(shí)，引物對(duì)的設(shè)計(jì)順序可能影響適合于反應(yīng)的引物對(duì)的總數(shù)。例如，如果為正巧是A/T富含靶區(qū)的第一靶區(qū)設(shè)計(jì)第一組引物，則這些引物將是富含A/T的。如果選擇的第二靶區(qū)也正巧是A/T富含靶區(qū)，則為這兩組設(shè)計(jì)的引物極可能由于異常相互作用如形成引物二聚體而不相容。但是，如果選擇的第二靶區(qū)不富含A/T，則更可能設(shè)計(jì)出不與第一A/T富含組相互作用的引物組。對(duì)于任何特定組的輸入靶序列，本發(fā)明將設(shè)計(jì)引物組的順序隨機(jī)化(參見(jiàn)圖8)。另外，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明以多種不同的、隨機(jī)的順序?qū)⑤斎氚行蛄薪M重新排序，從而使適合用于任何特定多重反應(yīng)的引物組的數(shù)量最大化(參見(jiàn)圖8)。
本發(fā)明提供在多重設(shè)計(jì)中使3’引物相互作用最小而使適合用于一組特定反應(yīng)靶標(biāo)的引物對(duì)數(shù)量最大的引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于表示為5′-N[x]-N[x-1]-.....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′的引物，N[1]是A或C(在替代實(shí)施方案中，N[1]是G或T)。設(shè)計(jì)的各正向和反向引物的N[2]-N[1]應(yīng)當(dāng)不與任何其他寡核苷酸的N[2]-N[1]互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，N[3]-N[2]-N[1]應(yīng)當(dāng)不與任何其他寡核苷酸的N[3]-N[2]-N[1]互補(bǔ)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，如果在給定N[1]處不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，則正向引物5′方向的下一個(gè)堿基或反向引物3′方向的下一個(gè)堿基可以作為N[1]位點(diǎn)評(píng)價(jià)。重復(fù)該過(guò)程，同時(shí)進(jìn)行靶標(biāo)隨機(jī)化，直到所有或大多數(shù)靶序列滿足所有標(biāo)準(zhǔn)(例如95％的靶序列可具有為滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的引物組制備的引物對(duì))。
在多重引物設(shè)計(jì)中需要克服的另一個(gè)挑戰(zhàn)是實(shí)際的、需要的核苷酸序列、序列長(zhǎng)度和寡核苷酸解鏈溫度(Tm)約束之間的平衡。重要的是，由于反應(yīng)中多重引物組中的引物應(yīng)當(dāng)在相同的緩沖液、鹽和溫度的反應(yīng)條件下起作用，因此它們需要有基本相似的Tm，而無(wú)論目標(biāo)區(qū)域的GC或AT富含程度如何。本發(fā)明允許滿足最小Tm和最大Tm要求和最小及最大長(zhǎng)度要求的引物設(shè)計(jì)。例如，在各引物的通式5′-N[x]-N[x-1]-.....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′中，選擇x，使該引物具有預(yù)定的解鏈溫度(例如，該引物中包含堿基，直到該引物具有計(jì)算的約50攝氏度的解鏈溫度)。
PCR反應(yīng)的產(chǎn)物通常用作另一核酸檢測(cè)方法如雜交型檢測(cè)試驗(yàn)或INVADER反應(yīng)試驗(yàn)的靶物質(zhì)。應(yīng)當(dāng)考慮引物的放置位置，以使第二反應(yīng)成功發(fā)生，而且，為了獲得精確的結(jié)果和數(shù)據(jù)，擴(kuò)增引物與第二反應(yīng)寡核苷酸之間的異常相互作用應(yīng)當(dāng)最小化?？梢允褂眠x擇標(biāo)準(zhǔn)，使為多重引物組設(shè)計(jì)的引物不與檢測(cè)試驗(yàn)的寡核苷酸組分反應(yīng)(例如與之雜交或觸發(fā)反應(yīng))。例如，為了防止引物與雙重INVADER試驗(yàn)的FRET寡核苷酸反應(yīng)，使用某些同源性標(biāo)準(zhǔn)。特別是，如果引物組中的各個(gè)引物都被限定為5′-N[x]-N[x-1]-.....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′，則選擇N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′，使其與FRET或INVADER寡核苷酸的同源性低于90％。在另外一些實(shí)施方案中，對(duì)各個(gè)引物選擇N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′，使其與FRET或INVADER寡核苷酸的同源性低于80％。在某些實(shí)施方案中，為各個(gè)引物選擇N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′，使其與FRET或INVADER寡核苷酸的同源性低于70％。
盡管使用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)發(fā)引物組，但是某些引物對(duì)也可能不滿足所有所述標(biāo)準(zhǔn)(這些可能作為錯(cuò)誤被排除)。例如，在一組100個(gè)靶標(biāo)中，設(shè)計(jì)30個(gè)滿足列出的所有標(biāo)準(zhǔn)，但是31組失敗。在本發(fā)明的方法中，31組可能被標(biāo)記為失敗，該方法可能繼續(xù)通過(guò)100個(gè)靶標(biāo)的列表，再次標(biāo)記那些不滿足該標(biāo)準(zhǔn)的組(見(jiàn)圖8)。一旦全部100個(gè)靶標(biāo)在引物設(shè)計(jì)中有機(jī)會(huì)，該方法將指出失敗組的編號(hào)，以新的隨機(jī)順序?qū)?00個(gè)靶標(biāo)重新排序，并重復(fù)該設(shè)計(jì)過(guò)程(見(jiàn)圖8)。在可設(shè)置的運(yùn)行數(shù)后，選擇引物對(duì)通過(guò)最多(失敗組數(shù)量最少)的組，用于多重PCR反應(yīng)(見(jiàn)圖8)。
圖8是顯示本發(fā)明方法和應(yīng)用軟件的某些實(shí)施方案的基本流程的流程圖。在優(yōu)選實(shí)施方案中，為了便于使用，將圖8詳述的過(guò)程加入到應(yīng)用軟件中(雖然也可以例如以圖8為指導(dǎo)手工進(jìn)行該方法)。
將靶序列和/或引物對(duì)輸入圖8所示的系統(tǒng)中。第一組框顯示如何將靶序列加入具有確定的足跡的序列列表中(見(jiàn)圖8的“B”)，而其他序列立即進(jìn)入引物組庫(kù)(例如PDPass，以前已經(jīng)處理并且顯示一起作用，而不形成引物二聚體或具有FRET序列反應(yīng)性的那些序列)，以及二聚體測(cè)試(DimerTest)輸入(例如用戶希望使用，但是還沒(méi)有檢測(cè)引物二聚體或fret反應(yīng)性的引物對(duì))。換句話說(shuō)，開(kāi)始的一組框直到“輸入結(jié)束”將序列分類(lèi)，使它們后來(lái)能夠被正確處理。
從圖8中的“A”開(kāi)始，引物庫(kù)基本被清除或“清空”，以開(kāi)始新的一輪。然后將靶序列傳送給“B”待處理，將DimerTest對(duì)傳送給“C”待處理。將靶序列傳送給“B”，用戶或應(yīng)用軟件在此確定該靶序列的足跡區(qū)(例如，為了檢測(cè)靶序列中的突變(例如SNP)，試驗(yàn)探針將在此雜交)。重要的是設(shè)計(jì)該區(qū)(用戶可以通過(guò)限定通過(guò)增加的雜交區(qū)的其他堿基而進(jìn)一步擴(kuò)展該區(qū))，使設(shè)計(jì)的引物完全包含該區(qū)。在圖8中，使用應(yīng)用軟件INVADER CREATOR設(shè)計(jì)INVADER寡核苷酸和將與靶區(qū)雜交的下游探針(盡管可以利用任何類(lèi)型的系統(tǒng)程序產(chǎn)生任何類(lèi)型的探針，但是用戶對(duì)于設(shè)計(jì)用于靶序列的探針，從而確定該靶序列上的足跡區(qū)感興趣)。因此，根據(jù)這兩種試驗(yàn)探針在靶標(biāo)上的位置限定核心足跡區(qū)。
然后，系統(tǒng)從足跡的5′邊開(kāi)始，以5′方向行進(jìn)，直到到達(dá)第一個(gè)堿基，或者直到到達(dá)第一個(gè)A或C(或G或T)。其被設(shè)置為限定正向引物序列的初始起點(diǎn)(即，其用作初始N[1]位點(diǎn))。從該初始N[1]位點(diǎn)開(kāi)始，正向引物的引物序列與靶區(qū)中遇到的堿基相同。例如，如果將該引物的缺省大小設(shè)置為12個(gè)堿基，則該系統(tǒng)從選擇為N[1]的堿基開(kāi)始，然后添加在靶序列中發(fā)現(xiàn)的下面11個(gè)堿基。然后檢測(cè)該12-mer引物的解鏈溫度(例如使用INVADER CREATOR)，根據(jù)靶序列添加另外的堿基，直到該序列具有被用戶指定為缺省最低和最高解鏈溫度的解鏈溫度(例如約50攝氏度，并且不超過(guò)55攝氏度)。例如，該系統(tǒng)使用通式5′-N[x]-N[x-1]-.....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′，x開(kāi)始時(shí)是12。然后該系統(tǒng)將x調(diào)節(jié)為更大的數(shù)字(例如更長(zhǎng)的序列)，直到達(dá)到預(yù)先設(shè)定的解鏈溫度。在某些實(shí)施方案中，用最大引物的大小作為缺省參數(shù)，用作設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度的上限。在一些實(shí)施方案中，最大引物的大小為大約30個(gè)堿基(例如29個(gè)堿基，30個(gè)堿基，或31個(gè)堿基)。在其他一些實(shí)施方案中，能夠用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)操作工具修改缺省設(shè)置(例如最小和最大引物大小，和最低和最高Tm)。
圖8中的下一個(gè)框被用來(lái)確定迄今設(shè)計(jì)的引物是否將產(chǎn)生引物二聚體和/或fret反應(yīng)性(例如與該庫(kù)中已經(jīng)存在的其他序列)。用于這種確定的標(biāo)準(zhǔn)在上文中已經(jīng)解釋。如果引物通過(guò)該步驟，則將該正向引物加入引物庫(kù)中。但是，如果該正向引物不滿足該標(biāo)準(zhǔn)，如圖8所示，則起點(diǎn)(N[1])以5′方向移動(dòng)一個(gè)核苷酸(或者移至下一個(gè)A或C，或下一個(gè)G或T)。該系統(tǒng)首先進(jìn)行核對(duì)，以確保在靶序列上足夠的空間移動(dòng)，以成功制備引物。如果是，則該系統(tǒng)返回，檢查該新引物的解鏈溫度。但是，如果沒(méi)有序列可以設(shè)計(jì)，則該靶序列被標(biāo)記為錯(cuò)誤(例如，指出該靶標(biāo)不能制備正向引物)。
然后為了設(shè)計(jì)反向引物，重復(fù)同一過(guò)程，如圖8所示。如果反向引物成功制備，則將該引物對(duì)或引物輸入引物庫(kù)中，并且該系統(tǒng)回到“B”(如果要處理更多靶序列的話)，或者轉(zhuǎn)向“C”來(lái)檢測(cè)DimerTest對(duì)。
從圖8中的“C”開(kāi)始顯示該系統(tǒng)如何處理作為引物輸入的引物對(duì)(DimerTest)。如果沒(méi)有DimerTest對(duì)，如圖8所示，該系統(tǒng)轉(zhuǎn)向“D”。但是，如果存在DimerTest對(duì)，則如上所述檢測(cè)引物二聚體和/或FRET反應(yīng)性。如果DimerTest對(duì)不能滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，則標(biāo)記為錯(cuò)誤。如果DimerTest對(duì)滿足該標(biāo)準(zhǔn)，則將它們加入引物組庫(kù)中，然后如果要評(píng)價(jià)更多DimerTest對(duì)則該系統(tǒng)回到“C”，或者如果不再評(píng)價(jià)DimerTest對(duì)則轉(zhuǎn)向“D”。
從圖8中的“D”開(kāi)始，評(píng)價(jià)已經(jīng)產(chǎn)生的引物庫(kù)。該部分的第一步是檢查序列的這種特定隨機(jī)化運(yùn)行產(chǎn)生的錯(cuò)誤(失敗)數(shù)。如果沒(méi)有錯(cuò)誤，則該組是最佳組，可以輸出給用戶。如果有大于0個(gè)錯(cuò)誤，則該系統(tǒng)將這次運(yùn)行與以前的任何其他運(yùn)行進(jìn)行比較，以判斷哪次運(yùn)行產(chǎn)生的錯(cuò)誤最少。如果當(dāng)前的運(yùn)行具有較少的錯(cuò)誤，則指示它為當(dāng)前最佳組。此時(shí)，系統(tǒng)可以回到“A”，用相同序列的另一隨機(jī)組開(kāi)始復(fù)查，或者預(yù)先設(shè)置的最大運(yùn)行數(shù)(例如運(yùn)行5次)可能在這次運(yùn)行時(shí)達(dá)到(例如，這是第5次運(yùn)行，而最大運(yùn)行數(shù)設(shè)置為5)。如果最大數(shù)已經(jīng)達(dá)到，則該最佳組輸出為最佳組。該最佳引物組然后可以用來(lái)產(chǎn)生寡核苷酸物理組，使多重PCR反應(yīng)可以進(jìn)行。
多重PCR反應(yīng)將要克服的另一挑戰(zhàn)是導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)多重反應(yīng)的不相等的擴(kuò)增子濃度。擴(kuò)增針對(duì)的不同基因座在擴(kuò)增反應(yīng)中可能各自有不同的行為，產(chǎn)生非常不同濃度的各個(gè)不同擴(kuò)增子產(chǎn)物。本發(fā)明提供方法、系統(tǒng)、應(yīng)用軟件、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)，它們可以用來(lái)相對(duì)于第一檢測(cè)試驗(yàn)讀數(shù)(例如INVADER試驗(yàn)讀數(shù))調(diào)節(jié)引物濃度，使平衡的引物濃度接近于不同擴(kuò)增子有基本相等的濃度。
各種引物對(duì)的濃度可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。在一些實(shí)施方案中，第一輪用等摩爾濃度的所有引物進(jìn)行。然后進(jìn)行時(shí)間讀數(shù)。根據(jù)該時(shí)間讀數(shù)，確定每個(gè)擴(kuò)增子的相對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)。然后根據(jù)一致化校正方程，獲得使信號(hào)在同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)更接近的引物濃度的評(píng)價(jià)。這些檢測(cè)試驗(yàn)可以在不同大小的陣列(384孔板)上進(jìn)行。
預(yù)計(jì)將本發(fā)明與檢測(cè)試驗(yàn)和檢測(cè)試驗(yàn)陣列相組合將具有提高的處理效率。使用本發(fā)明產(chǎn)生的引物或引物對(duì)的平衡混合物，可以進(jìn)行單點(diǎn)讀取，使平均用戶在不同靶標(biāo)陣列上進(jìn)行需要高靈敏度和特異性的試驗(yàn)時(shí)可以獲得高效率。
在單一反應(yīng)容器中優(yōu)化引物對(duì)濃度使用戶能夠在單一反應(yīng)容器和一個(gè)步驟中對(duì)多個(gè)或多種擴(kuò)增靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增。然后用該一步法的產(chǎn)物成功獲得例如幾百個(gè)試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)。例如，在384孔板上的每個(gè)孔上可能有不同的檢測(cè)試驗(yàn)。一步多重PCR反應(yīng)的結(jié)果擴(kuò)增了384個(gè)不同的基因組DNA靶標(biāo)，每塊板提供384個(gè)試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)每個(gè)孔具有多個(gè)試驗(yàn)時(shí)，可以獲得甚至更高的效率。
因此，本發(fā)明提供在高度多重PCR中使用各個(gè)引物組的濃度作為一個(gè)參數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)各PCR產(chǎn)物的無(wú)偏好擴(kuò)增。任何PCR都包括引物退火和引物延伸步驟。在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下，數(shù)量級(jí)為1μM的高濃度引物確保了引物退火的快速動(dòng)力學(xué)，而引物延伸步驟的最佳時(shí)間取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，并且可以比退火步驟更長(zhǎng)。通過(guò)降低引物濃度，引物退火動(dòng)力學(xué)可能成為限速步驟，PCR擴(kuò)增倍數(shù)應(yīng)當(dāng)強(qiáng)烈依賴(lài)于引物濃度、引物的結(jié)合速度常數(shù)和退火時(shí)間。
引物P與靶標(biāo)T的結(jié)合可以用如下模型描述
其中ka是引物退火的結(jié)合速度常數(shù)a我們假定退火在低于引物解鏈溫度的溫度下發(fā)生，并且逆反應(yīng)可以忽略。
在引物過(guò)量的條件下該動(dòng)力學(xué)的解式眾所周知[PT]=T0(1-e-kact)---(2)]]>其中[PT]是與引物結(jié)合的靶分子濃度，T0是初始靶標(biāo)濃度，c是初始引物濃度，t是引物退火時(shí)間。假定與引物結(jié)合的各個(gè)靶分子均復(fù)制產(chǎn)生完整大小的PCR產(chǎn)物，則一個(gè)PCR循環(huán)中的靶標(biāo)擴(kuò)增倍數(shù)是Z=T0+[PT]T0=2-e-kact---(3)]]>n個(gè)循環(huán)后的總PCR擴(kuò)增倍數(shù)為F=Zn=(2-e-kact)n---(4)]]>根據(jù)方程式4，在引物退火動(dòng)力學(xué)是PCR的限速步驟的條件下，擴(kuò)增倍數(shù)應(yīng)當(dāng)強(qiáng)烈依賴(lài)于引物濃度。因此，偏好的基因座擴(kuò)增，無(wú)論它是由各個(gè)結(jié)合速度常數(shù)、引物延伸步驟還是由任何其他因素引起的，都可以通過(guò)調(diào)節(jié)多重PCR中各引物組的引物濃度來(lái)修正。調(diào)節(jié)的引物濃度也可以用來(lái)修正用于分析PCR預(yù)擴(kuò)增的基因座的INVADER試驗(yàn)的偏好表現(xiàn)。利用這個(gè)基本原理，本發(fā)明已經(jīng)證明擴(kuò)增效率與引物濃度之間存在線性相關(guān)，并且在該方程式中用來(lái)平衡不同擴(kuò)增子的引物濃度，在實(shí)施例1中導(dǎo)致10個(gè)不同擴(kuò)增子有相等的擴(kuò)增。該技術(shù)可以用于任意大小的一組多重引物對(duì)。
II.檢測(cè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)以下部分描述本發(fā)明可以使用的檢測(cè)試驗(yàn)。例如，可以利用許多不同試驗(yàn)確定靶核酸序列上的足跡，然后對(duì)多重PCR的輸出進(jìn)行該檢測(cè)試驗(yàn)(或者該檢測(cè)試驗(yàn)可以與多重PCR反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行)。
有多種檢測(cè)技術(shù)可以用來(lái)確定靶核酸一個(gè)或多個(gè)位置處的序列。例如，有大量技術(shù)可以用于檢測(cè)SNP的存在或不存在。許多這樣的技術(shù)需要使用寡核苷酸與靶標(biāo)雜交。然后根據(jù)所用的試驗(yàn)，切割、延長(zhǎng)、連接、解離或以其他方式改變寡核苷酸，其中監(jiān)測(cè)該寡核苷酸在試驗(yàn)中的行為作為表征靶核酸序列的手段。下面第IV部分詳細(xì)描述了大量這樣的技術(shù)。
本發(fā)明提供用于設(shè)計(jì)在檢測(cè)試驗(yàn)中使用的寡核苷酸的系統(tǒng)和方法。特別是，本發(fā)明提供用于設(shè)計(jì)在檢測(cè)試驗(yàn)希望的反應(yīng)條件(例如溫度、緩沖液條件等)下與靶核酸的適當(dāng)區(qū)(例如不含二級(jí)結(jié)構(gòu)的靶核酸區(qū))成功雜交的寡核苷酸的系統(tǒng)和方法。這些系統(tǒng)和方法也允許設(shè)計(jì)在相同或基本相同的反應(yīng)條件下在該檢測(cè)試驗(yàn)中均起作用的多種不同的寡核苷酸(例如可與靶核酸不同部分雜交的，或者可與兩種或多種不同靶核酸雜交的寡核苷酸)。這些系統(tǒng)和方法也可以用來(lái)設(shè)計(jì)在實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件下工作的對(duì)照樣品。
盡管本發(fā)明的系統(tǒng)和方法不限于任何特定的檢測(cè)試驗(yàn)，但是以下描述說(shuō)明了本發(fā)明與INVADER試驗(yàn)(Third Wave Technologies，Madison WI；參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,846,717、5,985,557、5,994,069和6,001,567號(hào)，PCT申請(qǐng)WO 97/27214和WO 98/42873，和de Arruda等人，Expert.Rev.Mol.Diagn.2(5)，487-496(2002)，均在此全文引用作為參考)組合使用檢測(cè)SNP。INVADER試驗(yàn)提供易用性和靈敏度水平，當(dāng)與本發(fā)明的系統(tǒng)和方法組合使用時(shí)，可以在檢測(cè)板、ASRs和臨床診斷中使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該說(shuō)明性實(shí)施例的具體和一般特征通常適用于其他檢測(cè)試驗(yàn)。
A.INVADER試驗(yàn)INVADER試驗(yàn)提供根據(jù)靶核酸的存在形成核酸切割結(jié)構(gòu)，并且切割該核酸切割結(jié)構(gòu)從而釋放不同切割產(chǎn)物的手段。例如，利用5′核酸酶活性切割靶標(biāo)依賴(lài)性的切割結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的切割產(chǎn)物指示樣品中特定靶核酸序列的存在。如下文所述，當(dāng)核酸或寡核苷酸的兩條鏈都與靶核酸鏈雜交從而形成重疊侵入切割結(jié)構(gòu)時(shí)，可能發(fā)生侵入切割。盡管切割劑(例如5′核酸酶)與上游寡核苷酸相互作用，但是也可以使切割劑在內(nèi)部位點(diǎn)處切割下游寡核苷酸，從而產(chǎn)生不同的片段。
在一些實(shí)施方案中，INVADER試驗(yàn)提供如下檢測(cè)試驗(yàn)，其中靶核酸在與寡核苷酸探針的多輪雜交和探針切割過(guò)程中再使用或者再循環(huán)，不需要使用溫度循環(huán)(即，靶核酸鏈的周期變性)或核酸合成(即，基于聚合的靶標(biāo)或探針核酸鏈置換)。當(dāng)在探針在靶鏈上被連續(xù)置換的條件下進(jìn)行切割反應(yīng)時(shí)(例如通過(guò)探針-探針置換，或者通過(guò)探針/靶標(biāo)結(jié)合和解離之間的平衡，或者通過(guò)包含這些機(jī)制的組合)，(Reynaldo等人，J.Mol.Biol.97511-520 )，多個(gè)探針可以與同一靶標(biāo)雜交，導(dǎo)致多種切割，和多種切割產(chǎn)物的產(chǎn)生。
B.用于INVADER試驗(yàn)的寡核苷酸設(shè)計(jì)在一些實(shí)施方案中，其中設(shè)計(jì)寡核苷酸以在INVADER試驗(yàn)中用來(lái)檢測(cè)SNP，將目標(biāo)序列輸入INVADERCREATOR程序(Third WaveTechnologies，Madison，WI)。如上所述，可以從任何數(shù)量的來(lái)源輸入序列進(jìn)行分析，可以直接輸入到裝有INVADERCREATOR程序的計(jì)算機(jī)中，或者利用通過(guò)通訊網(wǎng)絡(luò)(例如LAN、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)或因特網(wǎng))連接的遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)。該程序?yàn)橛辛x鏈和反義鏈設(shè)計(jì)探針。鏈的選擇通?；诤铣傻娜菀壮潭?、二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的最小化和可制備性。在一些實(shí)施方案中，用戶選擇序列鏈對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)。在另外一些實(shí)施方案中，軟件自動(dòng)選擇鏈。通過(guò)為最佳探針循環(huán)和信號(hào)產(chǎn)生引入熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Allawi和SantaLucia，Biochemistry，3610581 )，可以設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，以在預(yù)先選擇的試驗(yàn)溫度(例如63℃)下運(yùn)行。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，選擇最終探針組(例如用于2個(gè)等位基因的第一探針和1個(gè)INVADER寡核苷酸)。
在一些實(shí)施方案中，INVADERCREATOR系統(tǒng)是基于web的程序，具有包含轉(zhuǎn)至BLAST(可在國(guó)家生物技術(shù)信息中心、國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館、國(guó)立衛(wèi)生研究院的網(wǎng)站上獲得)的鏈接，并且可能鏈接到RNAsturcture(Ma thews等人，RNA 51458 )的安全站點(diǎn)訪問(wèn)，RNAsturcture是引入mfold的軟件程序(Zuker，Science，24448 )。RNAsturcture檢驗(yàn)INVADERCREATOR產(chǎn)生的寡核苷酸設(shè)計(jì)，用于可能的單分子和雙分子復(fù)合物形成。INVADERCREATOR適應(yīng)開(kāi)放式數(shù)據(jù)庫(kù)連接性(ODBC)，并且使用Oracle數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行輸出/集成。該INVADERCREATOR系統(tǒng)用Oracle配置，應(yīng)用UNIX系統(tǒng)工作良好，因?yàn)榇蠖鄶?shù)基因組中心都是基于UNIX的。
在一些實(shí)施方案中，INVADERCREATOR分析在分開(kāi)的服務(wù)器(例如Sun服務(wù)器)上提供，因此能夠處理大批量工作的分析。例如，用戶可以在一封郵件中提交多達(dá)2,000個(gè)SNP序列。該服務(wù)器將這批序列傳送到INVADERCREATOR軟件中，當(dāng)啟動(dòng)時(shí)，該程序設(shè)計(jì)檢測(cè)試驗(yàn)寡核苷酸組。在一些實(shí)施方案中，探針組設(shè)計(jì)在收到序列24小時(shí)內(nèi)返回用戶。
每個(gè)INVADER反應(yīng)都包括至少兩種用于第一反應(yīng)的靶序列特異性的、未標(biāo)記的寡核苷酸上游INVADER寡核苷酸和下游探針寡核苷酸。INVADER寡核苷酸通常設(shè)計(jì)為在反應(yīng)溫度下穩(wěn)定結(jié)合，而探針設(shè)計(jì)為與靶鏈自由結(jié)合和解離，只在未切割的探針與相鄰的重疊INVADER寡核苷酸雜交時(shí)才發(fā)生切割。在一些實(shí)施方案中，探針包括不與靶標(biāo)互補(bǔ)的5′翼或“臂”，并且當(dāng)發(fā)生切割時(shí)該翼從探針上釋放下來(lái)。在一些實(shí)施方案中，釋放的翼作為INVADER寡核苷酸參與第二反應(yīng)。
下面的描述提供了如何為INVADERCREATOR程序配置用戶界面的一個(gè)實(shí)例。
用戶打開(kāi)工作屏，例如通過(guò)點(diǎn)擊計(jì)算機(jī)桌面顯示(例如Windows桌面)上的一個(gè)圖標(biāo)。用戶輸入關(guān)于為其設(shè)計(jì)試驗(yàn)的靶序列的信息。在一些實(shí)施方案中，用戶輸入靶序列。在另外一些實(shí)施方案中，用戶輸入導(dǎo)致從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索序列的代碼或數(shù)字。在再另外一些實(shí)施方案中，可以提供其他信息，如用戶名、靶序列相關(guān)的識(shí)別號(hào)和/或順序號(hào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用戶指明(例如通過(guò)復(fù)選框或下拉菜單)靶核酸是DNA或RNA。在其他一些優(yōu)選實(shí)施方案中，用戶指明該核酸的來(lái)源物種。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用戶指明該設(shè)計(jì)是用于單重檢測(cè)(即，每次反應(yīng)檢測(cè)一種靶序列或等位基因)還是用于多重檢測(cè)(即，每次反應(yīng)檢測(cè)多種靶序列或等位基因)。當(dāng)完成必要的選擇和輸入時(shí)，用戶啟動(dòng)分析過(guò)程。在一個(gè)實(shí)施方案中，用戶點(diǎn)擊“進(jìn)行設(shè)計(jì)”按鈕繼續(xù)。
在一些實(shí)施方案中，軟件在繼續(xù)前要確認(rèn)字段輸入。在一些實(shí)施方案中，軟件要核對(duì)任何需要的字段是否已經(jīng)填上適當(dāng)類(lèi)型的信息。在其他一些實(shí)施方案中，軟件要驗(yàn)證輸入的序列是否滿足選擇的要求(例如最小或最大長(zhǎng)度，DNA或RNA含量)。如果任一字段的輸入被發(fā)現(xiàn)是無(wú)效的，則可出現(xiàn)錯(cuò)誤信息或?qū)υ捒?。在?yōu)選實(shí)施方案中，錯(cuò)誤信息指示哪個(gè)字段未填寫(xiě)和/或不正確。一旦序列輸入得到核實(shí)，軟件即繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
在一些實(shí)施方案中，訂單輸入字段(order entry fields)提供的信息指定了將產(chǎn)生哪種類(lèi)型的設(shè)計(jì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，靶序列和多選復(fù)選框指定了產(chǎn)生哪種類(lèi)型的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)選項(xiàng)包括但不限于SNP試驗(yàn)、多重PCR試驗(yàn)(例如其中在一個(gè)反應(yīng)中組合用于不同等位基因的探針組)、多SNP試驗(yàn)(例如其中輸入序列具有多個(gè)將要為其設(shè)計(jì)探針組的變異位點(diǎn))和多探針臂試驗(yàn)。
在一些實(shí)施方案中，INVADERCREATOR軟件通過(guò)網(wǎng)絡(luò)訂單輸入(WebOE)過(guò)程(即通過(guò)內(nèi)聯(lián)網(wǎng)/因特網(wǎng)瀏覽器界面)啟動(dòng)，這些參數(shù)通過(guò)小應(yīng)用程序<param>標(biāo)記從WebOE轉(zhuǎn)移，而不是通過(guò)菜單或復(fù)選框輸入。
對(duì)于多SNP設(shè)計(jì)，用戶選擇兩種或多種設(shè)計(jì)一起工作。在一些實(shí)施方案中，這種選擇打開(kāi)了新的屏幕視圖(例如多SNP設(shè)計(jì)選擇視圖)。在一些實(shí)施方案中，該軟件對(duì)靶序列中的各個(gè)基因座產(chǎn)生設(shè)計(jì)，分別評(píng)分，并且通過(guò)屏幕視圖將它們呈現(xiàn)給用戶。用戶然后可以選擇任意兩種設(shè)計(jì)一起工作。在一些實(shí)施方案中，用戶選擇第一種和第二種設(shè)計(jì)(例如通過(guò)菜單或按鈕)，并點(diǎn)擊“進(jìn)行設(shè)計(jì)”按鈕來(lái)繼續(xù)。
為了選擇在預(yù)先選擇的反應(yīng)溫度下表現(xiàn)最佳的探針序列，用最接近鄰居模型和公開(kāi)的DNA雙鏈體形成參數(shù)計(jì)算所要檢測(cè)的SNP的解鏈溫度(Tm)(Allawi和SantaLucia，Biochemistry，3610581 )。在靶鏈?zhǔn)荝NA的實(shí)施方案中，可以使用適合RNA/DNA異源雙鏈體形成的參數(shù)。因?yàn)樵囼?yàn)的鹽濃度通常不同于獲得最近鄰居參數(shù)的溶液條件(1M NaCl，并且不含二價(jià)金屬)，并且因?yàn)槊傅拇嬖诤蜐舛扔绊懥俗钸m反應(yīng)溫度，所以應(yīng)當(dāng)調(diào)節(jié)計(jì)算的Tm，以確定進(jìn)行反應(yīng)的最適溫度。補(bǔ)償這些因素的一種方法是改變?cè)诮怄湝囟扔?jì)算中提供的鹽濃度值。這種調(diào)節(jié)被稱(chēng)為“鹽校正”。本文使用的術(shù)語(yǔ)“鹽校正”是指為了反映影響核酸雙鏈體的非鹽參數(shù)或條件對(duì)該雙鏈體Tm計(jì)算的影響，對(duì)提供的鹽濃度值進(jìn)行的改變。提供的標(biāo)準(zhǔn)濃度值的改變也影響這些計(jì)算的結(jié)果。使用0.5M NaCl的值(SantaLucia，Proc Natl Acad Sci U SA，951460 )和約1mM探針和1fM靶標(biāo)的鏈濃度，用于計(jì)算探針-靶標(biāo)解鏈溫度的算法適合用于預(yù)測(cè)最適INVADER試驗(yàn)反應(yīng)溫度。對(duì)于一組30種探針，用該方法計(jì)算的最適測(cè)定溫度與通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的該溫度之間的平均差為大約1.5℃。
針對(duì)特定SNP的下游探針的長(zhǎng)度取決于為了進(jìn)行該反應(yīng)而選擇的溫度(例如63℃)。從靶DNA上變異核苷酸(與位于預(yù)期切割位點(diǎn)5′方向的探針核苷酸配對(duì)的靶堿基)的位置開(kāi)始，并且在3′端添加，使用迭代方法使探針的靶標(biāo)結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度一次增加一個(gè)堿基對(duì)，直到達(dá)到與希望的反應(yīng)溫度相匹配的計(jì)算的最適反應(yīng)溫度(Tm加鹽校正，以補(bǔ)償酶的影響)。優(yōu)選選擇探針的非互補(bǔ)臂，以使第二反應(yīng)在同一反應(yīng)溫度下循環(huán)。對(duì)于能夠干擾該反應(yīng)的可能的二聚體復(fù)合物或二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，利用諸如mfold(Zuker，Science，24448 )或Oligo 5.0(Rychlik和Rhoads，Nucleic Acids Res，178543 )的程序篩選整個(gè)探針寡核苷酸。INVADER寡核苷酸設(shè)計(jì)也遵循相同的原則。簡(jiǎn)言之，從靶DNA上的位點(diǎn)N開(kāi)始，將INVADER寡核苷酸的3′端設(shè)計(jì)為具有不與懷疑待測(cè)樣品中所含任一等位基因互補(bǔ)的核苷酸。這種錯(cuò)配不會(huì)不利地影響切割(Lyamichev等人，Nature Biotechnology，17292 )，它可以增加探針循環(huán)，這可能是通過(guò)使兩種探針之間的同軸穩(wěn)定效應(yīng)最小化引起的。然后從殘基N-1開(kāi)始以5′方向添加與靶DNA互補(bǔ)的其他殘基，直到INVADER寡核苷酸-靶標(biāo)雜合體的穩(wěn)定性超過(guò)探針的穩(wěn)定性(因此，超出計(jì)劃的測(cè)定反應(yīng)溫度)，通常超過(guò)15-20℃。
該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的一個(gè)方面是可以選擇所有探針序列，使得第一和第二反應(yīng)在相同最適溫度下發(fā)生，由此反應(yīng)步驟可以同時(shí)進(jìn)行。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，探針可以設(shè)計(jì)為在不同最適溫度下工作，由此反應(yīng)步驟不在最適溫度下同時(shí)進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，軟件向用戶提供改變?cè)O(shè)計(jì)的不同方面的機(jī)會(huì)，這些方面包括但不限于探針、靶標(biāo)和INVADER寡核苷酸最適溫度和濃度；阻斷組；探針臂；染色、加帽組和其他加合物；探針和靶標(biāo)的各個(gè)堿基(例如從靶標(biāo)和/或探針的末端添加或刪除堿基，或者改變INVADER和/或探針和/或靶寡核苷酸中的內(nèi)部堿基)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)從菜單中選擇進(jìn)行改變。在其它一些實(shí)施方案中，將改變輸入文本或?qū)υ捒騼?nèi)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該選項(xiàng)打開(kāi)一個(gè)新的屏幕(例如Designer Worksheet視圖)。
在一些實(shí)施方案中，軟件提供評(píng)分系統(tǒng)，用來(lái)指示試驗(yàn)設(shè)計(jì)的質(zhì)量(例如實(shí)施的可能性)。在一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)分系統(tǒng)包括點(diǎn)(例如100個(gè)點(diǎn))的起始得分，其中該起始得分指示理想的設(shè)計(jì)，并且其中已知或者懷疑對(duì)試驗(yàn)實(shí)施具有不利影響的設(shè)計(jì)特征被賦予罰分值。罰分值可以隨序列以外的試驗(yàn)參數(shù)而改變，這些參數(shù)包括但不限于該設(shè)計(jì)預(yù)期的試驗(yàn)類(lèi)型(例如單重、多重)和進(jìn)行測(cè)定反應(yīng)的溫度。下列實(shí)施例根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定的信息，提供了INVADER試驗(yàn)的一些實(shí)施方案使用的說(shuō)明性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)?？烧兄略u(píng)分罰分的設(shè)計(jì)特征的例子包括但不限于以下情形[罰分值在括號(hào)中標(biāo)出，第一個(gè)數(shù)字用于較低溫度試驗(yàn)(例如62-64℃)，第二個(gè)用于較高溫度試驗(yàn)(例如65-66℃)]1.[100:100]INVADER寡核苷酸的3′末端類(lèi)似于探針臂臂序列 如果INVADER結(jié)束于以下序列則給予罰分臂1CGCGCCGAGG5′...GAGGX或5′...GAGGXX臂2ATGACGTGGCAGAC5′...CAGACX或5′...CAGACXX臂3ACGGACGCGGAG 5′...GGAGX或5′...GGAGXX臂4TCCGCGCGTCC 5′...GTCCX或5′...GTCCXX2.[70:70]探針具有含多態(tài)性的5堿基延伸(即5個(gè)相同堿基排成一列)；3.[60:60]探針具有與多態(tài)性相鄰的5堿基延伸；4.[50:50]探針具有5堿基延伸，一個(gè)堿基來(lái)源于多態(tài)性；5.[40:40]探針具有5堿基延伸，兩個(gè)堿基來(lái)源于多態(tài)性；6.[50:50]探針的5堿基延伸是G附加罰分；7.[100:100]探針在任一處具有6堿基延伸；8.[90:90]兩個(gè)或三個(gè)堿基序列重復(fù)至少4次；9.[100:100]探針中存在簡(jiǎn)并堿基；10.[60:90]探針雜交區(qū)短(對(duì)于設(shè)計(jì)65-67℃，13個(gè)堿基或更少；對(duì)于設(shè)計(jì)62-64℃，12個(gè)堿基或更少)；11.[40:90]探針雜交區(qū)長(zhǎng)(對(duì)于設(shè)計(jì)65-67℃，29個(gè)堿基或更多；對(duì)于設(shè)計(jì)62-64℃，28個(gè)堿基或更多)12.[5:5]探針雜交區(qū)長(zhǎng)度——根據(jù)堿基附加罰分13.[80:80]Ins/Del設(shè)計(jì)，對(duì)探針臂后的前3個(gè)堿基具有較差的辨別力14.[100:100]計(jì)算的INVADER寡核苷酸Tm在探針靶標(biāo)Tm的7.5℃以?xún)?nèi)(設(shè)計(jì)65-67℃，INVADER寡核苷酸≤70.5℃，設(shè)計(jì)62-64℃，INVADER寡核苷酸≤69.5℃)15.[20:20]計(jì)算的探針Tm相差2.0℃以上16.[100:100]探針計(jì)算的Tm比靶標(biāo)Tm低2℃17.[10:10]靶標(biāo)的一條鏈比另一條鏈長(zhǎng)8個(gè)堿基18.[30:30]INVADER寡核苷酸在任一處具有6堿基延伸-初始罰分19.[70:70]INVADER寡核苷酸的6堿基延伸是G附加罰分20.[15:15]探針雜交區(qū)長(zhǎng)度為14、15或24-28個(gè)堿基(65-67℃)或13、14或26、27個(gè)堿基(62-64℃)21.[15:15]探針具有含多態(tài)性的4堿基G延伸。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，重新計(jì)算設(shè)計(jì)中各個(gè)寡核苷酸的溫度，并且在改變時(shí)重新計(jì)算得分。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)點(diǎn)擊“描述”按鈕可以看到得分描述。在一些實(shí)施方案中，提供BLAST搜索選項(xiàng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)點(diǎn)擊“BLAST設(shè)計(jì)”按鈕進(jìn)行BLAST搜索。在一些實(shí)施方案中，該動(dòng)作彈出描述BLAST過(guò)程的對(duì)話框。在優(yōu)選實(shí)施方案中，BLAST搜索結(jié)果在Designer Worksheet上顯示為突出顯示的設(shè)計(jì)。
在一些實(shí)施方案中，用戶通過(guò)點(diǎn)擊“接受”按鈕接受一種設(shè)計(jì)。在另外一些實(shí)施方案中，該程序不需用戶干預(yù)即認(rèn)可一種設(shè)計(jì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該程序?qū)⒄J(rèn)可的設(shè)計(jì)傳送給下一處理步驟(例如，傳送至產(chǎn)生；傳送至文件或數(shù)據(jù)庫(kù))。在一些實(shí)施方案中，該程序提供屏幕視圖(例如輸出頁(yè))，允許檢查產(chǎn)生的最終設(shè)計(jì)，并且允許給該設(shè)計(jì)附加備注。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用戶可以返回Designer Worksheet(例如通過(guò)點(diǎn)擊“返回”按鈕)，或者可以保存該設(shè)計(jì)(例如通過(guò)點(diǎn)擊“保存”按鈕)，并且繼續(xù)(例如提交設(shè)計(jì)的寡核苷酸以產(chǎn)生結(jié)果)。
在一些實(shí)施方案中，該程序提供一個(gè)選項(xiàng)，以產(chǎn)生為打印(例如只有文本的視圖)或其他輸出(例如輸出視圖)而優(yōu)化的設(shè)計(jì)的屏幕視圖。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該輸出視圖提供對(duì)特別適合于打印或輸出到另一應(yīng)用程序的設(shè)計(jì)的描述(例如通過(guò)拷貝和粘貼到另一應(yīng)用程序)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該輸出視圖在單獨(dú)的窗口中打開(kāi)。
本發(fā)明不限于INVADERCREATOR軟件的使用。實(shí)際上，有多種軟件程序是可用的并且可以作為商品獲得，包括但不限于GCG Wisconsin軟件包(Genetics computer Group，Madison，WI)和Vector NTI(Informax，Rockville，Maryland)。本發(fā)明中也可以使用其他檢測(cè)試驗(yàn)。
1.直接測(cè)序試驗(yàn)在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)變異序列。在這些試驗(yàn)中，首先利用任何適當(dāng)?shù)姆椒◤氖茉囌咧蟹蛛xDNA樣品。在一些實(shí)施方案中，將目標(biāo)區(qū)克隆到合適的載體中，通過(guò)在宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌)中生長(zhǎng)而擴(kuò)增。在另外一些實(shí)施方案中，目標(biāo)區(qū)中的DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增后，目標(biāo)區(qū)(例如含有SNP或目標(biāo)突變的區(qū)域)中的DNA用任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)序，這些方法包括但不限于使用放射性標(biāo)記核苷酸的手工測(cè)序或自動(dòng)測(cè)序。利用任何適當(dāng)?shù)姆椒@示測(cè)序結(jié)果。檢查該序列，確定特定SNP或突變的存在或不存在。
2.PCR試驗(yàn)在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用基于PCR的試驗(yàn)檢測(cè)變異序列。在一些實(shí)施方案中，該P(yáng)CR試驗(yàn)包括使用只與變異或野生型等位基因(例如多態(tài)性或突變區(qū))雜交的寡核苷酸引物。利用兩組引物擴(kuò)增DNA樣品。如果只有突變引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，則患者含突變等位基因。如果只有野生型引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，則患者含野生型等位基因。
3.片段長(zhǎng)度多態(tài)性試驗(yàn)在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用片段長(zhǎng)度多態(tài)性試驗(yàn)檢測(cè)變異序列。在片段長(zhǎng)度多態(tài)性試驗(yàn)中，利用酶(例如限制性?xún)?nèi)切酶或CLEAVASE I[Third Wave Technologies，Madison，WI]酶)在一系列位點(diǎn)處切割DNA產(chǎn)生獨(dú)特的DNA帶型。來(lái)自樣品的含SNP或突變的DNA片段將具有與野生型不同的帶型。
a.RFLP試驗(yàn)在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性試驗(yàn)(RFLP)檢測(cè)變異序列。首先通過(guò)PCR分離目標(biāo)區(qū)。然后用已知對(duì)特定多態(tài)性可產(chǎn)生獨(dú)特長(zhǎng)度片段的限制性?xún)?nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物。限制性?xún)?nèi)切酶消化的PCR產(chǎn)物通常通過(guò)凝膠電泳分離，并且可以通過(guò)溴化乙錠染色來(lái)顯示。將片段長(zhǎng)度與分子量標(biāo)準(zhǔn)和由野生型和突變體對(duì)照產(chǎn)生的片段進(jìn)行比較。
b.CFLP試驗(yàn)在另外一些實(shí)施方案中，用CLEAVASE片段長(zhǎng)度多態(tài)性試驗(yàn)(CFLP；Third Wave Technologies，Madison，WI；參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,843,654；5,843,669；5,719,208；和5,888,780號(hào)；均在此引用作為參考)檢測(cè)變異序列。該試驗(yàn)基于以下發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA單鏈自身折疊時(shí)，假定它們形成對(duì)于該DNA分子精確序列非常獨(dú)特的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)涉及部分雙鏈的DNA區(qū)，于是單鏈區(qū)與雙鏈DNA發(fā)夾并列。CLEAVASE I酶是一種結(jié)構(gòu)特異性的、熱穩(wěn)定的核酸酶，它識(shí)別并切割這些單鏈區(qū)與雙鏈區(qū)之間的接點(diǎn)。
首先例如通過(guò)PCR分離目標(biāo)區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記一條或兩條鏈。然后，加熱分開(kāi)DNA鏈。接下來(lái)，冷卻反應(yīng)物，以使鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成。然后用CLEAVASE I酶處理PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生對(duì)于特定SNP或突變獨(dú)特的一系列片段。分離、檢測(cè)(例如通過(guò)變性凝膠電泳)并顯示(例如通過(guò)放射自顯影、熒光成像或染色)該CLEAVASE酶處理的PCR產(chǎn)物。將片段長(zhǎng)度與分子量標(biāo)準(zhǔn)和由野生型和突變體對(duì)照產(chǎn)生的片段進(jìn)行比較。
4.雜交試驗(yàn)在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用雜交試驗(yàn)檢測(cè)變異序列。在雜交試驗(yàn)中，根據(jù)來(lái)自樣品的DNA與互補(bǔ)DNA分子(例如寡核苷酸探針)雜交的能力確定特定SNP或突變的存在或不存在?？梢圆捎檬褂枚喾N雜交和檢測(cè)技術(shù)的多種雜交試驗(yàn)。下文提供了關(guān)于試驗(yàn)選擇的描述。
a.雜交的直接檢測(cè)在一些實(shí)施方案中，探針與目標(biāo)序列(例如SNP或突變)的雜交通過(guò)顯示結(jié)合的探針直接檢測(cè)(例如Northern或Southern試驗(yàn)；參見(jiàn)，例如，Ausabel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology，Jolm Wiley & Sons，NY )。在這些試驗(yàn)中，從受試者中分離基因組DNA(Southern)或RNA(Northern)。然后用一系列在基因組中通常不切割并且不靠近所測(cè)定的任何標(biāo)記的限制性?xún)?nèi)切酶切割該DNA或RNA。然后分離(例如在瓊脂糖凝膠上)該DNA或RNA，將其轉(zhuǎn)移到膜上。使對(duì)于檢測(cè)的SNP或突變特異的標(biāo)記(例如通過(guò)摻入放射性核苷酸)探針在低、中或高嚴(yán)格性條件下接觸該膜。除去未結(jié)合的探針，通過(guò)顯示標(biāo)記探針檢測(cè)結(jié)合的存在。
b.利用“DNA芯片”試驗(yàn)檢測(cè)雜交在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用DNA芯片雜交試驗(yàn)檢測(cè)變異序列。在該試驗(yàn)中，將一系列寡核苷酸探針附著在固體支持體上。這些寡核苷酸探針設(shè)計(jì)成對(duì)于特定SNP或突變獨(dú)特的。目標(biāo)DNA樣品與DNA“芯片”接觸，并檢測(cè)雜交。
在一些實(shí)施方案中，DNA芯片試驗(yàn)是一種基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA；參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利6,045,996；5,925,525；和5,858,659號(hào)；均在此引用作為參考)試驗(yàn)?；蛐酒夹g(shù)使用附著在“芯片”上的寡核苷酸探針的小型化、高密度陣列。探針陣列通過(guò)Affymetrix的光引導(dǎo)化學(xué)合成法制造，該方法將固相化學(xué)合成法與半導(dǎo)體工業(yè)中使用的光刻制造技術(shù)結(jié)合起來(lái)。使用一系列光刻用掩模限定芯片的暴露部位，隨后進(jìn)行特定化學(xué)合成步驟，該方法構(gòu)建高密度的寡核苷酸陣列，每個(gè)探針均位于該陣列中預(yù)先確定的位置上。在大玻璃片上同時(shí)合成多個(gè)探針陣列。然后將該玻璃片切成小片，將各個(gè)探針陣列包裝在噴射模塑的塑料盒中，保護(hù)它們不受環(huán)境影響，并且作為雜交室。
分離將要分析的核酸，PCR擴(kuò)增，用熒光報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記。然后使用流體站(fluidics station)，使標(biāo)記的DNA與該陣列一起溫育。然后將該陣列插入掃描儀中，檢測(cè)雜交模式。收集雜交數(shù)據(jù)，其為已經(jīng)摻入到與探針陣列結(jié)合的靶標(biāo)中的熒光報(bào)道基團(tuán)所發(fā)出的光。與靶標(biāo)完全匹配的探針通常比具有錯(cuò)配的探針產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)。由于根據(jù)互補(bǔ)性已知每個(gè)探針在陣列上的序列和位置，因此可以確定施加到該探針陣列上的靶核酸的身份。
在另外一些實(shí)施方案中，使用含有電子捕獲探針的DNA微芯片(Nanogen，San Diego，CA)(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利6,017,696；6,068,818；和6,051,380號(hào)；均在此引用作為參考)。通過(guò)使用微電子技術(shù)，Nanogen的技術(shù)能夠使帶電分子向半導(dǎo)體微芯片上的選定檢測(cè)部位，或從該部位向外活躍移動(dòng)并集中。特定SNP或突變獨(dú)特的DNA捕獲探針被電子學(xué)地置于或者“定位”于微芯片上的特定部位。由于DNA帶有強(qiáng)負(fù)電荷，它可以電子學(xué)地移動(dòng)到正電荷區(qū)。
首先，用正電荷電活化該微芯片上的檢測(cè)部位或一排檢測(cè)部位。然后，將含有DNA探針的溶液引至該微芯片上。帶負(fù)電荷的探針快速移動(dòng)到帶正電荷的部位，在該部位集中，并且化學(xué)結(jié)合到微芯片上的部位。然后洗滌該微芯片，加入另外一種不同DNA探針的溶液，直到特異性結(jié)合的DNA探針的陣列完成。
然后通過(guò)確定哪種DNA捕獲探針與檢測(cè)樣品中的互補(bǔ)DNA(例如PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因)雜交，分析該檢測(cè)樣品中靶DNA分子的存在。也利用電荷使靶分子移動(dòng)和集中至微芯片上的一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)部位。各個(gè)檢測(cè)部位處樣品DNA的電子濃度促進(jìn)了樣品DNA與互補(bǔ)捕獲探針快速雜交(雜交可以在幾分鐘內(nèi)發(fā)生)。為了從各個(gè)部位上除去任何未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的DNA，使該部位的極性或電荷逆轉(zhuǎn)為負(fù)值，從而將任何未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的DNA推回溶液中，離開(kāi)捕獲探針。利用基于激光的熒光掃描儀檢測(cè)結(jié)合。
在另外一些實(shí)施方案中，采用基于在平面(芯片)上根據(jù)表面張力的差異分離流體的陣列技術(shù)(ProtoGene，Palo Alto，CA)(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利6,001,311；5,985,551；和5,474,796號(hào)；均在此引用作為參考)。Protogene的技術(shù)基于以下事實(shí)可以在平面上根據(jù)化學(xué)涂層引起的表面張力的差異分離流體。一旦這樣分離，即通過(guò)試劑的噴墨打印在芯片上直接合成寡核苷酸探針。其反應(yīng)部位被表面張力限定的陣列固定在X/Y傳動(dòng)平臺(tái)上，置于一組4個(gè)壓電噴嘴下，分別對(duì)應(yīng)于4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DNA堿基。該傳動(dòng)平臺(tái)沿該陣列的各行移動(dòng)，并將適當(dāng)?shù)脑噭┹斔偷礁鱾€(gè)反應(yīng)部位。例如，A amidite只被輸送到在合成步驟過(guò)程中amidite A將要偶聯(lián)的部位，等等。通過(guò)溢流至整個(gè)表面，然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)除去，輸送普通試劑和洗液。
利用Protogene的技術(shù)將對(duì)于目標(biāo)SNP或突變獨(dú)特的DNA探針附著在芯片上。該芯片然后接觸PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因。雜交后，除去未結(jié)合的DNA，利用任何合適的方法(例如通過(guò)摻入的熒光基團(tuán)的熒光去猝滅)檢測(cè)雜交。
在另外一些實(shí)施方案中，用“珠陣列”檢測(cè)多態(tài)性(Illumina，SanDiego，CA；參見(jiàn)，例如PCT申請(qǐng)WO99/67641和WO 00/39587，均在此引用作為參考)。Illumina使用珠陣列技術(shù)，該技術(shù)組合了自裝配為陣列的光纖束和珠子。每個(gè)光纖束根據(jù)束直徑含有數(shù)千個(gè)到數(shù)百萬(wàn)個(gè)纖維。珠子用對(duì)于特定SNP或突變檢測(cè)特異的寡核苷酸包被。幾批珠子組合形成該陣列特異的庫(kù)。為了進(jìn)行測(cè)定，該珠陣列接觸制備的試樣(例如DNA)。用任意合適的方法檢測(cè)雜交。
c.雜交的酶檢測(cè)在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)酶切特定結(jié)構(gòu)檢測(cè)雜交(INVADER試驗(yàn)，Third Wave Technologies；參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,846,717；6,090,543；6,001,567；5,985,557；和5,994,069號(hào)；均在此引用作為參考)。INVADER試驗(yàn)通過(guò)用結(jié)構(gòu)特異性酶切割重疊寡核苷酸探針雜交形成的復(fù)合物，檢測(cè)特異的DNA和RNA序列。溫度升高和一種探針過(guò)量使得對(duì)于存在的各個(gè)靶序列，多個(gè)探針將被切割，而不需溫度循環(huán)。這些切割的探針然后引導(dǎo)第二標(biāo)記探針的切割。第二探針寡核苷酸的5′末端可以用熒光染料標(biāo)記，該熒光染料被第二種染料或其他猝滅部分猝滅。切割后，去猝滅的染料標(biāo)記的產(chǎn)物可用標(biāo)準(zhǔn)熒光讀板儀檢測(cè)，或者用在反應(yīng)過(guò)程中收集熒光數(shù)據(jù)的儀器(即“實(shí)時(shí)”熒光檢測(cè)儀，如ABI 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)檢測(cè)。
INVADER試驗(yàn)檢測(cè)未擴(kuò)增基因組DNA中的特定突變和SNP。在用于檢測(cè)基因組DNA中SNP的INVADER試驗(yàn)的一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)寡核苷酸(SNP/突變或野生型序列特異性的第一探針，和INVADER寡核苷酸)與基因組DNA串聯(lián)雜交，形成重疊結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)特異性核酸酶識(shí)別該重疊結(jié)構(gòu)，并且切割該第一探針。在第二反應(yīng)中，切割的第一探針與熒光標(biāo)記的第二探針結(jié)合，產(chǎn)生另一重疊結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被該酶切割。第一和第二反應(yīng)可在同一容器中同時(shí)進(jìn)行。第二探針的切割如上所述用熒光檢測(cè)器檢測(cè)。檢測(cè)樣品的信號(hào)可以與已知的陽(yáng)性和陰性對(duì)照進(jìn)行比較。
在一些實(shí)施方案中，結(jié)合探針的雜交用TaqMan試驗(yàn)檢測(cè)(PEBiosystems，F(xiàn)oster City，CA；參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,962,233和5,538,848號(hào)，均在此引用作為參考)。該試驗(yàn)在PCR反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行。TaqMan試驗(yàn)利用DNA聚合酶如AMPLITAQ DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。該P(yáng)CR反應(yīng)中包括特定等位基因或突變特異性的探針。該探針由寡核苷酸與5′-報(bào)道染料(例如熒光染料)和3′-猝滅染料組成。在PCR過(guò)程中，如果探針與其靶標(biāo)結(jié)合，則AMPLITAQ聚合酶的5′-3′核酸裂解活性在報(bào)道染料與猝滅染料之間切割該探針。報(bào)道染料與猝滅染料的分離導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。隨著每個(gè)PCR循環(huán)進(jìn)行，信號(hào)積累，可以用熒光計(jì)監(jiān)測(cè)。
在另一些實(shí)施方案中，用SNP-IT引物延伸試驗(yàn)檢測(cè)多態(tài)性(Orchid Biosciences，Princeton，NJ；參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,952,174和5,919,626號(hào)，均在此引用作為參考)。在該試驗(yàn)中如下鑒定SNP利用特別合成的DNA引物和DNA聚合酶，使DNA鏈在懷疑的SNP位點(diǎn)處選擇性延伸一個(gè)堿基。擴(kuò)增并變性目標(biāo)區(qū)中的DNA。然后用被稱(chēng)為微觀流體裝置的小型系統(tǒng)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)。通過(guò)向懷疑處于SNP或突變位點(diǎn)處的核苷酸上添加一個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記物向DNA內(nèi)的摻入可以用任何合適的方法檢測(cè)(例如，如果該核苷酸含有生物素標(biāo)記，則通過(guò)熒光標(biāo)記的生物素特異性抗體進(jìn)行檢測(cè))。
III.序列輸入和用戶界面可以從任何數(shù)量的來(lái)源輸入序列進(jìn)行分析。在許多實(shí)施方案中，將序列信息輸入計(jì)算機(jī)中。該計(jì)算機(jī)不一定是進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析的同一計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將候選靶序列輸入連接到通訊網(wǎng)絡(luò)(例如局域網(wǎng)、因特網(wǎng)或內(nèi)聯(lián)網(wǎng))的計(jì)算機(jī)中。在這樣的實(shí)施方案中，能夠訪問(wèn)通訊網(wǎng)絡(luò)的世界上任何地方的用戶都可以在其自己的地點(diǎn)輸入候選序列。在一些實(shí)施方案中，在通訊網(wǎng)絡(luò)上給用戶提供用戶界面(例如基于萬(wàn)維網(wǎng)的用戶界面)，其中包括計(jì)算機(jī)分析所需信息的輸入字段(例如候選靶序列的序列)。使用基于Web的用戶界面具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，通過(guò)提供輸入向?qū)?，用戶界面能夠確保用戶以正確的格式輸入必要量的信息。在一些實(shí)施方案中，用戶界面要求靶序列的序列信息是最小長(zhǎng)度(例如20個(gè)或更多，50個(gè)或更多，100個(gè)或更多個(gè)核苷酸)，并且是單一格式(例如FASTA)。在另外一些實(shí)施方案中，可以以任何格式輸入信息，本發(fā)明的系統(tǒng)和方法將輸入信息編輯或改變成合適的形式進(jìn)行分析。例如，如果輸入靶序列太短，則本發(fā)明的系統(tǒng)和方法搜索公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的短序列，如果確定了唯一的序列，則通過(guò)在輸入靶序列的一端或兩端上添加核苷酸使短序列轉(zhuǎn)化為適當(dāng)長(zhǎng)度的序列。同樣，如果序列信息以不希望的格式輸入或者包含無(wú)關(guān)的非序列字符，則可以在進(jìn)一步的計(jì)算機(jī)分析之前將該序列修改為標(biāo)準(zhǔn)格式(例如FASTA)。用戶界面也可以收集關(guān)于用戶的信息，包括但不限于用戶的名稱(chēng)和地址。在一些實(shí)施方案中，靶序列輸入與用戶的識(shí)別碼相關(guān)聯(lián)。
在一些實(shí)施方案中，直接從試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件(例如INVADERCREATOR軟件)輸入序列。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，給每個(gè)序列一個(gè)ID號(hào)。該ID號(hào)與所要分析的靶序列相關(guān)聯(lián)，以避免重復(fù)分析。例如，如果計(jì)算機(jī)分析確定對(duì)應(yīng)于輸入序列的靶序列已經(jīng)被分析，則通知用戶，并給出繞過(guò)計(jì)算機(jī)分析而只接收以前獲得的結(jié)果的選項(xiàng)。
Web-訂購(gòu)系統(tǒng)和方法希望訂購(gòu)檢測(cè)試驗(yàn)、設(shè)計(jì)檢測(cè)試驗(yàn)、或者訪問(wèn)本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫(kù)或其他信息的用戶可以使用電子通信系統(tǒng)(例如因特網(wǎng))。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的訂購(gòu)和信息系統(tǒng)連接到公共網(wǎng)絡(luò)，使任何用戶都可以獲得該信息。在一些實(shí)施方案中，提供私有的電子通訊網(wǎng)絡(luò)。例如，當(dāng)客戶或用戶是重復(fù)的用戶時(shí)(例如分銷(xiāo)商或大的診斷實(shí)驗(yàn)室)，可以在用戶的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)與本發(fā)明系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)之間提供全時(shí)的專(zhuān)用私人連接?？梢栽O(shè)置該系統(tǒng)使人的交互作用最小化。例如，在一些實(shí)施方案中，利用存貨控制軟件監(jiān)測(cè)用戶擁有的檢測(cè)試驗(yàn)的數(shù)量和類(lèi)型。以確定的間隔發(fā)出查詢(xún)，以確定用戶是否具有適當(dāng)數(shù)量和類(lèi)型的檢測(cè)試驗(yàn)，以及如果檢測(cè)到缺乏，則發(fā)送指令，為用戶設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和/或遞送另外的試驗(yàn)。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)也監(jiān)測(cè)銷(xiāo)售者的存貨水平，在優(yōu)選實(shí)施方案中，與生產(chǎn)系統(tǒng)集成，以管理生產(chǎn)能力和時(shí)間安排。
在一些實(shí)施方案中，提供用戶友好的界面，以利于檢測(cè)試驗(yàn)的選擇和訂購(gòu)。由于數(shù)十萬(wàn)種檢測(cè)試驗(yàn)可以提供，和/或用戶可能希望查詢(xún)多態(tài)性，用戶友好的界面允許通過(guò)一組復(fù)雜的選項(xiàng)來(lái)導(dǎo)航。例如，在一些實(shí)施方案中，利用一系列棧式數(shù)據(jù)庫(kù)引導(dǎo)用戶到達(dá)希望的產(chǎn)物，在一些實(shí)施方案中，第一層提供一個(gè)生物體所有染色體的展示。用戶選擇一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)染色體。染色體的選擇提供更詳細(xì)的染色體圖譜，指示染色體上的帶區(qū)。選擇所需的帶使圖譜顯示基因位置。一個(gè)或多個(gè)另外的細(xì)節(jié)層提供多態(tài)性的堿基位置、基因名稱(chēng)、基因數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別標(biāo)記、注釋、現(xiàn)有已開(kāi)發(fā)的可購(gòu)買(mǎi)得到的檢測(cè)試驗(yàn)的染色體區(qū)、沒(méi)有已開(kāi)發(fā)的試驗(yàn)但是可以設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的區(qū)域，等等。選擇一個(gè)區(qū)域、多態(tài)性或檢測(cè)試驗(yàn)使用戶到達(dá)訂購(gòu)界面，在該界面收集信息以啟動(dòng)檢測(cè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和/或訂購(gòu)。在一些實(shí)施方案中，提供了搜索引擎，向其中輸入基因名稱(chēng)、序列范圍、多態(tài)性或其他查詢(xún)，將立即引導(dǎo)用戶到達(dá)合適的信息層。
在一些實(shí)施方案中，訂購(gòu)、設(shè)計(jì)和生產(chǎn)系統(tǒng)與財(cái)務(wù)系統(tǒng)集成，其中檢測(cè)試驗(yàn)的定價(jià)由以下一個(gè)或多個(gè)因素決定是否需要設(shè)計(jì)，基于檢測(cè)試驗(yàn)成分的物品成本，對(duì)于某些客戶的特殊折扣，對(duì)于大量訂購(gòu)的折扣，對(duì)于再訂購(gòu)的折扣，產(chǎn)品被知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)或向第三方的合同支付義務(wù)引起的價(jià)格提高，和基于用法的價(jià)格選擇。例如，當(dāng)檢測(cè)試驗(yàn)將用于或者有資格用于臨床診斷而不是研究用途時(shí)，價(jià)格將提高。在一些實(shí)施方案中，臨床產(chǎn)品的價(jià)格提高自動(dòng)發(fā)生。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)連接到FDA、公開(kāi)出版物或其他數(shù)據(jù)庫(kù)，以確定一種產(chǎn)品是否具有臨床診斷或ASR用途的資格。
實(shí)施例提供下列實(shí)施例是為了證明及進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案和方面，不實(shí)視為限制其范圍。
在下面的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中，使用下列縮寫(xiě)N(正常)；M(摩爾濃度)；mM(毫摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；pmol(皮摩爾)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(納克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；DS(硫酸葡聚糖)；C(攝氏度)；和Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
實(shí)施例1設(shè)計(jì)10重反應(yīng)(手工)INVADER試驗(yàn)的檢驗(yàn)下面的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例描述了用于多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增引物的手工設(shè)計(jì)，以及隨后利用INVADER試驗(yàn)檢測(cè)擴(kuò)增子。
從可在TWT內(nèi)部寡核苷酸訂單輸入數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的一組預(yù)先證實(shí)的含SNP序列中選擇10個(gè)靶序列。每個(gè)靶序列含有一個(gè)已經(jīng)預(yù)先為其設(shè)計(jì)INVADER試驗(yàn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。該INVADER試驗(yàn)寡核苷酸用INVADER CREATOR軟件(Third Wave Technologies，Inc.Madison，WI)設(shè)計(jì)，因此在該實(shí)施例中足跡區(qū)被定義為INVADER “足跡”，或被INVADER和探針寡核苷酸覆蓋的堿基，其最佳定位用于檢測(cè)目標(biāo)堿基，在該情況下，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性。對(duì)于擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)分析，10個(gè)靶序列各分析約200個(gè)核苷酸，SNP堿基大致位于該序列的中心。
按照探針解鏈溫度Tm的范圍50-60℃，限定最大和最小探針長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)(缺省分別為30個(gè)核苷酸和12個(gè)核苷酸)。在該實(shí)施例中，為了選擇在預(yù)先選擇的反應(yīng)溫度下表現(xiàn)最佳的探針序列，用DNA雙鏈體形成的最近鄰居模型和公開(kāi)的DNA雙鏈體形成參數(shù)計(jì)算寡核苷酸的解鏈溫度(Tm)(Allawi和SantaLucia，Biochemistry，3610581 ，在此引用作為參考)。因?yàn)樵撛囼?yàn)的鹽濃度通常不同于獲得最近鄰居參數(shù)的溶液條件(1M NaCl，并且不含二價(jià)金屬)，并且因?yàn)槊傅拇嬖诤蜐舛扔绊懥俗钸m反應(yīng)溫度，因此應(yīng)當(dāng)調(diào)節(jié)計(jì)算的Tm，以確定進(jìn)行反應(yīng)的最適溫度。補(bǔ)償這些因素的一種方法是改變解鏈溫度計(jì)算中提供的鹽濃度值。這種調(diào)節(jié)被稱(chēng)為“鹽校正”。術(shù)語(yǔ)“鹽校正”是指為了反映影響核酸雙鏈體的非鹽參數(shù)或條件對(duì)該雙鏈體Tm計(jì)算的影響，對(duì)提供的鹽濃度值進(jìn)行的改變。提供的標(biāo)準(zhǔn)濃度值的改變也影響這些計(jì)算的結(jié)果。使用280nM NaCl的值(SantaLucia，Proc Natl AcadSci U S A，951460 ，在此引用作為參考)和大約10pM探針和1fM靶標(biāo)的鏈濃度，用于計(jì)算探針-靶標(biāo)解鏈溫度的算法適合用于預(yù)測(cè)最佳引物設(shè)計(jì)序列。
然后，掃描在上游和下游與該足跡區(qū)相鄰的序列，選擇第一個(gè)A或C 為設(shè)計(jì)起點(diǎn)，使得引物表示為5′-N[x]-N[x-1]-.....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3′，其中N[1]應(yīng)當(dāng)是A或C。使用以下原則避免引物互補(bǔ)性指定寡核苷酸引物的N[2]-N[1]應(yīng)當(dāng)不與任何其他寡核苷酸的N[2]-N[1]互補(bǔ)，且N[3]-N[2]-N[1]應(yīng)當(dāng)不與任何其他寡核苷酸的N[3]-N[2]-N[1]互補(bǔ)。如果在給定的N[1]處不能滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，則對(duì)于正向引物，5′方向的下一個(gè)堿基，或者對(duì)于反向引物，3′方向的下一個(gè)堿基，將被作為N[1]位點(diǎn)評(píng)價(jià)。在手工分析的情況下，為了使3’末端的互補(bǔ)性最小化，針對(duì)A/C富含區(qū)。
在該實(shí)施例中，在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行INVADER試驗(yàn)。因此，第二INVADER反應(yīng)寡核苷酸(FRET寡核苷酸序列)的一部分也被引入作為引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)；該擴(kuò)增引物序列與FRET寡核苷酸的特定區(qū)的同源性應(yīng)當(dāng)?shù)陀?0％。
所有引物均按照標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸化學(xué)法合成，脫鹽(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法)，根據(jù)A260的吸光度定量，并且稀釋為50μM濃縮貯存液。
然后使用等摩爾量的引物(0.01μM/引物)在如下條件下通過(guò)10重PCR進(jìn)行多重PCR100mM KCl，3mM MgCl2，10mM Tris pH8.0，200μMdNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶，和10ng人基因組DNA(hgDNA)模板，在50μl反應(yīng)體系中。該反應(yīng)溫育(94℃/30秒，50℃/44秒)30個(gè)循環(huán)。溫育后，該多重PCR反應(yīng)液用水1∶10稀釋?zhuān)⑶矣肐NVADER試驗(yàn)FRET檢測(cè)板、96孔基因組雙重、100ng CLEAVASE VIII酶進(jìn)行INVADER分析，INVADER試驗(yàn)如下設(shè)置為15μl反應(yīng)體系1μl 1∶10稀釋的PCR反應(yīng)液，3μl PPI混合物，5μl 22.5mM MgCl2，6μl dH2O，覆蓋15μlCHILLOUT液體石蠟。樣品通過(guò)在95℃下5分鐘在雙重INVADER中變性，然后在63℃下溫育，并在不同時(shí)間點(diǎn)用Cytofluor 4000測(cè)量熒光。
使用如下標(biāo)準(zhǔn)精確進(jìn)行基因分型呼叫(FOZ_FAM+FOZ_RED-2＞0.6)，在63℃下溫育10分鐘后10個(gè)INVADER試驗(yàn)呼叫中只有2個(gè)能夠進(jìn)行，在63℃下再溫育50分鐘(共60分鐘)后，10個(gè)呼叫中只有5個(gè)能夠進(jìn)行。在60分鐘時(shí)間點(diǎn)處，在最強(qiáng)信號(hào)(41646，F(xiàn)AM_FOZ+RED_FOZ-2＝54.2，也遠(yuǎn)在讀數(shù)器的動(dòng)態(tài)范圍之外)和最弱信號(hào)(67356，F(xiàn)AM_FOZ+RED_FOZ-2＝0.2)之間，可檢測(cè)FOZ值之間的變化超過(guò)100倍。使用直接針對(duì)100ng人基因組DNA的相同的INVADER試驗(yàn)(其中可以使用等摩爾量的各種靶標(biāo))，所有讀數(shù)將在讀數(shù)器的動(dòng)態(tài)范圍之內(nèi)，并且這些試驗(yàn)的最強(qiáng)(53530，F(xiàn)AM_FOZ+RED_FOZ-2＝3.1)與最弱(53530，F(xiàn)AM_FOZ+RED_FOZ-2＝0.43)之間FOZ值的變化大約為7倍。這提示在同一多重PCR反應(yīng)的不同擴(kuò)增子之間所見(jiàn)FOZ值的明顯不一致是偏好擴(kuò)增的結(jié)果，而不是INVADER試驗(yàn)引起的變化。在這些條件下，不同INVADER試驗(yàn)產(chǎn)生的FOZ值可彼此直接比較，能夠容易地用作擴(kuò)增效率的指示。
使用FOZ值估計(jì)特定擴(kuò)增子的擴(kuò)增倍數(shù)。為了估計(jì)特定擴(kuò)增子的擴(kuò)增倍數(shù)(F)，可以利用INVADER試驗(yàn)的FOZ值估計(jì)擴(kuò)增子豐度。在特定時(shí)間未知濃度的特定擴(kuò)增子的FOZ(FOZm)可以與確定時(shí)間點(diǎn)已知量靶標(biāo)(例如100ng基因組DNA＝單基因的30,000個(gè)拷貝)的FOZ(FOZ240，240分鐘)直接進(jìn)行比較，并且用來(lái)計(jì)算未知擴(kuò)增子的拷貝數(shù)。在方程式1中，F(xiàn)OZm代表在INVADER試驗(yàn)中溫育特定時(shí)間(m)的未知濃度靶標(biāo)的RED_FOZ和FAM_FOZ之和。FOZ240代表240分鐘時(shí)使用已知拷貝數(shù)的靶標(biāo)(例如100ng,hgDNA≅30,000]]>拷貝)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的RED_FOZ值(采用INVADER試驗(yàn)41646)。
F＝((FOZm-1)*500/(FOZ240-1))*(240/m)^2(方程式1a)盡管方程式1a用來(lái)確定引物濃度與擴(kuò)增倍數(shù)F之間的線性關(guān)系，但是在計(jì)算10重PCR的擴(kuò)增倍數(shù)時(shí)使用方程式1a′(都使用等摩爾量的引物和最佳引物濃度)，D值代表PCR反應(yīng)物的稀釋倍數(shù)。對(duì)于1∶3稀釋的50μl多重PCR反應(yīng)物，D＝0.3333。
F＝((FOZm-2)*500/(FOZ240-1)*D)*(240/m)^2(方程式1a′)盡管方程式1a和1a′用于描述10重多重PCR，但是在優(yōu)化107重PCR的引物濃度時(shí)使用該方程式的更正確的變化形式。在此情況下，F(xiàn)OZ240＝整個(gè)INVADER MAP板上FAM_FOZ240+RED_FOZ240的平均值，其使用hgDNA作為模板(FOZ240＝3.42)，稀釋倍數(shù)D設(shè)置為0.125。
F＝((FOZm-2)*500/(FOZ240-2)*D)*(240/m)^2(方程式1b)應(yīng)當(dāng)指出，為了更精確地估計(jì)擴(kuò)增倍數(shù)F，F(xiàn)OZ值應(yīng)當(dāng)位于進(jìn)行讀數(shù)的儀器的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。對(duì)于該研究中使用的Cytofluor 4000，動(dòng)態(tài)范圍為大約1.5至大約12FOZ。
部分3.擴(kuò)增倍數(shù)與引物濃度之間的線性關(guān)系為了確定引物濃度與擴(kuò)增倍數(shù)(F)之間的線性關(guān)系，使用相同引物1117-70-17和1117-70-18，分別以0.01μM、0.012μM、0.014μM、0.020μM的濃度，進(jìn)行4個(gè)不同的單重PCR反應(yīng)。這4個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行100mM KCl，3mM MgCl，10mM Tris pH8.0，200μM dNTPs，使用10ng hgDNA作為模板。在(94℃/30秒，50℃/20秒)溫育30個(gè)循環(huán)。PCR后，反應(yīng)液用水1∶10稀釋?zhuān)跇?biāo)準(zhǔn)條件下用INVADER試驗(yàn)FRET檢測(cè)板、96孔基因組雙重、100ng CLEAVASE VIII酶進(jìn)行。各15μl反應(yīng)體系如下建立1μl 1∶10稀釋的PCR反應(yīng)物，3μl PPI混合物SNP#47932，5μl 22.5mM MgCl2，6μl水，15μl CHILLOUT液體石蠟。整個(gè)板都在95℃下溫育5分鐘，然后在63℃下60分鐘，在該時(shí)間點(diǎn)用Cytofluor 4000熒光讀板儀進(jìn)行一次讀數(shù)。對(duì)4個(gè)不同引物濃度(0.01μM，0.012μM，0.014μM，0.020μM)分別用方程式1a計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)F，F(xiàn)OZm＝60分鐘時(shí)FOZ_FAM和FOZ_RED之和，m＝60，F(xiàn)OZ240＝1.7。各反應(yīng)的引物濃度對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)的對(duì)數(shù)Log(F)作圖，可見(jiàn)強(qiáng)線性關(guān)系。使用這些數(shù)據(jù)點(diǎn)，描述擴(kuò)增倍數(shù)與引物濃度間線性關(guān)系的公式用方程式2描述Y＝1.684X+2.6837 (方程式2a)使用方程式2，特定擴(kuò)增子的擴(kuò)增倍數(shù)Log(F)＝Y(jié)可以用已知引物濃度(X)以可預(yù)測(cè)的方式得到。以相反的方式，可以根據(jù)擴(kuò)增倍數(shù)F，將多重PCR中在等摩爾引物濃度條件下觀察到的擴(kuò)增偏好測(cè)定為“表觀”引物濃度(X)。在多重PCR中，不同擴(kuò)增子之間的“表觀”引物濃度的值可以用來(lái)估計(jì)平衡不同基因座擴(kuò)增所需的各擴(kuò)增子的引物量X＝(Y-2.6837)/1.68 (方程式2b)部分4.由平衡的多重混合物計(jì)算表觀引物濃度如以上部分所述，引物濃度可直接影響特定擴(kuò)增子的擴(kuò)增倍數(shù)。在等摩爾量引物的條件下，可以利用方程式2，用FOZm讀數(shù)計(jì)算各個(gè)擴(kuò)增子的“表觀”引物濃度。用給定擴(kuò)增倍數(shù)的log(F)代替方程式2中的Y，解X，根據(jù)多重反應(yīng)中給定擴(kuò)增子的相對(duì)豐度，得到“表觀”引物濃度。利用方程式2計(jì)算多重反應(yīng)中所有引物(以等摩爾濃度提供)的“表觀”引物濃度，提供了使引物組相互標(biāo)準(zhǔn)化的方法。為了得出應(yīng)當(dāng)加入“最佳”多重引物混合物R中的各個(gè)引物的相對(duì)量，各個(gè)“表觀”引物濃度應(yīng)當(dāng)除以最大表觀引物濃度(Xmax)，使最強(qiáng)的擴(kuò)增子設(shè)置為數(shù)值1，其余的擴(kuò)增子設(shè)置為等于或大于1的數(shù)值。
R[n]＝Xmax/X[n](方程式3)使用R[n]值作為相對(duì)引物濃度的任意值，R[n]值乘以恒定的引物濃度，得到特定多重反應(yīng)中各引物的工作濃度。在所示實(shí)施例中，對(duì)應(yīng)于SNP試驗(yàn)41646的擴(kuò)增子具有等于1的R[n]值。所有R[n]值都乘以0.01μM(等摩爾多重PCR反應(yīng)中最初的起始引物濃度)，使得最低的引物濃度是R[n]為41646，其設(shè)置為1，或0.01μM。其余的引物組也按比例增加。下面描述了使用“最佳”引物混合物的多重PCR的結(jié)果。
部分5.在多重PCR中使用最佳引物濃度，10個(gè)INVADER試驗(yàn)之間FOZ的變化大大降低。
根據(jù)體積使用不同量的引物以10重PCR進(jìn)行多重PCR(X[max]為SNP41646，設(shè)置1x＝0.01μM/引物)。多重PCR在與使用等摩爾引物混合物相同的條件下進(jìn)行100mM KCl，3mM MgCl，10mM Tris pH8.0，200μM dNTPs，2.5U taq，和10ng hgDNA模板，在50μl反應(yīng)體系中。該反應(yīng)溫育(94℃/30秒，50℃/44秒)30個(gè)循環(huán)。溫育后，該多重PCR反應(yīng)物用水1∶10稀釋?zhuān)M(jìn)行INVADER分析。使用INVADER試驗(yàn)FRET檢測(cè)板(96孔基因組雙重，100ng CLEAVSE VIII酶)，該反應(yīng)如下設(shè)置為15μl反應(yīng)體系1μl 1∶10稀釋的PCR反應(yīng)物，3μl適當(dāng)?shù)腜PI混合物，5μl 22.5mM MgCl2，6μl dH2O。向每孔中加入另外15μlCHILL OUT，然后在95℃下溫育5分鐘。平板在63℃下溫育，在10分鐘時(shí)用Cytofluor 4000測(cè)量熒光。
使用以下標(biāo)準(zhǔn)精確進(jìn)行基因分型呼叫(FOZ_FAM+FOZ_RED-2＞0.6)，10個(gè)INVADER呼叫中全部10個(gè)(100％)都可以在63℃溫育10分鐘后進(jìn)行。另外，F(xiàn)AM+RED-2的值(總信號(hào)產(chǎn)生的指示，與擴(kuò)增倍數(shù)直接相關(guān)(見(jiàn)方程式2))在最低信號(hào)(67325，F(xiàn)AM+RED-2＝0.7)和最高信號(hào)(47892，F(xiàn)AM+RED-2＝4.3)之間變化不到7倍。
實(shí)施例2使用應(yīng)用軟件對(duì)101重PCR的設(shè)計(jì)使用TWT Oligo訂單輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得長(zhǎng)度低于200個(gè)核苷酸的144個(gè)序列，其中SNP用括號(hào)標(biāo)注，以指示各個(gè)序列的SNP位點(diǎn)(例如NNNNNNN[N(wt)/N(mt)]NNNNNNNN)。為了擴(kuò)充位于目標(biāo)SNP之側(cè)的序列數(shù)據(jù)，利用BLAST分析將序列擴(kuò)展為長(zhǎng)度約1kB(位于SNP每一側(cè)的500nts)。在144個(gè)起始序列中，有16個(gè)不能被BLAST擴(kuò)展，導(dǎo)致最終一組128個(gè)序列擴(kuò)展至大約1kB的長(zhǎng)度。這些擴(kuò)展的序列以Excel格式，連同各個(gè)序列的以下信息一起提供給用戶(1)TWT號(hào)，(2)短名標(biāo)識(shí)符，和(3)序列。該Excel文件轉(zhuǎn)換為以逗號(hào)分隔的格式，作為輸入文件用于Primer Designer INVADER CREATOR v1.3.3.軟件(該程序版本不篩選引物的FRET反應(yīng)性，也不能使用戶指定引物的最大長(zhǎng)度)的輸入文件。INVADER CREATOR Primer Designer v1.3.3.在缺省條件(例如最小引物大小為12，最大為30)下運(yùn)行，不同之處在于Tm低設(shè)置為60℃。輸出文件包含128個(gè)引物組(256條引物)，其中4個(gè)由于引物序列過(guò)長(zhǎng)而排除(SNP #47854、47889、54874、67396)，留下124個(gè)引物組(248條引物)可用于合成。剩余的引物用標(biāo)準(zhǔn)程序以200nmol的規(guī)模合成，并且通過(guò)脫鹽進(jìn)行純化。合成失敗后，107個(gè)引物組可用于組合等摩爾107重引物混合物(214條引物)。在可用于擴(kuò)增的107個(gè)引物組中，只有101個(gè)存在于INVADER MAP板上，用來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增倍數(shù)。
使用等摩爾量的引物(0.025μM/引物)在如下條件下以101重PCR進(jìn)行多重PCR100mM KCl，3mM MgCl，10mM Tris pH8.0，200μM dNTPs，和10ng人基因組DNA(hgDNA)模板，在50μl反應(yīng)體系中。在95℃變性10分鐘后，加入2.5單位Taq，并且該反應(yīng)溫育(94℃/30秒，50℃/44秒)50個(gè)循環(huán)。溫育后，該多重PCR反應(yīng)物用水1∶24稀釋?zhuān)肐NVADER MAP檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行INVADER分析。各INVADER MAP試驗(yàn)如下以6μl反應(yīng)體系進(jìn)行3μl 1∶24稀釋的PCR反應(yīng)物(總稀釋度1∶8，等于D＝0.125)，3μl 15mM MgCl2，覆蓋6μl CHILLOUT。通過(guò)在95℃下溫育5分鐘使樣品在INVADER MAP板中變性，然后在63℃下溫育，并在160分鐘內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)用Cytofluor 4000(384孔讀板儀)測(cè)量熒光。在10、20、40、80、160分鐘時(shí)計(jì)算的FOZ值的分析顯示，INVADERMAP平臺(tái)可檢測(cè)到的101個(gè)擴(kuò)增子中有94個(gè)可進(jìn)行正確呼叫(與同一DNA樣品的基因組呼叫相比)。這提供了INVADER CREATOR PrimerDesigner軟件能夠產(chǎn)生在高度多重PCR中起作用的引物組的證據(jù)。
在使用整個(gè)160分鐘時(shí)程內(nèi)獲得的FOZ值時(shí)，計(jì)算101個(gè)擴(kuò)增子各自的擴(kuò)增倍數(shù)F和R[n]。R[nmax]設(shè)置為1.6，但是對(duì)在160分鐘時(shí)不能提供足夠FOZm信號(hào)的擴(kuò)增子進(jìn)行低端校正，賦予R[n]為任意值12。對(duì)10分鐘時(shí)讀出FOZm值的擴(kuò)增子進(jìn)行高端校正，任意賦予R[n]值為1。使用10重反應(yīng)實(shí)施例中所述的基本原則和方程式1b計(jì)算101重反應(yīng)的最佳引物濃度，其中R[n]為1相當(dāng)于0.025μM引物(不同引物濃度見(jiàn)圖15)。多重PCR在如下條件下進(jìn)行100mM KCl，3mM MgCl，10mM Tris pH8.0，200μM dNTPs，和10ng人基因組DNA(hgDNA)模板，在50μl反應(yīng)體系中。在95℃下變性10分鐘后，加入2.5單位Taq，反應(yīng)物溫育(94℃/30秒，50℃/44秒)50個(gè)循環(huán)。溫育后，多重PCR反應(yīng)物用水1∶24稀釋?zhuān)肐NVADER MAP檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行INVADER分析。各個(gè)INVADER MAP試驗(yàn)均以如下6μl反應(yīng)體系進(jìn)行3μl 1∶24稀釋的PCR反應(yīng)物(總稀釋度1∶8，相當(dāng)于D＝0.125)，3μl 15mM MgCl2，覆蓋6μl CHILLOUT。通過(guò)在95℃下溫育5分鐘在INVADER MAP板上變性樣品，然后在63℃下溫育，用Cytofluor 4000(384孔讀板儀)在160分鐘內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量熒光。在10、20、40分鐘時(shí)進(jìn)行FOZ值的分析，并與直接對(duì)基因組DNA進(jìn)行的呼叫進(jìn)行比較。用等摩爾引物濃度的101重PCR在10分鐘時(shí)進(jìn)行的呼叫與最佳引物濃度下用101重PCR在10分鐘時(shí)進(jìn)行的呼叫進(jìn)行比較。在等摩爾引物濃度下，多重PCR導(dǎo)致在10分鐘時(shí)間點(diǎn)時(shí)只有50個(gè)正確呼叫，而在最佳引物濃度下，多重PCR導(dǎo)致71個(gè)正確呼叫，增加了21個(gè)(42％)新呼叫。盡管所有101個(gè)呼叫都不能在10分鐘時(shí)間點(diǎn)時(shí)進(jìn)行，但是94個(gè)呼叫可以在40分鐘時(shí)間點(diǎn)時(shí)進(jìn)行，提示大多數(shù)擴(kuò)增子的擴(kuò)增效率提高。與只需要一輪優(yōu)化的10重優(yōu)化不同，更復(fù)雜的多重反應(yīng)可能需要多輪優(yōu)化來(lái)平衡所有基因座的擴(kuò)增。
實(shí)施例3應(yīng)用INVADER試驗(yàn)確定PCR的擴(kuò)增倍數(shù)INVADER試驗(yàn)可以用來(lái)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中擴(kuò)增的進(jìn)展，即，確定反映反應(yīng)中特定擴(kuò)增子擴(kuò)增效率的擴(kuò)增倍數(shù)F。特別是，INVADER試驗(yàn)可以參照由定量參照DNA分子產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定PCR反應(yīng)任意點(diǎn)時(shí)存在的分子數(shù)。擴(kuò)增倍數(shù)F確定為擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物濃度與初始靶濃度的比值。該實(shí)施例證明了不同引物濃度對(duì)測(cè)定的擴(kuò)增倍數(shù)的影響。
PCR反應(yīng)進(jìn)行增量為5的可變循環(huán)數(shù)，即5、10、15、20、25、30個(gè)循環(huán)，使得可以用INVADER試驗(yàn)測(cè)定積累的產(chǎn)物來(lái)評(píng)價(jià)反應(yīng)的進(jìn)展。連續(xù)稀釋該反應(yīng)物，以確保靶標(biāo)量不飽和INVADER試驗(yàn)，即可以在該試驗(yàn)的線性范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。INVADER試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線用含有已知量擴(kuò)增子的稀釋系列產(chǎn)生。該標(biāo)準(zhǔn)曲線用來(lái)外推PCR反應(yīng)中指定循環(huán)數(shù)后擴(kuò)增DNA片段的數(shù)量。用指定PCR循環(huán)數(shù)后的分子數(shù)量與擴(kuò)增前的數(shù)量之比得出各個(gè)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增倍數(shù)F。
PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)用等摩爾量的引物(例如0.02μM或0.1μM引物，終濃度)建立。對(duì)于檢測(cè)的各個(gè)擴(kuò)增水平，即5、10、15、20、25、30個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)引物濃度下的反應(yīng)均建立三份。一份主混合物足以進(jìn)行6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)(一式三份×2引物濃度)加2個(gè)對(duì)照×6次試驗(yàn)(5、10、15、20、25或30PCR循環(huán))加足以覆蓋的附加反應(yīng)。
PCR反應(yīng)產(chǎn)物的連續(xù)稀釋為了確保作為靶標(biāo)加入INVADER測(cè)定反應(yīng)中的PCR產(chǎn)物的量不超過(guò)用PERSEPTIVE BIOSYSTEMS CYTOFLUOR 4000進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍，在加入到INVADER試驗(yàn)之前稀釋PCR反應(yīng)產(chǎn)物。每個(gè)反應(yīng)開(kāi)始時(shí)進(jìn)行20倍稀釋?zhuān)缓?倍連續(xù)稀釋。
為了產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)，利用標(biāo)準(zhǔn)方法從非變性聚丙烯酰胺凝膠中分離用不同循環(huán)數(shù)試驗(yàn)中使用的相同引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且用PICOGREEN試驗(yàn)定量。制備200pM的工作貯存液，這些濃度標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)稀釋液用含30ng/μl tRNA的水制備，以產(chǎn)生擴(kuò)增子濃度為0.5、1、2.5、6.25、15.62、39和100fM的系列。
INVADER測(cè)定反應(yīng)各PCR反應(yīng)物和非靶標(biāo)對(duì)照的適當(dāng)稀釋液一式三份制備，在標(biāo)準(zhǔn)單INVADER測(cè)定反應(yīng)中檢測(cè)。對(duì)所有INVADER測(cè)定反應(yīng)制備一份主混合物。在全部反應(yīng)中，有6個(gè)PCR循環(huán)條件×24分別的檢測(cè)試驗(yàn)[(1次試驗(yàn)三份稀釋液×2引物條件×3PCR重復(fù))＝18+6非靶標(biāo)對(duì)照]。另外，在標(biāo)準(zhǔn)系列中有7個(gè)定量擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)的稀釋液和1個(gè)非靶標(biāo)對(duì)照。對(duì)于另外32個(gè)INVADER試驗(yàn)，該標(biāo)準(zhǔn)系列在兩個(gè)平板上重復(fù)分析。INVADER試驗(yàn)的總數(shù)為6×24+32＝176。主混合物包括32個(gè)反應(yīng)的范圍。INVADER試驗(yàn)主混合物含有如下標(biāo)準(zhǔn)成分FRET緩沖液/Cleavase XI/Mg/PPI混合物，用于192加16個(gè)孔。
PPI混合物中含有如下寡核苷酸用于試驗(yàn)2的0.25μM INVADER(GAAGCGGCGCCGGTTACCACCA)用于試驗(yàn)2的2.5μM A探針(CGCGCCGAGGTGGTTGAGCAATTCCAA)用于試驗(yàn)2的2.5μM G探針(ATGACGTGGCAGACCGGTTGAGCAATTCCA)所有孔均覆蓋15μl礦物油，在95℃下溫育5分鐘，然后在63℃下以不同間隔，例如在20、40、80或160分鐘時(shí)，根據(jù)產(chǎn)生的信號(hào)水平讀數(shù)。反應(yīng)板用CytoFluorSeries 4000熒光多孔板讀板儀讀數(shù)。使用的設(shè)置為對(duì)于F染料檢測(cè)為485/20nm激發(fā)/帶寬和530/25nm發(fā)射/帶寬，對(duì)于R染料檢測(cè)為560/20nm激發(fā)/帶寬和620/40nm發(fā)射/帶寬。對(duì)每種染料設(shè)置儀器增益，使得非靶標(biāo)空白產(chǎn)生100-200的絕對(duì)熒光單位(AFU)。
結(jié)果當(dāng)一式三份INVADER試驗(yàn)的結(jié)果在擴(kuò)增倍數(shù)的log10(y-軸)對(duì)循環(huán)數(shù)(x-軸)的圖中顯示時(shí)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的外推由INVADER試驗(yàn)估計(jì)PCR產(chǎn)物濃度。重復(fù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)不進(jìn)行平均，而是在圖中顯示為多個(gè)重疊的點(diǎn)。
這些結(jié)果表明，該P(yáng)CR反應(yīng)在檢測(cè)的循環(huán)范圍內(nèi)為指數(shù)增長(zhǎng)。使用不同的引物濃度產(chǎn)生不同的斜率，用較高引物濃度(0.1μM)進(jìn)行的PCR反應(yīng)的INVADER試驗(yàn)分析產(chǎn)生的斜率比使用較低(0.02μM)濃度的更陡峭。另外，用0.1μM方法獲得的斜率預(yù)期有完美的倍增(0.301)。在各個(gè)引物濃度時(shí)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增倍數(shù)根據(jù)斜率獲得對(duì)于0.1μM引物，斜率＝0.286；擴(kuò)增倍數(shù)1.93對(duì)于0.02μM引物，斜率＝0.218；擴(kuò)增倍數(shù)1.65。
這些線似乎不延伸到原點(diǎn)，而是在0-5個(gè)循環(huán)之間與X軸相交，這也許反映了在估計(jì)人基因組DNA起始濃度時(shí)的誤差。
因此，這些數(shù)據(jù)表明，引物濃度影響PCR反應(yīng)過(guò)程中的擴(kuò)增程度。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，INVADER試驗(yàn)是監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增的有效工具。
實(shí)施例4擴(kuò)增倍數(shù)與引物濃度的相關(guān)性該實(shí)施例證明了擴(kuò)增倍數(shù)F與引物濃度c之間的相關(guān)性。在該實(shí)驗(yàn)中，分別在4個(gè)不同引物濃度時(shí)測(cè)定2個(gè)等位基因的F，該等位基因來(lái)自在單重PCR反應(yīng)中擴(kuò)增的6個(gè)SNP中的每一個(gè)，因此6個(gè)引物對(duì)×2個(gè)基因組樣品×4個(gè)引物濃度＝48個(gè)PCR反應(yīng)。
在實(shí)施例3中，在2個(gè)引物濃度下對(duì)一個(gè)擴(kuò)增區(qū)檢測(cè)PCR循環(huán)數(shù)的影響，而在該實(shí)施例中，所有檢測(cè)的PCR反應(yīng)都進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，但是不同引物濃度的影響在4個(gè)不同濃度水平上研究0.01μM，0.025μM，0.05μM，0.1μM。另外，該實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了不同基因組區(qū)的擴(kuò)增的差異，以研究(a)不同基因組區(qū)是否不同程度地?cái)U(kuò)增(即PCR偏好)，和(b)不同基因組的擴(kuò)增如何依賴(lài)于引物濃度。
如同實(shí)施例3一樣，通過(guò)使用純化的、定量的參照擴(kuò)增子制品的稀釋系列產(chǎn)生每個(gè)基因座的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定F。在該情況下，產(chǎn)生12個(gè)不同的參照擴(kuò)增子用引物對(duì)擴(kuò)增的6個(gè)基因組區(qū)中所含SNP的每個(gè)等位基因各一個(gè)。用INVADER試驗(yàn)檢測(cè)每個(gè)參照擴(kuò)增子的濃度，產(chǎn)生熒光計(jì)數(shù)對(duì)擴(kuò)增子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。也對(duì)基因組DNA樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，稀釋產(chǎn)物，然后在INVADER試驗(yàn)中檢測(cè)，以通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，根據(jù)分子數(shù)確定擴(kuò)增程度。
a.使用定量的參照擴(kuò)增子產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線在標(biāo)準(zhǔn)雙重INVADER試驗(yàn)中篩選總共8個(gè)從全血中分離的基因組DNA樣品，以確定它們?cè)?4個(gè)SNP處的基因型，從而鑒定在總共6個(gè)不同基因座處野生型或變異等位基因純合的樣品。
一旦鑒定了這些基因座，即在分開(kāi)的PCR反應(yīng)中用位于含有各個(gè)SNP的基因組區(qū)之側(cè)的引物分析野生型和變異基因組DNA樣品。在每個(gè)SNP處，一個(gè)等位基因報(bào)道給FAM，一個(gè)報(bào)道給RED。
然后在標(biāo)準(zhǔn)的各個(gè)單重PCR反應(yīng)中擴(kuò)增適當(dāng)?shù)幕蚪MDNA制品，以產(chǎn)生擴(kuò)增片段，用作如實(shí)施例3所述的PCR參照標(biāo)準(zhǔn)。
PCR后，擴(kuò)增的RNA用標(biāo)準(zhǔn)方法凝膠分離，預(yù)先用PICOGREEN試驗(yàn)定量。這些濃度標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)稀釋如下產(chǎn)生稀釋各個(gè)純化的擴(kuò)增子，產(chǎn)生濃度為200pM的工作貯存液。這些貯存液然后如下連續(xù)稀釋。用含30ng/μl tRNA的dH2O制備各擴(kuò)增子的工作貯存溶液，濃度為1.25pM。該工作貯存液在96孔微量滴定板中稀釋?zhuān)缓筮B續(xù)稀釋?zhuān)贗NVADER試驗(yàn)中產(chǎn)生下列終濃度1、2.5、6.25、15.6、39、100和250fM。一塊板準(zhǔn)備用于在INVADER試驗(yàn)中用報(bào)道給FAM染料的探針寡核苷酸檢測(cè)的擴(kuò)增子，另一塊板準(zhǔn)備用于用報(bào)道給RED染料的探針寡核苷酸檢測(cè)的擴(kuò)增子。所有擴(kuò)增子稀釋液均一式兩份分析。
在該設(shè)計(jì)中，將100μl等份轉(zhuǎn)移至96孔MJ Research板，并且在95℃下變性5分鐘，之后加入INVADER試驗(yàn)中。
b.在不同引物濃度時(shí)，基因組樣品的PCR擴(kuò)增建立PCR反應(yīng)，用于在4種不同引物濃度下分別擴(kuò)增前面實(shí)施例所述的6個(gè)基因組區(qū)的各2個(gè)等位基因，總共48個(gè)PCR反應(yīng)。所有PCR均進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。檢測(cè)如下引物濃度0.01μM，0.025μM，0.05μM和0.1μM。
用于全部48個(gè)反應(yīng)的主混合物按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備，不同之處在于改變了引物濃度，以及多出另外23個(gè)反應(yīng)(16個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)備但是未使用，多準(zhǔn)備了另外7個(gè)反應(yīng))。
c.PCR反應(yīng)物的稀釋在INVADER試驗(yàn)分析之前，必需如實(shí)施例1和2所述稀釋PCR反應(yīng)產(chǎn)物。48個(gè)PCR反應(yīng)物的連續(xù)稀釋液對(duì)于每個(gè)SNP均用一塊96孔板制備。該板的左半部含有將要用報(bào)道給FAM的探針寡核苷酸檢測(cè)的SNP；右半部使用報(bào)道給RED的探針寡核苷酸。初始稀釋度為1∶20；后續(xù)稀釋度為1∶5至1∶62,500。
d.PCR稀釋液和參照擴(kuò)增子的INVADER試驗(yàn)分析在標(biāo)準(zhǔn)雙重INVADER試驗(yàn)中對(duì)各個(gè)PCR反應(yīng)的所有稀釋液以及各個(gè)定量參照擴(kuò)增子的指定稀釋液進(jìn)行INVADER分析(以產(chǎn)生每個(gè)擴(kuò)增子的標(biāo)準(zhǔn)曲線)。
所有孔均覆蓋15μl礦物油。樣品在95℃下加熱5分鐘變性，然后在64℃下溫育。熒光測(cè)量用CytoFluor4000熒光讀板儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)在40和80分鐘時(shí)進(jìn)行。使用的設(shè)置為對(duì)于F染料檢測(cè)，為485/20nm激發(fā)/帶寬和530/25nm發(fā)射/帶寬，對(duì)于R染料檢測(cè)，為560/20nm激發(fā)/帶寬和620/40nm發(fā)射/帶寬。對(duì)每種染料設(shè)置儀器增益，使得非靶標(biāo)空白產(chǎn)生100-200絕對(duì)熒光單位(AFU)。原始數(shù)據(jù)是由用來(lái)測(cè)定試驗(yàn)表現(xiàn)(實(shí)時(shí)或終點(diǎn)模式)的裝置/儀器產(chǎn)生的。
這些結(jié)果表明了lnF與c的相關(guān)性，證明在相同反應(yīng)條件下12個(gè)PCR有不同的擴(kuò)增速度，盡管在代表同一SNP的每對(duì)靶標(biāo)內(nèi)該差異極小。在低引物濃度時(shí)，擴(kuò)增倍數(shù)強(qiáng)烈依賴(lài)于c，在較高引物濃度時(shí)趨向于平臺(tái)。該現(xiàn)象可以用引物退火動(dòng)力學(xué)解釋。在高引物濃度時(shí)，快速退火動(dòng)力學(xué)確保引物與所有靶標(biāo)結(jié)合，并達(dá)到最大擴(kuò)增速度，相反，在低引物濃度時(shí)，引物退火動(dòng)力學(xué)變?yōu)榻档虵的限速步驟。
該分析提示，在ln(2-F1/n)對(duì)c的坐標(biāo)中擴(kuò)增倍數(shù)對(duì)引物濃度作圖應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生直線，斜率為-kata。數(shù)據(jù)在ln(2-F1/n)對(duì)c的坐標(biāo)中將該數(shù)據(jù)重新作圖證明對(duì)低引物濃度預(yù)期的線性相關(guān)(低擴(kuò)增倍數(shù))，由于低于預(yù)期的擴(kuò)增倍數(shù)，其在0.1μM引物濃度時(shí)偏離線性(F為105或更高)。可以使用以下方程式計(jì)算各個(gè)PCR的kata值。
F=zn=(2-e-kacta)n]]>實(shí)施例5192重PCR反應(yīng)的INVADER試驗(yàn)分析該實(shí)施例描述使用INVADER試驗(yàn)檢測(cè)用來(lái)擴(kuò)增人類(lèi)基因組中192個(gè)不同基因座的高度多重PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。
基因組DNA提取基因組DNA從5ml全血中分離，用Gentra Systems，Inc.(Minneapolis，MN)制造的Autopure純化。純化的DNA置于500μl dH2O中。
引物設(shè)計(jì)用于192個(gè)基因座的正向和反向引物組用Primer Designer 1.3.4版本設(shè)計(jì)(參見(jiàn)上文中的引物設(shè)計(jì)部分，包括圖8)。將用于INVADER設(shè)計(jì)的靶序列，其含有位于相關(guān)SNP位點(diǎn)之側(cè)的不超過(guò)500個(gè)堿基，轉(zhuǎn)換成逗號(hào)分離的文本文件，用作Primer Designer的輸入文件。Primer Designer用缺省參數(shù)運(yùn)行，不同之處是將oligo Tm設(shè)置為60℃。
引物合成寡核苷酸引物用Polyplex(GeneMachines，San Carlos，CA)以標(biāo)準(zhǔn)方法合成。規(guī)模為0.2微摩爾，只在NAP-10上脫鹽(不純化)，不干燥。
PCR反應(yīng)制備兩個(gè)主混合物。主混合物1含有用來(lái)擴(kuò)增基因座1-96的引物；主混合物2含有用來(lái)擴(kuò)增基因座97-192的引物。該混合物按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備，含有標(biāo)準(zhǔn)成分。所有引物的終濃度均為0.025μM，KCl為100mM，MgCl為3mM。在MJ PTC-100熱循環(huán)儀(MJ Research，Waltham，MA)中PCR循環(huán)條件如下95℃15分鐘；94℃30秒，然后55℃44秒，共50個(gè)循環(huán)。
循環(huán)后，合并全部4個(gè)PCR反應(yīng)物，用CYBI-well 2000自動(dòng)移液臺(tái)(CyBio AG，Jena，德國(guó))將3μl等份分配到384深孔板中。該儀器將各種試劑加入到384孔微孔板的各個(gè)孔中。所添加的試劑本身排列在384孔深半板中。
INVADER試驗(yàn)反應(yīng)INVADER試驗(yàn)用CYBI-well 2000建立。將3μl等份基因組DNA靶標(biāo)加入合適的孔中。非靶標(biāo)對(duì)照含有3μl Te(10mM Tris，pH8.0，0.1mM EDTA)。在INVADER試驗(yàn)中使用的試劑是標(biāo)準(zhǔn)PPI混合物、緩沖液、FRET寡核苷酸和Cleavase VIII酶，分別用CYBI-well 2000加入各孔中。
加入試劑后，用6μl礦物油覆蓋各孔。平板在MJ PTC-200 DNAENGINE熱循環(huán)儀(MJ Research)中95℃加熱5分鐘，然后冷卻至63℃的溫育溫度。20分鐘和40分鐘后用Safire微孔板讀板儀(Tecan，Zurich，瑞士)讀取熒光，使用如下設(shè)置對(duì)于F染料檢測(cè)，為495/5nm激發(fā)/帶寬和520/5nm發(fā)射/帶寬；對(duì)于R染料檢測(cè)，為600/5nm激發(fā)/帶寬和575/5nm發(fā)射/帶寬Z位置，5600μs；閃光數(shù)為10；滯后時(shí)間為0；積分時(shí)間40μSec。對(duì)F染料在90nm處設(shè)置增益，R染料在120處設(shè)置增益。原始數(shù)據(jù)由用來(lái)檢測(cè)該試驗(yàn)表現(xiàn)(實(shí)時(shí)或終點(diǎn)模式)的裝置/儀器產(chǎn)生。
在192個(gè)反應(yīng)中，在20分鐘后可以對(duì)157個(gè)進(jìn)行基因型呼叫，在40分鐘后可以對(duì)158個(gè)進(jìn)行，或者總計(jì)82％。對(duì)于其中88個(gè)試驗(yàn)，基因分型結(jié)果可用于比較以前先用單重PCR后用INVADER分析獲得的數(shù)據(jù)，或直接從基因組DNA分析獲得的INVADER結(jié)果。對(duì)于69個(gè)結(jié)果，無(wú)法獲得確證的基因型結(jié)果。
該實(shí)施例表明，在一個(gè)多重PCR反應(yīng)中能夠擴(kuò)增150個(gè)以上的基因座。該實(shí)施例進(jìn)一步表明，這種多重PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的各擴(kuò)增片段當(dāng)作為INVADER試驗(yàn)中的靶標(biāo)時(shí)，其量足以產(chǎn)生可辨別的基因型呼叫。另外，該多重PCR試驗(yàn)中產(chǎn)生的許多擴(kuò)增子在INVADER試驗(yàn)中產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)，作為FOZ測(cè)定，而有一些產(chǎn)生無(wú)法進(jìn)行基因型呼叫的弱信號(hào)。另外還有一些擴(kuò)增子以低水平存在或根本不存在，以致在INVADER試驗(yàn)中無(wú)法產(chǎn)生任何信號(hào)。
實(shí)施例6引物濃度的優(yōu)化，用以改善高度多重PCR反應(yīng)的表現(xiàn)多重PCR中各反應(yīng)之間的競(jìng)爭(zhēng)可以加劇擴(kuò)增偏好，并且使擴(kuò)增倍數(shù)相比單重PCR總體下降。擴(kuò)增倍數(shù)與引物濃度的相關(guān)性可以用來(lái)減輕PCR偏好。以上實(shí)施例的192重PCR中擴(kuò)增的不同基因座產(chǎn)生的可變信號(hào)水平，結(jié)合顯示引物濃度對(duì)擴(kuò)增倍數(shù)影響的實(shí)施例3的結(jié)果，進(jìn)一步提示通過(guò)調(diào)節(jié)引物濃度能夠提高PCR反應(yīng)的百分比，可產(chǎn)生足以用于INVADER試驗(yàn)的靶標(biāo)。
例如，實(shí)施例5中分析的一種特定樣品，在INVADER試驗(yàn)中溫育40分鐘后，產(chǎn)生29.54FAM和66.98RED的FOZ結(jié)果，而另一樣品在40分鐘后產(chǎn)生分別為1.09和1.22的FOZ結(jié)果，從而確定沒(méi)有足夠的信號(hào)產(chǎn)生基因型呼叫。引物濃度的調(diào)節(jié)，在第一種樣品中下調(diào)，在第二種樣品中上調(diào)，應(yīng)當(dāng)使這兩種樣品的擴(kuò)增倍數(shù)更接近于同一值。預(yù)期這種調(diào)節(jié)可能是一個(gè)反復(fù)過(guò)程，需要一次以上的修改來(lái)使擴(kuò)增倍數(shù)足夠彼此接近，從而使大多數(shù)或全部基因座在多重PCR反應(yīng)中能夠以大致相當(dāng)?shù)男蕯U(kuò)增。
實(shí)施例7多重實(shí)施例原則上，PCR擴(kuò)增可以以多重形式進(jìn)行，其中多個(gè)基因座在同一管中擴(kuò)增。但是實(shí)際上，該方法可能由于PCR偏好而導(dǎo)致各個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量非常不同。該實(shí)施例描述了多重反應(yīng)條件的優(yōu)化，以使擴(kuò)增偏好降到最小。擴(kuò)增偏好是由于各反應(yīng)之間變化的擴(kuò)增速度引起的，導(dǎo)致在多次循環(huán)后PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量具有顯著差異。在該實(shí)施例中，在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中分析PCR靶標(biāo)擴(kuò)增，并利用定量INVADER試驗(yàn)研究影響PCR產(chǎn)量的參數(shù)。根據(jù)該研究，開(kāi)發(fā)了描述靶標(biāo)擴(kuò)增倍數(shù)與引物濃度和引物退火時(shí)間的相關(guān)性的模型，該模型闡明了引起擴(kuò)增偏好的機(jī)理。使用6重PCR作為檢測(cè)使偏好最小化的不同條件的模型系統(tǒng)，確定了兩種方法。第一種方法依靠調(diào)節(jié)引物濃度來(lái)平衡不同基因座的擴(kuò)增倍數(shù)。第二種方法使全部反應(yīng)的引物濃度保持相同，但是優(yōu)化引物退火時(shí)間和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，以使擴(kuò)增偏好最小化。用優(yōu)化的PCR條件對(duì)8個(gè)基因組DNA樣品進(jìn)行192重PCR擴(kuò)增，并且使用INVADER試驗(yàn)進(jìn)行基因分型。
材料與方法材料。除非另外說(shuō)明，化學(xué)試劑和緩沖液均來(lái)自FisherScientific。結(jié)構(gòu)特異性5′核酸酶Cleavase1酶(Third WaveTechnologies)如(5)所述純化。將該酶透析并貯存在50％甘油，20mMTrisHCl，pH8，50mM KCl，0.5％Tween 20，0.5％Nonidet P40，100μg/ml BSA中。除非另外說(shuō)明，A、G、C、T是指脫氧核糖核苷酸。
基因組DNA的制備。使用AutoPure LS儀器(Gentra Systems，Minneapolis，MN)，從10ml白細(xì)胞中制備8個(gè)基因組樣品G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7和G8。純化的DNA用含10mM Tris HCl pH8.0，0.1mM EDTA的TE緩沖液稀釋為13.3ng/μl。
寡核苷酸的合成。在INVADER試驗(yàn)組合單重和6重PCR反應(yīng)中使用的寡核苷酸用PerSeptive Biosystems儀器使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法合成，其中包括A、G、C、T、6-羧基熒光素染料(FAM)(GlenResearch)、Redmond REDTM染料(RED)(Epoch Biosciences，Redmond，WA)和Eclipse暗猝滅劑(Z)(Epoch Biosciences)。第一探針和FRET盒用Resource Q柱(Amersharn-Pharmacia Biotech，Newark，NJ)通過(guò)離子交換HPLC純化，侵入探針在NAP-10柱(Amersham 17-0854-02)上脫鹽純化。192重PCR試驗(yàn)中使用的第一探針由BiosearchTechnologies用C16CPG柱(Biosearch Technologies，Novato，CA，BG1-SD14-1)合成，并用SuperPure Plus純化柱(Biosearch，SP-2000-96)純化。用于192重試驗(yàn)的侵入探針由BiosearchTechnologies合成并用5′上三苯甲基捕獲純化法純化。PCR引物由Integrated DNA Technologies，Chicago，IL合成。寡核苷酸濃度用260nn處的吸光度(A260)和A、C、G、T分別為15,400、7,400、11,500、8,700A260M-1的消光系數(shù)確定。
用于多重PCR的引物設(shè)計(jì)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種計(jì)算機(jī)程序，PrimerDesigner軟件(Third Wave Technologies；Madison，WI，見(jiàn)圖8和以上引物設(shè)計(jì)部分的描述)，來(lái)輔助設(shè)計(jì)用于多重PCR的引物，并減少形成引物二聚體的可能性。使用下列參數(shù)，結(jié)合以上和圖8中的引物設(shè)計(jì)敘述，用Primer Designer軟件設(shè)計(jì)用于多重形式的PCR引物。對(duì)于待擴(kuò)增的各個(gè)基因座，在SNP任一側(cè)上包含500個(gè)核苷酸，每個(gè)基因座總共1001個(gè)堿基。對(duì)于各個(gè)基因座，確定侵入和第一探針結(jié)合所需的60-80個(gè)核苷酸的序列，通過(guò)從該區(qū)向外“步移”鑒定候選正向和反向PCR引物。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)選擇候選引物(1)引物在3′末端必須具有A或C，以避免形成引物二聚體；(2)引物的Tm為60℃(11，12)；(3)引物長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)介于12至30個(gè)核苷酸之間；(4)任何引物的兩個(gè)和三個(gè)3′末端堿基都應(yīng)當(dāng)不與該多重PCR混合物中任何其他引物的兩個(gè)和三個(gè)3′末端堿基互補(bǔ)；(5)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有引物與任一INVADER第一探針的切割的5′臂序列具有80％以上的序列相似性。通過(guò)為隨機(jī)選擇的基因座設(shè)計(jì)前兩種引物，啟動(dòng)該算法，并通過(guò)向該庫(kù)中反復(fù)加入更多引物來(lái)繼續(xù)。如果不能對(duì)一種基因座設(shè)計(jì)引物，則該算法使用新隨機(jī)選擇的基因座從起點(diǎn)開(kāi)始。
INVADER試驗(yàn)設(shè)計(jì)。用于INVADER試驗(yàn)的第一和侵入探針用別處所述的INVADERCreator算法設(shè)計(jì)(Lyamichev，V.和Neri，B.(2003)INVADER assay for SNP genotyping.Methods Mol Biol，212，229-40，在此引用作為參考)。用于INVADER試驗(yàn)1-6的探針序列分別對(duì)應(yīng)于PCR 1-6。用于192重PCR實(shí)驗(yàn)的192個(gè)INVADER測(cè)定的序列用同一算法設(shè)計(jì)。
用INVADER試驗(yàn)對(duì)PCR的定量分析。單重或6重形式的PCR 1-6在50μl GeneAmp PCR緩沖液(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)中進(jìn)行，該緩沖液中含有文中所述濃度的引物，0.2mM dNTP，1μl(5U/μl)Amplitaq DNA聚合酶(PE Biosystems，N808-0171)，1μl(1.1μg/μl)TaqStart抗體(Clontech，目錄號(hào)5400-2，Palo Alto，CA)和50ng人基因組DNA，或用于非靶標(biāo)對(duì)照的3.8μl Te緩沖液。為了防止蒸發(fā)，每個(gè)孔都覆蓋15μl澄清的Chill-out(MJ Research，目錄號(hào)CHO-1411 Las Vegas，NV)，平板用箔封覆蓋(Beclcman Coulter，目錄號(hào)BK 538619，F(xiàn)ullerton，CA)。循環(huán)數(shù)和各個(gè)循環(huán)的時(shí)間-溫度分布在文中指出。各個(gè)PCR均包括開(kāi)始時(shí)的樣品變性步驟95℃15分鐘，和最后的溫育步驟99℃10分鐘。每個(gè)反應(yīng)都在96孔板上一式三份進(jìn)行。PCR產(chǎn)物在第一步中連續(xù)稀釋20倍，然后用含有30μg/ml tRNA(BoehringerMannheim，目錄號(hào)BK 538619，Indianapolis，IN)的Te緩沖液稀釋5倍，使產(chǎn)物濃度處于該INVADER試驗(yàn)的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。
使用稀釋的PCR產(chǎn)物的INVADER反應(yīng)在96孔板中以15μl體積中進(jìn)行，其中含有0.05μM侵入寡核苷酸，各0.5μM第一探針，各0.33μM FRET盒，5.3ng/μl Cleavase XI酶，12mM MOPS(pH7.5)，15.3mM MgCl2，2.5％PEG 8000，0.02％NP40，0.02％Tween 20，覆蓋15μl礦物油(Signa)。PCR產(chǎn)物占15μl反應(yīng)體系中的7.5μL。對(duì)于非靶標(biāo)對(duì)照，使用7.5μl Te緩沖液代替PCR產(chǎn)物。反應(yīng)物在95℃下溫育5分鐘以變性靶標(biāo)，然后在63℃下20分鐘至3小時(shí)。將平板冷卻至室溫終止反應(yīng)，用Cytofluor 4000熒光讀板儀(PE Biosystems)檢測(cè)熒光信號(hào)，對(duì)于FAM染料使用485/20nm激發(fā)和530/25發(fā)射濾片，對(duì)于RED染料使用560/20mn激發(fā)和620/40發(fā)射濾片。每個(gè)重復(fù)的PCR用相應(yīng)的INVADER試驗(yàn)一式三份分析，因此每個(gè)PCR反應(yīng)采集到9個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
為了確定PCR產(chǎn)物的濃度，使用相應(yīng)PCR產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)濃度獲得INVADER試驗(yàn)1-6各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用于試驗(yàn)1-6的PCR標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)PCR擴(kuò)增DNA樣品G1、G2、G6或G8制備。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)乙醇沉淀濃縮，經(jīng)8％聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳純化，并用Picogreen dsDNA定量試劑盒(Molecular Probes，Eugene，OR，目錄號(hào)P7589)定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的INVADER反應(yīng)與分析的PCR產(chǎn)物在同一微量滴定板中用0-100fMPCR標(biāo)準(zhǔn)一式兩份進(jìn)行。
利用標(biāo)準(zhǔn)曲線上最接近PCR樣品熒光信號(hào)值的三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，通過(guò)線性回歸，根據(jù)熒光信號(hào)確定分析的PCR產(chǎn)物的濃度。由一式三份INVADER試驗(yàn)測(cè)量值估測(cè)重復(fù)進(jìn)行的各PCR的PCR產(chǎn)物濃度和方差。用一式三份INVADER試驗(yàn)分析的方差加權(quán)每個(gè)重復(fù)的平均值，來(lái)估測(cè)一式三份PCR的PCR產(chǎn)物濃度。PCR中使用的基因組DNA樣品的初始濃度用同一標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)一式三份的INVADER試驗(yàn)確定。擴(kuò)增倍數(shù)F確定為估計(jì)的PCR產(chǎn)物濃度乘以稀釋倍數(shù)，再除以PCR使用的基因組DNA濃度。
192重PCR在PCR 1-6所述的條件下以一次重復(fù)進(jìn)行17個(gè)循環(huán)，其中使用DNA樣品G1-G8，各引物濃度為0.2μM，引物退火時(shí)間為1.5分鐘，引物延伸時(shí)間為2.5分鐘，開(kāi)始時(shí)的樣品變性步驟為95℃2.5分鐘。非靶標(biāo)對(duì)照的192重PCR使用Te緩沖液代替基因組DNA。該192重PCR反應(yīng)物用含30μg/ml tRNA(Boehringer Mannheim，109 525)的Te緩沖液稀釋30倍，95℃加熱5分鐘，之后加入INVADER反應(yīng)中。INVADER反應(yīng)如試驗(yàn)1-6所述進(jìn)行，不同之處在于侵入探針為0.07μM，第一探針各為0.7μM。對(duì)于基因組PCR樣品和非靶標(biāo)PCR對(duì)照，在15、30、60分鐘后或者在文中指出的時(shí)間采集FAM和RED熒光信號(hào)。從192個(gè)INVADER試驗(yàn)中每一個(gè)的樣品信號(hào)中減去非靶標(biāo)信號(hào)，得到凈熒光信號(hào)。基因分型軟件使用以下算法進(jìn)行分析。(1)將樣品信號(hào)除以非靶標(biāo)對(duì)照信號(hào)，得到各個(gè)INVADER試驗(yàn)的FAM(FOZF)和RED(FOZR)信號(hào)的FOZ值。(2)對(duì)于每個(gè)INVADER試驗(yàn)，比值H確定為(FOZF-1)/(FOZR-1)。(3)如果0.25＜H＜4且FOZF和FOZR均＞1.3，則確定樣品為雜合的(HET)；如果H＞4且FOZF＞1.6則確定為純合的FAM；如果H＜0.25且FOZR＞1.6則確定樣品為純合的RED。在其他所有情況中，樣品都被稱(chēng)為“不明確的”。
為了研究影響PCR的參數(shù)，開(kāi)發(fā)了一種方法，其利用定量INVADER試驗(yàn)確定反應(yīng)全過(guò)程中的靶標(biāo)擴(kuò)增倍數(shù)F。F倍數(shù)被定義為擴(kuò)增產(chǎn)物與初始基因組DNA濃度的比值，這兩種濃度均如“材料與方法”所述，使用以已知量PCR產(chǎn)物獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)INVADER試驗(yàn)測(cè)定。
首先，分析隨PCR循環(huán)數(shù)n變化的F。使用0.1μM的引物濃度c，用DNA G2進(jìn)行單重PCR 5，n＝5、10、15、20、25、30、35個(gè)循環(huán)后確定F(圖2)。如圖2所示，PCR 5顯示對(duì)于前25個(gè)循環(huán)，lgF與n線性相關(guān)，斜率為0.296±0.0016，證明靶標(biāo)擴(kuò)增是數(shù)量級(jí)大于7的指數(shù)擴(kuò)增。根據(jù)線性相關(guān)斜率確定的每個(gè)PCR循環(huán)的平均擴(kuò)增倍數(shù)等于1.98±0.007，表明在每個(gè)循環(huán)后靶標(biāo)量幾乎加倍。圖2中的插圖顯示除了用大量DNA G2作為靶標(biāo)之外，在相同條件下，對(duì)于PCR 5的循環(huán)1、2、3、5，lgF與n相關(guān)。由斜率為0.283的lgF對(duì)n的線性函數(shù)也可以近似地得出這種相關(guān)性。25個(gè)循環(huán)后，PCR 5達(dá)到平臺(tái)期，此時(shí)F為2×108，根據(jù)初始基因組DNA濃度0.28fM測(cè)定，相當(dāng)于0.06μM的靶標(biāo)濃度。該平臺(tái)期可以解釋為是由于PCR中使用的0.1μM濃度引物的消耗，或自身產(chǎn)物對(duì)PCR的抑制。類(lèi)似于PCR 5，對(duì)PCR 2的定量分析顯示對(duì)于前25個(gè)循環(huán)，lgF與n線性相關(guān)，斜率為0.295±0.004，在F＝3×108時(shí)達(dá)到平臺(tái)期(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果明確了INVADER試驗(yàn)是用于PCR靶標(biāo)擴(kuò)增分析的一種定量方法，并且證明PCR以大于7的數(shù)量級(jí)指數(shù)進(jìn)行，或者進(jìn)行至少25個(gè)循環(huán)。
為了研究c對(duì)F的影響，作為調(diào)節(jié)F從而減少擴(kuò)增偏好的手段(Henegariu，O.等人，Biotechniques，23，504-11，1997)，使用定量INVADER試驗(yàn)研究了單重PCR 1-6。每個(gè)PCR以0.01、0.025、0.04、0.05或0.1μM的c進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。PCR 1、2、4、5中隨c變化的F的對(duì)數(shù)在圖3A中顯示。圖3A顯示了PCR 1(●)、PCR 2(○)、PCR 4(●)和PCR 5(□)中引物濃度c對(duì)lgF的影響。PCR擴(kuò)增在50mL體積中進(jìn)行，c為0.01、0.025、0.04、0.05或0.1mM，PCR 1、4、5使用50ng基因組DNA G2，或PCR 2使用基因組DNA G6。每個(gè)PCR都進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃ 30秒的模板變性步驟，55℃ 44秒的引物退火步驟，和72℃ 60秒的引物延伸步驟。c為0.01mM時(shí)PCR 1的lgF值太低，不能進(jìn)行可靠的測(cè)量。一式三份進(jìn)行PCR，并同樣一式三份進(jìn)行相應(yīng)的定量INVADER試驗(yàn)，通過(guò)分析每個(gè)重復(fù)，估算標(biāo)準(zhǔn)誤。PCR 3和6分別與PCR 5和2非常相似地進(jìn)行，為了簡(jiǎn)明起見(jiàn)不再示出。在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行的PCR之間F有顯著性差異。在低c時(shí)該差異最顯著；但是，在較高的c時(shí)顯著性較低，此時(shí)lgF接近理論最大值1g(220)或6.0。如以上部分所述，PCR在20個(gè)循環(huán)時(shí)可以認(rèn)為是指數(shù)反應(yīng)，可以用F來(lái)確定一個(gè)PCR循環(huán)中靶標(biāo)的擴(kuò)增倍數(shù)z作為F1/n。
如上所述，發(fā)現(xiàn)的c對(duì)F的影響可以用一個(gè)模型描述，該模型假設(shè)在較低c時(shí)引物退火是PCR的限速步驟。在該模型中，引物P與靶標(biāo)T的結(jié)合描述為二階反應(yīng)，結(jié)合速度常數(shù)ka為P+T→kaPT---(1)]]>假定引物相對(duì)于靶標(biāo)過(guò)量，并且在低于引物解鏈的溫度時(shí)發(fā)生退火，使逆反應(yīng)可以被忽略，則反應(yīng)(1)的解為[PT]=T0(1-e-kacta)---(2)]]>其中[PT]是引發(fā)的靶標(biāo)的濃度，T0是前一PCR循環(huán)后的靶標(biāo)濃度，ta是引物退火時(shí)間。假定兩個(gè)PCR引物具有相同的ka，并且退火時(shí)間ta長(zhǎng)到足以完成引發(fā)的各個(gè)靶分子的復(fù)制，則z可以確定為z=T0+[PT]T0=2-e-kacta---(3)]]>且n個(gè)循環(huán)后的F如下得出F=2n=(2-e-kacta)n---(4)]]>根據(jù)方程式4，ln(2-F1/n)應(yīng)當(dāng)是c的線性函數(shù)，斜率等于-kata。
使用ln(2-F1/n)對(duì)c的坐標(biāo)轉(zhuǎn)化圖3A所示的數(shù)據(jù)，證明各PCR具有預(yù)期的線性相關(guān)性(圖3B)，這提供了對(duì)該模型的強(qiáng)烈支持。在圖3B中，直線表示各PCR的最小二乘法擬合。由于高標(biāo)準(zhǔn)誤，不使用PCR 2和5在c為0.1mM時(shí)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。ln(2-F1/n)的斜率可以用來(lái)確定引物退火步驟的表觀結(jié)合速度常數(shù)kaaPP，它主要由具有最低ka的引物限定。使用ta＝44s，由圖3B確定的PCR 1、2、4、5的kaaPP值分別為0.34×106、0.73×106、0.45×106和1.2×106s-1M-1。這些值接近于短寡核苷酸在相似緩沖液條件下獲得的ka值1.5×106s-1M-1和2.6×106s-1M-1。最慢的(PCR 1)與最快的(PCR 5)ka之間至少差3倍，提示引物退火動(dòng)力學(xué)可明顯導(dǎo)致擴(kuò)增偏好。
PCR擴(kuò)增的定量分析結(jié)果提示了多重PCR中平衡靶標(biāo)擴(kuò)增的兩種方法(1)利用lgF與c的相關(guān)性調(diào)節(jié)各個(gè)反應(yīng)的c，和(2)提高c和ta，以在固定c時(shí)，根據(jù)方程式4，所有靶標(biāo)都接近最大擴(kuò)增。
由圖3A所示的數(shù)據(jù)確定調(diào)節(jié)的引物濃度cadj，該濃度使PCR 1-6均具有預(yù)期的F值104(表1)。
表1.在調(diào)節(jié)的引物濃度條件下，多重PCR 1、2、3、4、5、6的擴(kuò)增倍數(shù)的對(duì)數(shù)lgF

a多重PCR 1、2、3、4、5和6在含有50ng基因組DNA G2或G6的50μL體系中進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)使用95℃ 30秒的變性步驟，55℃ 44秒的引物退火步驟和72℃ 60秒的引物延伸步驟。
b由圖2確定PCR 1、2、3、4、5、6各自的Cadj，以得到預(yù)期的lgF值4。
c分別用基因組DNA G2和G6進(jìn)行定量INVADER試驗(yàn)和6重PCR，用其FAM信號(hào)確定PCR 1、3、4、5和PCR 2、6的lgFadj和lgF0.025。一式三份PCR分別用同樣一式三份的相應(yīng)INVADER試驗(yàn)分析，以確定標(biāo)準(zhǔn)誤。
在與圖3相同的條件下，用DNA G2或G6作為靶標(biāo)，用調(diào)節(jié)的濃度Cadj或0.025μM的固定c0.025對(duì)各個(gè)PCR進(jìn)行6重PCR 1-6。如表1所示，在Cadj條件下，所有6個(gè)靶標(biāo)都擴(kuò)增大約104倍，平均lgF為4.15±0.17，最快(PCR 3)與最慢(PCR 1)之間的F相差2.75倍。在c0.025條件下，在多重PCR中擴(kuò)增的總產(chǎn)物量類(lèi)似于使用Cadj的PCR，平均lgF為3.89±0.91，但是存在顯著的擴(kuò)增偏好，例如在最快與最慢PCR之間(分別為3和1)，F(xiàn)相差26.3倍。也在6重形式的條件下，使用Cadj或c0.025，以單重形式進(jìn)行PCR 1-6，證明F值非常類(lèi)似于表1所示的相應(yīng)的F值。該結(jié)果提示6重形式的各PCR之間沒(méi)有顯著干擾。
通過(guò)調(diào)節(jié)c平衡PCR是使擴(kuò)增偏好最小化的一種有效方法；但是，它使用對(duì)于各PCR已知的F與c的相關(guān)性或引物濃度的反復(fù)優(yōu)化。一種替代方法是使用固定的c值，但是在使偏好最小化的條件下進(jìn)行PCR。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(圖3)和理論分析(方程式3)均提示，隨著cta項(xiàng)值提高，z應(yīng)當(dāng)漸近地達(dá)到2。因此，使用0.1μM的固定c，即在圖3所示條件下所用的最大濃度，或0.2μM，和用90秒代替44秒的引物退火步驟，進(jìn)行多重PCR。使用DNA G1、G2、G6或G8作為靶標(biāo)，6重PCR 1-6進(jìn)行17個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生理論上最大的lgF值5.1。使用INVADER試驗(yàn)1-6對(duì)F的定量分析用FAM和RED信號(hào)進(jìn)行(關(guān)于基因組DNA的基因型見(jiàn)表S3)，lgF值顯示在表2中。
表2.在固定引物濃度的條件下，多重PCR 1、2、3、4、5、6的擴(kuò)增倍數(shù)的對(duì)數(shù)lgF

a多重PCR 1、2、3、4、5、6在含50ng基因組DNA G1、G2、G6或G8的50μL體系中以c＝0.1或0.2μM進(jìn)行17個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)使用95℃ 30秒的變性步驟、55℃ 90秒的引物退火步驟和72℃150秒的引物延伸步驟。一式三份PCR分別用同樣一式三份的相應(yīng)INVADER試驗(yàn)分析，以確定標(biāo)準(zhǔn)誤。
bINVADER試驗(yàn)的報(bào)道熒光染料。
對(duì)于0.1和0.2μM的PCR條件，用FAM和RED信號(hào)獲得的平均lgF值之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，t-檢驗(yàn)的p值分別為0.88和0.77，提示F的分析不依賴(lài)于INVADER試驗(yàn)類(lèi)型。c為0.2μM時(shí)PCR 1-6的平均lgF值分別為4.55±0.10、5.03±0.11、4.96±0.11、4.80±0.10、5.42±0.18、5.15±0.11，或者非常接近于預(yù)期值5.1。還不清楚為什PCR 5的lgF值5.42在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于預(yù)期，盡管INVADER試驗(yàn)5證明使用所有基因組DNA樣品都具有比其他試驗(yàn)相對(duì)較低的表現(xiàn)，這可導(dǎo)致假高的PCR產(chǎn)物與基因組DNA濃度的比值，和過(guò)高估計(jì)的lgF值。
對(duì)于PCR 1、2、4、6，在c為0.2μM和0.1μM時(shí)獲得的平均lgF值之差分別為0.32、0.13、0.18、0.17。這些差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的，相應(yīng)的t-檢驗(yàn)p值為＜0.0001、0.04、0.01和0.02。對(duì)于最快的PCR(3和5)，0.2μM和0.1μM的平均lgF值之差分別為0.07和0.08，t-檢驗(yàn)p值為0.37和0.47，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。該分析證明，cta項(xiàng)的升高改善了多重反應(yīng)中較慢PCR的表現(xiàn)，但是不影響已明顯達(dá)到擴(kuò)增平臺(tái)的快速PCR的表現(xiàn)。
該實(shí)施例的下一部分是192重PCR的開(kāi)發(fā)，其基本上使(Ohnishi，等人，J Hum Genet，46，471-7，2001)獲得的倍增倍數(shù)100加倍，用于以INVADER試驗(yàn)進(jìn)行SNP基因分型。隨機(jī)選擇代表染色體5、11、14、15、16、17和19的192個(gè)SNP，為每個(gè)SNP設(shè)計(jì)INVADER試驗(yàn)。在選擇過(guò)程中，不對(duì)重復(fù)區(qū)中的SNP進(jìn)行辨別。因此，192個(gè)SNP中的一些可能在多個(gè)基因座處被擴(kuò)增。為平衡擴(kuò)增而發(fā)展的PCR條件使用固定的引物濃度，因?yàn)槠浜?jiǎn)單并且發(fā)展時(shí)間短?；蚪MDNA樣品G1-G8用192重PCR擴(kuò)增17個(gè)循環(huán)，固定c為0.2μM，引物退火時(shí)間為1.5分鐘，引物延伸時(shí)間為2.5分鐘，然后如“材料與方法”所述用192個(gè)雙重INVADER試驗(yàn)分析。通過(guò)從樣品信號(hào)中減去非靶標(biāo)對(duì)照信號(hào)得到RED和FAM凈信號(hào)。根據(jù)凈信號(hào)鑒定基因型的一個(gè)方法是如“材料與方法”所述，對(duì)每個(gè)試驗(yàn)使用通用的呼叫標(biāo)準(zhǔn)。這些標(biāo)準(zhǔn)假定純合樣品只有來(lái)自一個(gè)等位基因的信號(hào)，沒(méi)有或者極少有來(lái)自其他等位基因的交叉反應(yīng)性信號(hào)，而且對(duì)于兩個(gè)等位基因，雜合樣品產(chǎn)生接近相等的信號(hào)。這種嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)在另外的功能性INVADER試驗(yàn)中通?？蓪?dǎo)致不明確的呼叫。
作為一個(gè)替代，通過(guò)對(duì)各個(gè)INVADER試驗(yàn)，將所有8個(gè)DNA樣品的FAM和RED凈信號(hào)作圖為散布圖，并且目視鑒別對(duì)應(yīng)于純合和雜合樣品的簇，呼叫基因型。如果包括太少的樣品，則不能進(jìn)行散布圖分析；該分析也包含主觀的因素，因?yàn)檫@種類(lèi)型的目視分析依賴(lài)于操作者的判斷。在該研究中已經(jīng)確定，對(duì)于192個(gè)INVADER試驗(yàn)中的大多數(shù)，8個(gè)樣品足以進(jìn)行目視呼叫。成功和失敗的散布圖分析的例子均在圖4中顯示。圖4顯示8個(gè)基因組DNA樣品的凈FAM和RED INVADER試驗(yàn)信號(hào)的散布圖。對(duì)于用196重PCR擴(kuò)增的DNA樣品G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8，將INVADER試驗(yàn)凈FAM和RED信號(hào)作圖。A-C，試驗(yàn)7、9、25的成功基因分型，其將所有樣品歸于不同的簇，分別確定為純合FAM(○)，純合RED(□)或雜合(×)。D-F，失敗的基因分型。在試驗(yàn)6(D)中，最接近坐標(biāo)原點(diǎn)的樣品不能歸于任何簇，在試驗(yàn)47(E)中，樣品形成3個(gè)不同的簇，但是任何樣品都沒(méi)有FAM信號(hào)；在試驗(yàn)54(F)中，樣品不能區(qū)分是具有高FAM信號(hào)交叉反應(yīng)的純合RED還是具有偏斜RED/FAM比的雜合體。RFU為相對(duì)熒光單位。
目視分析使用保守的標(biāo)準(zhǔn)，如果恰好有一個(gè)樣品不能被歸入一個(gè)簇，則排除整個(gè)一組樣品。另外，在兩個(gè)通道中都具有強(qiáng)信號(hào)的組也不認(rèn)為獲得精確的基因型，假定INVADER試驗(yàn)具有高交叉反應(yīng)性，或者更可能是，PCR引起多個(gè)同源基因座的擴(kuò)增。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)192個(gè)試驗(yàn)中的161個(gè)，或84％，進(jìn)行呼叫。使用“材料與方法”中所述的基因分型軟件進(jìn)行的呼叫與這些呼叫的82.5％相一致。
研究31個(gè)失敗的INVADER試驗(yàn)，以確定這種失敗是由于低PCR擴(kuò)增倍數(shù)、差I(lǐng)NVADER試驗(yàn)表現(xiàn)，還是由于PCR對(duì)高度同源性序列的擴(kuò)增。PCR靶序列用BLAT分析，以確定任一PCR是否擴(kuò)增一個(gè)以上的基因座。31個(gè)試驗(yàn)中8個(gè)試驗(yàn)的失敗明顯是由于各自有多個(gè)基因座可能被PCR擴(kuò)增，并且INVADER試驗(yàn)檢測(cè)了各個(gè)基因座。其余的23個(gè)試驗(yàn)的失敗估計(jì)是由于如下一個(gè)或多個(gè)原因較差的PCR擴(kuò)增，寡核苷酸設(shè)計(jì)和制備中的缺陷，或未包含于2003年4月的人類(lèi)基因組裝配圖中的未知重復(fù)序列。排除由于基因組中的重復(fù)序列而失敗的8個(gè)試驗(yàn)以外，192重PCR組合INVADER試驗(yàn)基因分型的效率估計(jì)為161/184或87.5％。
為了估計(jì)192重PCR中的擴(kuò)增偏好，對(duì)于用8個(gè)DNA樣品進(jìn)行的161個(gè)成功INVADER試驗(yàn)，每個(gè)等位基因標(biāo)準(zhǔn)化的RED凈熒光信號(hào)對(duì)PCR靶標(biāo)長(zhǎng)度作圖，如圖5所示。圖5顯示對(duì)于161個(gè)成功INVADER試驗(yàn)，隨PCR靶標(biāo)長(zhǎng)度變化的每個(gè)等位基因標(biāo)準(zhǔn)化的RED熒光信號(hào)。該INVADER反應(yīng)用8個(gè)DNA樣品進(jìn)行60分鐘，每個(gè)樣品均通過(guò)196重PCR擴(kuò)增。線段顯示作為PCR靶標(biāo)長(zhǎng)度函數(shù)的凈信號(hào)的線性回歸。
凈信號(hào)中存在顯著的變化性，包括PCR擴(kuò)增和INVADER試驗(yàn)表現(xiàn)的變化性。FAM凈信號(hào)獲得類(lèi)似的結(jié)果。凈信號(hào)與靶標(biāo)長(zhǎng)度之間存在弱相關(guān)性，提示長(zhǎng)于700bp的PCR靶標(biāo)將具有較低的成功基因分型的概率。
令人吃驚的是，盡管凈信號(hào)具有高變化性，但是在信號(hào)分布的高端和低端都成功進(jìn)行了基因分型。為了研究觀察到的這種INVADER試驗(yàn)基因分型的穩(wěn)定性，在15、30、60分鐘后測(cè)量相同192個(gè)INVADER反應(yīng)的凈信號(hào)。因?yàn)镮NVADER試驗(yàn)中的信號(hào)擴(kuò)增是時(shí)間的二次方(1)，30和60分鐘時(shí)間點(diǎn)將分別相當(dāng)于用高4倍和16倍的靶標(biāo)水平進(jìn)行的15分鐘反應(yīng)，從而模擬了低、中、高水平的PCR擴(kuò)增。作為一個(gè)例子，在15、30、60分鐘時(shí)間點(diǎn)獲得的INVADER試驗(yàn)110的散布圖在圖6中示出。圖6顯示8個(gè)DNA樣品的凈FAM和RED信號(hào)的散布圖。INVADER試驗(yàn)110用通過(guò)196重PCR擴(kuò)增的DNA樣品進(jìn)行，并在15(A)、30(B)和60(C)分鐘后測(cè)量信號(hào)。根據(jù)散布圖分析，這些樣品被確定為純合FAM(○)、純合RED(□)或雜合(×)。RFU為相對(duì)熒光單位。
該散布圖證明，通過(guò)聚類(lèi)分析進(jìn)行的INVADER基因分型不受強(qiáng)凈信號(hào)的影響，并且甚至能夠解釋60分鐘反應(yīng)，其中FAM和RED凈信號(hào)都達(dá)到飽和。該效應(yīng)的結(jié)果是，可以用更長(zhǎng)的INVADER反應(yīng)進(jìn)行更多的呼叫，因?yàn)槁齈CR產(chǎn)生更多信號(hào)，改善了基因型鑒定，但是同時(shí)快PCR的較高信號(hào)不影響樣品聚類(lèi)。
實(shí)施例8在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行的PCR擴(kuò)增和INVADER試驗(yàn)分析該實(shí)施例描述了在一個(gè)反應(yīng)容器中利用PCR擴(kuò)增少量靶標(biāo)，隨后進(jìn)行INVADER試驗(yàn)分析的方法。特別地，該實(shí)施例描述了進(jìn)行這兩種反應(yīng)，而在一個(gè)反應(yīng)設(shè)置后不需要操作或添加試劑。除非另外說(shuō)明，用試驗(yàn)指定的試劑進(jìn)行下面的實(shí)施例，以檢測(cè)DLEU基因(染色體13)和α-肌動(dòng)蛋白基因(染色體1)中的序列10mM MOPS緩沖液，pH7.57.5mM MgCl2dNTPs，各25μM基因組DNA 10ngPCR引物各200nM第一探針0.5μMINVADER oligos 0.05μMFRET探針0.05μMCLEAVASE酶(VIII或X)100ngStoffel或天然Taq DNA聚合酶1u用于DLEU的PCR引物正向引物1716-14-1(SEQ ID NO1)
5′-CCCGACATTTTTACGCATGCGCAAACTCCAACC-3′，Tm＝73.8℃反向引物1716-14-2(SEQ ID NO2)5′-TACACGCACGCGCAAGAAGCAAGAGGACT-3′，Tm＝74.1℃用于α-肌動(dòng)蛋白的PCR引物正向引物1716-14-3(SEQ ID NO3)5′-CTGGGTTTCCAACAGGCGAAAAGGCCCT-3′，Tm＝73.4℃反向引物1716-14-4(SEQ ID NO4)5′-GCGTGAGGGTGGAAGGAGATGCCCATGG-3′，Tm＝74.7℃探針、INVADER oligos、FRET盒(下劃線標(biāo)出的堿基表示翼序列；粗體表示INVADER試驗(yàn)中的位點(diǎn)1)α-肌動(dòng)蛋白探針1734-57ACGGACGCGGAGAGGAACCCTGTGACAT-hex(SEQ ID NO5)α-肌動(dòng)蛋白INVADER oligo 1734-57 CCATCCAGGGAAGAGTGGCCTGTTT(SEQ ID NO6)DLEU探針CGCGCCGAGGTTCTGCGCATGTGC-hex(SEQ ID NO7)DLEU INVADER oligo AGGGAGAGCCGTGCACCACGATGAC(SEQ ID NO8)DLEU FAM FRET 23-428 Fam-TCT-Z28-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG-hex(SEQ ID NO9)α-肌動(dòng)蛋白R(shí)ED FRET Red-TCT-Z28-TCGGCCTTTTGGCCGAGAGACTCCGCGTCCGT-hex(SEQ ID NO10)。
A.組合PCR-INVADER反應(yīng)的設(shè)置在一些情況中，可能需要暫時(shí)分開(kāi)PCR和INVADER反應(yīng)，例如在不利于INVADER反應(yīng)的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后改變反應(yīng)條件使INVADER反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。一種這樣的產(chǎn)生不同反應(yīng)條件的方法是使用針對(duì)該反應(yīng)中所用酶的抗體，如Light Cycler TaqBlock抗體(RocheApplied Sciences)。另一種這樣的方法是通過(guò)溫度。在該實(shí)施例中，PCR引物設(shè)計(jì)為退火溫度≥70℃，而用于INVADER試驗(yàn)的探針寡核苷酸設(shè)計(jì)為T(mén)m約為63℃，因此在PCR循環(huán)的退火、延伸或變性階段，探針不能與靶分子反應(yīng)。另外，已經(jīng)確定長(zhǎng)時(shí)間暴露于高溫(在此情況下為99℃ 10分鐘)可以滅活Taq DNA聚合酶和天然Taq DNA聚合酶的Stoffel片段，一些CLEAVASE酶在這種處理后保留活性。特別是，CLEAVASE VIII似乎對(duì)這樣的加熱高度穩(wěn)定，在后面的實(shí)驗(yàn)中使用。
進(jìn)行反應(yīng)，其中所有試劑都混合在使用上述成分的10μl終體積中，并覆蓋上礦物油。PCR進(jìn)行11-20個(gè)循環(huán)(95℃ 30秒；72℃ 30秒至2分鐘)。循環(huán)反應(yīng)后，將混合物加熱到99℃ 10分鐘，滅活TaqDNA聚合酶。反應(yīng)混合物然后在63℃下溫育30分鐘至3小時(shí)，使INVADER反應(yīng)進(jìn)行。
B.INVADER試驗(yàn)信號(hào)產(chǎn)生抑制的評(píng)價(jià)最初的結(jié)果表明，似乎存在限制INVADER試驗(yàn)信號(hào)產(chǎn)生的抑制。為了評(píng)價(jià)不同反應(yīng)成分對(duì)這種抑制的可能的貢獻(xiàn)，進(jìn)行了下面的實(shí)驗(yàn)。
為了檢測(cè)不同反應(yīng)成分的作用，配置部分反應(yīng)。具體地，從初始反應(yīng)設(shè)置中省略各種INVADER反應(yīng)成分，然后在熱滅活DNA聚合酶后再將它們加入反應(yīng)中。在下表中，“+”表示初始反應(yīng)設(shè)置中所含的成分；“-”表示為了使INVADER反應(yīng)進(jìn)行，在Taq DNA聚合酶熱變性后加入的成分。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Mops 100mM 1μl+ + + + + + + + + + + +MgCl21μl+ + + + + + + + + + + +dNTP 1.25mM ea 0.2μl + + + + + + + + + + + +引物1716-14-1/25μM ea 0.4μl + + + + + + + + + + + +引物1716-14-3/45μM ea 0.4μl + + + + + + + + + + + +Stoffel 10u/μl 0.1μl + + + + + + + + + + + +gDNA 03-422100ng/μl1μl+ + + + + + - - - - - -Dleu/α-肌動(dòng)蛋白PPI-FRET 5×3μl- + - - + - - + - - + -(-Dleu Inv)
Invader Dleu 2.5μM 0.6μM - - - + + + - - - + + +Cleavase VIII 100ng/μl 1μl- - + - + + - - + - + +體積10μl (95℃ 30″-＞72℃ 30″)20-＞98℃ 5′PCR后向5μl 10mM Mops 7.5mM MgCl2中加入缺失的成分(-)，并以95℃ 3′-＞63℃ 3h運(yùn)行。
Ex485/20 1478 801158 1519 67 1250 88 61 53 68 68 55Em530/25增益45Ex560/20 1977 1233 1810 2039 512 1860 70 78 70 87 98 57Em620/40增益502和5列的結(jié)果，其中在PCR反應(yīng)過(guò)程中包括FRET混合物，與1、3-4、6列的結(jié)果，其中不加FRET探針直到PCR反應(yīng)停止，它們之間的比較提示PPI-FRET混合物的存在可抑制INVADER試驗(yàn)中產(chǎn)生的信號(hào)。后面的實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)下文)，其中在PCR反應(yīng)過(guò)程中省略了PPI-FRET混合物的各種成分，證實(shí)了FRET探針是抑制性的。
Mops 100mM 1μl+ + + + + + + +MgCl21μl+ + + + + + + +dNTP 1.25mM ea 0.2μl + + + + + + + +引物1716-14-1/25μM ea 0.4μl + + + + + + + +引1716-14-3/45μM ea0.4μl + + + + + + + +Stoffel 10u/μl 0.1μl + + + + + + + +gDNA 03-422 100ng/μl 1μl+ + + + + + + +Dleu探針15μM 0.5μl - + - - - - - +α-肌動(dòng)蛋白探針15μM0.5μl - - + - - -- - +Dleu invader 2.5μM 0.5μl - - - + - -- - +α-肌動(dòng)蛋白invader 2.5μM 0.5μl - - - - + -- - +Dleu FRET 23-42 87.5μM 0.5μl - - - - - + - +α-肌動(dòng)蛋白FRET 23-75 57.5μM 0.5μl - - - - - - + +
體積10μl (95℃ 30″-＞72℃ 30″)20-＞98℃ 5′PCR后向5μl 10mM Mops 7.5mM MgCl2中加入缺失的成分(-)，并以95℃ 3′-＞63℃ 3h運(yùn)行。
Ex485/20 108 1782 1800 1692 1720 100 9489Em530/25增益45Ex560/20 2363 3313 3053 3243 2950 2284 1706 556Em620/40增益50檢查該表中最右側(cè)三列，表明反應(yīng)開(kāi)始時(shí)含有一種或兩種FRET探針(″+″)的反應(yīng)，與省略該探針的反應(yīng)相比，INVADER反應(yīng)信號(hào)產(chǎn)生降低。
Taq聚合酶含量升高的其他實(shí)驗(yàn)證明，Stoffel DNA聚合酶增加2倍導(dǎo)致INVADER試驗(yàn)中信號(hào)產(chǎn)生增強(qiáng)。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)可以確定，延長(zhǎng)PCR反應(yīng)中的延伸時(shí)間以及優(yōu)化Taq DNA聚合酶濃度將減輕這種抑制的影響。
C.組合PCR和INVADER試驗(yàn)反應(yīng)條件的優(yōu)化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以?xún)?yōu)化各反應(yīng)成分的量和組合試驗(yàn)中各步驟的時(shí)間。MgCl2的濃度在1.7mM至7.5mM的范圍內(nèi)變化；dNTP濃度在25-75mM范圍內(nèi)檢測(cè)；引物濃度在0.2μM-0.4μM之間變化。用天然Taq聚合酶獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例在下面給出，表明FAM信號(hào)產(chǎn)生依賴(lài)于DLEUINVADER oligo的存在，并且在17個(gè)PCR循環(huán)，隨后99℃ 10分鐘變性天然Taq DNA聚合酶，然后進(jìn)行61℃ 30分鐘的INVADER反應(yīng)后，兩個(gè)INVADER反應(yīng)都產(chǎn)生信號(hào)。
Mops 100mM 1.5μl + + + +
MgCl225mM 1.5μl+ + + +Dleu/α-肌動(dòng)蛋白PPI-FRET 5×(-Dleu3μl + + + +Inv)Dleu Invader 2.5μM，0.05μM終濃度0.3μl+ + - +Cleavase VIII 100ng/μl 1μl + + + -TaqPol(天然)5u/μl0.2μl+ + + +引物1716-14-1/25μM ea，0.4μM終濃度 1.2μl+ + + +引物1716-14-3/45μM ea，0.4μM終濃1.2μl+ + + +度dNTP 1.25mM ea，25μM終濃度 0.3μl+ + + +gDNA 03-42210ng/μl 1μl - + + +體積15μl (95℃ 30″-＞72℃ 2′)17-＞99℃ 10-＞61℃ 30′Ex485/20 110 1744 115 87Em530/20增益45Ex560/20 123 2642 2700 112Em620/40增益50D.組合PCR-INVADER試驗(yàn)的劑量應(yīng)答進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測(cè)在一定范圍的起始基因組DNA靶標(biāo)濃度中，組合PCR-INVADER試驗(yàn)中的信號(hào)產(chǎn)生。反應(yīng)如下建立1 2 34 5 678Mops 100mM1.5μl+ + ++ + +++MgCl275mM 0.75μl + + ++ + +++Dleu/α-肌動(dòng)蛋白PPI-FRET 5× 3μl + + ++ + +++CleavaseVIII 100ng/μl1μl + + ++ + +++TaqPol(天然)5u/μl0.1μl+ + ++ + +++引物1716-14-1/25μM ea，0.2μM0.6μl+ + ++ + +++終濃度引物1716-14-3/45μM ea，0.2μM0.6μl+ + ++ + +++終濃度
dNTP 1.25mM ea，25μM終濃度 0.3μl+ + ++ + +++gDNA 5ng 02948A- 2 1.5 1 0.75 0.5 0.3 0.1體積15μl (95℃ 30″-＞72℃ 2′)12-＞99℃ 10′-＞60℃60′INVADER反應(yīng)進(jìn)行120分鐘，在60分鐘或120分鐘后讀取結(jié)果。120分鐘讀取的結(jié)果示于圖7中。這些結(jié)果表明，組合PCR-INVADER反應(yīng)在DNA濃度范圍內(nèi)是線性的，足夠靈敏地檢測(cè)少至1.5ng的人基因組DNA。
E.多重PCR與雙重INVADER試驗(yàn)檢測(cè)的組合為了分析多重PCR反應(yīng)與INVADER試驗(yàn)的組合，進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)。如下所述建立20重PCR反應(yīng)。PCR CF混合物含有下表中的各種引物，濃度各為1μM?；蚪MDNA樣品如下表所述從Coriel獲得。
體積(μl)10×體積MgCl(50mM)2.25 22.5Cleavase VIII 100ng/μl 1.00 10.0天然Taq pol(5單位/μl)0.10 1.0dNTP混合物1.25mM 0.30 3.0PCR引物混合物(1869-80)(各1μM)3.00 30.0gDNA DNA 10ng/μl 1.00 10.0H2O 4.35 43.5合計(jì) 12.00120.00Coriel樣品如下編號(hào)(例如“C”n)Coriell號(hào)基因型1 NA11277 I507 de1 HET2 NA11280 711+1G＞T/621+1G＞T HET3 NA01531 delF508 HOM4 NA04539 delF508 HOM5 NA07381 delF508/3849+10kb HET6 NA07441 3120+1G＞A/621+1G＞T HET7 NA07469 delF508/R553X8 NA11283 A455E/delF508 HET9 NA11284 R560T/delF508 HET10 NA11286 delF508/G551D HET11 NA11290 A455E621+1G＞T HET12 NA07552 delF508/R553X13 NA08342 delF508/G551D HET14 NA11275 3659delC/delF508 HET15 NA12785 G551D/R347P HET
16 NA11472 G1349D/N1303K HET17 NA11496 G542X HOM18 NA11497 G542X HET19 NA11723 W1282X HET20 NA11761 G551D/R553X HET21 NA11282 G85E/621+1G＞T HET22 NA12960 R334W/未知突變HET23 NA13032 I506V24 NA13033 F508C25 NA13423 G85E/D1152H HET26 NA11859 2789+5G＞A HOM27 NA11860 3849+10kb HOM28 NA12444 1717-1G＞A HET29 NA12585 R1162X HET30 NA13591 delF508/R117H HF31 NA08338 G551D32 NA11281 621+1G＞T/de1F50834 NA12961 V520F35 NA11278 Q493X/de1F50836 NA11285 Y1092X(C＞A)/delF50838 NA00946 AN139 NA00130 AN2PCR引物選自下組cftr外顯子3TGGTCCCACTTTTTATTCTTTTGCAGAcftr外顯子4AAGTCACCAAAGCAGTACAGCCcftr外顯子5GCTGTCAAGCCGTGTTCTAGATAAAcftr外顯子7CGGAAGGCAGCCTATGTGAGAcftr外顯子9CATGGGCCATGTGCTTTTCAAACcftr外顯子9-1 CATGGGCCATGTGCTTTTCAAACcftr外顯子9-2 CTTCTTGGTACTCCTGTCCTGAAAGAcftr外顯子10 ATTATGGGAGAACTGGAGCCTTCAcftr外顯子11 GATTACATTAGAAGGAAGATGTGCCTTTCAAcftr外顯子12 TAAGGCAAATCATCTACACTAGATGACCAcftr外顯子13 TAACTGAGACCTTACACCGTTTCTCA
cftr外顯子14B ATGGGAGGAATAGGTGAAGATGTTAGAAcftr外顯子16TCTGAATGCGTCTACTGTGATCCAcftr外顯子17A CCTGCACAATGTGCACATGTACCcftr外顯子17B GGACTATGGACACTTCGTGCCcftr外顯子18GGAGAAGGAAGAGTTGGTATTATCCTGACcftr外顯子19GCATCAAACTAATTGTGAAATTGTCTGCCcftr外顯子19-1 GCATCAAACTAATTGTGAAATTGTCTGCCcftr外顯子19-2 GAAGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACAcftr外顯子20GTACCTATATGTCACAGAAGTGATCCCAcftr外顯子21GATTAGAAAAATGTTCACAAGGGACTCCAcftr 3849+10kb CAGTTGACTTGTCATCTTGATTTCTGGAcftr外顯子17A-2 CCTCGACAATGTGCACATGTACC反向引物cftr外顯子3 ACCTATTCACCAGATTTCGTAGTCTTTTCAcftr外顯子4 TGTACCAGCTCACTACCTAATTTATGACAcftr外顯子5 GAGCTGAGCAAGACTTAACCACTAATTACcftr外顯子7 GTGAACATTCCTAGTATTAGCTGGCAACcftr外顯子9 CTCCAAAAATACCTTCCAGCACTACAAAcftr外顯子9-1 GAAATTACTGAAGAAGAGGCTGTCATCACcftr外顯子9-2 CTCCAAAAATACCTTCCAGCACTACAAAcftr外顯子10GACTAACCGATTGAATATGGAGCCAAAcftr外顯子11CTTAAATGTGATTCTTAACCCACTAGCCAcftr外顯子12GAGGTAAAATGCAATCTATGATGGGACAcftr外顯子13TAAGGGAGTCTTTTGCACAATGGAAAAcftr外顯子14B ACCTCACCCAACTAATGGTCATCAcftr外顯子16TAGACAGGACTTCAACCCTCAATCAcftr外顯子17A GAGTATCGCACATTCACTGTCATACCcftr外顯子17B AAGGTAACAGCAATGAAGAAGATGACAAA
cftr外顯子18TAATGACAGATACACAGTGACCCTCAAcftr外顯子19GCTTCAGGCTACTGGGATTCACcftr外顯子19-1 GTCATCTTTCTTCACGTGTGAATTCTCAAcftr外顯子19-2 GCTTCAGGCTACTGGGATTCACcftr外顯子20TTCTGGCTAAGTCCTTTTGCTCACcftr外顯子21CATTTCAGTTAGCAGCCTTACCTCAcftr 3849+10kb TCCTCCCTGAGAATGTTGGATCAAVs1 Int std F TGATGGTGGTATGTTTTCAGGCTAGAVs1 Int std R GTTCTCCCCTGTCCCAGTTTTAACPCR反應(yīng)如上所述進(jìn)行72℃延伸2.5分鐘，95℃變性45秒，共14個(gè)循環(huán)。將混合物加熱到99℃ 10分鐘，然后冷卻至63℃ 1小時(shí)。結(jié)果顯示在圖9中。delF508樣品為Coriel #3；G85E/621+1 G＞T為Coriel 21；1717-1G＞A，Coriel 28；delF508/R117H為Coriel 30；delF508/3849+10kb，Coriel 5；A455E/delF508，Coriel 8，和R560T/delF508 Coriel 9。這些結(jié)果表明組合PCR+INVADER試驗(yàn)可以用多重PCR反應(yīng)進(jìn)行。
實(shí)施例9四重INVADER試驗(yàn)4-染料系統(tǒng)提高分析通量的另外一種方法是提高可以在一個(gè)反應(yīng)或反應(yīng)容器中進(jìn)行并分析的INVADER反應(yīng)數(shù)。本實(shí)施例描述了4重INVADER試驗(yàn)的實(shí)現(xiàn)，其中一個(gè)反應(yīng)中包括4組寡核苷酸。在該情況下，反應(yīng)也包括4種不同的靶序列兩種不同SNP的野生型和變異形式。也考慮了另外的構(gòu)型，包括4個(gè)不同的基因座、3個(gè)不同的基因座和1個(gè)內(nèi)部控制等。
設(shè)置用于多重FRET分析的INVADER試驗(yàn)中的一個(gè)變量與包含于FRET探針上的染料的選擇有關(guān)。染料和猝滅劑的許多組合在本領(lǐng)域中公知(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,925,517、5,691,146和6,103,476號(hào)，均在此引用作為參考)。在一些實(shí)施方案中，希望選擇顯示最小干擾CLEAVASE酶酶切活性的染料-猝滅劑組合。這些染料-猝滅劑組合當(dāng)用于INVADER試驗(yàn)時(shí)可能促使更佳的更新速率。
影響染料選擇的另一個(gè)考慮涉及它們的光譜特性。在一些實(shí)施方案中，例如對(duì)于用熒光讀板儀檢測(cè)的試驗(yàn)，各種染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)優(yōu)選是彼此可被儀器光譜解析的。如果它們沒(méi)有足夠的光譜上的差異，一種染料的熒光輸出可能干擾或“滲入”另一染料產(chǎn)生的信號(hào)。這種“串?dāng)_”可能導(dǎo)致測(cè)定靈敏度降低或差錯(cuò)率升高。有些儀器具有分辨在多通道中檢測(cè)的信號(hào)檢測(cè)的實(shí)質(zhì)能力(例如通過(guò)對(duì)采集的信號(hào)進(jìn)行光過(guò)濾和/或軟件處理)，因此不同染料組合的選擇與用來(lái)檢測(cè)多重反應(yīng)的儀器有關(guān)。
來(lái)自熒光讀板儀掃描的特定染料熒光輸出與其濃度成比例，如下熒光＝α·[染料]+b(1)其中α是隨激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)和讀板儀增益設(shè)置而改變的常數(shù)，b是背景。如果存在多種染料，則各種染料產(chǎn)生總熒光，如熒光＝α·[染料a]+β·[染料b]+γ·[染料c]+...n·[染料n]+背景(2)或熒光-背景＝α·[染料a]+β·[染料b]+γ·[染料c]+...n·[染料n](3)當(dāng)進(jìn)行多重掃描時(shí)，來(lái)自各個(gè)掃描的熒光可以寫(xiě)為熒光1-背景1＝α1·[染料a]+β1·[染料b]+γ1·[染料c]+...n1·[染料n]熒光2-背景2＝α2·[染料a]+β2·[染料b]+γ2·[染料c]+...n2·[染料n]熒光3-背景3＝α3·[染料a]+β3·[染料b]+γ3·[染料c]+...n3·[染料n]熒光n-背景n＝αn·[染料a]+βn·[染料b]+γn·[染料c]+...nn·[染料n]
其中下標(biāo)數(shù)字代表各個(gè)掃描的熒光讀數(shù)、染料系數(shù)和背景成分。這一系列線性方程式可以用矩陣形式寫(xiě)為F1-b1F2-b2F3-b3···Fn-bn=α1β1γ1n1α2β2γ2n2α3β3γ3n3············αnβnγnnndyeAdyeBdyeC···dyeN---(3)]]>或F＝Ad(4)其中線性矩陣F的要素是減去背景的熒光讀數(shù)，A是二維系數(shù)矩陣，d是線性矩陣，其要素為從INVADER試驗(yàn)中釋放的各游離染料的量。假如對(duì)每次不同的掃描使用純?nèi)玖虾涂瞻走M(jìn)行一些類(lèi)別的校正，則F和A矩陣的要素可以確定。因此，使方程式(4)的兩側(cè)都乘以A的倒數(shù)可以得到d的解。
如下得出4重染料組的這種矩陣。染料-T10寡核苷酸，即具有5’末端染料、含有10個(gè)dT殘基的oligo，用來(lái)確定“游離染料”的發(fā)射特性。不同比例的這些dT10 oligo與含有相應(yīng)染料和適當(dāng)猝滅劑的FRET探針組合，模擬INVADER試驗(yàn)隨時(shí)間的信號(hào)產(chǎn)生。500nM的工作貯存液分別由各種dT10和各種FRET探針制成?？倶悠敷w積為15μl，各樣品均覆蓋15μl礦物油。檢測(cè)的比值為0％ dT10/100％ FRET探針；25％ dT10/75％ FRET探針；50％ dT10/50％ FRET探針；75％ dT10/25％ FRET探針；和100％ dT10/0％ FRET探針。檢測(cè)的染料是熒光素(FAM)、Cal-Gold和Cal-Orange(Biosearch Technologies，Inc.，Novato，CA)和REDMOND RED(Synthetic Genetics)。試管在Tecan SafireXFLUOR 4中在適合各種染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下讀數(shù)。在各種情況下，均發(fā)現(xiàn)各種染料產(chǎn)生的熒光隨著dT10 oligo比例的增加線性提高，并且信號(hào)是加成的。將線性回歸的斜率輸入如下的系數(shù)矩陣中。

如上所述通過(guò)計(jì)算各值的倒數(shù)獲得A-1，產(chǎn)生相應(yīng)的矩陣，從而得出各個(gè)情況中游離染料的百分?jǐn)?shù)d。
INVADER試驗(yàn)如下進(jìn)行。如上所述用CLEAVASE VIII酶和5pM(終)合成靶標(biāo)在15μl終體積中建立標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)。在該實(shí)施例中使用四種不同的合成靶標(biāo)野生型和突變的SNP 1和2。使用的FRET探針如下

該反應(yīng)在63℃下溫育，20分鐘后在指定波長(zhǎng)下讀取熒光。這些組合反應(yīng)的結(jié)果顯示在圖10中，其顯示靶分子不同組合的檢測(cè)。
實(shí)施例10預(yù)裝用于靶標(biāo)檢測(cè)的INVADER試驗(yàn)試劑的微觀流體卡下面的實(shí)施例描述了含有用于檢測(cè)DNA樣品的INVADER試驗(yàn)試劑的微觀流體卡的應(yīng)用。在該實(shí)施例中，靶物質(zhì)通過(guò)PCR分別制備。3M微觀流體卡具有8個(gè)加樣口，每一個(gè)均設(shè)置為在離心該卡時(shí)向48個(gè)獨(dú)立反應(yīng)室中供應(yīng)液體試劑。這些反應(yīng)室含有預(yù)分配并干燥的用于檢測(cè)一種或多種特定等位基因的INVADER試驗(yàn)反應(yīng)成分(如以下實(shí)施例11所述)。在離心該卡后當(dāng)這些試劑接觸液體試劑時(shí)，它們?nèi)芙狻?br> 多重PCR反應(yīng)混合物用如下成分(所示濃度是它們?cè)赑CR反應(yīng)中的終濃度)制備2ng/μl基因組DNA，0.2μM多重PCR引物混合物，1×PCR緩沖液+MgCl2，0.2mM dNTPs，和0.2U/rxn天然Taq聚合酶。終反應(yīng)體積為20μl。這些混合物在95℃下加熱2.5分鐘，然后通過(guò)95℃ 30秒的步驟、55℃ 1.5分鐘的步驟和72℃ 2.5分鐘的步驟循環(huán)20次。最后，樣品在99℃下溫育10分鐘，以破壞聚合酶的活性。
PCR后，擴(kuò)增子用dH2O以1∶125稀釋?zhuān)?0μl該樣品與含28mM MgCl2和4ng/μL CLEAVASEX酶的50μl溶液混合。然后將該混合物加入以上實(shí)施例中所述的3M CF微觀流體卡的8個(gè)獨(dú)立口之一。INVADER試驗(yàn)在63℃下進(jìn)行20分鐘，用微孔板熒光計(jì)檢測(cè)該試驗(yàn)產(chǎn)生的熒光。結(jié)果顯示在圖11A-11G中?；蚪M樣品DNA的基因型在各圖上方標(biāo)出，檢測(cè)的各個(gè)突變沿X軸標(biāo)出。
實(shí)施例11在3M CF微觀流體卡上的INVADER加PCR下面的實(shí)施例描述了含有INVADER試驗(yàn)試劑的微觀流體卡在DNA樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。在該實(shí)施例中，在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增并檢測(cè)靶物質(zhì)。該反應(yīng)如上所述在3M微觀流體卡上進(jìn)行。
微觀流體卡的反應(yīng)室含有在該卡上干燥的，用于運(yùn)行48個(gè)不同INVADER試驗(yàn)的INVADER試驗(yàn)反應(yīng)成分(即INVADER寡核苷酸、第一探針和FRET盒)。為了制備這種卡，將2μl 1×PPIFF-MOPS混合物(各0.25μM第一探針寡核苷酸，各0.125μM FRET寡核苷酸，0.025μMINVADER寡核苷酸，置于10mM MOPS緩沖液中)分配到該微觀流體卡的孔內(nèi)。然后使該卡在施加HEPA過(guò)濾空氣穿過(guò)其中的風(fēng)箱中干燥。通常不必控制空氣的溫度或相對(duì)濕度。裝配的微觀流體卡中的各個(gè)反應(yīng)室的容積為大約1.7μL，因此反應(yīng)過(guò)程中這些成分的終濃度是1×PPIFF-MOPS混合物中濃度的大約1.18倍。
用這些INVADER試驗(yàn)寡核苷酸組檢測(cè)的等位基因變體如下

制備INVADER試驗(yàn)的主混合物，其中含有多重PCR擴(kuò)增靶標(biāo)必需的所有材料，以及INVADER試驗(yàn)所需的CLEAVASE VIII酶，并且將該混合物分為8份。向這8份中的7份中加入獨(dú)特的基因組DNA樣品，剩下的樣品作為不含模板的對(duì)照。將各100μL這8份混合物加入該卡上的各加樣口中，該卡中的孔通過(guò)離心加樣。這些混合物中成分的終濃度如下7.5mM MgCl2，6.67ng/μL CleavaseVIII，0.033U/μL天然Taq-pol，25μM dNTP混合物，0.2μM多重PCR引物。
組合PCR和INVADER試驗(yàn)反應(yīng)物如下溫育95℃ 15秒，72℃ 2分15秒，共15個(gè)循環(huán)，然后99℃ 10分鐘一步，以破壞天然Taq-pol的活性，然后60℃ 1小時(shí)用于INVADER試驗(yàn)反應(yīng)。
INVADER試驗(yàn)產(chǎn)生的熒光信號(hào)用熒光微孔板讀板儀檢測(cè)，結(jié)果顯示在圖12A-12G中(省略了非靶標(biāo)對(duì)照樣品)。各個(gè)基因組樣品DNA的基因型在各個(gè)圖上方標(biāo)出，所檢測(cè)的各個(gè)突變沿X軸標(biāo)出。
實(shí)施例12未純化全血樣品的直接檢測(cè)該實(shí)施例描述了直接檢測(cè)未純化全血樣品中的靶序列。具體地，與上述實(shí)施例類(lèi)似，該實(shí)施例描述了在一個(gè)反應(yīng)容器中組合PCR擴(kuò)增和INVADER試驗(yàn)，以檢測(cè)基因組DNA。但是，該實(shí)施例通過(guò)使用一個(gè)反應(yīng)容器組合PCR-INVADER分析的方法將上述實(shí)施例進(jìn)一步擴(kuò)展到未純化的全血樣品。
如下制備總體積為20μl的PCR/INVADER試驗(yàn)反應(yīng)混合物。緩沖液使用大約4μl來(lái)自Shimadzu的0.5×AMPDIRECT-A(不含5×AmpAddition-1)或10mM TAPS生物緩沖液(3-[[tris(羥甲基)甲基]氨基]丙磺酸)，約pH9。
應(yīng)當(dāng)指出，意外地發(fā)現(xiàn)TAPS pH9可用作全血中直接PCR和INVADER檢測(cè)的緩沖液，而AMPDIRECT-A不行。另外，關(guān)于AMPDIRECT-A緩沖液和全血PCR的其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)于，例如，美國(guó)專(zhuān)利公布20020102660和20020142402，以及Nishimura等人，Clin.Lab.，2002，48377-84，和Nishimura等人，Ann.Clin Biochem，2000，37674-80，為了所有目的均在此引用作為參考)。使用下列其他試劑各6.25μM dNTP，各0.2μM PCR引物，0.3單位Taq聚合酶(天然)，40ng CLEAVASE VIII，3mM MgCl2(除了AMPDIRECT緩沖液中的任何MgCl2以外，如果使用該緩沖液的話)，0.5μM用于檢測(cè)的各個(gè)靶標(biāo)(例如靶向的基因組DNA和內(nèi)部控制)的第一探針，0.05μM用于檢測(cè)的各個(gè)等位基因的INVADER寡核苷酸(如果檢測(cè)SNP，則使用多個(gè)第一探針)，或0.05μM用于檢測(cè)的各個(gè)靶標(biāo)的INVADER寡核苷酸(例如，當(dāng)相對(duì)于內(nèi)部控制靶標(biāo)定量可變靶標(biāo)時(shí)使用)，各0.25μM FRET探針(用于靶標(biāo)和對(duì)照反應(yīng))，和用于20μL總反應(yīng)體積的蒸餾水。
待測(cè)的液態(tài)人全血標(biāo)本首先用諸如枸櫞酸鈉、EDTA二鉀或肝素鈉的抗凝劑處理。通過(guò)加至反應(yīng)管底部而不混合，將約0.4μl(或更少的)這種處理過(guò)的人全血加入PCR/INVADER反應(yīng)混合物中。需要時(shí)可以覆蓋礦物油。然后，對(duì)樣品進(jìn)行PCR共28個(gè)循環(huán)。例如，可以用適合人全血的如下溫度分布進(jìn)行PCR在80℃下預(yù)加熱15分鐘，然后94℃ 4.5分鐘，隨后94℃ 30秒，退火溫度1分鐘，72℃ 1分鐘，共28個(gè)循環(huán)，和72℃ 7分鐘。
這些循環(huán)反應(yīng)后，將混合物加熱到99℃ 10分鐘，以滅活Taq DNA聚合酶。反應(yīng)混合物然后在63℃下溫育約30分鐘至約3小時(shí)，以使INVADER試驗(yàn)反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。收集INVADER試驗(yàn)的結(jié)果(參見(jiàn)，例如，以上所述的實(shí)施例)。該實(shí)施例的結(jié)果表明全血內(nèi)基因組DNA中的靶序列得到成功PCR擴(kuò)增，并且目標(biāo)靶序列得到成功INVADER測(cè)定檢測(cè)。無(wú)論是使用AMPDIRECT還是TAPS pH9作為緩沖液，都可能從全血中成功檢測(cè)目標(biāo)靶核酸。
也可以應(yīng)用血-斑卡，如來(lái)自WHATMAN的血-斑卡，用組合PCR和INVADER試驗(yàn)進(jìn)行直接DNA檢測(cè)。類(lèi)似于以上所述，PCR-INVADER反應(yīng)緩沖液可以如下制備10mM TAPS pH9緩沖液，3mM MgCl2，各0.2μM PCR引物，各6.25μM dNTP，0.5μM用于各待測(cè)靶標(biāo)(例如靶基因組DNA和內(nèi)部控制)的第一探針，0.05μM用于各待測(cè)等位基因的INVADER寡核苷酸(如果檢測(cè)SNP，則使用多個(gè)第一探針)或0.05μM用于各待測(cè)靶標(biāo)的INVADER寡核苷酸(例如，當(dāng)相對(duì)于內(nèi)部控制靶標(biāo)定量可變靶標(biāo)時(shí)使用)，各0.25μM FRET探針(用于靶標(biāo)和對(duì)照反應(yīng))，0.06μl TaqPol(天然，5u/μl)，0.2μl CLEAVASE VIII 200ng/μl，和用于20μL終體積的蒸餾水。
從血液點(diǎn)樣的WHATMAN FTA基因卡上打一個(gè)1毫米的孔，其中含有血液，從不含任何血液的卡的一個(gè)位置處打一個(gè)同樣直徑的對(duì)照孔。紙孔然后用1ml水洗滌約10分鐘，不時(shí)加以搖動(dòng)。
PCR和INVADER試驗(yàn)如上所述進(jìn)行。該方法的結(jié)果顯示，來(lái)自全血基因組的靶序列得到成功PCR擴(kuò)增，并且目標(biāo)靶序列得到成功的INVADER試驗(yàn)檢測(cè)。
以上說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專(zhuān)利都如本文描述一樣在此引用作為參考。本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種修飾和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。盡管已經(jīng)結(jié)合具體優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)只限于這些具體實(shí)施方案。實(shí)際上，所述用于實(shí)施本發(fā)明的方式對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的各種變化也落入以下權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)未純化體液中的靶核酸的方法，包括在一定條件下使未純化的體液暴露于檢測(cè)試驗(yàn)試劑，使得如果存在所述靶核酸，則在一步反應(yīng)中檢測(cè)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述一步反應(yīng)包括聚合酶鏈反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述一步反應(yīng)包括聚合酶鏈反應(yīng)和侵入切割試驗(yàn)反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述一步反應(yīng)包括侵入切割試驗(yàn)反應(yīng)。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述聚合酶鏈反應(yīng)具有少于20個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述聚合酶鏈反應(yīng)具有少于15個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述聚合酶鏈反應(yīng)具有少于12個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶核酸是哺乳動(dòng)物基因組DNA。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶核酸來(lái)源于病原體。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶核酸來(lái)源于植物。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述體液包括血液。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶核酸通過(guò)熒光檢測(cè)。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑包括聚合酶、5’核酸酶和緩沖液。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述緩沖液包括pH9的TAPS。
15.一種用于檢測(cè)未純化體液中的靶核酸的試劑盒，其包含聚合酶、5’核酸酶和緩沖液，其允許可檢測(cè)地?cái)U(kuò)增所述未純化體液中的靶核酸。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述5’核酸酶包括FEN-1內(nèi)切核酸酶。
17.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述緩沖液包括pH9的TAPS。
18.權(quán)利要求15的試劑盒，其進(jìn)一步包含擴(kuò)增引物。
19.權(quán)利要求15的試劑盒，其進(jìn)一步包含在所述靶核酸的存在下用來(lái)產(chǎn)生侵入切割結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。
20.一種靶核酸多重檢測(cè)的方法，其包括a)在微觀流體卡中提供聚合酶鏈反應(yīng)和侵入切割試驗(yàn)試劑，其中所述試劑用來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)所述靶核酸；b)利用離心力將懷疑含有所述靶核酸的樣品暴露于所述試劑；和c)檢測(cè)所述靶核酸的存在或不存在。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述暴露包括進(jìn)行20個(gè)或少于20個(gè)循環(huán)的聚合酶鏈反應(yīng)。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述試劑包括聚合酶和5’核酸酶。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述5’核酸酶包括FEN-1內(nèi)切核酸酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了開(kāi)發(fā)及優(yōu)化用于基礎(chǔ)研究、臨床研究以及用于開(kāi)發(fā)臨床檢測(cè)試驗(yàn)的核酸檢測(cè)試驗(yàn)的方法和程序。特別地，本發(fā)明提供用于設(shè)計(jì)在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中使用的寡核苷酸引物的方法。本發(fā)明還提供優(yōu)化多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的方法。本發(fā)明還提供用于組合靶標(biāo)和信號(hào)產(chǎn)生試驗(yàn)的方法。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1922331SQ200480035700
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者V·利亞米切瓦, A·A·盧克維亞克, N·賈維斯, R·羅韋恩, J·G·霍爾, H·T·阿拉韋 申請(qǐng)人:第三次浪潮技術(shù)公司