一種變換核酸基因型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及醫(yī)學(xué)診斷和生物技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 選擇性擴(kuò)增核酸和選擇性破壞核酸，在核酸分析領(lǐng)域已有許多成功的應(yīng)用例 證。一個(gè)選擇性擴(kuò)增核酸的最有價(jià)值的例子是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase化ain Reaction,PCR)。PCR因其應(yīng)用十分廣泛，已獲諾貝爾獎(jiǎng)。另一個(gè)選擇性擴(kuò)增核酸的例子是 采用一定比例的雙脫氧單核甘酸介導(dǎo)的部分鏈終止法核酸擴(kuò)增，也即Sanger'S經(jīng)典測(cè)序 技術(shù)，該技術(shù)也已獲諾貝爾獎(jiǎng)。
[0003] 兩個(gè)選擇性破壞核酸的例子為采用識(shí)別核酸不同堿基的化學(xué)試劑對(duì)核酸進(jìn)行部 分降解，運(yùn)是世界上最早出現(xiàn)的實(shí)用測(cè)序技術(shù)即化學(xué)裂解法測(cè)序，也已獲諾貝爾獎(jiǎng)。另一例 子為核糖核酸酶保護(hù)分析用于核糖核酸的定性與定量分析。
[0004] 核糖核酸酶保護(hù)法主要用于實(shí)驗(yàn)研究，該方法可用W從細(xì)胞中提取出來(lái)混雜的 RNA樣本中鑒定出單獨(dú)的RNA或多種RNA。此技術(shù)可W在即使總濃度很低的情況下鑒定一 種或多種已知序列的RNA分子。被提取出來(lái)的RNA首先與反義RNA或DNA探針相混合，探 針是與被研究的序列相互補(bǔ)的，接下來(lái)互補(bǔ)鏈相互雜交W形成雙鏈RNA(或DNA-RNA雜交分 子）。然后將混合物使用具有特異性地切割僅為單鏈的RNA的核糖核酸酶，而不對(duì)雙鏈核酸 分子發(fā)揮酶解作用。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行完全時(shí)，易受影響的RNA區(qū)域被降解為非常短的低聚物或 單個(gè)核巧酸；存留下來(lái)的RNA片段是與之前所加進(jìn)的反義鏈相互補(bǔ)的RNA，因此包含目的序 列。獲得保護(hù)的目的序列片段通過(guò)后續(xù)電泳或其他分析技術(shù)得W確認(rèn)。但是，核糖酶保護(hù) 分析法只應(yīng)用了選擇性破壞核酸，而未同時(shí)采用選擇性擴(kuò)增核酸。 陽(yáng)0化]上述例證都為單獨(dú)應(yīng)用選擇性擴(kuò)增核酸或選擇性破壞核酸。但上述例子中的單獨(dú) 反應(yīng)，在同時(shí)含有不同等位基因或野生序列片段和突變片段的混合標(biāo)本，尤其是當(dāng)混合標(biāo) 本中的大多數(shù)基因片段均為非目的片段而其中稀有的基因型為目的片段時(shí)，如何通過(guò)技術(shù) 手段得到較高含量的稀有基因型產(chǎn)物，是常規(guī)基因擴(kuò)增技術(shù)難W滿足的難點(diǎn)。
[0006] 而現(xiàn)實(shí)世界的許多生物標(biāo)本，如尿液提取的游離核酸，糞便提取的游離核酸，血液 提取的游離核酸，W及動(dòng)植物的組織核酸提出物等，在用于基因克隆或基因突變分析時(shí)的 難點(diǎn)是在大多數(shù)情況下，是特定目的基因型片段較少，或野生序列片段含量高而突變序列 含量過(guò)低，W及特定基因片段較短等。一種有用的技術(shù)方案為首先對(duì)目的基因型片段進(jìn)行 富集。BEAMing技術(shù)平臺(tái)即采用先富集突變序列然后再對(duì)其進(jìn)行分析的技術(shù)路線。其存在 的缺陷是：（1)富集效率較低；(2)此外，富集需要針對(duì)變化多樣的不同種可能的突變序列； (3)富集難W對(duì)基因組數(shù)量巨大的突變序列設(shè)計(jì)和生產(chǎn)相應(yīng)的富集材料。盡管PCR結(jié)合測(cè) 序分析存在假陽(yáng)性，但仍具有高敏感性，臨床上得到較廣泛應(yīng)用。但是，當(dāng)突變片段較設(shè) 計(jì)的引物對(duì)包含的范圍更段時(shí)，PCR不能擴(kuò)增突變片段，從而測(cè)序也無(wú)法得到突變片段的 信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可W在混合有不同等位基因或混合有野生 與突變基因片段的生物標(biāo)本中選擇性提高目的基因型基因片段的方法。通過(guò)破壞特定基因 型對(duì)應(yīng)的基因序列，利用DNA聚合酶對(duì)上述基因被破壞過(guò)程所產(chǎn)生的部分可延伸斷裂片段 進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)的產(chǎn)物中已轉(zhuǎn)換基因型的部分在下一次反應(yīng)中作為模板使用，而 未轉(zhuǎn)化基因型的部分產(chǎn)物將被基因破壞反應(yīng)所破壞。
[0008] 為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0009] 一種體外變換核酸基因型的方法，其包含如下步驟：
[0010] (1)提供含有不同等位基因型的混合標(biāo)本，其包括目的基因型核酸片段和特定基 因型核酸片段；
[0011] (2)對(duì)其中一種特定基因型核酸片段進(jìn)行選擇性破壞；
[0012] (3)利用被選擇性破壞后的斷裂片段W其他等位基因的目的基因型核酸片段作為 模板進(jìn)行核酸延伸反應(yīng)；
[0013] 后面兩個(gè)反應(yīng)步驟按照順序重復(fù)進(jìn)行25-55次。
[0014] 本發(fā)明一優(yōu)選技術(shù)方案，特定基因型的核酸片段被選擇性破壞后，產(chǎn)生的斷裂片 段有兩種情形：(A)斷裂片段Ξ末端具有與目的基因型核酸片段不配對(duì)的堿基，度）斷裂片 段Ξ末端不具有與目的基因型核酸片段不配對(duì)的堿基。此時(shí)，斷裂片段上與目的基因型核 酸不配對(duì)的堿基位于斷裂片段的五末端。
[0015] 本發(fā)明一優(yōu)選技術(shù)方案，核酸延伸反應(yīng)為采用DNA聚合酶介導(dǎo)的化學(xué)反應(yīng)。
[0016] 作為本發(fā)明一優(yōu)選技術(shù)方案，當(dāng)斷裂片段為情況（A)時(shí)，采用的DNA聚合酶為具有 Ξ末端向五末端外切功能的高保真DNA聚合酶。當(dāng)斷裂片段為情況度）時(shí)，采用的DNA聚 合酶為不具有Ξ末端向五末端外切功能的DNA聚合酶。
[0017] 本發(fā)明一優(yōu)選技術(shù)方案，選擇性破壞核酸等位基因型為核酸酶介導(dǎo)的具有破壞特 定序列的化學(xué)反應(yīng)。
[0018] 優(yōu)選地，核酸酶選自天然的限制性核酸內(nèi)切酶，或者是基因工程核酸酶，包括但不 限于CRISPR-cas9核酸酶，鋒指核酸酶狂FNs)，反因子核酸酶燈ALE化）中的任意一種。且 上述的核酸酶優(yōu)選耐高溫，具體而言例如，耐受95°C的高溫而不失活。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案之一，所述化學(xué)反應(yīng)是具有破壞核酸特定序列的非生物酶 類的化學(xué)試劑介導(dǎo)的化學(xué)反應(yīng)。
[0020] 本發(fā)明一優(yōu)選技術(shù)方案中，其包含步驟如下：提供含有不同等位基因型的混合標(biāo) 本，其包括目的基因型核酸片段和特定基因型核酸片段；目的基因型樣本片段通常為突變 型基因型核酸片段；該特定基因型核酸片段通常為野生型基因型核酸片段；
[0021] 在上述的混合樣本中，加入對(duì)其中特定基因型核酸片段進(jìn)行選擇性破壞的耐高溫 核酸酶；
[0022] 在上述混合樣本中加入可擴(kuò)增目的基因型核酸片段的引物和DNA聚合酶進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
[002引在本發(fā)明的方法中，還可W在上述PCR反應(yīng)體系中加入包含有目的基因型核酸片 段的突變堿基的寡核巧酸單鏈。且加入的含有突變堿基的寡核巧酸單鏈，可W為正向突變 堿基的寡核巧酸單鏈和/或反向突變堿基的寡核巧酸單鏈。
[0024] 本發(fā)明方法中，耐高溫核酸酶為可W耐受95°C的高溫而不失活的核酸內(nèi)切酶，例 如耐高溫核酸內(nèi)切酶PstI，化elll。
[00巧]本發(fā)明的方法可用于核酸定性和定量分析。
[00%] 本發(fā)明的技術(shù)核屯、為將核酸破壞技術(shù)與DNA聚合酶對(duì)斷裂的核酸片段進(jìn)行延伸 技術(shù)相偶聯(lián)，達(dá)到基因型變換的效果。
[0027] 通常，高保真聚合酶的產(chǎn)物表現(xiàn)出模板依賴性，而低保真聚合酶表現(xiàn)出引物依賴 性。本發(fā)明中采用的選擇性破壞特定基因型基因序列片段的反應(yīng)，為目的基因型在作為模 板獲得模板依賴性延伸產(chǎn)物的反應(yīng)中逐漸成為混合標(biāo)本中的主要成分，達(dá)到基因型體外變 換的目的。當(dāng)不同基因型表現(xiàn)為斷裂片段五末端與不會(huì)被破壞的基因型片段不完全相同 時(shí)，使用低保真聚合酶對(duì)斷裂片段進(jìn)行延伸，已變換基因型的延伸產(chǎn)物在隨后的破壞反應(yīng) 中不被破壞而再次作為目的基因型模板；未變換基因型的延伸產(chǎn)物在隨后的破壞反應(yīng)中被 破壞。當(dāng)不同基因型表現(xiàn)為斷裂片段Ξ末端與不會(huì)被破壞的基因型片段不完全相同時(shí)，使 用高保真聚合酶對(duì)斷裂片段進(jìn)行延伸，該聚合酶利用其校正功能先對(duì)斷裂片段Ξ末端進(jìn)行 校正，然后進(jìn)行模板依賴性延伸，使被破壞的基因型產(chǎn)物變換為目的基因型產(chǎn)物。
[0028] 選擇性破壞核酸是生物領(lǐng)域常用技術(shù)，如一些核糖核酸酶可選擇性破壞核糖核 酸而不破壞脫氧核糖核酸，反之亦然，一些脫氧核酸酶選擇性破壞脫氧核糖核酸而不破壞 核糖核酸；一些限制性核酸內(nèi)切酶還能僅僅破壞具有特定序列的核酸，而對(duì)其他核酸序列 沒有破壞作用。具有對(duì)特定序列選擇性破壞的核酸酶包含限制性核酸內(nèi)切酶，鋒指核酸 酉每（zincfingernuclease)，反因子核酉《酉每（Transcriptionactivator-likeeffector nuclease)， 和CRISPR-cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromic r巧eatsequences-cas9)系統(tǒng)等。除上述蛋白質(zhì)酶類外，核糖核酸本身也可作為一種核酸 酶，破壞特定核酸，該發(fā)現(xiàn)在多年前已獲諾貝爾獎(jiǎng)。一些化學(xué)試劑，除前面提到的已得到諾 貝爾獎(jiǎng)的化學(xué)測(cè)序法中對(duì)單個(gè)核酸相關(guān)憐脂鍵具有破壞作用的化學(xué)試劑外，飽-邸TA與膚 核巧酸結(jié)合能對(duì)特定序列脫氧核糖核酸進(jìn)行破壞。
[0029] 本發(fā)明中含有不同等位基因片段的樣本，是指樣本中包括控制某一性狀的不同種 類的基因類型，例如可W是指突變型與野生型的混合標(biāo)本，突變型基因型核酸片段為目的 基因型樣本片段；野生型基因型核酸片段為待破壞的特定基因型核酸片段。
[0030] 本發(fā)明上述的混合樣本中，加入的耐高溫核酸酶可W對(duì)待破壞的基因型核酸片段 進(jìn)行選擇性破壞，耐高溫核酸酶優(yōu)選為耐高溫限制性核酸內(nèi)切酶，可W耐受95°c的高溫而 不失活。野生型基因型核酸片段含有耐高溫限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，而與之相對(duì)的 突變型基因型核酸片段由于堿基發(fā)生突變，在其相應(yīng)的位點(diǎn)則無(wú)法被酶切。在一些實(shí)施例 中，堿基突變點(diǎn)處為某些核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，則可W直接添加相應(yīng)的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)， 進(jìn)行基因型變換。在另一些