專利名稱：培養(yǎng)Thraustochytriales屬微生物的方法
各種不同的PUFAs(多不飽和脂肪酸)，特別是ω-3脂肪酸(n-3脂肪酸)是人類營養(yǎng)的必需成分。
然而，已知在大多數工業(yè)化國家中，n-3脂肪酸的供給是不足的。與此相反，飲食中的總脂肪比例以及飽和脂肪酸和n-6脂肪酸的攝入太高。這是由于我們的飲食結構發(fā)生的變化，特別是在最近的大約150年間發(fā)生的變化所引起的，并與各種不同的文明化所帶來的慢性病，例如工業(yè)化國家主要的死亡原因——心血管疾病的出現相關聯(lián)(Simopoulos，A.P.，1999，Am.J.Clin.Nutr.70，560-569)。同時，大量的研究顯示，通過定向地增加n-3脂肪酸，特別是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的攝入，可能極大地降低心血管病的風險(GISSI-Prevenzione研究人員(Gruppo Italiano per lo Studio dellaSopravvivenza nell′Infarto miocardico)，1999，心肌梗塞后在飲食中供應n-3多不飽和脂肪酸和維生素EGISSI-prevenzione試驗的結果，Lancet354，447-455；Burr等，1989，脂肪、魚類和纖維攝取量的變化對死亡和心肌梗塞的影響飲食和再次梗塞試驗(DART)，Lancet 2，757-761)。因此，許多不同的組織(WHO、FAO、AHA、ISSFAL、不列顛營養(yǎng)基金會等)推薦大量增加n-3脂肪酸的攝入量(Kris-Eherton等，魚類消費量、魚油、ω-3脂肪酸和心血管疾病，Circulation 2002，2747-2757)。
生產PUFAs以及特別是n-3脂肪酸的源泉為上述所有海洋冷水魚類以及從它們中提取的油，此外還包括海洋微生物，這些海洋微生物與魚類相比的優(yōu)勢在于它們可在成本效應和受控條件下進行發(fā)酵以生產PUFAs。發(fā)酵生產不存在任何污染的危險，而對于魚類或從其中提取的魚油來說卻經常被描述發(fā)生這樣的問題(Olsen SF.Int J Epidemiol.20011279-80)。此外，提取的魚油的成分必然會受到對魚的種類和培養(yǎng)條件的選擇的影響，而不易受到季節(jié)變化的影響，正如對于魚類和魚產品所描述的那樣(Gamez-Meza et al.Lipids 1999639-42)。
已經發(fā)現了許多適合于生產n-3PUFA的微生物，例如弧菌(Vibrio)屬的細菌(例如海產弧菌(Vibrio marinus))或甲藻(Dinophyta)，特別是隱甲藻(Crypthecodinium)屬中的微生物例如寇氏隱甲藻(C.cohnii)，或原生藻菌(Stramenopiles)例如Pinguiophyceae中的微生物例如Glossomastix、Phaeomonas、Pinguiochrysis、Pinguiococcus和Polydochrysis。優(yōu)選的用于發(fā)酵生產PUFA的微生物屬于原生藻菌(Stramenopiles)(或網粘菌門(Labyrinthulomycota))，特別是Thraustochytriales目(Thraustchytriidea)中的微生物，又特別是Japonochytrium、Schizochytrium、Thraustochytrium、Althornia、Labyrinthuloides、Aplanochytrium和Ulkenia屬中的微生物。
已經知道一些上面提到的微生物可以用于工業(yè)化生產脂肪酸，相應的工藝方法已經被描述。因此，國際專利申請WO 91/07498A1公開了使用破囊壺菌(Thraustochytrium)和裂壺菌(Schizochytrium)屬的生物來生產PUFAs。WO 91/11918 A1公開了使用寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)生產PUFAs，WO 96/33263A1和相應的歐洲專利申請EP 0 823 475 A1描述了使用Schizochytrium屬的微生物生產PUFAs，而專利申請WO 98/03671公開了使用Ulkenia屬的微生物生產PUFAs。
上面描述的微生物特別是網粘菌門(Labyrinthulomycota)的自然棲息地是海洋棲息地。因此，這些微生物通常培養(yǎng)在含鹽的培養(yǎng)基中，對本發(fā)明來說，海水的鹽濃度被定為32-35g/L和90-95％含量的鈉和氯。用于培養(yǎng)海洋微生物例如Thraustochytrium或Schizochytrium的典型培養(yǎng)基是基于海水(例如ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)的790By+培養(yǎng)基[酵母提取物1.0g，蛋白胨1.0g，D+葡萄糖5.0g，海水1L])。但是，也已經知道Thraustochytriales目的微生物可以在具有非常低鹽度的培養(yǎng)基中存活。但是，當鹽含量低于7.5-15g/L的限度，對應于鹽度7.5-15‰時，它的生長被描述為只是非常低，在低鹽度范圍內沒有中間最大值。最適生長速率只在高于上面提到的限度時才能獲得(Fan等，Botanica Marina 45，2002，第50-57頁)。
在發(fā)酵過程中經常發(fā)生的問題是培養(yǎng)過程中強烈的pH變動，這是由于代謝產物的出現和/或單一培養(yǎng)基成分的消耗的結果。這特別會發(fā)生在用于發(fā)酵海洋微生物的富鹽培養(yǎng)基中。為此，這樣的發(fā)酵通常需要能夠調節(jié)pH的方式。但是，在大規(guī)模發(fā)酵的情況下，pH控制導致了很多附加的費用。這時，需要添加酸和堿的附加容器，它們本來可以用在別處用于補加其它的成分。此外，用于pH值調節(jié)的滴定需要技術上的控制。對于Labyrinthulomycota的發(fā)酵以在生產規(guī)模上獲得PUFA來說，pH控制的培養(yǎng)方法現有技術已經使用。
然而在細胞培養(yǎng)中慣常使用的通過緩沖液系統(tǒng)控制pH值的方法有一些缺點。因此，在PUFA發(fā)酵所需的pH范圍內例如TRIS、HEPES和MOPS的緩沖容量是不足的，因為它們的pKa值大于7。此外，在低于7.5的pH范圍TRIS不是一種好的緩沖液，會產生具有潛在反應性的伯胺，積極參與多種生物反應。另一種也是經常使用的緩沖液——磷酸緩沖液，在存在二價陽離子的情況下具有從溶液中沉淀出來的特點，因此對于需要或消耗磷酸的發(fā)酵過程來說也是一種壞的選擇。乙酸鹽緩沖液也不適合，因為它們的緩沖范圍狹窄，并且它們在發(fā)酵過程中被代謝。此外，許多可以選擇的緩沖系統(tǒng)由于高的費用而不夠經濟。
因此，根據本技術領域的現狀，本發(fā)明的一個目的是提供一種新的、簡單而經濟的培養(yǎng)海洋微生物的方法。據此應該使工藝控制得到相當的簡化。除了經濟上合算之外，該方法應該能夠高產量地生產高純度的PUFAs。
該任務以及其它雖沒有明確地描述但可以從引言所述的關系中毫不費力地得出或推演出的任務，可以通過在本發(fā)明權利要求中限定的目標來實現。
權利要求1中限定的方法提供了一種有優(yōu)勢的培養(yǎng)Thraustochytriales目微生物的方法。該方法包括在其pH值完全通過CaCO3進行穩(wěn)定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中的CaCO3，其含量是3-15g/L，并且如果適用，從微生物和/或培養(yǎng)基中分離PUFAs。
本發(fā)明還包括了生產高純度PUFAs的方法。
按照本發(fā)明，優(yōu)選的PUFAs是DHA、DPA和EPA。
具體來說，通過上述方法培養(yǎng)的微生物表現出大于10％，優(yōu)選情況下大于14％和非常特別優(yōu)選情況下大于18％DHA/干生物質的產量。
具體來說，通過上述方法培養(yǎng)的微生物表現出大于1％，優(yōu)選情況下大于2％和非常特別優(yōu)選情況下大于3％DPA/干生物質的產量。
通過在培養(yǎng)后從微生物(生物質)和/或培養(yǎng)基中分離PUFAs，可以獲得高產量和高純度的PUFAs。
此外，本發(fā)明包括了生產生物質的方法，其中生物質是通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法提供的。
該生物質可以以所有可以想象得到的方式使用。具體來說，該生物質可以以例如干燥的形式(干生物質)使用，直接作為食品或動物飼料使用。
此外，本發(fā)明還包括油狀的形式，它是通過實施本發(fā)明的培養(yǎng)方法，然后從微生物和/或培養(yǎng)基中分離該油狀物而獲得的。
具體來說，這是除了許多其它優(yōu)選應用之外，可以方便地用于人類營養(yǎng)的油狀物。
在本發(fā)明的條件下，微生物表現出每單位重量的干生物質大于30％，優(yōu)選情況下大于35％油狀物的產量。
根據本發(fā)明，油狀物被理解為含有至少70％中性脂和至少2％磷脂，與本領域的專業(yè)人員所熟知的正常的Thraustochytriales脂肪酸形式相一致。其中的中性脂組成為至少80％的甘油三酯和其它化合物例如二?；视汀㈢薮嫉?。此外甘油三酯的重量分數包括大約95％的脂肪酸和5％甘油。
在沒有極端的pH值調控的情況下，特別是在能夠以高葡萄糖消耗進行快速生長的條件下發(fā)酵海洋微生物生產PUFA的可能性，是絕對令人吃驚的。在缺少適當的pH控制的條件下發(fā)酵海洋微生物確實會很快地導致培養(yǎng)基酸化，并導致生長停止(參見實施例1以及Wen，Z.-Y.和Chen，F.，2003，Biotechnology Advances 21，273-294)。
沒有利用其它的pH值穩(wěn)定方式，本發(fā)明的方法令人吃驚地成功了。在本發(fā)明中，pH值穩(wěn)定方式被理解為從補料罐中根據培養(yǎng)過程中達到的pH值調節(jié)酸或堿的加入，也被理解為在培養(yǎng)基本身中使用緩沖液系統(tǒng)，盡管本發(fā)明人沒有了解到任何使用緩沖液系統(tǒng)例如TRIS或磷酸鹽緩沖液的經濟上可利用的培養(yǎng)方法。
根據本發(fā)明，CaCO3是用于穩(wěn)定pH值的主要方式。即使如此，在某些條件下可能也需要向培養(yǎng)基中加入酸或堿來調整pH值。這種加入也包括在本發(fā)明中，只要CaCO3仍然是穩(wěn)定pH值的主要方式就行。例如，如果在培養(yǎng)過程中由于微生物格外快速的生長使得pH值下降到低于特定的靶值，可以暫時通過加入酸或堿調整到這個靶值，而這種添加不是pH值調控的主要方式。
術語pH值調控和pH值控制或pH值穩(wěn)定在本發(fā)明中使用時具有同樣的意義。
根據本發(fā)明添加了CaCO3的各種情況下，當加入和不加入酸時測量的pH值的差值小于或等于1時，優(yōu)選小于或等于0.75時，特別優(yōu)選小于或等于0.5時，非常特別優(yōu)選小于或等于0.2時，最特別優(yōu)選小于或等于0.1時，主要的方式仍然是CaCO3。這樣的酸和/或堿的添加在本發(fā)明中被理解為少量地添加酸和/或堿，它們被包括在本發(fā)明中。
優(yōu)選的培養(yǎng)系統(tǒng)不需要使用任何酸和/或堿的添加。
此外，任何可以替換的緩沖液系統(tǒng)由于與使用碳酸鈣相比需要較高的花費，因而都是不經濟的。
碳酸鈣在培養(yǎng)Thraustochytriales目的微生物時作為緩沖劑的高效能是令人吃驚的，因為唯一形成的二氧化碳在水中只有有限的溶解度，這導致在發(fā)酵過程中緩沖能力的降低。
令人吃驚的是，發(fā)酵不僅可能達到完全的葡萄糖消耗，而且除此之外當本發(fā)明使用碳酸鈣穩(wěn)定培養(yǎng)基時，生物質中PUFA的比例也明顯地增加了。更令人吃驚的是，葡萄糖的利用以及與此相關的PUFA的生產加速了，從而導致空間-時間產率的提高。
在本發(fā)明以前，沒有已知的發(fā)酵工藝可以使用碳酸鈣穩(wěn)定pH的培養(yǎng)基在Thraustochytriales目的微生物中生產n-3脂肪酸，而不需要其它的pH值穩(wěn)定方式。
PUFAs是多不飽和長鏈脂肪酸，鏈長大于C12，含有至少兩個雙鍵?？梢园凑毡景l(fā)明的方法生產的PUFAs具體來說是n-3脂肪酸和n-6脂肪酸。
在本發(fā)明中，n-3脂肪酸(ω-3脂肪酸)被理解為多不飽和長鏈脂肪酸，鏈長大于C12，含有至少兩個或以上雙鍵，其中第一個雙鍵位于從烷基末端開始的C3和C4碳原子之間。因此，對于n-6脂肪酸來說，第一個雙鍵位于從烷基末端開始的C6和C7碳原子之間。
屬于Labyrinthulomycota組的微生物被考慮用于按照本發(fā)明的方法生產PUFAs。Thraustochytriales(Thraustchytriidea)目的微生物是優(yōu)選的(Lewis，T.E.，Nichols，P.D.，McMeekin，T.A.，Thraustochytrids的生物技術潛力，海洋生物技術，1999，580-587頁；和Porter，D.，原生生物手冊中的Labyrinthulomycota門動物、植物和真菌之外的真核微生物及其后裔的結構、培養(yǎng)、棲息地和生活史藻類、纖毛蟲、有孔蟲、sprorozoa、水霉和其它原生生物指南。Margulis，L，Corliss，J.O.，Melkonian，M.和Chapman，D.J.主編，McKhann，H.I.協(xié)編，Jones andBartlett Publishers，ISBN 0-86720-052-9 1990，388-398頁)。特別優(yōu)選的是Japonochytrium，Schizochytrium，Thraustochytrium Althornia，Labyrinthuloides，Aplanochytrium和Ulkenia屬的微生物。其中，Schizochytrium、Thraustochytrium和Ulkenia是最特別優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是Japonochytrium sp.ATCC 28207，Thraustochytrium aureum(特別是ATCC 28211和ATCC 34304)，Thraustochytrium roseum ATCC 28210，Thraustochytrium sp.ATCC 20890，ATCC 20891，ATCC 20892和ATCC26185，Schizochytrium aggregatum ATCC 28209，Schizochytrium sp.ATCC 20888和ATCC 20889，Schizochytrium SR21，以及Ulkenia sp.SAM 2179和SAM 2180。
適合用于本發(fā)明方法的微生物可以是野生型的，也可以是突變體和從它們衍生的菌株以及相應生物體的重組菌株。本發(fā)明特別包括了用于提高PUFA產量的突變或重組菌株。
本發(fā)明的微生物通過用這些生物體的預培養(yǎng)物接種液體或固體培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)。
適合于Thraustochytriales目的微生物的培養(yǎng)技術對本技術領域的專業(yè)技術人員來說是眾所周知的。一般但不是絕對地來說，培養(yǎng)是通過在相應的容器中進行含水發(fā)酵來完成的。用于這種類型發(fā)酵的典型容器的例子包括搖瓶或生物反應器，例如STRs(攪拌釜式反應器)或泡罩塔。培養(yǎng)一般在溫度為10℃到40℃之間，優(yōu)選為20℃到35℃之間，特別優(yōu)選為25℃到30℃之間，更特別優(yōu)選為27℃和29℃之間進行，特別是在28±0.5℃下進行。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，pH穩(wěn)定的培養(yǎng)基中碳酸鈣的含量相當于3g/L到15g/L，優(yōu)選4g/L到12g/L，特別優(yōu)選5g/L到10g/L范圍內的值。非常特別優(yōu)選的碳酸鈣含量是7.5±0.5g/L。
在優(yōu)選情況下pH穩(wěn)定的培養(yǎng)基還含有一種或多種碳源，以及一種或多種氮源。對于本技術領域的專業(yè)技術人員來說，可用做培養(yǎng)Thraustochytriales目的微生物的碳源和氮源的物質是眾所周知的。
可以使用的碳源例如碳水化合物例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶淀粉、巖藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、谷氨酸、糖蜜、甘油或甘露醇、或脂肪和油類或植物水解產物。
可以使用的天然氮源例如蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、牛肉提取物、酪蛋白氨基酸、玉米漿或大豆，可以使用的有機氮源例如谷氨酸和尿素，無機氮源例如乙酸銨、碳酸氫銨、硫酸銨或硝酸銨也可以被用做氮源。
除了碳酸鈣之外，pH穩(wěn)定的培養(yǎng)基可以含有本領域的專業(yè)技術人員所熟知的能夠協(xié)助Thraustochytriales目的微生物培養(yǎng)的所有其它成分，特別是例如Ca、Mg、K、Fe、Ni、Co、Cu、Mn、Mo或Zn的無機鹽?？梢粤信e的例子有磷酸鹽例如磷酸氫鉀，或氯化物例如氯化鎂，硫酸鹽例如硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鐵或硫酸鈉。其它可以使用的無機鹽例如鹵化物，例如溴化鉀或碘化鉀，以及其它的碳酸鹽例如碳酸氫鈉。
在適合的情況下，培養(yǎng)基可以含有添加的大量或微量營養(yǎng)素，例如氨基酸、嘌呤、嘧啶、玉米漿、蛋白水解物、(水溶性和/或水不溶性的)維生素，以及其它本領域的專業(yè)技術人員所熟知的培養(yǎng)基成分。如果需要也可以加入消泡劑。培養(yǎng)基可以含有復雜成分，或者是化學上確定的。
每種成分的量可以變化，只要對微生物的生長或生產率沒有負面影響就行。本領域的專業(yè)技術人員可以根據微生物的需要容易地確定每種情況下所需的成分。一般來說，碳源的添加濃度不超過300g/L，氮源的添加濃度為1到30g/L。在優(yōu)選情況下，氮的含量依賴于培養(yǎng)基中碳的含量來進行調整。
特別優(yōu)選的pH值穩(wěn)定的培養(yǎng)基含有葡萄糖、酵母提取物、玉米漿(CSL)、氯化鎂、碳酸鈣、氯化鈣、硫酸鈉和磷酸鉀。
培養(yǎng)基的pH值在開始發(fā)酵之前通過加入相應的酸或堿被設定在3到10的范圍內，優(yōu)選為4到8，特別優(yōu)選為5到7，非常特別優(yōu)選為大約6。
然后將培養(yǎng)基滅菌。對培養(yǎng)基進行滅菌的技術對本領域的專業(yè)技術人員來說是熟知的，可以舉出的例子有高壓滅菌和除菌過濾。
正如本領域的專業(yè)技術人員通常所了解的那樣，培養(yǎng)可以以分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)的方式進行。
分批培養(yǎng)或補料分批培養(yǎng)通常進行的時間為1到12天，優(yōu)選為2到10天，特別優(yōu)選為3到9天。
培養(yǎng)基成分可以單獨地或作為混合物加入到培養(yǎng)基中，事先制備的混合物也能夠使用。培養(yǎng)基成分，特別是碳源和氮源或特異性培養(yǎng)基添加物可以在培養(yǎng)前或培養(yǎng)過程中加入。成分的加入可以重復一次或幾次，也可以連續(xù)地進行。
生產出的PUFA一般為中性脂肪的形式例如三酰甘油，或極性脂的形式例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇。
對于本發(fā)明來說，術語PUFA、n-3脂肪酸或n-3活性物質被理解為其中可以存在相應脂肪酸的所有可能的形式，即游離脂肪酸、酯、甘油三酯、磷脂或其它衍生物。所有這些物質都在下文中進行了概述，使用的術語具有同樣的意義。此外，在從培養(yǎng)物中分離之前或之后，PUFAs可以通過化學的或生物催化的轉酯反應方式進行轉化和濃縮，例如在適當的酶(脂酶)的幫助下。
從發(fā)酵的微生物或培養(yǎng)基中分離PUFAs以及分析脂肪酸形式可以使用本領域的專業(yè)技術人員所熟知的常用方法來進行(Wanasundara，U.N.，Wanasundara，J.，Shahidi，F.，ω-3脂肪酸濃縮物生產技術綜述，海洋食品——質量、技術和營養(yǎng)藥物應用，2002，157-174頁)。
構成了本發(fā)明方法的基礎的pH穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)基在下文中以一些實施例的方式進行描述。然而，發(fā)酵培養(yǎng)基以及本發(fā)明并不限于這些實施例1在完全用不同量CaCO3穩(wěn)定pH的不同培養(yǎng)基中發(fā)酵Ulkenia sp.SAM 2179菌株生產PUFA
Ulkenia sp.SAM 2179菌株被培養(yǎng)在含有50ml培養(yǎng)基的300ml帶有擋板的錐形燒瓶中。
培養(yǎng)基組成發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖150g/L玉米漿3.75g/LKH2PO43g/LNa2SO41g/LMgCl2×6H2O1g/LCaCl2×2H2O0.3g/L(NH4)2SO45g/L每個50mL搖瓶中添加的CaCO3培養(yǎng)基1.10g/L培養(yǎng)基1.21g/L培養(yǎng)基1.32g/L培養(yǎng)基1.45g/L培養(yǎng)基1.510g/L用NaOH將pH值調整到6.0并高壓滅菌。
培養(yǎng)條件溫度(℃) 28轉速(rpm) 150在培養(yǎng)96小時后通過離心收獲細胞。然后將細胞冷凍干燥并確定干生物質。通過在10％甲醇鹽酸中于60℃熱處理2小時(同時攪拌)來進行細胞裂解和脂肪酸測定。酯通過氣相色譜進行分析以測定脂肪酸的組成。
表1不同碳酸鈣濃度時的發(fā)酵參數
DBM干生物質；DHA/DBM單位重量DBM中DHA(二十二碳六烯酸)的重量百分比；g/L×d以每天每升的克數表示的空間-時間產率；STY空間-時間產率；DHA面積(％)DHA在總脂肪酸中的比例在缺少足夠的pH穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵Ulkenia sp.SAM 2179會導致在發(fā)酵過程中葡萄糖消耗的減速，并由于pH值的急劇下降導致生長的停止(參見培養(yǎng)基1.1.-1.3.)。只有較大量的CaCO3緩沖物能夠在培養(yǎng)過程中穩(wěn)定pH值(培養(yǎng)基1.4和1.5)。在這里，增加CaCO3的濃度也導致在培養(yǎng)過程中葡萄糖消耗的增加。由于pH值穩(wěn)定和與此相關的葡萄糖消耗的增加，可以達到較高的生物質值，從而得到較高的DHA空間-時間產率，在上述條件下可達到大約2g/L×d。
實施例2在完全用不同量CaCO3穩(wěn)定pH值的不同培養(yǎng)基中發(fā)酵Ulkenia sp.SAM 2179菌株直到葡萄糖極限來生產PUFAUlkenia sp.SAM 2179菌株被培養(yǎng)在含有50ml培養(yǎng)基的300ml帶有擋板的錐形燒瓶中直到葡萄糖完全消耗。
培養(yǎng)基組成發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖150g/L玉米漿3.75g/L
KH2PO43g/LNa2SO41g/LMgCl2×6H2O1g/LCaCl2×2H2O0.3g/L(NH4)2SO45g/L每個50mL搖瓶中添加的CaCO3培養(yǎng)基1.45g/L培養(yǎng)基1.5 10g/L用NaOH將pH值調整到6.0并高壓滅菌。
培養(yǎng)條件溫度(℃) 28轉速(rpm)150在培養(yǎng)144.5小時后通過離心收獲細胞。然后將細胞冷凍干燥并確定干生物質。通過在10％甲醇鹽酸中于60℃熱處理2小時(同時攪拌)來進行細胞裂解和脂肪酸測定。酯通過氣相色譜進行分析以測定脂肪酸的組成。
表2在葡萄糖極限后的發(fā)酵參數
在分別用5g/L和10g/L CaCO3緩沖的培養(yǎng)基中發(fā)酵Ulkenia sp.SAM 2179能夠將培養(yǎng)進行到葡萄糖極限而pH值沒有強烈的下降。因此獲得的生物質和單位生物質的DHA含量非常高，對應于葡萄糖完全消耗分別為大約58-64g/L生物質和20-22％DHA/DBM。同時發(fā)現較高的CaCO3濃度(10g/L)產生較大量的生物質，盡管單位生物質的主要PUFA-DHA的比例與較低CaCO3濃度(5g/L)時相比略微下降。但是從此獲得的DHA空間-時間產率在兩種濃度下保持基本相同。
實施例3在最適化的發(fā)酵條件下培養(yǎng)Ulkenia sp.SAM 2179菌株生產PUFAUlkenia sp.SAM 2179菌株被培養(yǎng)在含有50ml培養(yǎng)基的300ml帶有擋板的錐形燒瓶中直到葡萄糖完全消耗。發(fā)酵的最適化來自于7.5g/L的CaCO3濃度和修改的預培養(yǎng)。對于預培養(yǎng)而言，不使用在DH1培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)，而是使用在同樣培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(48小時，150rpm，28C)。
培養(yǎng)基組成預培養(yǎng)培養(yǎng)基DH1培養(yǎng)基單水葡萄糖(g/L) 56.25酵母提取物(g/L) 12.5[Difco]Tropic Marin海鹽(g/L)16.65[Dr.Biener GmbH，Wartenberg，Germany]用HCl將pH值調整到6.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 150g/L玉米漿 3.75g/LKH2PO43g/LNa2SO41g/LMgCl2×6H2O 1g/LCaCl2×2H2O 0.3g/L(NH4)2SO45g/L每個50mL搖瓶中添加的CaCO3培養(yǎng)基1.67.5g/L用NaOH將pH值調整到6.0并高壓滅菌。
培養(yǎng)條件溫度(℃) 28轉速(rpm) 150
在培養(yǎng)99.75小時后通過離心收獲細胞。然后將細胞冷凍干燥并確定干生物質。通過在10％甲醇鹽酸中于60℃熱處理2小時(同時攪拌)來進行細胞裂解和脂肪酸測定。酯通過氣相色譜進行分析以測定脂肪酸的組成。
表3在最適化的緩沖條件下的發(fā)酵參數
使用最適化發(fā)酵條件，其中Ulkenia sp.SAM 2179首先在DH1培養(yǎng)基中于28℃和150rpm下培養(yǎng)48小時，DHA的空間-時間產率可以被顯著提高到超過3.5g/L×d。這主要是由于較快的生長，其中在不到100小時時就達到葡萄糖極限了。在發(fā)酵培養(yǎng)基中使用7.5g/L CaCO3能夠獲得最適化培養(yǎng)所需的pH穩(wěn)定。使用7.5g/L CaCO3是得自于實施例2的結果，其中10g/L CaCO3獲得了較高的生物質值，而5g/L CaCO3得到了較好的DHA值。因此用于DHA生產的最適CaCO3濃度(即最大可能的生物質與最大可能的DNA含量)被懷疑是在5到10g/L CaCO3之間。除了pH值穩(wěn)定之外，使用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基在葡萄糖極限時還達到了驚人高的DHA空間-時間產率，超過3g/L×d。在這種情況下獲得了與實施例2中相同的生物質值，但是單位生物質的DNA含量和獲得的DHA數量都較大(超過10％)。
實施例4在用和不用CaCO3穩(wěn)定pH的培養(yǎng)基中發(fā)酵Ulkenia sp.SAM 2179菌株以生產PUFAUlkenia sp.SAM 2179菌株被培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐中直到葡萄糖完全消耗。
培養(yǎng)基組成
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 150g/L玉米漿 3.75g/LKH2PO43g/LNa2SO41g/LMgCl2×6H2O 1g/LCaCl2×2H2O 0.3g/L(NH4)2SO45g/L對于進行pH控制的發(fā)酵用H3PO4將pH值調整到4.0并高壓滅菌對于不進行pH控制的發(fā)酵用NaOH將pH值調整到6.0并高壓滅菌，并加入7.5g/L CaCO3培養(yǎng)條件溫度(℃)28通氣量 0.8vvm進行和不進行pH控制的發(fā)酵表4進行和不進行pH控制的發(fā)酵參數
使用本發(fā)明的CaCO3穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)基也能夠在5L的發(fā)酵規(guī)模上不進行pH控制將Ulkenia sp.SAM 2179的培養(yǎng)進行到葡萄糖極限。足夠量CaCO3的使用由于加快了葡萄糖的消耗而導致較快的生長。此外，還獲得了較大的生物質。此外，與此相關，在發(fā)酵過程中達到了單位生物質較大的DHA比率并獲得較大量的DHA。這使得CaCO3緩沖的發(fā)酵與控制pH的發(fā)酵相比在DHA空間-時間產率上并非微不足道的增加，超過15％。
實施例5在用7.5g/L CaCO3穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)基1.6中發(fā)酵Schizochytrium sp.SR21生產PUFASchizochytrium sp.SR 21菌株被培養(yǎng)在含有50ml培養(yǎng)基的300ml帶有擋板的錐形燒瓶中直到葡萄糖完全消耗。
培養(yǎng)基組成預培養(yǎng)培養(yǎng)基GY培養(yǎng)基葡萄糖(g/L)30.0酵母提取物(g/L) 10.0[Difco]Tropic Marin海鹽(g/L)16.65[Dr.Biener GmbH，Wartenberg，Germany]用HCl將pH值調整到6.0發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 150g/L玉米漿 3.75g/LKH2PO43g/LNa2SO41g/LMgCl2×6H2O 1g/LCaCl2×2H2O 0.3g/L(NH4)2SO45g/L每個50mL搖瓶中添加的CaCO3培養(yǎng)基1.67.5g/L用NaOH將pH值調整到6.0并高壓滅菌。
培養(yǎng)條件溫度(℃) 28轉速(rpm)150在培養(yǎng)96小時后通過離心收獲細胞。然后將細胞冷凍干燥并確定干生物質。通過在10％甲醇鹽酸中于60℃熱處理2小時(同時攪拌)來進行細胞裂解和脂肪酸測定。酯通過氣相色譜進行分析以測定脂肪酸的組成。
表5在最適化緩沖條件下的發(fā)酵參數
在本發(fā)明中描述的使用CaCO3穩(wěn)定pH的培養(yǎng)基在屬于Labyrinthulomycota的其它生物體中也導致了PUFA的最適化生產。因此在構成本發(fā)明目的的培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物Schizochytrium sp.SR21微生物也是可能的。在SR 21中主要的PUFA，DHA的空間-時間產率略微低于Ulkenia sp.SAM 2179(參見實施例3)，但是對于n-3PUFA DHA來說超過了總干生物質的15％(w/w)。該實施例表明構成了本發(fā)明目的的最適化pH穩(wěn)定培養(yǎng)基能夠在Labyrinthulomycota的其它成員中不進行pH控制來發(fā)酵生產PUFAs。
權利要求
1.一種培養(yǎng)Thraustochytriales屬微生物的方法，其特征為將微生物培養(yǎng)在除了CaCO3之外只使用極少的其他pH穩(wěn)定方式的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在優(yōu)選情況下除了CaCO3之外不使用其它pH穩(wěn)定方式。
2.權利要求1的方法，其中的微生物每單位重量干生物質產生多于25wt％的油，在優(yōu)選情況下多于35wt％的油，以及在非常特別優(yōu)選情況下多于45wt％的油。
3.權利要求1的方法，其中的微生物每單位重量干生物質產生多于10％，優(yōu)選情況下多于14％，特別優(yōu)選情況下多于18％，以及非常特別優(yōu)選情況下多于22wt％的DHA。
4.前述權利要求任何一個的方法，其中的微生物每單位干生物質產生多于1％，優(yōu)選情況下多于2％，特別優(yōu)選情況下多于3％，以及非常特別優(yōu)選情況下多于4％的DPA。
5.權利要求1或2的方法，其中向培養(yǎng)基中加入3g/L到15g/L，優(yōu)選情況下4g/L到12g/L，特別優(yōu)選情況下5g/L到10g/L，以及非常特別優(yōu)選情況下7.5±0.5g/L的CaCO3。
6.權利要求1到5的方法，其特征為培養(yǎng)基含有葡萄糖、玉米漿、氯化鎂、氯化鈣、碳酸鈣、硫酸鈉、硫酸銨和磷酸氫鉀。
7.前述權利要求任何一個的方法，其特征為培養(yǎng)基的pH值在3到10之間，優(yōu)選情況下在5到7之間。
8.前述權利要求任何一個的方法，其特征為培養(yǎng)發(fā)生在10℃到40℃之間，優(yōu)選情況下在25℃到35℃之間。
9.前述權利要求任何一個的方法，其特征為培養(yǎng)進行1到10天，優(yōu)選情況下進行3到9天。
10.前述權利要求任何一個的方法，其特征為微生物屬于裂壺菌(Schizochytrium)、破囊壺菌(Thraustochytrium)或Ulkenia屬。
11.前述權利要求任何一個的方法，其特征為微生物是Ulkenia sp.SAM 2179。
12.前述權利要求任何一個的方法，其特征為微生物是Schizochytrium sp.SR 21。
13.只含有CaCO3作為pH穩(wěn)定方式的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)Thraustochytriales目的微生物。
14.含有至少20％面積比的DHA，優(yōu)選情況下至少30％面積比的DHA，以及特別優(yōu)選情況下至少40％面積比的DHA的油，其使用權利要求1到12任何一個的方法生產，并隨后從培養(yǎng)液和/或其中獲得的生物質中分離油。
15.含有至少3％面積比的DPA，優(yōu)選情況下至少6％面積比的DPA，以及特別優(yōu)選情況下至少9％面積比的DPA的油，其使用權利要求1到12任何一個的方法生產，并隨后從培養(yǎng)液和/或其中獲得的生物質中分離油。
16.純度至少為90％的DHA，其使用權利要求1到12任何一個的方法生產，并隨后從培養(yǎng)液和/或其中獲得的生物質中分離DHA。
17.純度至少為90％的DPA，其使用權利要求1到12任何一個的方法生產，并隨后從培養(yǎng)液和/或其中獲得的生物質中分離DPA。
18.通過權利要求1到12任何一個的方法生產，并隨后從培養(yǎng)液中分離的生物質。
19.含有權利要求18的生物質的動物飼料。
20.含有權利要求18的生物質的人類營養(yǎng)食品。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)屬于原生藻菌(Stramenopiles)的微生物來生產PUFAs的最適化方法，培養(yǎng)在使用碳酸鈣穩(wěn)定pH的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行，該培養(yǎng)基含有3－15g/L CaCO
文檔編號C12N1/14GK1914327SQ200480035830
公開日2007年2月14日 申請日期2004年11月10日 優(yōu)先權日2003年11月10日
發(fā)明者馬爾庫什·盧伊, 馬西亞斯·魯辛 申請人:努特諾瓦營養(yǎng)產品及食品成分有限公司