專利名稱：成纖維細胞生長因子的21突變蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對具有改良的藥學(xué)特性的成纖維細胞生長因子21新突變蛋白的鑒定。
背景技術(shù)：
成纖維細胞生長因子21是在發(fā)育及成熟組織中廣泛表達的大型多肽(Baird等，Cancer Cells，3239-243，1991)，在包括血管生成、有絲分裂、圖式形成、細胞分化、代謝調(diào)節(jié)及組織創(chuàng)傷修復(fù)等多重生理功能中具有重要作用(McKeehan等，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.59135-176，1998)。根據(jù)已發(fā)表文獻，F(xiàn)GF家族目前包括至少二十三個成員，F(xiàn)GF-1到FGF-23(Reuss等，Cell Tissue Res.313139-157(2003))。
據(jù)報道，成纖維細胞生長因子21(FGF-21)優(yōu)選表達于肝臟(Nishimura等，Biochimica et Biophysica Acta，1492203-206，(2000)；WO01/36640和WO01/18172)，可作為缺血性血管疾病、創(chuàng)傷愈合、與肺、支氣管或肺泡功能損失相關(guān)疾病及很多其他不適的治療手段。最近證實FGF-21能夠促進小鼠3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖攝取(不論胰島素存在與否)，并可以劑量依賴性的方式降ob/ob/ob和db/db小鼠以及8周大ZDF大鼠餐后及空腹時血中的葡萄糖、甘油三酯及糖原水平，因而提供了FGF-21用于治療糖尿病和肥胖癥(WO03/011213)的基礎(chǔ)。此外，已證實FGF-21能夠有效降低重癥病人的死亡率和發(fā)病率(WO03/059270)。
研制諸如FGF-21的蛋白質(zhì)藥物制劑的巨大挑戰(zhàn)是處理其物理及化學(xué)不穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的組成多樣性和特性決定了其特定行為，如折疊、構(gòu)象穩(wěn)定性及解折疊/變性。在研發(fā)利用水性蛋白質(zhì)溶液的藥物制劑條件時，必須針對這些特性來穩(wěn)定蛋白質(zhì)(Wang，W.，Int.J.of Pharmaceutics，18，(1999)。
具體而言，在藥用蛋白質(zhì)研制中，如苯酚、m-甲酚、甲基對苯甲酸、間苯二酚及苯甲醇之類的抗微生物防腐劑是旨在成為無菌、多用途制劑的腸胃外藥物制劑所必需的。遺憾的是，這些化合物常會對蛋白質(zhì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響，會引發(fā)其交聯(lián)和聚集(Maa等，Int.J.of Pharmaceutics140155-168(1996)；Lam等，Pharm.Res.14(6)725-729(1997))。
FGF-21很可能作為多用途無菌藥物制劑使用。然而，已經(jīng)明確防腐劑(即m-甲酚)在這些條件下對其穩(wěn)定性有不良影響。顯然需要研制出治療用FGF-21蛋白的穩(wěn)定水性蛋白質(zhì)制劑。本發(fā)明的FGF-21突變蛋白在藥物制劑條件下比野生型FGF-21更穩(wěn)定，從而克服了其物理不穩(wěn)定性的巨大障礙。因此，本發(fā)明的FGF-21突變蛋白提供了可用于治療2型糖尿病、肥胖癥、代謝綜合征以及降低重癥病人的死亡率和發(fā)病率的穩(wěn)定藥用蛋白質(zhì)制劑。
發(fā)明概述首先，本發(fā)明提供人成纖維細胞生長因子21的突變蛋白或其生物活性肽，包括用帶電荷的和/或極性但不帶電荷的氨基酸替換以下一個或多個氨基酸甘氨酸42、谷胺酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷胺酰胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170或絲氨酸172，其中氨基酸編號依據(jù)SEQ ID NO1。
其次，本發(fā)明提供人成纖維細胞生長因子21的突變蛋白或其生物活性肽，包括用半胱氨酸替換以下兩個或多個氨基酸精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷胺酰胺27、谷胺酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷胺酰胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷胺酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬酰胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139，其中氨基酸編號依據(jù)SEQ IDNO1。
第三，本發(fā)明提供人FGF-21的突變蛋白或其生物活性肽，包括用任何帶電荷的和/或極性但不帶電荷的氨基酸替換任一個本發(fā)明第一個實施方案中指出的氨基酸位置，同時用半胱氨酸替換本發(fā)明第二個實施方案中指出的兩個或多個氨基酸位置。
其他實施方案涉及編碼第一、第二及第三實施方案中突變蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的載體以及攜帶所述載體的宿主細胞。另一個實施方案涉及生產(chǎn)多肽、生產(chǎn)能夠產(chǎn)生所述多肽的細胞以及生產(chǎn)含有編碼所述多肽DNA的載體的方法。
此外，另一實施方案則涉及治療具有肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖癥或代謝綜合征中一項或多項表現(xiàn)的病人的方法，包括對所述需要該類治療的病人施用治療有效量的實施方案一、二或三中的人FGF-21突變蛋白或其藥物組合物。
發(fā)明詳述為說明此處公開及要求權(quán)利的本發(fā)明，定義下列術(shù)語如下“FGF-21”為包括27個氨基酸前導(dǎo)序列的長為208個氨基酸的多肽。人FGF-21與小鼠FGF-21具有～79％的氨基酸同一性，與大鼠FGF-21具有～80％的氨基酸同一性。人FGF-21為本發(fā)明突變蛋白優(yōu)選的多肽模板，但可以理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易地在另一種哺乳動物的FGF-21多肽序列基礎(chǔ)上制備突變蛋白。根據(jù)下示181個氨基酸的成熟人FGF-21多肽(SEQ ID NO1)，確定本發(fā)明中突變蛋白的氨基酸位置1 10 20His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr30 40Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr50 60Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro70 80Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly90 100Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu110 120Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly130 140Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro150 160Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val170 180Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr AlaSer編碼該181氨基酸的成熟人FGF-21多肽的相應(yīng)DNA序列為(SEQ IDNO2)CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAA
TGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACTCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCC蛋白質(zhì)表達領(lǐng)域的技術(shù)人員會意識到可以將甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列引入該成熟序列(SEQ ID NO1)的N-末端，以便在大腸桿菌E.coli中表達，這也為本發(fā)明所設(shè)想。
可以利用三字母密碼子定義氨基酸或者利用標(biāo)準(zhǔn)的一字母密碼子定義。利用三字母密碼子表示原氨基酸，加上該氨基酸編號，再加上替換氨基酸的三字母密碼子來表示突變。每一突變蛋白的編碼數(shù)字是基于成熟野生型人FGF-21的181氨基酸序列而定。例如，用帶負電荷氨基酸谷氨酸(Glu)替換139位的亮氨酸(即Leu139)，表示為Leu139Glu或L139E。與之相似，用帶負電荷氨基酸谷氨酸(Glu)對152位的異亮氨酸和163位的絲氨酸(Ile152，Ser163)進行雙重替換，表示為Ile152Glu/Ser163Glu、I152E/S163E或I152E-S163E。
人FGF-21突變蛋白指其含有人FGF-21，其中至少一個野生型成熟蛋白的氨基酸被另一個氨基酸所替換。一般而言，突變蛋白具有某些野生型蛋白結(jié)構(gòu)或功能上的性質(zhì)改良。例如突變蛋白在濃縮溶液中的物理穩(wěn)定性可能得到增強或改善(例如，更少發(fā)生疏水介導(dǎo)的聚集)，同時還保留其有利的生物活性特點。突變蛋白與藥物防腐劑(如m-甲酚、苯酚、苯乙醇)的相容性可能有所提高，因而能夠制備可在保存期間維持該蛋白生理化學(xué)特性及生物學(xué)活性的保存型藥物制劑。因此，與野生型FGF-21相比藥物穩(wěn)定性增加的突變蛋白，在生理及保存型藥物制劑條件下的濃縮溶液中的物理穩(wěn)定性均有所改善，同時還保持其生物學(xué)效力。此處所用的這些術(shù)語并無限制性，某一給定突變蛋白完全有可能具有一種或多種野生型蛋白質(zhì)的改良特性。
“生物活性肽”是指保持本發(fā)明突變蛋白改良特性和生物學(xué)效力的本發(fā)明突變蛋白肽。
“治療有效量”為對病人產(chǎn)生治療益處所需的活性劑的最小劑量。例如，對于表現(xiàn)患有或易感2型糖尿病、肥胖癥或代謝綜合征的患者或為預(yù)防其發(fā)病的病人而言，“治療有效量”是指能夠誘導(dǎo)、改進或者造成與上述紊亂相關(guān)或因與之對抗所致的病理癥狀、疾病進展、生理情況改善的劑量。本發(fā)明中“個體”或“病人”優(yōu)選為人，但也可為動物，更具體而言為同伴動物(如狗、貓等)、農(nóng)場動物(如牛、羊、豬、馬等)以及實驗室動物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
“2型糖尿病”的特征在于胰島素存在時仍有過量葡萄糖生成；由于葡萄糖清除不足，循環(huán)中的葡萄糖水平過高。
“葡萄糖不耐受”可定義為對葡萄糖的異常敏感性。
“高血糖癥”是指血中糖(葡萄糖)過量。
“低血糖癥”也稱為低血糖，發(fā)生于血中葡萄糖水平過低而無法提供機體活動所需的足夠能量時。
“高胰島素血癥”是指血中胰島素水平高于正常。
“胰島素抵抗”是指正常量胰島素產(chǎn)生低于正常的生物學(xué)反應(yīng)的狀態(tài)。
“肥胖癥”，對于人個體而言是指體重超過給定人群理想體重的20％(R.H.Williams，Textbook of Endocrinology，1974，904-916頁)。
“代謝綜合征”是指具有以下至少三種癥狀的癥候群腹部脂肪——對于大多數(shù)男性為腰圍40英寸或以上；高血糖——空腹至少為110毫克每分升(mg/dl)；高甘油三酯——血中含量至少150mg/dl；低高密度脂蛋白(HDL)——低于40mg/dl；以及血壓為130/85或更高。
本發(fā)明中的重癥病人一般都處于不穩(wěn)定的高代謝狀態(tài)。該不穩(wěn)定代謝狀態(tài)是由底物代謝改變所致，而這一改變可能會導(dǎo)致某些營養(yǎng)素的相對不足。一般而言脂肪和肌肉的氧化都有所增加。
此外，重癥病人優(yōu)選為那些全身炎癥反應(yīng)綜合征或呼吸窘迫的病人。發(fā)病率的降低是指降低了重癥病人發(fā)生其他疾病、狀況或癥狀的可能性，或降低了發(fā)生其他疾病、狀況或癥狀的嚴重度。例如降低發(fā)病率可能指降低菌血癥或敗血癥或多器官衰竭相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率。
此處所用的“全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)”描述了與大量臨床狀況相關(guān)的炎癥過程，包括(但不僅限于)出現(xiàn)以下一項以上的臨床表現(xiàn)(1)體溫高于38℃或低于36℃；(2)心率大于每分鐘90次；(3)呼吸急促(表現(xiàn)為呼吸速率大于每分鐘20次)，或通氣過度(表現(xiàn)為PaCO2小于32mmHg)；以及(4)血白細胞計數(shù)改變，如計數(shù)大于12,000/cu mm、計數(shù)小于4,000/cu mm，或出現(xiàn)多于10％的未成熟中性粒細胞。當(dāng)沒有其他已知原因(如化療、誘導(dǎo)產(chǎn)生的中性粒細胞缺乏癥及白細胞缺乏癥)可解釋這些異常時，這些生理性改變反映了基線水平上的急性改變。
此處所用的“敗血癥”定義為感染引發(fā)的SIRS。SIRS的非感染性病因可以包括胰腺炎、缺血、多重創(chuàng)傷和組織損傷(即重度損傷或嚴重?zé)齻?、出血性休克、免疫介導(dǎo)的器官損傷以及外源性施用此類炎癥過程的公認介質(zhì)，如腫瘤壞死因子及其他細胞因子。
敗血癥性休克以及多器官功能障礙是ICU科室(ICU setting)發(fā)病率和死亡率的主要成因。敗血癥與很多宿主防御機制的活化相關(guān)并由之介導(dǎo)，這些機制包括細胞因子網(wǎng)絡(luò)、白細胞和補體級聯(lián)反應(yīng)，以及包括內(nèi)皮在內(nèi)的凝血/纖溶系統(tǒng)。與多種器官微血管系統(tǒng)的內(nèi)纖維蛋白沉積相關(guān)的彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)及其他程度的消耗性凝血病是敗血癥/敗血癥性休克的表現(xiàn)。宿主防御反應(yīng)對靶器官的下游作用是多器官功能障礙綜合征(MODS)發(fā)展的重要中介，也是敗血癥、嚴重敗血癥及并發(fā)休克的敗血癥病人預(yù)后差的原因之一。
此處所用的“呼吸窘迫”是指病人由于某種類型的肺功能障礙出現(xiàn)呼吸困難的情形。通常這些病人會表現(xiàn)出程度不等的低氧血癥，補充氧治療可能有效也可能無效。
呼吸窘迫可能發(fā)生于因直接肺損傷導(dǎo)致肺功能受損的病人，也可能由于間接肺損傷(如在全身疾病過程中)而發(fā)生。此外，多重易患(predisposing)疾病的存在極大地增加了發(fā)病風(fēng)險；如長期酗酒、慢性肺疾病及低血清pH值之類的次級因素的存在也是如此。
直接肺損傷的一些原因包括肺炎、胃內(nèi)容物吸入、肺挫傷、脂肪栓塞、近乎溺死、吸入性損傷、高海拔以及肺移植或肺栓子切除術(shù)后再灌注性肺水腫。間接肺損傷的一些原因包括敗血癥、伴休克及多次輸血的嚴重創(chuàng)傷、心肺分流術(shù)、藥物過量、急性胰腺炎以及血制品輸注。
有一類引發(fā)呼吸窘迫的肺疾病與所謂的肺原性心臟病(Cor Pulmonale)綜合征相關(guān)。該類疾病伴有慢性低氧血癥，導(dǎo)致稱為肺動脈高血壓的肺循環(huán)壓力升高。產(chǎn)生的肺動脈高血壓增加了右心室的工作負荷，從而導(dǎo)致其擴張或肥厚。肺原性心臟病通常表現(xiàn)為右心衰竭，定義為右心室壓力的持續(xù)增高以及靜脈回右心血量減少的臨床表現(xiàn)。
“慢性阻塞性肺疾病”(COPD)，包括肺氣腫和慢性支氣管炎，也會引起呼吸窘迫，其特征在于氣流阻塞。COPD為第四位死因，每年造成超過100,000人死亡。
“急性呼吸窘迫綜合征”(ARDS)常為漸進性的，其特征在于具有明確的分期。該綜合征通常表現(xiàn)為具有該狀況危險因素的病人中迅速發(fā)作的呼吸衰竭，以補充氧治療難以糾正的動脈低氧血癥為特征。在肺重力低垂區(qū)(dependent lung zone)可能存在肺泡充盈、實變及肺不張；然而非低垂區(qū)也可能有廣泛的炎癥。該綜合征可能發(fā)展為纖維化肺泡炎，伴有持續(xù)低氧血癥、肺泡通氣死腔增加以及肺順應(yīng)性的進一步下降。也可能出現(xiàn)對肺毛細血管床造成損害的肺動脈高血壓。
本發(fā)明第一優(yōu)選的方面包括人FGF-21突變蛋白，其中替換是指用任何帶電荷的和/或極性但不帶電荷的氨基酸取代至少一個以下氨基酸甘氨酸42、谷胺酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷胺酰胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170或絲氨酸172，其中氨基酸編號依據(jù)SEQ ID NO1。帶電荷氨基酸是指攜帶正電荷或負電荷的氨基酸。帶正電荷的氨基酸包括組氨酸、賴氨酸、精氨酸及它們非天然存在的類似物(例如γ氨基丁酸、鳥氨酸等)。帶負電荷氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸及它們非天然存在的類似物(例如氨基己二酸)。極性但不帶電荷的氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺及它們非天然存在的類似物。實施方案一中最優(yōu)選的突變蛋白為Gln54Glu、Leu139Glu、Ala145Glu、Leu146Glu、Ile152Glu、Gln156Glu、Ser163Glu及Ile152Glu-Ser163Glu。
本發(fā)明其次提供人FGF-21的突變蛋白或其生物活性肽，包括用半胱氨酸替換以下兩個或多個氨基酸精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷胺酰胺27、谷胺酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷胺酰胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷胺酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、；脯氨酸119、天冬酰胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139，其中氨基酸編號依據(jù)SEQ ID NO1。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也會認識到天然半胱氨酸(半胱氨酸75和半胱氨酸93)也可用作引入可能改善性質(zhì)的新二硫鍵的位點。特別設(shè)想在絲氨酸85或苯丙氨酸73分別引入半胱氨酸替換，伴隨改變半胱氨酸93或半胱氨酸75，其中后兩個位點可用任意其他氨基酸取代。
天然二硫鍵(如半胱氨酸殘基所提供)一般能夠提高蛋白質(zhì)的熱力學(xué)穩(wěn)定性。T4溶酶體酶(Matsumura等，PNAS 866562-6566(1989))和芽孢桿菌RNA酶(Johnson等，J.Mol.Biol.268198-208(1997))的多重二硫鍵突變體是熱力學(xué)穩(wěn)定性提高(以熔解溫度升高衡量)的成功實例。本發(fā)明的一個方面認為通過二硫鍵限制FGF-21的118-134氨基酸環(huán)靈活性能夠增加FGF-21在防腐劑中的物理穩(wěn)定性，推想這可能是由于限制防腐劑進入該蛋白質(zhì)的疏水核心所致。
含有除Cys75-Cys93處天然存在的二硫鍵之外的人工二硫鍵的FGF-21突變蛋白如下Gln76Cys-Ser109Cys、Cys75-Ser85Cys、Cys75-Ala92Cys、Phe73Cys-Cys93、Ser123Cys-His125-Cys、Asp102Cys-Tyr104Cys、Asp127Cys-Gly132Cys、Ser94Cys-Glu110Cys、Pro115Cys-His117Cys、Asn121Cys-Asp127Cys、Leu100Cys-Asp102Cys、Phe95Cys-Tyr107Cys、Arg19Cys-Pro138Cys、Tyr20Cys-Leu139Cys、Tyr22Cys-Leu137Cys、Arg77Cys-Asp79Cys、Pro90Cys-Ala92Cys、Glu50Cys-Lys69Cys、Thr23Cys-Asp25Cys、Ala31Cys-Gly43Cys、Gln28Cys-Gly43Cys、Thr23Cys-Gln28Cys、Val41Cys-Leu82Cys、Leu58Cys-Val62Cys、Gln54Cys-Leu66Cys、Ile35Cys-Gly67Cys、Gly67Cys-Arg72Cys、Ile35Cys-Gly84Cys、Arg72Cys-Gly84Cys或Arg77Cys-Ala81Cys，其中氨基酸編號依據(jù)SEQ ID NO1。優(yōu)選含以下人工二硫鍵的突變蛋白Tyr22Cys-Leu139Cys、Asp24Cys-Arg135Cys、Leu118Cys-Gly132Cys、His117Cys-Pro130Cys、His117Cys-Ala129Cys、Leu82Cys-Pro119Cys、Gly80Cys-Ala129Cys、Gly43Cys-Pro124Cys、Gly42Cys-Arg126Cys、Gly42Cys-Pro124Cys、Gln28Cys-Pro124Cys、Gln27Cys-Ser123Cys、Ala26Cys-Lys122Cys或Asp25Cys-Lys122Cys。最優(yōu)選含導(dǎo)入二硫鍵的突變蛋白為Leu118Cys-Ala134Cys、Leu21Cys-Leu33Cys、Ala26Cys-Lys122Cys、Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys。
本發(fā)明的第三方面提供了人FGF-21突變蛋白或其生物活性肽，包括用任何帶電荷的和/或極性但不帶電荷的氨基酸替換任一個本發(fā)明第一個實施方案中指出的氨基酸位置，同時用半胱氨酸替換本發(fā)明第二個實施方案中指出的兩個或多個氨基酸位置。
本領(lǐng)域眾所周知在研制蛋白質(zhì)藥物的中一大挑戰(zhàn)在于對付蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)不穩(wěn)定性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)藥物制劑用作多用途的可注射制劑而需要穩(wěn)定、濃縮及防腐的溶液，同時還保持其有利生物活性特征時，這一挑戰(zhàn)更為突顯。野生型FGF-21詳細的生物物理學(xué)特征決定了當(dāng)濃縮的蛋白質(zhì)溶液(＞5mg/ml)處于應(yīng)激條件下(如高溫或低pH)時會加速其交聯(lián)和聚集(即較差的物理穩(wěn)定性和生物制藥學(xué)特性)。FGF-21濃縮蛋白質(zhì)溶液暴露于藥物防腐劑(如m-甲酚)也會對其物理穩(wěn)定性產(chǎn)生負面影響。
因此，本發(fā)明的一個實施方案是在生理及儲存制劑條件下保持化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)效力的同時，增加濃縮溶液的物理穩(wěn)定性。據(jù)認為交聯(lián)和聚集可能是疏水相互作用所致，因為在給定的蛋白質(zhì)濃度下，溫度及離子強度對物理穩(wěn)定性具有相當(dāng)?shù)挠绊憽４蟛糠智闆r下，目標(biāo)定位于非保守的、推定存在于表面的氨基酸殘基。分析這些殘基的局部環(huán)境，并選擇誘變那些被認為不具結(jié)構(gòu)重要性的殘基。引發(fā)具體變化的方法之一是通過引入谷氨酸殘基(“谷氨酸掃描”)進一步降低蛋白質(zhì)的pI。有假說認為帶電荷替換氨基酸的引入會通過電荷-電荷相斥抑制疏水介導(dǎo)的聚集，并能改善防腐劑相容性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也會認識到，通過足夠程度的誘變引入正電荷、伴隨或不伴隨負電荷的同時減少，可以將pI遷移至基本pH范圍內(nèi)，從而使能夠產(chǎn)生電荷-電荷排斥。
盡管本發(fā)明的實施方案涉及在生理及儲存藥物制劑條件下的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，保持該突變蛋白相對于野生型FGF-21的生物學(xué)效力也是考慮的重要因素。因此，本發(fā)明突變蛋白的生物學(xué)效力是指突變蛋白影響葡萄糖攝取(如體外3T3-L1細胞測定(實施例4)所測量)，和/或降低血漿葡萄糖水平以及血漿甘油三酯(如ob/ob小鼠測定(實施例5)所測量)的能力。
根據(jù)本發(fā)明施用的FGF-21突變蛋白可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法產(chǎn)生和/或分離。最優(yōu)選產(chǎn)生該突變蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組DNA方法。此類方法描述于《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons，Inc.)，其在此處引用作為參考。
此外，優(yōu)選實施方案包括此處所述突變蛋白來源的生物活性肽。該肽含有至少一個前述替換，且該突變蛋白具有生物學(xué)活性。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何及所有方法產(chǎn)生該肽，其實例包括但不僅限于酶消化、化學(xué)合成或重組DNA方法。
本領(lǐng)域已經(jīng)明確某些成纖維細胞生長因子的肽段具有生物學(xué)活性。見例如Baird等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)852324-2328(1988)以及J.Cell.Phys.Suppl.5101-106(1987)。因此，根據(jù)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)選擇突變蛋白的片斷或肽。例如，已知二肽基肽酶IV(DPP-IV)為滅活神經(jīng)肽、內(nèi)分泌肽及細胞因子所涉及的絲氨酸型蛋白酶(Damme等.Chem.Immunol.7242-56，(1999))。FGF-21的N末端(HisProIlePro)含有是DPP-IV潛在底物的兩個二肽，可產(chǎn)生從N-末端截去4個氨基酸的FGF-21片斷。出人意料的是，已經(jīng)證實野生型FGF-21的該片斷保留有其生物活性(表1)，因此，從N-末端截去本發(fā)明突變蛋白的至多4個氨基酸，是本發(fā)明的實施方案之一。
本發(fā)明也包括RNA形式或DNA形式的編碼上述突變蛋白的多核苷酸，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成DNA。DNA可以為雙鏈或單鏈。編碼本發(fā)明突變蛋白的編碼序列可由于冗余或遺傳密碼的簡并而有所不同。
編碼本發(fā)明突變蛋白的多核苷酸可包括以下僅該突變蛋白的編碼序列、突變蛋白編碼序列及額外的編碼序列(如功能多肽，或前導(dǎo)或分泌序列或前蛋白質(zhì)序列)；突變蛋白的編碼序列及非編碼序列(如內(nèi)含子，或突變蛋白編碼序列5’和/或3’端的非編碼序列)。因此術(shù)語“編碼突變蛋白的多核苷酸”所指的多核苷酸可能不僅含有突變蛋白的編碼序列，還含有包括額外編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及編碼含上述替換的多肽的片斷、類似物及衍生物的所述多核苷酸變體。多核苷酸變體可能為天然存在的人FGF-21序列等位基因變體、非天然存在的變體，或如上所述的截短變體。因此，本發(fā)明也包括編碼上述突變蛋白的多核苷酸，還包括該多核苷酸的變體，所述變體編碼公開突變蛋白的片斷、衍生物或類似物。這類核苷酸變體包括缺失變體、替換變體、截短變體以及添加或插入變體，只要其中存在至少一個實施方案一或二中指出的氨基酸替換。
將本發(fā)明的多核苷酸與表達控制序列進行有效連接(即定位可確保其功能)后，于宿主中表達。這些表達載體通?？梢愿郊芋w或宿主染色體DNA整合部分的形式在宿主生物中進行復(fù)制。一般而言，表達載體含有選擇標(biāo)記(如四環(huán)素、新霉素及二氫葉酸還原酶)以允許檢測被目的DNA序列轉(zhuǎn)化的細胞。在適當(dāng)?shù)膯幼涌刂葡拢現(xiàn)GF-21突變蛋白可以在哺乳動物細胞、昆蟲、酵母、細菌或其他細胞中表達。也可利用本發(fā)明DNA構(gòu)建體衍生的RNA、通過無細胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)。
大腸桿菌為原核宿主，尤其適用于克隆本發(fā)明的多核苷酸。其他適用的微生物宿主包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)以及沙雷氏菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的多個種，但也可以選擇使用其他宿主。也可以在這些原核宿主中制備表達載體，其中通常含有與宿主細胞相容的表達控制序列(如復(fù)制起點)。此外，還可能具有眾多公知啟動子中的任一種，如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)或噬菌體λ或T7來源的啟動子系統(tǒng)。通常這些啟動子會控制表達(可選通過操縱子序列)，且具有核糖體結(jié)合位點序列等，以便起始和完成轉(zhuǎn)錄及翻譯。
蛋白表達領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到可以將甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列引入該成熟序列(SEQ ID NO1)的N-末端，以便在大腸桿菌E.coli中表達，且這也是本發(fā)明所考慮的。因此除非另有說明，在大腸桿菌中表達的本發(fā)明突變蛋白N-末端引入了甲硫氨酸序列。
如酵母或真菌等的其他微生物也可用于表達。優(yōu)選的酵母宿主實例為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)以及嗜甲醇畢赤酵母(Pichiaangusta)，同時需要合適的具有表達控制序列的載體，所述序列如啟動子(包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶)，以及復(fù)制起點、終止序列等所需序列。真菌宿主的實例為黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)及裂褶菌(Schizophyllum commune)，但也可選擇使用其他真菌。
哺乳動物組織細胞培養(yǎng)也可用于表達和產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。實際上優(yōu)選真核細胞，因為本領(lǐng)域已經(jīng)研制出一些能夠分泌完整突變蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、多種COS細胞系、NS0細胞、敘利亞地鼠(Syrian Hamster)卵巢細胞系、HeLa細胞或人胎腎細胞系(即HEK293、HEK293EBNA)。
這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如復(fù)制起點、啟動子、增強子以及必要的加工信息位點(如核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止序列)。優(yōu)選的表達控制序列為SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒、Raus肉瘤病毒等來源的啟動子。優(yōu)選的聚腺苷酸化位點包括SV40及牛生長激素來源的序列。
可以通過公知的方法將含有目的多核苷酸序列(如FGF-21突變蛋白以及表達控制序列)的載體轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)，所采用的方法取決于細胞宿主的類型。例如，對原核細胞通常采用氯化鈣轉(zhuǎn)染法，而對于其他細胞宿主可以使用磷酸鈣處理或電穿孔法。
可以使用多種蛋白質(zhì)純化方法，此類方法為本領(lǐng)域公知且其描述見如Deutscher，Methods in Enzymology 18283-9(1990)及Scopes，《ProteinPurificationPrinciples and Practice》，Springer-Verlag，NY(1982)。選用的純化步驟取決于如生產(chǎn)FGF-21突變蛋白所用方法的性質(zhì)。
含F(xiàn)GF-21突變蛋白的組合物應(yīng)當(dāng)根據(jù)有效醫(yī)療實踐的需要，考慮病人的臨床情況、FGF-21突變蛋白組合物的遞送位點、施用方法、施用時間安排以及操作者已知的其他因素，來制成劑型并確定劑量。因此，用于此處目的的FGF-21突變蛋白“治療有效量”取決于上述考慮。
可以通過能達到一般目的(即治療2型糖尿病、肥胖癥、代謝綜合征或重癥病人)的任何方法施用本發(fā)明的FGF-21突變蛋白藥物組合物。此處所用的術(shù)語“腸胃外”是指包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下及關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注在內(nèi)的施用模式。施用的劑量則取決于年齡、健康狀況及受者的體重、目前接受的治療(如果有)、治療頻率以及所期望的效果。本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物包括所有組合物，其中含有能有效達到所需醫(yī)療效果的劑量的FGF-21突變蛋白，所述醫(yī)療效果包括治療2型糖尿病、肥胖癥或代謝綜合征。雖然病人間的個體需求可能存在差異，普通臨床醫(yī)師仍然能夠確定所有成分治療有效量的最佳范圍。
本發(fā)明的FGF-21突變蛋白可以根據(jù)已知方法配制以制備可藥用組合物。理想的制劑應(yīng)當(dāng)為能夠通過適當(dāng)稀釋劑復(fù)原的穩(wěn)定凍干產(chǎn)品，或為可選含有可藥用載體、防腐劑、賦形劑或穩(wěn)定劑的高純度液體溶液[Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版(1980)]。本發(fā)明的突變蛋白可以與可藥用緩沖液組合，并調(diào)整其pH以提供一定的穩(wěn)定性以及可施用的pH值。
在一個實施方案中，一般將一種或多種FGF-21突變蛋白按所需純度與可藥用載體(即在使用劑量和濃度內(nèi)對受者無毒并與制劑其他成分相容的載體)混合為單位注射劑型(溶液、懸浮液或乳濁液)來制備為腸胃外施用的FGF-21突變蛋白?？蓛?yōu)選添加一種或多種可藥用的抗微生物劑。苯酚、m-甲酚及苯甲醇為優(yōu)選的可藥用抗微生物劑。
可選加入一種或多種可藥用鹽來調(diào)節(jié)離子強度或張力?？杉尤胍环N或多種賦形劑進一步調(diào)節(jié)制劑的等張性。甘油、氯化鈉及甘露醇為等張調(diào)節(jié)賦形劑的實例。
本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)良好的醫(yī)療實踐及病人個體的臨床情況，能夠很容易地最優(yōu)化含有FGF-21突變蛋白的治療組合物的治療有效量及其施用方案。本發(fā)明FGF-21突變蛋白的一般成人劑量范圍為每天約0.01mg至每天約1000mg不等。優(yōu)選的劑量范圍為每天約0.1mg至每天約100mg，更優(yōu)選為約1.0mg/天至約10mg/天。最優(yōu)選的劑量為約1-5mg/天。施用合適劑量的FGF-21突變蛋白能夠降低血中葡萄糖水平，并通過更快更有效地利用葡萄糖增加能量消耗，因此可以用于治療2型糖尿病、肥胖癥和代謝綜合征。
此外，由于在營養(yǎng)支持的重癥病人中常見高血糖癥和胰島素抵抗，一些ICU施用胰島素以治療進食重癥病人的過度高血糖。實際上，最近的研究證明無論病人是否有糖尿病史，使用外源性胰島素保持血糖水平不高于110mg/dl都能夠降低外科重癥監(jiān)護病房重癥病人的發(fā)病率和死亡率(Vanden Berghe等.N Engl J Med.，345(19)1359，(2001))。因此，本發(fā)明的FGF-21突變蛋白獨特地適用于協(xié)助代謝不穩(wěn)定的重癥病人恢復(fù)代謝穩(wěn)定性。FGF-21突變蛋白的獨特之處在于它們刺激葡萄糖攝取并增加胰島素敏感性，但不會誘導(dǎo)低血糖。
本發(fā)明另一方面設(shè)想提供作為藥物用于治療2型糖尿病、肥胖癥、代謝綜合征或重癥病人的FGF-21突變蛋白。
至此已對本發(fā)明進行了詳細描述，參照以下實例能夠?qū)χ懈宄睦斫?，所述實例僅為說明目的而并不旨在對本發(fā)明進行限制。
引用的所有專利及出版物均在此處明確引用作為參考。
實施例1在大腸桿菌中表達和純化FGF-21突變蛋白本實施例使用細菌表達載體pET30a進行細菌表達(Novagen，Inc.，Madison，Wisconsin)。pET30a編碼卡那霉素抗生素抗性基因，含有細菌復(fù)制起點(“ori”)、強T7噬菌體-IPTG誘導(dǎo)啟動子、核糖體結(jié)合位點(“RBS”)以及帶有多個特異限制性內(nèi)切酶裂解位點的合適MCS。為便于純化，該載體可編碼用于N-末端肽融合的His-及S-標(biāo)簽，以及C-末端His-標(biāo)簽融合。然而，為達本發(fā)明的目的，將編碼FGF-21變體的cDNA分別插入限制性位點NdeI和BamHI之間，所產(chǎn)生的構(gòu)建體不使用任何上述標(biāo)簽。
利用PCR寡核苷酸引物(退火為開放閱讀框的5’和3’末端)，從cDNA克隆中擴增編碼FGF-21突變蛋白的核酸序列，所述序列缺少前導(dǎo)序列但以甲硫氨酸殘基替代之。將含有限制性酶NdeI和BamHI識別位點的額外核苷酸分別添加到該5’和3’序列中。
根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，所述5’正向及3’反向PCR引物含有與FGF-21突變蛋白編碼核酸編碼序列的一部分對應(yīng)或互補的核苷酸，以進行克隆。本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員會理解多核苷酸序列中引物的起始位點可以有所變化。
用限制性酶NdeI和BamHI消化擴增的核酸片斷和載體pET30a，隨后將純化的消化DNA片斷連接起來。向限制性切割的pET30a載體中引入FGF-21突變蛋白編碼DNA，使包括其相應(yīng)終止密碼子的FGF-21突變蛋白多肽編碼區(qū)位于IPTG-誘導(dǎo)啟動子的下游，并處于以起始密碼子ATG起始的讀碼框內(nèi)。相聯(lián)的終止密碼子TAG阻斷了插入點下游6-組氨酸密碼子的翻譯。
利用如《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons，Inc.)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細胞。
在LB/卡那霉素平板上進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，過夜生長轉(zhuǎn)化體后，挑取轉(zhuǎn)化株以制備質(zhì)?；蛟涣呀庥糜赑CR篩選。通過限制性分析及隨后的DNA序列分析確定含有所需FGF-21變體插入的陽性重組質(zhì)粒。然后使用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達株并生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
使用大腸桿菌株BL21(DE3)、BL21(DE3)STAR或BL21(DE3)RP表達FGF-21突變蛋白。這些菌株僅是許多適于表達FGF-21突變蛋白中的一些，它們可以分別通過商業(yè)渠道自Novagen，Inc.，Invitrogen及Stratagen獲得。利用轉(zhuǎn)化體在含有卡那霉素的LB平板上的生長能力可將其鑒別出來。
使含有所需構(gòu)建體的克隆在含有卡那霉素(30μg/ml)的LB培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)過夜生長(o/n)。利用該o/n培養(yǎng)物接種大型的培養(yǎng)物，稀釋比為約1∶25至1∶250。待這些細胞生長至600nm處光密度為0.6(“OD600”)后，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)使其最終濃度為1mM，以通過失活lacI阻遏物誘導(dǎo)乳糖抑制子敏感性啟動子的轉(zhuǎn)錄。隨后再孵育細胞3至12小時。隨后通過離心收獲細胞，用50mM Tris緩沖液洗滌沉淀，于pH8.0及-20℃下貯存至純化。FGF-21突變蛋白表達進不溶性級分(即大腸桿菌包含體(或顆粒))中。盡管變異株之間的表達水平可能有所差異，一般檢測到的野生型(WT)FGF-21蛋白質(zhì)水平為50mg/L。此后的純化步驟起始于這些顆粒的溶解以及經(jīng)過四個層析步驟后的變體重折疊。
為從大腸桿菌中純化FGF-21突變蛋白，將顆粒溶解于50mM Tris，pH9.0，7M尿素及1mM DTT中，調(diào)節(jié)pH至pH為11.0，室溫下振蕩1小時。隨后使用上述的相同緩沖液將蛋白質(zhì)捕獲于Q-Sepharose柱上，并用線性梯度為0-400mM的NaCl洗脫。在室溫下用10mM DTT處理Q-Sepharose洗脫液2小時以還原所有的二硫鍵。然后將洗脫液稀釋10倍使緩沖液的濃度如下50mM Tris(pH 9.0)、7M尿素、10mM半胱氨酸、1mM DTT，蛋白質(zhì)濃度為約250-500μg/ml。在還原條件下室溫再孵育2小時以獲得游離二硫鍵形式的蛋白質(zhì)后，將洗脫液用20mM甘氨酸(pH 9.0)透析約48小時，以便形成正確的二硫鍵。
在Vydac C18柱上以0.1％TFA/0-50％CH3CN為流動相，使用反相HPLC層析法作為純化的起始步驟。該柱用于濃縮FGF-21或FGF-21突變蛋白，并除去污染的外毒素。
此后的純化步驟是在1X PBS緩沖液(pH7.4)中在Superdex 35/600柱上進行大小排阻層析。在這一步FGF-21突變蛋白純度可達～95％。最后一步涉及在50mM Tris(pH 8.0)中行MonoQ層析，并利用線性梯度為0-300mM的NaCl洗脫，通?？梢援a(chǎn)生純度＞97％的蛋白質(zhì)。
將上述四柱步驟純化方案用于所有FGF-21突變蛋白，并生產(chǎn)穩(wěn)定的制品。
實施例2在HEK293EBNA細胞中表達和純化FGF-21突變蛋白此外，可以在如HEK293EBNA細胞(EdgeBiosystems，Gaiethersburg，MD)的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中生產(chǎn)FGF-21突變蛋白。將FGF-21突變蛋白亞克隆進特有表達載體中，所述載體是商業(yè)可得pEAK10在MCS的NheI和XbaI限制性位點間的改良。將編碼成熟FGF-21的cDNA序列與Igκ前導(dǎo)序列于框內(nèi)融合，以促進目的產(chǎn)物在組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中的分泌。該表達受CMV病毒強啟動子的驅(qū)動。利用如Fugene(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染試劑和適當(dāng)數(shù)量的重組質(zhì)粒，在適當(dāng)?shù)募毎芏认滤矔r轉(zhuǎn)染HEK293EBNA細胞(單層或懸浮培養(yǎng))。在37℃、5％CO2下的無血清培養(yǎng)基中孵育細胞，每天收集，共計5天。一般而言HEK293EBNA懸浮培養(yǎng)的表達水平為～30mg/L。在哺乳動物細胞中表達人FGF-21能夠產(chǎn)生天然的HPIP N-末端序列，即N-末端不具有甲硫氨酸殘基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用DPP-IV(豬腎，SIGMA St Louis)酶解處理HEK293EBNA細胞來源的FGF-21會在N-末端截去4個氨基酸。當(dāng)在小鼠3T3-L1脂肪細胞測定法(見實施例4)中測定時，該FGF-21截短變體刺激葡萄糖攝取的水平與野生型FGF-21相當(dāng)(表1)。
實施例3在酵母中表達和純化FGF-21突變蛋白還可用于生產(chǎn)FGF-21突變蛋白的表達系統(tǒng)為酵母，如巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)或釀酒酵母。商業(yè)可得的系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA)使用具有強AOX1(醇氧化酶)啟動子的載體驅(qū)動重組蛋白的高水平表達，以在巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)FGF-21突變蛋白?；蛘呖衫檬褂肎AP基因(3-磷酸甘油醛脫氫酶)來源啟動子的載體進行高水平的組成型表達。多重拷貝的巴斯德畢赤酵母表達載體可以獲得將多重拷貝目的基因整合入基因組的菌株。增加重組巴斯德畢赤酵母菌株中目的基因的拷貝數(shù)能夠提高蛋白質(zhì)表達水平。另一種酵母表達系統(tǒng)為釀酒酵母。其表達載體含有GAL1基因啟動子和增強子序列。由于其在乳糖誘導(dǎo)時的強大轉(zhuǎn)錄活性，GAL1啟動子是使用最為廣泛的酵母啟動子之一。
分析特征(質(zhì)譜分析)表明在巴斯德畢赤酵母中表達的FGF-21被截短(N-末端去除了多至4個氨基酸[HisProIlePro]，以下稱為des-HPIP)。當(dāng)在小鼠3T3-L1脂肪細胞檢測(見實施例4)中測定時，該FGF-21的截短變體刺激葡萄糖攝取的水平可與野生型FGF-21相當(dāng)(表1)。
實施例4小鼠3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖攝取自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)獲取3T3-L1脂肪細胞。在含有10％富鐵胎牛血清的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基的生長培養(yǎng)基(GM)中培養(yǎng)細胞。細胞達到匯合(標(biāo)記為第0天)兩天后將細胞于含10％胎牛血清、10μg/ml胰島素、1μM地塞米松及0.5μM異丁基甲基黃嘌呤的分化培養(yǎng)基(DM)中暴露48小時，進行標(biāo)準(zhǔn)脂肪細胞分化。此后將細胞保存在含有10％胎牛血清和10μg/ml胰島素的分化后培養(yǎng)基中。
葡萄糖轉(zhuǎn)運測定-通過0.1mM 2-脫氧-D-[14C]葡萄糖積累測定，如下測量己糖攝取利用加熱至37℃且含有0.2％BSA的KRP緩沖液(136mMNaCl、4.7mM KCl、10mM NaPO4、0.9mM CaCl2、0.9mM MgSO4，pH7.4)將12孔平板上的3T3-L1脂肪細胞洗滌兩次，將細胞在含0.2％BSA的Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基中于37℃室內(nèi)空氣中孵育2小時，然后用含0.2％BSA緩沖液的KRP再洗滌兩次，并在不含(僅Me2SO)或含有渥曼青霉素的KRP-0.2％BSA緩沖液中于37℃室內(nèi)空氣中孵育30分鐘。隨后加入胰島素至最終濃度為100nM，計15分鐘，最后4分鐘時測量2-脫氧-D-[14C]葡萄糖的攝取。從所有測量值中扣除存在10μM細胞松弛素B時測得的非特異性攝取。利用Pierce的二辛可寧酸測定來確定蛋白質(zhì)的濃度。每一實驗常規(guī)測定三到四次攝取值。
根據(jù)野生型FGF-21的體外活性對體外效力進行標(biāo)準(zhǔn)化，前者標(biāo)定為1.0并用作陽性對照。表1為本發(fā)明FGF-21突變蛋白的體外效力與野生型FGF-21的比較。如表1所示，相對于野生型，本發(fā)明的突變蛋白不同程度地保留了生物學(xué)效力。
表1

*在N-末端截去4個氨基酸，即des-HPIP**通過DPP-IV在N-末端酶解截去4個氨基酸，即des-HPIP實施例5Ob/ob小鼠模型采用雄性ob/ob小鼠肥胖癥模型的一項研究監(jiān)測了相對于載體組及胰島素對照組，F(xiàn)GF-21治療后的血漿葡萄糖水平和甘油三酯水平。對試驗組的雄性ob/ob小鼠(7周大)進行皮下注射純載體溶液(0.9％NaCl)、或FGF-21突變蛋白(0.125mg/kg)(0.1m1，每日一次)共計7天。于第7天最后一次化合物注射后1小時從鼠尾切口處收集血液，并利用標(biāo)準(zhǔn)方法測定血漿葡萄糖水平。FGF-21突變蛋白相對于載體對照降低血漿葡萄糖水平的能力如表2所示。表2的數(shù)據(jù)顯示了本發(fā)明突變蛋白與載體對照相比降低的血漿葡萄糖水平。FGF-21突變蛋白相對于載體對照降低血漿甘油三酯水平的能力如表3所示。
表2

表3


實施例6FGF-21突變蛋白的藥物穩(wěn)定性在模擬生理及藥物制劑條件下分析本發(fā)明FGF-21突變蛋白的穩(wěn)定性。為了模擬生理條件，在室溫(RT)、目的蛋白質(zhì)濃度10mg/ml、pH7.4的PBS中分析突變蛋白的穩(wěn)定性。如果通過大小排阻和/或反相層析法測得制品蛋白質(zhì)的復(fù)原在室溫下可達到＞90％的復(fù)原率，則PBS中突變蛋白的溶解性/物理穩(wěn)定性是符合要求的。表4和5所示的本發(fā)明突變蛋白滿足這一標(biāo)準(zhǔn)。
期望本發(fā)明突變蛋白的藥物制劑很可以成為為保存型多用制劑，因此，分析其與普通防腐劑間的相容性。為測試制劑相容性，于室溫下向含有約10mg/ml突變蛋白、pH7.4的PBS溶液中加入防腐劑m-甲酚(最終濃度3mg/ml，該濃度在中性pH條件下通常能夠滿足歐洲藥典B的防腐效力標(biāo)準(zhǔn))。通過室溫下進行反相和大小排阻層析法測定層析主峰的蛋白質(zhì)復(fù)原率，以初步評估防腐劑存在時的物理穩(wěn)定性。進一步，以m-甲酚存在2小時后微粒相對于野生型FGF-21的平均直徑來表示通過DLS(動態(tài)光散射法)在37℃測量的聚集程度。較大的平均直徑對應(yīng)于較高程度的蛋白質(zhì)交聯(lián)和/或聚集。本發(fā)明第一和第二實施方案中突變蛋白相對于野生型FGF-21的防腐劑相容性(表示為顆粒的功能性平均直徑)如表4所示。所有的突變蛋白均在大腸桿菌中表達。
在PBS中穩(wěn)定且與防腐劑相容的本發(fā)明突變蛋白即被認為相對于野生型FGF-21具有增強或改善的藥學(xué)性質(zhì)。如表4所示，本發(fā)明相對于野生型FGF-21藥學(xué)特性增強的優(yōu)選突變蛋白為L139E、A145E、L146E、I152E、Q156E、[I152E、S163E]、S163E、Q54E、[L21C-L33C、L118C-A134C]、L21C-L33C、A26C-K122C及L118C-A134C。
表4


*平均顆粒直徑表示目的蛋白濃度為10mg/ml、m-甲酚為3mg/ml，于37℃下孵育2小時后的蛋白質(zhì)溶液。
序列表<110>伊萊利利公司<120>成纖維細胞生長因子21的突變蛋白<130>X-16280<160>2<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>181<212>PRT<213>人<400>1His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val1 5 10 15Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His20 25 30Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser35 40 45Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln50 55 60Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly65 70 75 80Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His100 105 110Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro115 120 125Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro130 135 140Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val145 150 155 160Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser165 170 175Pro Ser Tyr Ala Ser180<210>2<211>543<212>DNA<213>人<400>2caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac60ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg120gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg180ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg240gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt300gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg360aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca420
ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg480ggctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct540tcc 54權(quán)利要求
1.人成纖維細胞生長因子21(FGF-21)的突變蛋白或其生物活性肽，其包含用帶電荷的和/或極性但不帶電荷的氨基酸對以下一個或多個氨基酸的替換甘氨酸42、谷胺酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷胺酰胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170或絲氨酸172，其中氨基酸編號依據(jù)SEQ ID NO1。
2.權(quán)利要求1的突變蛋白，其中帶負電荷的氨基酸選自天冬氨酸、谷氨酸及它們非天然存在的類似物。
3.權(quán)利要求1的突變蛋白，其中極性但不帶電荷的氨基酸選自絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺及它們非天然存在的類似物。
4.權(quán)利要求1的突變蛋白，其中所述突變蛋白選自Leu139Glu、Ala145Glu、Leu146Glu、Ile152Glu、Gln156Glu、Ser163Glu、Ile152Glu、Ser163Glu及Gln54Glu。
5.權(quán)利要求4的突變蛋白，其中所述突變蛋白在N-末端截去多至4個氨基酸。
6.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1的突變蛋白。
7.權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸為DNA。
8.表達載體，其含有權(quán)利要求7的DNA。
9.宿主細胞，其含有權(quán)利要求8的表達載體。
10.權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述宿主細胞為酵母細胞。
11.生產(chǎn)多肽的方法，其包括(a)在權(quán)利要求10的宿主細胞中表達所述多肽，并；(b)分離所述多肽。
12.藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求1的FGF-2l突變蛋白和可藥用載體，其中所述組合物用于治療具有肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖癥或代謝綜合征中一種或幾種表現(xiàn)的病人。
13.治療病人的方法，其包括對所述病人施用治療有效量的權(quán)利要求1的FGF-21突變蛋白，其中所述病人具有選自肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖癥或代謝綜合征中的一種或多種適應(yīng)癥。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述病人表現(xiàn)為2型糖尿病。
15.人FGF-21突變蛋白或其生物活性肽，其包含用半胱氨酸對以下兩個或多個氨基酸的替換精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷胺酰胺27、谷胺酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷胺酰胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷胺酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬酰胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139，其中氨基酸編號依據(jù)SEQ ID NO1。
16.權(quán)利要求15的突變蛋白，其中所述突變蛋白選自Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys、Leu21Cys/Leu33Cys、Leu118Cys/Ala134Cys或Ala26Cys/Lys122Cys。
17.權(quán)利要求16的突變蛋白，其中所述突變蛋白在N-末端截去多至4個氨基酸。
18.權(quán)利要求17的突變蛋白，其中所述突變蛋白為des-HPIP-Leu118Cys/Ala134Cys。
19.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求15的突變蛋白。
20.權(quán)利要求19的多核苷酸，其中所述多核苷酸為DNA。
21.表達載體，其含有權(quán)利要求20的DNA。
22.宿主細胞，含有權(quán)利要求21的表達載體。
23.權(quán)利要求22的宿主細胞，其中所述宿主細胞為酵母細胞。
24.生產(chǎn)多肽的方法，其包括(a)在權(quán)利要求23的宿主細胞中表達所述多肽，并；(b)分離所述多肽。
25.藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求15的FGF-21突變蛋白和可藥用載體，其中所述組合物用于治療表現(xiàn)選自肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖癥或代謝綜合征中的一種或多種適應(yīng)癥的病人。
26.治療病人的方法，包括對所述病人施用治療有效量的權(quán)利要求15的FGF-21突變蛋白，其中所述病人表現(xiàn)選自肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖或代謝綜合征中的一種或多種適應(yīng)癥。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述病人表現(xiàn)為2型糖尿病。
28.人成纖維細胞生長因子21的突變蛋白或其生物活性肽，其包含用帶電荷的和/或極性但不帶電荷的氨基酸對以下一個或多個氨基酸位置的替換甘氨酸42、谷胺酰胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、賴氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷胺酰胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170或絲氨酸172；同時還有用半胱氨酸對以下兩個或多個氨基酸位置的替換精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷胺酰胺27、谷胺酰胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、谷氨酸50、谷胺酰胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷胺酰胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、谷氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬酰胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139，其中氨基酸編號依據(jù)SEQ IDNO1。
29.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求28的突變蛋白。
30.權(quán)利要求29的多核苷酸，其中所述多核苷酸為DNA。
31.表達載體，其含有權(quán)利要求30的DNA。
32.宿主細胞，其含有權(quán)利要求31的表達載體。
33.權(quán)利要求32的宿主細胞，其中所述宿主細胞為酵母細胞。
34.生產(chǎn)多肽的方法，其包括(a)在權(quán)利要求33的宿主細胞中表達所述多肽，并；(b)分離所述多肽。
35.藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求28的FGF-21突變蛋白和可藥用載體，其中所述組合物用于治療表現(xiàn)選自肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖癥或代謝綜合征中的一種或多種適應(yīng)癥的病人。
36.治療病人的方法，其包括對所述病人施用治療有效量的權(quán)利要求28的FGF-21突變蛋白，其中所述病人表現(xiàn)選自肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖癥或代謝綜合征中的一種或多種適應(yīng)癥。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述病人表現(xiàn)為2型糖尿病。
38.權(quán)利要求28的突變蛋白，其中所述突變蛋白在N-末端截去多至4個氨基酸。
39.權(quán)利要求1的FGF-21突變蛋白的用途，用于制造治療選自肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖癥或代謝綜合征中的一種或多種適應(yīng)癥的藥物。
40.權(quán)利要求15的FGF-21突變蛋白的用途，用于制造治療選自肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖癥或代謝綜合征中的一種或多種適應(yīng)癥的藥物。
41.權(quán)利要求28的FGF-21突變蛋白的用途，用于制造治療選自肥胖癥、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖癥或代謝綜合征中的一種或多種適應(yīng)癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有改良的藥學(xué)性質(zhì)的人成纖維細胞生長因子21新突變蛋白，公開了蛋白質(zhì)及各自的編碼核酸。本發(fā)明也包括用于擴增所述核酸序列并產(chǎn)生所述突變蛋白的載體和宿主細胞。同時還公開了治療2型糖尿病、肥胖癥、代謝綜合征以及降低重癥病人的死亡率和發(fā)病率的方法。
文檔編號C12N1/19GK1890371SQ200480035794
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月10日
發(fā)明者J·M·比爾斯, C·C·弗賴伊, W·格萊斯納, S·李, R·拉特納查拉姆, J·尚, B·A·斯特里弗勒, R·米卡諾維克 申請人:伊萊利利公司