專利名稱：表達(dá)MEGSIN/RAGE/iNOS的疾病模型動(dòng)物及借助于該動(dòng)物評(píng)估化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病模型動(dòng)物，特別是，用于高血糖癥的伴腎機(jī)能障礙(例如糖尿病性腎病)的模型動(dòng)物，以及腎小球障礙癥的伴腎機(jī)能障礙的模型動(dòng)物。本發(fā)明也涉及利用該疾病模型動(dòng)物評(píng)估化合物對(duì)腎機(jī)能障礙療效的方法。
背景技術(shù)：
最近幾年中，由于生活方式和飲食逐漸西化，糖尿病患者數(shù)量穩(wěn)步增加。糖尿病是一種疾病，其中持續(xù)性高血糖癥引起遍及全身的各種組織病癥(稱為并發(fā)癥)。除所謂的諸如冠狀動(dòng)脈硬化癥和腦血管障礙的大血管并發(fā)癥外，糖尿病特有的病理癥狀出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病和腎病，統(tǒng)稱為“三種主要并發(fā)癥”。特別是，在發(fā)達(dá)國家腎病是糖尿病患者的一種致命并發(fā)癥，而且還是終末期腎病(ESRD)的主要起因(非專利文獻(xiàn)1)。
因?yàn)榇蠹s30％的胰島素依賴性糖尿病(IDDM)患者發(fā)展為糖尿病性腎病，且需要透析或腎移植等，最終其生活質(zhì)量(QOL)嚴(yán)重受損(非專利文獻(xiàn)1和2)。此外，與普通人群相比，男女糖尿病患者的平均預(yù)期壽命縮短了10或更多年。持續(xù)性蛋白尿、腎機(jī)能漸進(jìn)性病損以及組織病理學(xué)的腎小球系膜細(xì)胞增生是糖尿病性腎病的特有癥狀。
因此，糖尿病并發(fā)癥發(fā)病和進(jìn)展的分子機(jī)制的闡明以及預(yù)防和治療方法的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是醫(yī)學(xué)和社會(huì)的重要目標(biāo)。
闡明糖尿病性腎病發(fā)病機(jī)制和開發(fā)治療和預(yù)防方法需要模型動(dòng)物。許多研究正旨在創(chuàng)建這樣的模型動(dòng)物。但是，除僅有的一些模型，例如糖尿病動(dòng)物模型，一種發(fā)展為限制性障礙(如輕度腎小球系膜細(xì)胞硬化癥)的自發(fā)性非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(非專利文獻(xiàn)4)，以及用化學(xué)方法誘導(dǎo)糖尿病的嚙齒模型動(dòng)物(非專利文獻(xiàn)5)之外，沒有已知的動(dòng)物模型能顯示出如在人類糖尿病性腎病中觀察到的那些改變(非專利文獻(xiàn)3)。此外，就其再現(xiàn)性和病理檢查結(jié)果，這些已知的動(dòng)物模型都不能滿足需要。具體地說，腎小球系膜基質(zhì)輕度增生以及所產(chǎn)生的腎小球肥大是一些在常規(guī)糖尿病性腎病模型也可見的病理檢查結(jié)果。但是，沒有已知的動(dòng)物模型具有所有類似于人類糖尿病性腎病那些的表型(生化和病理檢查結(jié)果)。此外。沒有顯示出在晚期病理癥狀中所觀察到的結(jié)節(jié)性腎小球硬化的模型。因此，糖尿病性腎病的研究變得困難。在上述情況下，重要的是要?jiǎng)?chuàng)建具有類似于人類糖尿病性腎病那些表型的動(dòng)物模型，以便了解糖尿病性腎病的病理生理學(xué)。
如上所述，糖尿病性腎病是一種糖尿病并發(fā)癥，并且認(rèn)為下列體內(nèi)反應(yīng)與其發(fā)病機(jī)制有關(guān)。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)暴露于還原糖(如葡萄糖)時(shí)，誘導(dǎo)了非酶糖基化反應(yīng)，并產(chǎn)生諸如可逆的希夫堿(Schiff base)及阿馬多爾(Amadori)重排化合物的糖基化產(chǎn)物(非專利文獻(xiàn)6)。該過程稱為“早期反應(yīng)”。然后，通過諸如縮合、裂解以及交聯(lián)的復(fù)雜分子內(nèi)重排反應(yīng)產(chǎn)生了不可逆的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)(非專利文獻(xiàn)6)。這一系列反應(yīng)稱為“糖基化”。AGE是通過上述方法所產(chǎn)生的這樣結(jié)構(gòu)的類名。在糖尿病中，長期持續(xù)的高血糖狀態(tài)加速了該反應(yīng)，并且在循環(huán)血和各種組織中沉積了AGE(非專利文獻(xiàn)6)。AGE的產(chǎn)生被認(rèn)為是引起糖尿病并發(fā)癥的原因之一。
同時(shí)，利用細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)制吸引了人們的注意力，該應(yīng)答是通過識(shí)別AGE作為特異性配體的細(xì)胞表面受體(晚期糖基化終產(chǎn)物受體RAGE；以下簡稱為“RAGE”)所誘導(dǎo)的。
RAGE是一種具有約35kDa分子量的膜蛋白質(zhì)，屬于1992年自牛肺中分離并鑒定的免疫球蛋白總類。RAGE是一種識(shí)別AGE的細(xì)胞表面受體(非專利文獻(xiàn)7和8)。近來，發(fā)現(xiàn)全長的糖基化的人類RAGE分子量為55kDa(非專利文獻(xiàn)9)。RAGE是一種具有三個(gè)免疫球蛋白樣胞外結(jié)構(gòu)域的單次跨膜受體(single-transmembrane receptor)，還具有一個(gè)預(yù)計(jì)對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不可缺少的短胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。已發(fā)現(xiàn)RAGE的AGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于上述三個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的大多數(shù)N-末端中。另外，已發(fā)現(xiàn)RAGE在許多類型細(xì)胞中表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞和構(gòu)成血管的細(xì)胞，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞(pericyte)和腎小球系膜細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)7和8)。也已揭示了在上列細(xì)胞之一的內(nèi)皮細(xì)胞中，AGE配體自身在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)了RAGE基因的表達(dá)(非專利文獻(xiàn)10)。
為研究AGE-RAGE系統(tǒng)對(duì)糖尿病血管并發(fā)癥的體內(nèi)影響，特別是對(duì)腎病和視網(wǎng)膜病變的影響，本發(fā)明人事先創(chuàng)建并分析了其血管細(xì)胞過表達(dá)RAGE的轉(zhuǎn)基因小鼠(RAGE-Tg)(非專利文獻(xiàn)11)。具體地說，使用轉(zhuǎn)基因來創(chuàng)建RAGE-Tg，其中人類RAGE基因業(yè)已連接到血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性小鼠flk-1啟動(dòng)子的下游。然后，為誘導(dǎo)糖尿病，將該小鼠與不同品系轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠(非專利文獻(xiàn)12)雜交，其中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS；以下簡稱“iNOS”)以一種胰β細(xì)胞特異性方式過表達(dá)，創(chuàng)建了在出生后初期發(fā)展為胰島素依賴性糖尿病的雙Tg(RAGE/iNOS-Tg)小鼠。
該RAGE/iNOS-Tg發(fā)展為類似于人類糖尿病性腎病中所發(fā)現(xiàn)的腎衰竭和進(jìn)行性腎小球硬化癥。具體地說，當(dāng)腎病進(jìn)展程度在患有糖尿病的RAGE-Tg同窩出生仔和患有糖尿病的非Tg雄性小鼠(對(duì)照)之間進(jìn)行比較時(shí)，在RAGE/iNOS-Tg中腎障礙已明顯加劇了，盡管就諸如血糖水平、HbAic水平和血AGE水平的指標(biāo)而言在這兩組之間沒有明顯差異。也就是說，尿白蛋白和肌酸酐之比(蛋白尿的一個(gè)指示物)在RAGE/iNOS-Tg中提高了；血清肌酸酐水平和腎/身體的重量比也提高了；并在組織學(xué)上觀察到明顯的腎小球肥大和腎小球硬化。
因此，首次證實(shí)了RAGE過表達(dá)在個(gè)體水平上能增強(qiáng)糖尿病性腎病的發(fā)病和進(jìn)展。RAGE被確定為一種腎病易感基因，并已確認(rèn)RAGE/iNOS-Tg能作為用于了解致糖尿病腎病理的ESRD-介導(dǎo)過程的首選動(dòng)物模型。因此，對(duì)于糖尿病并發(fā)癥預(yù)防和治療方法而言，AGE-RAGE系統(tǒng)可能是一種有前途的靶。
因此，RAGE/iNOS-Tg是一種用于糖尿病并發(fā)癥的極好動(dòng)物模型。但是，如果能獲得發(fā)展為更明顯的腎機(jī)能障礙且發(fā)病需時(shí)較短的動(dòng)物模型，該模型應(yīng)當(dāng)更有助于了解如糖尿病性腎病的糖尿病并發(fā)癥的病理生理學(xué)，且對(duì)于開發(fā)用于糖尿病并發(fā)癥的治療藥等非常有用。
同時(shí)，本發(fā)明人分離了megsin，一種在腎小球系膜細(xì)胞中特異表達(dá)的基因(專利文獻(xiàn)1)，并創(chuàng)建了導(dǎo)入megsin的轉(zhuǎn)基因小鼠(megsin-Tg)。在約35-40周齡的megsin-Tg的腎小球組織中，觀察到明顯的細(xì)胞增生(主要為膜細(xì)胞增生，增加的膜基質(zhì)，和由補(bǔ)體和免疫球蛋白組成的免疫復(fù)合物沉積)，和腎小球系膜增生(如節(jié)段性硬化)的病理檢測(cè)結(jié)果(非專利文獻(xiàn)13)。基于上述發(fā)現(xiàn)，可以證明megsin-Tg可用作一種系膜增生性腎小球腎炎動(dòng)物模型。但是，megsin-Tg的腎機(jī)能是正常的，且未檢測(cè)到尿蛋白或類似指標(biāo)。此外，其在出生后35-40周之久才發(fā)展為系膜增生性腎小球腎炎。因此，megsin-Tg無法滿足上述糖尿病并發(fā)癥動(dòng)物模型的需要。
專利文獻(xiàn)1國際公布號(hào)WO 99/15652非專利文獻(xiàn)1Bojestig，M.，等，N.Engl.J.Med.，33015-18(1994)非專利文獻(xiàn)2Krolewski，M.，等，Kidney Int.，502041-2046(1996)非專利文獻(xiàn)3Velasquez，M.T.，等，F(xiàn)ASEB J.，42850-2859(1990)非專利文獻(xiàn)4Doi，T.，等，Lab.Invest.，63204-212(1990)非專利文獻(xiàn)5Williamson，J.R.，等，Diabetes.，36813-821(1987)非專利文獻(xiàn)6Brownlee，M.，等，N.Engl.J.Med.，3181315-1321(1988)非專利文獻(xiàn)7Schmidt，A.M.，等，J.Biol.Chem.，26714987-14997(1992)非專利文獻(xiàn)8Neeper，M.，等，J.Biol.Chem.，26714998-15004(1992)非專利文獻(xiàn)9Yonekura，H.，等，Biochem.J.，3701097-1109(2003)非專利文獻(xiàn)10Tanaka，N.，等，J.Biol.Chem.，27525781-25790(2000)非專利文獻(xiàn)11Yamamoto，Y.，等，J.Clin.Invest.，108261-268(2001)非專利文獻(xiàn)12Takamura，T.，等，J.Biol.Chem.，2732493-2496(1998)非專利文獻(xiàn)13Miyata，T.，等，J.Clin.Invest.，109585-593(2002)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供較常規(guī)糖尿病性腎病動(dòng)物模型更有效的疾病動(dòng)物模型。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于評(píng)估具有治療糖尿病性腎病用途化合物的方法。
本發(fā)明人從其研究中發(fā)現(xiàn)系膜增生性腎小球腎炎可通過在腎小球中強(qiáng)迫表達(dá)megsin而誘導(dǎo)，且RAGE/iNOS-Tg可作為一種極好的糖尿病并發(fā)癥的動(dòng)物模型。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)腎機(jī)能障礙發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了專門研究，特別是對(duì)糖尿病性腎病機(jī)制。從該研究中，獲得了產(chǎn)生本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)。
首先，通過將megsin-Tg和RAGE/iNOS-Tg雜交創(chuàng)建了三Tg(megsin/RAGE/iNOS-Tg)。發(fā)現(xiàn)該megsin/RAGE/iNOS-Tg產(chǎn)生了糖尿病腎病理(結(jié)節(jié)性腎小球硬化)，其并不見于常規(guī)模型中，且在早期發(fā)病，并同樣地觀察到諸如腎小球肥大的腎病理。
更具體地說，在所創(chuàng)建的三Tg小鼠中，腎小球肥大和腎小球細(xì)胞增生在早期被檢測(cè)到(例如，在8周或16周的小鼠中)，并加速了相關(guān)的腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張。該早期形態(tài)學(xué)上腎小球異常引起了腎小球障礙(腎小球系膜細(xì)胞活化)、重度腎小管間質(zhì)性障礙(纖維變性)、巨噬細(xì)胞間質(zhì)性浸潤、增強(qiáng)的氧化應(yīng)激等。該三Tg小鼠在16周的極早期就顯示出晚期糖尿病性腎病的病理癥狀(結(jié)節(jié)性損傷，以及腎小球簇與腎小囊的黏附)。
因此，三Tg的所有表型(生化和病理檢測(cè)結(jié)果)都類似于在人類糖尿病性腎病中所見的那些。特別是，迄今還沒有任何模型在早期能有效顯示出在更晚期的病理學(xué)圖像中所觀察到的結(jié)節(jié)性腎小球硬化。因此，本發(fā)明的動(dòng)物模型作為糖尿病性腎病動(dòng)物模型是有用的。
此外，因?yàn)楸景l(fā)明的模型通過腎小球系膜細(xì)胞障礙(megsin過表達(dá))可加速形成，所以該模型具有能在病理進(jìn)行階段這一很寬范圍內(nèi)更詳細(xì)地比較和分析糖尿病性腎病中megsin病理生理學(xué)和腎小球系膜細(xì)胞病理生理學(xué)差異的特點(diǎn)。因此，本發(fā)明的模型動(dòng)物可用作評(píng)估開發(fā)在晚期病理出現(xiàn)前抑制腎障礙進(jìn)展的新型診斷方法和藥物的模型。
本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)完成的，具體描述如下。
一種疾病模型動(dòng)物，其表達(dá)megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因，其中該模型動(dòng)物包括非人類哺乳動(dòng)物。
[1]的疾病模型動(dòng)物，其導(dǎo)入有megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因。
[1]或[2]的疾病模型動(dòng)物，表現(xiàn)出至少一種選自下列表型(a)-(f)的表型(a)腎/身體重量比增加；(b)尿白蛋白水平增加；(c)血甘油三酯水平增加；(d)體重過輕(發(fā)育不全)；(e)高血糖癥；和(f)低胰島素血癥。
[1]-[3]中任一個(gè)的疾病模型動(dòng)物，其在腎小球系膜基質(zhì)中表現(xiàn)出至少一種下列表型(a)腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張；(b)免疫球蛋白和/或補(bǔ)體沉積的增強(qiáng)；和(c)膠原蛋白、層粘連蛋白和/或纖連蛋白的增加。
[1]或[2]的疾病模型動(dòng)物，其在腎小管間質(zhì)組織中表現(xiàn)出表型(a)纖維變性；和/或(b)炎性細(xì)胞浸潤。
[1]-[5]中任一個(gè)的疾病模型動(dòng)物，其中megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因來自人類。
[1]-[6]中任一個(gè)的疾病模型動(dòng)物，其中疾病是糖尿病性腎病。
一種創(chuàng)建疾病模型動(dòng)物的方法，包括將megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因?qū)敕侨祟惒溉閯?dòng)物受精卵的步驟，其中所述疾病模型動(dòng)物包括非人類哺乳動(dòng)物，在該非人類哺乳動(dòng)物中所述megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因的表達(dá)業(yè)已進(jìn)行。
一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)腎機(jī)能障礙療效的方法，包括步驟(1)對(duì)[1]-[7]中任一個(gè)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)檢測(cè)被給服測(cè)試化合物的該疾病模型動(dòng)物腎機(jī)能障礙的緩解效果。
一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)腎機(jī)能障礙療效的方法，包括步驟(1)對(duì)[1]-[7]中任一個(gè)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)在給服所述測(cè)試化合物后，測(cè)定該疾病模型動(dòng)物中腎/身體重量比、尿白蛋白水平、血甘油三酯水平和尿8-OHdG水平中的至少任一個(gè)。
一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)腎機(jī)能障礙療效的方法，包括步驟(1)對(duì)[1]-[7]中任一個(gè)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)在給服所述測(cè)試化合物后測(cè)定該疾病模型動(dòng)物的腎小球系膜基質(zhì)是否改變或該改變是否減小。
[11]的方法，其中腎小球系膜基質(zhì)的改變至少是以下之一(a)腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張；(b)免疫球蛋白和/或補(bǔ)體沉積的增強(qiáng)；和(c)膠原蛋白、層粘連蛋白和/或纖連蛋白的增加。
一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)腎機(jī)能障礙療效的方法，包括步驟(1)對(duì)[1]-[7]中任一個(gè)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)在給服測(cè)試化合物后測(cè)定該疾病模型動(dòng)物的腎小管間質(zhì)組織是否改變或該改變是否減小。
[13]的方法，其中腎小管間質(zhì)組織的改變是(a)纖維變性；和/或(b)炎性細(xì)胞浸潤。
[9]-[14]中任一個(gè)的方法，其中腎機(jī)能障礙是伴發(fā)高血糖癥的腎機(jī)能障礙。
一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)高血糖癥療效的方法，包括步驟(1)對(duì)[1]-[7]中任一個(gè)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)在給服測(cè)試化合物后測(cè)定該疾病模型動(dòng)物中葡萄糖或/胰島素水平。
本發(fā)明提供了導(dǎo)入了megsin、RAGE和iNOS基因的疾病模型動(dòng)物。在本發(fā)明的模型動(dòng)物中觀察到明顯的腎小球病(結(jié)節(jié)性硬化損傷)。該發(fā)現(xiàn)支持了本發(fā)明的疾病模型動(dòng)物的病理學(xué)狀態(tài)更接近類似于人類糖尿病性腎病。此外，與常規(guī)模型小鼠(40周齡)相比，本發(fā)明模型動(dòng)物在早期(16周齡)就產(chǎn)生了疾病，并且所觀察到包括腎小球肥大的多種病理癥狀是相同的。因此，預(yù)計(jì)本發(fā)明的模型動(dòng)物對(duì)于糖尿病性腎病病因的闡明特別有用。本發(fā)明的模型動(dòng)物不僅可用于分析糖尿病性腎病的發(fā)病機(jī)制和病理狀態(tài)，還可用于開發(fā)和篩選糖尿病性腎病治療藥、藥劑及其他目的。
本發(fā)明也提供了具有高血糖癥癥狀的疾病模型動(dòng)物。盡管具有高血糖癥的模型動(dòng)物是已知的，但在短時(shí)間內(nèi)就確定無疑地發(fā)展為高血糖癥的動(dòng)物是未知的，例如上述本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的疾病模型動(dòng)物。本發(fā)明的疾病模型動(dòng)物用于分析和探究高血糖癥所引起的各種病變的治療方法，以及發(fā)現(xiàn)高血糖癥的治療方法。已揭示了高血糖癥所引起的各種病癥。因此，其中由高血糖癥所引起的各種病變可被觀察到的模型被用于分析上述病理狀態(tài)。
可使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物創(chuàng)建本發(fā)明表達(dá)megsin/RAGE/iNOS的疾病模型動(dòng)物?？纱笠?guī)模提供高度一致的模型動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物使得實(shí)驗(yàn)?zāi)芨叨染_地進(jìn)行。此外，在本發(fā)明的疾病模型動(dòng)物中，觀察到接近類似于人類病理狀態(tài)的結(jié)節(jié)性硬化損傷和糖尿病性腎病。如上所述，其重要意義在于提供了真實(shí)模擬實(shí)際病變的模型動(dòng)物。


圖1顯示了通過PCR證實(shí)三Tg小鼠中三種導(dǎo)入基因(RAGE、megsin和iNOS基因)存在的結(jié)果。
圖2是一組顯示實(shí)施例2中所述的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠和對(duì)照小鼠腎小球組織PAS或PAM染色結(jié)果的顯微照片。上megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠；中RAGE/iNOS-Tg小鼠；下megsin-Tg小鼠。腎組織收集自均為16周齡的小鼠。
圖3是一組顯示使用熒光抗體法檢測(cè)腎小球系膜基質(zhì)中免疫球蛋白沉積結(jié)果的熒光顯微照片。左來自對(duì)照RAGE/iNOS-Tg小鼠；右來自實(shí)施例megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠。
圖4是一組顯示使用熒光抗體法檢測(cè)腎小球系膜基質(zhì)中補(bǔ)體沉積結(jié)果的熒光顯微照片。左來自對(duì)照RAGE/iNOS-Tg小鼠；右來自實(shí)施例的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠。
圖5是一組顯示通過使用抗IV型膠原蛋白抗體進(jìn)行免疫組織學(xué)染色，存在于腎小球系膜基質(zhì)中的IV型膠原蛋白染色結(jié)果的顯微照片。左來自實(shí)施例的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠；右來自對(duì)照megsin-Tg小鼠。
圖6是一組顯示通過使用抗-纖連蛋白抗體進(jìn)行免疫組織學(xué)染色，存在于腎小球系膜基質(zhì)中的纖連蛋白染色結(jié)果的顯微照片。左來自實(shí)施例的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠；右來自對(duì)照megsin-Tg小鼠。
圖7是一組顯示通過使用抗-層粘連蛋白抗體進(jìn)行免疫組織學(xué)染色，存在于腎小球系膜基質(zhì)中的層粘連蛋白染色結(jié)果的顯微照片。左來自實(shí)施例的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠；右來自對(duì)照megsin-Tg小鼠。
圖8是一組顯示megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠腎組織病理分析結(jié)果的電子顯微照片。來自正常小鼠(非轉(zhuǎn)基因小鼠)的腎組織作為對(duì)照示于左邊用于比較。
圖9是一組顯示megsin/RAGE/iNOS-Tg(三Tg)小鼠(16周齡)中腎小球肥大的圖。在三Tg和比較對(duì)照的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，顯示了(a)腎小球簇區(qū)的尺寸，(b)腎小球系膜基質(zhì)/腎小球簇區(qū)的比率，和(c)在每一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中用于腎小球細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞核的數(shù)目。
圖10是一組顯示megsin/RAGE/iNOS-Tg(三Tg)小鼠(8周齡)中腎小球肥大的圖。在三Tg和比較對(duì)照的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，顯示了(a)腎小球簇區(qū)的尺寸，(b)腎小球系膜基質(zhì)/腎小球簇區(qū)的比率，和(c)在每一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中用于腎小球細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞核的數(shù)目。
圖11是一組顯示megsin/RAGE/iNOS-Tg(三Tg)小鼠中腎小球和腎小管間質(zhì)性損傷的免疫組織學(xué)染色圖像。(a)利用“α-SMA”(一種腎小球系膜基質(zhì)活化和腎小管間質(zhì)性損傷標(biāo)記物)的免疫染色圖像；(b)利用F4/80的巨噬細(xì)胞浸潤的免疫染色圖像。
圖12是一張顯示通過利用8-OHdG(一種氧化應(yīng)激標(biāo)記物)測(cè)定megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中氧化應(yīng)激增加所得到結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的疾病模型動(dòng)物包括表達(dá)至少三種基因megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因(iNOS)的非人類哺乳動(dòng)物。通過表達(dá)這三種基因，與常規(guī)模型動(dòng)物相比在早期就能誘導(dǎo)出明顯的腎障礙癥狀。上述癥狀包括具有增加的腎/身體重量比(較megsin Tg小鼠大1.5-2倍以上或較正常小鼠大1.5倍以上)的明顯腎肥大、升高的尿白蛋白水平(較RAGE/iNOS-Tg小鼠大2倍以上)以及升高的血甘油三酯水平(較megsin Tg小鼠高2倍以上)。此外，與常規(guī)的megsin Tg小鼠和RAGE/iNOS-Tg小鼠相比，通過改變腎小球系膜基質(zhì)，例如腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張，免疫球蛋白和/或補(bǔ)體的沉積的增加以及膠原蛋白、層粘連蛋白和/或纖連蛋白的增加，還有腎小管間質(zhì)性纖維變性，炎性細(xì)胞浸潤等，這三種基因能在更早期誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)性障礙。此外，當(dāng)與正常動(dòng)物比較時(shí)，本發(fā)明表達(dá)megsin/RAGE/iNOS的疾病模型動(dòng)物也顯示出低體重(發(fā)育不全)、高血糖癥和低胰島素血癥。
本發(fā)明表達(dá)megsin/RAGE/iNOS的疾病模型動(dòng)物可通過例如給服對(duì)動(dòng)物每種內(nèi)源基因(megsin、RAGE或iNOS基因)啟動(dòng)子起作用的物質(zhì)而獲得。更可取地，該模型動(dòng)物可通過創(chuàng)建導(dǎo)入上述三種基因的三轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而獲得。
在此megsin基因指一種基因，即如上所述在腎小球系膜細(xì)胞中特異表達(dá)且例如，如果其被單獨(dú)導(dǎo)入小鼠的話，可誘導(dǎo)諸如系膜增生性腎小球腎炎的腎衰竭病理癥狀的基因。作為megsin基因的例子，人類megsin cDNA如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明的megsin基因可以是包含與上述SEQ ID NO1中所示的人類megsin基因類似的序列的megsin基因、非人類megsin基因等，只要其能誘導(dǎo)如上所述類型的腎炎。例如，大鼠和小鼠的megsins描述于國際專利申請(qǐng)公布號(hào)WO 99/15652中。
RAGE是一種特異性識(shí)別血液或組織中通過糖基化形成的不可逆晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)的細(xì)胞表面受體。編碼RAGE的人類RAGE cDNA如SEQ ID NO2所示。但是，本發(fā)明的RAGE基因并不限于SEQ ID NO2所示的人類RAGE基因，并且可以是編碼能識(shí)別AGE的受體蛋白質(zhì)的類似序列，不同于SEQ ID NO2序列的人類基因，非人類RAGE基因等。
iNOS基因編碼誘導(dǎo)型一氧化氮合酶。小鼠cDNA已存儲(chǔ)于GeneBank/EMBL數(shù)據(jù)庫M84373內(nèi)，在此該序列作為SEQ ID NO3包括在內(nèi)。但是，該序列并不限于本發(fā)明的SEQ ID NO3，其可以是不同于該序列的但編碼誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的類似序列、功能上等價(jià)的小鼠基因、和來自其它物種(如人類)的iNOS基因等。
基于上述各自的核苷酸序列，通過常規(guī)方法可獲得上述相應(yīng)的基因。例如，就megsin基因而論，可通過使用包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA作為探針篩選腎小球系膜細(xì)胞的cDNA文庫來分離編碼megsin基因的cDNA?；蛘?，可通過使用cDNA文庫作為模板和基于SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所設(shè)計(jì)的引物，通過PCR擴(kuò)增megsin基因獲得megsin cDNA。
RAGE基因在許多細(xì)胞類型中表達(dá)，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞以及腎系膜細(xì)胞。因此，可通過使用包含SEQ IDNO2所示核苷酸序列的DNA作為探針篩選這些細(xì)胞任一的cDNA文庫來分離編碼RAGE基因的cDNA。或者，可使用cDNA文庫作為模板和基于SEQ ID NO2所示的核苷酸序列所設(shè)計(jì)的引物，通過PCR擴(kuò)增RAGE基因獲得RAGE cDNA。
就iNOS基因來說，可通過使用包含SEQ ID NO3序列或其一部分的DNA作為探針篩選例如IL-1β-刺激的胰β細(xì)胞或活化的巨噬細(xì)胞的cDNA文庫來分離編碼iNOS基因的cDNA?；蛘撸墒褂胏DNA文庫作為模板和基于SEQ ID NO3序列設(shè)計(jì)的引物，通過PCR擴(kuò)增iNOS基因獲得iNOS cDNA。
可通過選擇能在嚴(yán)格條件下與上述相應(yīng)序列雜交的序列，以獲得具有不同于上述SEQ ID NO1序列的序列的功能等價(jià)megsin基因、具有不同于SEQ ID NO2序列的序列的功能等價(jià)RAGE基因以及具有不同于SEQ ID NO3序列的序列的功能等價(jià)iNOS基因。對(duì)于洗滌，嚴(yán)格條件包括“1×SSC，0.1％SDS和37℃”的標(biāo)準(zhǔn)條件；“0.5×SSC，0.1％SDS和42℃”的更嚴(yán)格條件；以及“0.1×SSC，0.1％SDS和55℃”的最嚴(yán)格條件。
在創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，將上述各種基因與能表達(dá)被導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中的該基因的啟動(dòng)子連接是有利的。可以使用能在包括小鼠和大鼠在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物中表達(dá)外源基因的雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。或者，當(dāng)基因要在特定組織中表達(dá)時(shí)，可以使用組織特異性啟動(dòng)子。例如，小鼠flk-1是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞-特異性啟動(dòng)子。如果需要，可結(jié)合使用增強(qiáng)子以增強(qiáng)外源基因表達(dá)?？梢允褂冒鰪?qiáng)子和啟動(dòng)子及其下游用于插入外源基因的多克隆位點(diǎn)的常規(guī)載體(例如，pCAGGS等)。在這些載體中，兔β珠蛋白終止子置于多克隆位點(diǎn)下游，其改善了所插入外源基因的表達(dá)效率。
利用上述連接有啟動(dòng)子的各種基因創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明的疾病模型動(dòng)物包括導(dǎo)入上述三種基因(megsin、RAGE和iNOS基因)的三轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。該三轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可通過將這三種基因?qū)氲揭粋€(gè)生殖細(xì)胞中并強(qiáng)烈表達(dá)這三種基因而得到創(chuàng)建。或者，各種基因可單獨(dú)導(dǎo)入不同的生殖細(xì)胞中，接著將各自產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相繼雜交創(chuàng)建具有這三種外源基因的三Tg動(dòng)物。用于創(chuàng)建本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法并不限于特定的方法，可以使用本領(lǐng)域公知用于創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法(參見，例如，“Hassei Kohgaku JikkenManyuaru(Manual for Experiments in Development Engineering)”，編輯M.Katsuki(Japan，Kodansha)，1989；“Shin Seikagaku Jikken Kohza，DoubutsuJikkenhou(New series，Lecture for Biochemical ExperimentsMethods ofAnimal Experiments)”編輯The Japanese Biochemical Society，(Japan，TokyoKagakudojin)1991)。制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的常規(guī)方案簡要描述如下。
可通過將基因?qū)肜绨词芫?、受精卵、精子及其原基?xì)胞的生殖細(xì)胞中創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。作為要被導(dǎo)入基因的細(xì)胞，使用在胚胎形成階段的細(xì)胞，更具體地說，在非人類哺乳動(dòng)物發(fā)育中的單細(xì)胞階段或受精卵階段，以及通常在8細(xì)胞階段或更早的細(xì)胞。作為用于導(dǎo)入上述基因的方法，磷酸鈣法、電脈沖法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、凝集(agglutination)法、微量注射法、基因槍法、DEAE-葡聚糖法等是公知的，并且可以使用這些方法的任一種。當(dāng)對(duì)各種基因創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，將基因單獨(dú)導(dǎo)入不同的受精卵等中?；蛘?，當(dāng)這三種基因共同導(dǎo)入時(shí)，通過任一上述方法將包含這三種基因的溶液導(dǎo)入受精卵中。
這里，要被導(dǎo)入基因的細(xì)胞可以是來源自任何容許創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的非人類哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。具體地說，可以使用來自小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛、狗、貓等的細(xì)胞。例如，就大鼠來說，可導(dǎo)入基因的受精卵可通過將正常的雄性大鼠與給服排卵誘導(dǎo)劑的雌性大鼠雜交而收集獲得。一般而言，當(dāng)使用大鼠受精卵時(shí)，可通過微量注射將基因(或多種基因)導(dǎo)入雄性生殖核中。將已導(dǎo)入基因(或多種基因)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)約一夜。接著，將一些預(yù)計(jì)已成功導(dǎo)入基因的細(xì)胞移植到代理母親的輸卵管中，然后生出轉(zhuǎn)基因嵌合動(dòng)物。將與輸精管已切斷的雄性動(dòng)物交配制備的假孕雌性動(dòng)物用作為代理母親。
通過分析新生轉(zhuǎn)基因嵌合動(dòng)物體細(xì)胞中的基因，對(duì)它們進(jìn)行檢驗(yàn)以確定外源基因(或多種外源基因)是否已整合入基因組中。該轉(zhuǎn)基因嵌合動(dòng)物與正常動(dòng)物雜交生出F1動(dòng)物。當(dāng)雜交時(shí)，最好選擇攜有更高基因拷貝數(shù)的個(gè)體。一般地，作為基因要被導(dǎo)入的外源DNA以多拷貝串聯(lián)排列方式整合入在同一位點(diǎn)的基因組中。一般而言，隨著整合基因的拷貝數(shù)增多，該基因的表達(dá)水平就更高且可預(yù)期獲得更多獨(dú)特的表達(dá)類型。此外，通過使用斑點(diǎn)印跡法可以實(shí)現(xiàn)拷貝數(shù)的相對(duì)比較。
在由雜交出生的F1動(dòng)物中，在它們體細(xì)胞中攜有外源基因(或多種外源基因)的動(dòng)物是雜合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物且能將外源基因(或多種外源基因)傳遞至生殖細(xì)胞上。因此，通過從親本F1動(dòng)物中選擇在它們體細(xì)胞中攜有外源基因(或多種外源基因)的動(dòng)物，并容許所選擇的動(dòng)物生出F2動(dòng)物，通過同型結(jié)合保留外源基因(或多種外源基因)的純合動(dòng)物可作為F2動(dòng)物獲得。
當(dāng)通過上述方法創(chuàng)建各種基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，首先，將這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的兩種雜交以創(chuàng)建雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過將所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與未雜交的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交創(chuàng)建三轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明的疾病模型動(dòng)物可以是任何一代的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，只要該動(dòng)物表達(dá)上述三種基因即可。雜合攜帶三個(gè)DNA的F1代以及雜合攜帶該DNA的F2代或后代也包括在本發(fā)明中。
如上所述創(chuàng)建的三Tg動(dòng)物在早期有效地顯示出高血糖癥和腎衰竭的病理癥狀(特別是，高血糖癥腎病)。例如，當(dāng)本發(fā)明的三轉(zhuǎn)基因小鼠與常規(guī)RAGE/iNOS轉(zhuǎn)基因小鼠相比時(shí)，本發(fā)明的小鼠在約16周可發(fā)展為糖尿病性腎病，而常規(guī)小鼠在約40周才發(fā)展為糖尿病性腎病。正如上述小鼠例子所看到的，依照本發(fā)明疾病的發(fā)病可被加速，因此本發(fā)明使得疾病模型動(dòng)物能快速地得到提供。因此，當(dāng)本發(fā)明的三轉(zhuǎn)基因小鼠為14周或更大時(shí)，更適宜地為16周或更大時(shí)，其可用作為糖尿病性腎病模型。此外，鑒于常規(guī)RAGE/iNOS轉(zhuǎn)基因小鼠在約40周齡前不能發(fā)展為糖尿病性腎病這一事實(shí)，本發(fā)明的三轉(zhuǎn)基因小鼠特征在于其能在14-40周，更適宜地在16-40周就可作為糖尿病性腎病模型。
此外，當(dāng)與常規(guī)RAGE/iNOS-Tg和megsin Tg相比時(shí)，本發(fā)明的三轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表現(xiàn)出同種表型，例如腎機(jī)能障礙，因此可提供在質(zhì)量上更有效的模型動(dòng)物。具體地說，腎肥大、尿白蛋白水平的增加、血甘油三酯水平的增加以及為一種氧化應(yīng)激標(biāo)記物的8-OHdG尿水平的增加，在本發(fā)明的三轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中都檢測(cè)到了。此外，除腎小球系膜基質(zhì)增生和結(jié)節(jié)性腎小球硬化癥狀之外，在腎小球系膜基質(zhì)中，IV型膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白增加了，且免疫球蛋白和補(bǔ)體的沉積也增加。還觀察到腎小管間質(zhì)性纖維變性和炎性細(xì)胞浸潤。這樣的表型使該糖尿病性腎病模型非常有用。
本發(fā)明腎機(jī)能障礙的臨床和病理學(xué)特征描述如下。表達(dá)megsin/RAGE/iNOS的本發(fā)明疾病模型動(dòng)物表現(xiàn)出腎肥大?；谀I/體重比(KW/BW)的增加可評(píng)估腎肥大。測(cè)量體重和腎重，基于這些值計(jì)算KW/BW。當(dāng)KW/BW值大于正常動(dòng)物時(shí)，腎將被判斷為肥大。
蛋白尿也是表達(dá)megsin/RAGE/iNOS的本發(fā)明疾病模型動(dòng)物的顯著特征。在糖尿病性腎病中，在腎病早期檢測(cè)到痕量的白蛋白尿，隨著疾病進(jìn)展，檢測(cè)到持續(xù)性的蛋白尿。本發(fā)明的動(dòng)物也顯示出上述蛋白尿的顯著特征。蛋白尿是指一種癥狀，其排泄到尿中的蛋白質(zhì)的水平高于該動(dòng)物正常水平。測(cè)定尿蛋白質(zhì)的方法為本領(lǐng)域公知。例如，生物化學(xué)法(如蛋白質(zhì)誤差法和染料結(jié)合法)廣泛地用作為測(cè)定尿蛋白質(zhì)的半定量法?；谶@些測(cè)定原理的尿試紙?jiān)谑袌?chǎng)上可買到?；诿庖邔W(xué)原理的測(cè)定業(yè)已作為測(cè)定尿蛋白質(zhì)的更敏感和更特異性方法用于實(shí)踐中。在免疫學(xué)測(cè)定中，例如，使用抗血清白蛋白的抗體檢測(cè)排泄到尿中的白蛋白。正常地，僅有痕量蛋白質(zhì)排泄到尿中。例如，在大鼠中，尿中蛋白質(zhì)正常水平被認(rèn)為是0-40mg/dl。因此，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)以高于上述值的水平持續(xù)排泄到尿中時(shí)，大鼠被評(píng)定為具有蛋白尿。在本發(fā)明中，對(duì)于排泄到尿中的蛋白質(zhì)類型沒有限制。一般而言，尿蛋白質(zhì)主要包含重要的血液蛋白質(zhì)白蛋白和球蛋白。
在本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)動(dòng)物中血甘油三酯水平升高。已知在糖尿病或腎障礙患者中血甘油三酯水平繼發(fā)性升高。這樣的情況在本發(fā)明的動(dòng)物中也觀察到了。血甘油三酯水平增加指超出了該動(dòng)物正常范圍的水平。測(cè)定血甘油三酯的方法為本領(lǐng)域公知。例如，可以使用LPL/GK/GPDH-心肌黃酶/甲 (formazan)染料法。
在本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的動(dòng)物中出現(xiàn)了腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張和結(jié)節(jié)性腎小球硬化。腎小球基底膜增厚、腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張以及腎小球中結(jié)節(jié)性硬化損傷是糖尿病性腎病的特征。這些顯著特征也出現(xiàn)在本發(fā)明的模型動(dòng)物中。此外，基于擴(kuò)張過程中所產(chǎn)生的膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等的增加，可以觀察到腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張。使用相應(yīng)的抗體可以對(duì)病理組織進(jìn)行免疫組織學(xué)分析。如果與其正常的免疫組織學(xué)圖像相比，該動(dòng)物的免疫組織學(xué)圖像具有更大的染色面積和/或更強(qiáng)的染色強(qiáng)度，則確定膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等已增加。同時(shí)，通過利用電子顯微鏡的病理學(xué)分析可以檢測(cè)到腎小球基底膜的增厚。基底膜增厚的主要原因是基質(zhì)新陳代謝的高血糖癥-相關(guān)的異常性(產(chǎn)物增加和代謝減退)，業(yè)已清楚其潛在機(jī)制與腎小球系膜基質(zhì)增生是一樣的。
本發(fā)明表達(dá)megsin/RAGE/iNOS的模型動(dòng)物也具有在腎小球系膜基質(zhì)中免疫球蛋白和補(bǔ)體沉積增加的特征。在人類糖尿病性腎病中，在腎小球毛細(xì)血管壁和腎小球系膜基質(zhì)存在的腎小球系膜區(qū)中檢測(cè)到免疫球蛋白和補(bǔ)體的沉積。這樣的病變也出現(xiàn)在本發(fā)明的模型動(dòng)物中。利用對(duì)免疫球蛋白和補(bǔ)體具有特異性的抗體通過免疫組織學(xué)染色可以檢測(cè)到免疫球蛋白和補(bǔ)體。如果染色面積或強(qiáng)度較該動(dòng)物正常組織的免疫組織學(xué)染色圖像中的那些更大或更強(qiáng)，則免疫球蛋白和補(bǔ)體的沉積被判斷為增加了。
本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)模型動(dòng)物也可具有腎小管間質(zhì)性纖維變性和炎性細(xì)胞浸潤的特征。腎小管和間質(zhì)組織這樣的檢測(cè)結(jié)果也被在晚期人類糖尿病性腎病的晚期病理癥狀中觀察到。這樣的病理也出現(xiàn)在本發(fā)明的模型動(dòng)物中。利用抗α-SMA的特異性抗體通過免疫組織學(xué)染色可以檢測(cè)腎小管間質(zhì)性纖維變性。通過利用抗α-SMA的特異性抗體對(duì)在腎小管或間質(zhì)組織中具有陽性反應(yīng)的細(xì)胞顯色可以檢測(cè)纖維變性細(xì)胞。或者，在顯微鏡下通過對(duì)腎小管或間質(zhì)組織中損傷程度直接評(píng)分可以半定量纖維變性。同時(shí)，在腎小管間質(zhì)組織中諸如巨噬細(xì)胞的炎性細(xì)胞浸潤可利用特異于該炎性細(xì)胞的抗體等通過免疫組織學(xué)染色來檢測(cè)。例如，實(shí)施例中描述的F4/80可用作為檢測(cè)巨噬細(xì)胞的抗體。
本發(fā)明megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的模型動(dòng)物也可具有氧化應(yīng)激增加的特征。近來對(duì)人類糖尿病性腎病病理狀態(tài)的分析提出糖尿病性腎病發(fā)病是由氧化應(yīng)激引起的。在上述人類糖尿病性腎病病理狀態(tài)中所觀察到的氧化應(yīng)激的增加也在模型動(dòng)物中觀察到了。氧化應(yīng)激可通過例如使用動(dòng)物尿或血進(jìn)行測(cè)定。例如，一種氧化應(yīng)激標(biāo)記物8-OHdG可利用動(dòng)物尿作為樣品以及在市場(chǎng)上可買到的ELISA試劑盒等容易地進(jìn)行測(cè)定。
如上所述，本發(fā)明的模型動(dòng)物具有諸如糖尿病性腎病、腎小球障礙(結(jié)節(jié)性硬化損害)和腎小管間質(zhì)性障礙的腎機(jī)能障礙的顯著特征，因此可作為這些疾病有用的模型動(dòng)物。此外，本發(fā)明的模型動(dòng)物在早期表現(xiàn)出高血糖癥和低胰島素血癥，因此用作為糖尿病的模型動(dòng)物。因此，本發(fā)明的模型動(dòng)物可用于研究以闡明糖尿病及其并發(fā)癥(包括糖尿病性腎病和結(jié)節(jié)性腎小球硬化)的發(fā)病機(jī)制，以及用于其他目的。同樣地，它們可作為開發(fā)高血糖癥和腎機(jī)能障礙的治療方法、治療藥等的評(píng)估系統(tǒng)。
本發(fā)明也提供了用于評(píng)估抗高血糖癥或腎機(jī)能障礙的治療藥的方法，其使用了上述疾病模型動(dòng)物。第一種評(píng)估方法包括下列步驟(1)對(duì)上述包含非人類哺乳動(dòng)物的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)測(cè)試上述已給服測(cè)試化合物的疾病模型動(dòng)物的腎機(jī)能。
在上述評(píng)估方法中，首先，對(duì)本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物。對(duì)于給藥途徑并不限制。可以選擇口服、靜脈注射、腹膜內(nèi)給藥等，或任何適合于測(cè)試化合物的可供選擇方法。通過給藥處理的疾病模型動(dòng)物，以及對(duì)照動(dòng)物(其是一種事先沒有給服測(cè)試化合物的等同的疾病模型動(dòng)物)，使用腎機(jī)能標(biāo)記物對(duì)它們的腎機(jī)能進(jìn)行測(cè)試。例如，下列腎機(jī)能標(biāo)記物是公知的且可用于該評(píng)估方法中。腎機(jī)能標(biāo)記物血肌酸酐和尿素氮、尿血紅蛋白、白蛋白、β2-微球蛋白以及α1-酸性糖蛋白。測(cè)定腎機(jī)能標(biāo)記物的方法也為本領(lǐng)域公知。
因此，可通過在測(cè)試化合物給服前后觀察這些指示物并比較所獲得的結(jié)果，以評(píng)估作為治療藥的測(cè)試化合物的有效性?；蛘?，當(dāng)使用來源自同一品系的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，通過觀察動(dòng)物中的這些指示物并比較所獲得的結(jié)果，也可比較測(cè)試化合物之間的有效性。
第二種評(píng)估方法使用了與腎小球障礙(如糖尿病性腎病)的相關(guān)的作為指示物的臨床標(biāo)記物，包括步驟對(duì)上述megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物并在該測(cè)試化合物給服后測(cè)定該疾病模型動(dòng)物中腎/身體重量比、蛋白尿水平和血甘油三酯的至少任一種。具體地說，在該方法中，對(duì)腎機(jī)能障礙療效的評(píng)估是基于增加的腎/身體重量比、蛋白尿和血甘油三酯的一種或多種指示物。
在上述第二種評(píng)估方法中，首先，對(duì)本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物。如上所述，對(duì)于給藥途徑并不限制?；谏鲜鲋甘疚?，對(duì)通過給藥處理的疾病模型動(dòng)物以及沒有事先給服測(cè)試化合物的對(duì)照模型動(dòng)物的腎機(jī)能進(jìn)行比較。此外，模型動(dòng)物可與健康動(dòng)物對(duì)象進(jìn)行比較。用于測(cè)定腎/身體重量比、蛋白尿和血甘油三酯增加的方法同上所述。與未處理組比較，當(dāng)給服一種測(cè)試化合物時(shí)，該化合物可緩解腎障礙或恢復(fù)腎機(jī)能至正常動(dòng)物水平，此化合物可作為腎小球衰竭的伴發(fā)腎機(jī)能障礙(例如糖尿病性腎病)的治療藥。
第三種評(píng)估方法包括步驟對(duì)本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物，評(píng)估通過給服測(cè)試化合物該腎小球系膜基質(zhì)是否已改變，或改變程度是否已減小。在該評(píng)估方法中，通過對(duì)腎小球系膜基質(zhì)組織學(xué)檢查來評(píng)估對(duì)腎機(jī)能障礙的緩解效果。特別是，在腎小球衰竭的伴發(fā)腎機(jī)能障礙中，如糖尿病性腎病中，可觀測(cè)到腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張、免疫球蛋白和/或補(bǔ)體的沉積的增加、膠原蛋白、層粘連蛋白和/或纖連蛋白的增加。因此，基于任一這些癥狀的緩解或恢復(fù)，完成了評(píng)估。
更具體地說，對(duì)本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物。給藥方法并不特別受限制。根據(jù)測(cè)試化合物，該方法可作適當(dāng)選擇。對(duì)通過給藥處理的疾病模型動(dòng)物和事先沒有給服測(cè)試化合物的對(duì)照模型動(dòng)物的腎小球系膜基質(zhì)進(jìn)行組織學(xué)比較。例如，通過測(cè)量PAS染色的腎小球系膜基質(zhì)的面積以評(píng)估腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張是否得到緩解。與未處理組比較，如果在給服該測(cè)試化合物組中腎小球系膜基質(zhì)面積減小或恢復(fù)到正常動(dòng)物水平，則該測(cè)試化合物被評(píng)估為對(duì)腎小球衰竭的伴腎機(jī)能障礙(如糖尿病性腎病)具有療效。同樣地，利用抗免疫球蛋白或補(bǔ)體的特異性抗體對(duì)腎小球系膜基質(zhì)免疫染色以測(cè)定沉積的免疫球蛋白或補(bǔ)體的量。當(dāng)給服測(cè)試化合物組的該數(shù)值小于未處理組的該數(shù)值時(shí)，該測(cè)試化合物被評(píng)估為對(duì)腎小球衰竭的伴腎機(jī)能障礙具有療效?；蛘?，利用抗膠原蛋白、層粘連蛋白和/或纖連蛋白的特異性抗體對(duì)腎小球系膜基質(zhì)免疫染色以測(cè)定它們的含量。如果給服測(cè)試化合物組的該數(shù)值小于未處理組的該數(shù)值，則該測(cè)試化合物被評(píng)估為對(duì)腎小球衰竭的伴腎機(jī)能障礙具有療效。
第四種評(píng)估方法包括步驟對(duì)本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物，并評(píng)估在給服該測(cè)驗(yàn)化合物后該疾病模型動(dòng)物的腎小管間質(zhì)組織是否已改變或改變程度是否已減小。在該評(píng)估方法中，通過腎小管間質(zhì)組織的組織學(xué)檢查對(duì)腎機(jī)能障礙的緩解效果進(jìn)行評(píng)估?；谠谕砥谌祟愄悄虿⌒阅I病的晚期病理癥狀中所觀察到的腎小管間質(zhì)組織病理學(xué)狀態(tài)，該評(píng)估方法檢查該病理狀態(tài)是否已緩解或恢復(fù)。
具體地說，對(duì)本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物。對(duì)通過給藥處理的該疾病模型動(dòng)物和事先沒有給服測(cè)試化合物的對(duì)照模型動(dòng)物的腎小管間質(zhì)組織進(jìn)行組織學(xué)比較。例如，利用上述抗α-SMA的抗體通過組織學(xué)染色或直接通過顯微鏡檢查可定量腎小管間質(zhì)性纖維變性。接著，如果與未處理組相比在給服測(cè)試化合物組中腎小管間質(zhì)性纖維變性程度減小，或如果如同在正常動(dòng)物體內(nèi)一樣纖維變性變得檢測(cè)不到，則該測(cè)試化合物被評(píng)估為對(duì)腎小球衰竭的伴腎機(jī)能障礙(例如糖尿病性腎病)具有療效。同樣地，利用抗炎性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)的特異性抗體對(duì)腎小管間質(zhì)組織免疫染色，以測(cè)定所存在的炎性細(xì)胞的比例。如果給服測(cè)試化合物組的測(cè)定值小于未處理組的測(cè)定值，則該測(cè)試化合物被評(píng)估為對(duì)腎小球衰竭的伴腎機(jī)能障礙具有療效。
本發(fā)明也提供了用于評(píng)估對(duì)糖尿病療效的方法。該方法包括步驟(1)對(duì)上述megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)在給服測(cè)試化合物后測(cè)定該疾病模型動(dòng)物的葡萄糖水平和/或胰島素水平。
在本發(fā)明的評(píng)估方法中，作用于糖尿病的療效程度可使用糖尿病標(biāo)記物(如葡萄糖或胰島素水平)作為指示物進(jìn)行評(píng)估。葡萄糖水平測(cè)定的對(duì)象可以是任何類型的體液，包括血、尿和汗。當(dāng)要測(cè)定胰島素水平時(shí)，優(yōu)選的樣品是血。或者，血紅蛋白Hcl、糖化白蛋白、果糖胺、尿酮體等可用作為評(píng)估對(duì)糖尿病癥狀療效的指標(biāo)。對(duì)糖尿病療效可通過在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)這些診斷指示物的改變而得到評(píng)估。因此，通過在給服測(cè)試化合物前后觀測(cè)這些指標(biāo)并比較所獲得結(jié)果，可以評(píng)估測(cè)試化合物作為治療藥的療效?；蛘?，當(dāng)使用來源自同一品系的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，也可通過觀測(cè)不同動(dòng)物之間的該指標(biāo)并比較所獲得結(jié)果以比較不同測(cè)試化合物之間的療效。
所有本文引證的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)在此都引入作為參考。
在下文中，本發(fā)明根據(jù)實(shí)施例將得到具體描述，但不應(yīng)理解為受之所限。
制備megsin/RAGE/iNOS-Tg將RAGE/iNOS-Tg小鼠(Yamamoto，Y.，等，J.Clin.Invest.，108261-268(2001))與megsin-Tg小鼠(Miyata，T.，等，J.Clin.Invest.，109585-593(2002))雜交以獲得megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠。從尾部組織提取基因組DNA，并依照描述于文獻(xiàn)(Yamamoto，Y.，等，J.Clin.Invest.，108261-268(2001)；Miyata，T.，等，J.Clin.Invest.，109585-593(2002))中的方法通過PCR證實(shí)RAGE、iNOS和megsin的表達(dá)。具體地說，在出生4周或更遲后切下Tg小鼠尾巴的一部分，利用DNA抽提試劑盒(Qiagen組織試劑盒；Qiagen)提取基因組DNA。使用該基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增導(dǎo)入基因的片段以證實(shí)每種導(dǎo)入基因的存在。對(duì)于megsin的PCR檢測(cè)，使用了β-gl-3引物(5’-CTT CTG GCG TGT GAC CGG CG-3’/SEQ ID NO4)和hM2-2引物(5’-ATC GAA TTC TGA GAT CAT AAT CCC TGT GGG ATGC-3’，SEQ ID NO5)，以及選用通過利用這些引物獲得其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(400bp)的個(gè)體(圖1)。對(duì)于RAGE基因的測(cè)定，使用了flk-1啟動(dòng)子引物(5’-AGG GAC GGA GAA GGA GT-3’/SEQ ID NO6；Ronicke，V.等，Circ.Res.，79277-285(1996))和人類RAGE基因引物(5’-TCACCCCACAGACTGAG-3’/SEQ ID NO7；Sugaya，K.等，Genomics，23408-419(1994))，并檢測(cè)到354bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。對(duì)于iNOS基因的檢測(cè)，使用了F-引物(5’-GTGGGCTATGGGTTTGTGGAAGGAGA-3’，SEQ ID NO8)和R-引物(5’-CGATGTCACATGCAGCTTGT-3’/SEQ ID NO9)，并檢測(cè)到800bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。將所獲得的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠與非轉(zhuǎn)基因CD1小鼠(Charles River Japan，Inc.)回交以擁有CD-1遺傳背景。
megsin/RAGE/iNOS-Tg中病理檢查結(jié)果從16周齡megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠上切下腎，依照常規(guī)方法及描述于WO 01/24628中的方法進(jìn)行腎小球的PAS染色和PAM染色。將卡諾伊氏(Carnoy′s)固定液固定的組織包埋于石蠟中并切成4微米切片，用于PAM染色。PAS染色(高碘酸希夫反應(yīng))一般將多糖染為紅色。在腎病理中，腎小球系膜基質(zhì)增生和基底膜增厚可通過將糖蛋白染為紅色而觀察到，該糖蛋白是腎小球系膜基質(zhì)和基底膜的組成成分。同時(shí)，在PAM染色(高碘酸-六亞甲基四胺銀鹽染色法)中，基底膜和結(jié)締組織的組成成分通常染為黑色(銀浸漬)。在腎病理中，腎小球系膜基質(zhì)硬化(纖維變性)和基底膜增厚被染為黑色。
PAS染色和PAM染色結(jié)果示于圖2中。依照PAS染色結(jié)果，在9只megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中高血糖癥組(6只小鼠；500mg/dl或更高的血糖水平)的所有病例中均發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的腎小球障礙(結(jié)節(jié)性硬化損傷)。在野生型小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)異常。具體地說，發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域中到處散布著明顯的腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張，也檢測(cè)到了腎小球肥大。同時(shí)，顯示了嚴(yán)重減少的腎小球細(xì)胞計(jì)數(shù)和伴發(fā)腎小球細(xì)胞死亡的腎小球硬化的圖像。此外，也通過PAM染色證實(shí)了擴(kuò)張的腎小球系膜基質(zhì)的硬化。
在對(duì)照RAGE/iNOS-Tg小鼠(11只小鼠；其中10只來自高血糖癥組(400mg/dl或更高))中局部發(fā)現(xiàn)了具有整體(global)或節(jié)段性腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張的腎小球。腎小球細(xì)胞計(jì)數(shù)保持不變。幾乎沒有發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)性改變。通過PAM染色檢測(cè)的硬化較RAGE/iNOS/megsin-Tg小鼠為輕。此外，在16周的megsin-Tg小鼠中沒有檢測(cè)到特定的病理檢查結(jié)果(圖2)。
megsin/RAGE/iNOS-Tg中腎重及尿和血的生化檢驗(yàn)測(cè)定16周齡megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中腎重及尿和血的生化參數(shù)(表1)。其它Tg小鼠(iNOS-Tg、RAGE/iNOS-Tg、megsin/iNOS-Tg、megsin/RAGE-Tg、megsin-Tg和RAGE-Tg)以及野生型小鼠(CD-1)作為對(duì)照用于比較。所要測(cè)定的項(xiàng)目如下體重(BW)；腎重(KW)；血清總蛋白(TP雙縮脲法)；甘油三酯(TGLPL/GK/GPDH-心肌黃酶/甲 染色法)；總膽固醇(Tcho酶法)；尿素氮(BUN脲酶-紫外光法)；肌酸酐(Cr堿性苦味酸鹽法)；胰島素(胰島素ELISA)；血糖水平(GLUGOD/POD法)；GOT；和GPT；尿白蛋白(HbA1c乳膠凝集反應(yīng)抑制法)；總蛋白(TP鄰苯三酚紅法)；尿素氮(BUN脲酶-紫外光法)；以及肌酸酐(Cr堿性苦味酸鹽測(cè)定法)。所顯示的TP、CRE和GLU的結(jié)果是使用尿(一次收集的單泡尿(spot urine))作為樣品測(cè)定的。
如表1所示，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠的KW/BW高于RAGE/iNOS-Tg小鼠和megsin-Tg小鼠，并且在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中可見腎肥大。此外，在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中也可見白蛋白尿和增加的血甘油三酯水平。此外，與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠也表現(xiàn)出體重過輕、高血糖癥和低胰島素血癥。
表1三Tg生化數(shù)據(jù)信息16周齡，CD-1(F4)


*1P＜0.001，vs CD-1注釋1通過DRI CEHM 3500V(FUJIFILM MEDICAL CO.，LTD.)測(cè)定。
*2P＜0.05，VS CD-1 注釋2由于大量的溶血樣品，胰島素?cái)?shù)據(jù)是參考值。
*3P＜0.01，vs CD-1 注釋3由于樣品不足，無法測(cè)定meg組的“ALB/CRE比”。
nonNS 通過免疫熒光顯微法沉積免疫復(fù)合物使用免疫熒光顯微法檢查免疫復(fù)合物沉積。將收集自megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠的腎組織包埋于冷凍組織包埋劑(OCT化合物；Tissue Tek Miles，Elkhart，IN)中，并在干冰/丙酮中快速凍結(jié)。自該凍結(jié)的包埋組織制備4μm冷凍切片。在室溫下于4％脫脂乳中封閉處理這些冷凍切片60分鐘，然后與1∶200稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)-標(biāo)記的山羊抗-小鼠IgG、IgA、IgM和C3抗體(CappelResearch Products)的任一個(gè)在4℃恒溫培育過夜。反應(yīng)后，用PB S洗滌切片并用甘油-PBS制成標(biāo)本，然后在熒光顯微鏡下檢查。
結(jié)果顯示與RAGE/iNOS-Tg小鼠相比，在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠腎小球系膜基質(zhì)中免疫球蛋白和補(bǔ)體的沉積增加了(圖3和4)。
腎小球系膜基質(zhì)改變通過免疫組織化學(xué)染色檢查16周Tg小鼠腎小球系膜基質(zhì)的改變。為鑒定腎小球系膜基質(zhì)組成成分，利用下列所示的抗體通過免疫組織學(xué)染色方法(Nangaku，M.等，J.Am.Soc.Nephrol.10，2323-2331，1999)處理冷凍切片。利用山羊抗-IV型膠原蛋白多克隆抗體(Southern Biotechnology)鑒定IV型膠原蛋白；利用兔抗-纖連蛋白抗體(Chemicon)鑒定纖連蛋白；以及利用兔抗-層粘連蛋白抗體(Chemicon)鑒定層粘連蛋白。
當(dāng)與RAGE/iNOS-Tg和megsin-Tg對(duì)照小鼠比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠擴(kuò)張的腎小球系膜基質(zhì)中IV型膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白增加了(圖5、6和7)。已知在人類糖尿病性腎病中也檢測(cè)到這樣的現(xiàn)象。
在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，由于megsin過表達(dá)而擴(kuò)張的基質(zhì)重塑迅速削弱了，由此加劇了腎小球障礙并縮短了硬化發(fā)病前的時(shí)間。還推測(cè)megsin/RAGE/iNOS-Tg動(dòng)物的腎小球是由暴露于諸如高度megsin表達(dá)和高血糖癥的負(fù)荷下的腎小球系膜細(xì)胞和在氧化應(yīng)激下的內(nèi)皮細(xì)胞組成。當(dāng)僅有腎小球系膜細(xì)胞暴露于megsin過表達(dá)和高血糖癥的負(fù)荷下時(shí)，腎小球障礙十分輕微(megsin/iNOS-Tg)。但是，如果內(nèi)皮細(xì)胞也暴露于如AGE-RAGE途徑激活，具體地說，在強(qiáng)氧化應(yīng)激和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子的負(fù)荷下，臨床狀況變得愈加嚴(yán)重。這由在其葡萄糖水平是正常的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠(Tg小鼠中的內(nèi)皮細(xì)胞沒有處在AGE-RAGE途徑激活的負(fù)荷下)中臨床狀況十分輕微的事實(shí)所支持。該megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠模型表明腎小球系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互干擾影響了病理學(xué)發(fā)展。
megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠病理學(xué)分析利用電子顯微鏡進(jìn)行megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠腎組織的病理學(xué)分析。將取自16周齡megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠的腎組織通過先在含有2％戊二醛的0.1M磷酸鈉緩沖液中浸沒2小時(shí)，然后在2％四氧化鋨中浸沒來固定。用乙醇對(duì)固定的腎組織脫水并在脫水后將其包埋在Epon 812(TAAB；England)中。用乙酸雙氧鈾對(duì)從樣品上切下的超薄切片染色并用丙酮處理，然后利用透射電子顯微鏡(在20,000倍放大率；JEM-1200EX，JEOL LTD.，Japan)進(jìn)行分析。
分析結(jié)果示于圖8中。足突損失和腎小球上皮細(xì)胞中高密度沉淀物、以及腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中透明斑損失見于megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中(A)。此外，不規(guī)則分層的腎小球基底膜(B)、腎小球系膜基質(zhì)增生以及結(jié)節(jié)(C)、還有在腎小球上皮細(xì)胞中泡狀結(jié)構(gòu)(D)見于megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中。這些檢測(cè)結(jié)果表明在構(gòu)成megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠腎小球(上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及腎小球系膜細(xì)胞)和基底膜的細(xì)胞中出現(xiàn)了形態(tài)異常。
由于高megsin表達(dá)加速了腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張通過計(jì)算機(jī)圖像分析檢查8周齡和16周齡megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠腎小球損傷。同齡的野生型小鼠、megsin-Tg小鼠和RAGE/iNOS-Tg小鼠也通過同一程序分析。具體地說，制備每種測(cè)試小鼠的PAS-染色的腎切片。使用3CCD照相機(jī)(Olympus Optical Co.，Tokyo，Japan)對(duì)每張染色圖像進(jìn)行掃描，并利用Image Grabber PCI軟件(Fuji Photo Film Co.，Tokyo Japan)和MacAspect(Mitani Co.，Tokyo，Japan)檢查腎小球簇區(qū)和腎小球系膜區(qū)(腎小球簇區(qū)的一部分)并通過單盲法分析測(cè)定腎小球細(xì)胞計(jì)數(shù)。檢查了中皮質(zhì)(midcortex)中的20個(gè)連續(xù)腎小球單位。將僅含有少量腎小球簇的腎小球橫切片(在一個(gè)橫切片中含有20個(gè)或更少的獨(dú)立管狀節(jié)段)排除在實(shí)驗(yàn)對(duì)象之外。此外，為避免實(shí)驗(yàn)者偏差，將最大和最小的腎小球從20個(gè)腎小球測(cè)試對(duì)象中排除。測(cè)試每個(gè)切片中剩下的18個(gè)腎小球并將平均水平表示為“平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差”。使用16周齡小鼠獲得的分析結(jié)果示于圖9中，使用8周齡小鼠的結(jié)果示于圖10中。
與野生型和megsin-Tg小鼠比較，腎小球肥大均見于16周齡的RAGE/iNOS-Tg小鼠和megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中(圖9(a))。在RAGE/iNOS-Tg小鼠中高megsin表達(dá)并不能加速腎小球肥大。在16周齡時(shí)，野生型小鼠、megsin-Tg小鼠和RAGE/iNOS-Tg小鼠顯示出在其腎小球系膜基質(zhì)尺寸上的差異。但是，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中高megsin表達(dá)顯著地加速了腎小球系膜基質(zhì)的擴(kuò)張(圖9(b))。與RAGE/iNOS-Tg小鼠相比，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中這些檢測(cè)結(jié)果與重度腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張以及結(jié)節(jié)性損傷相關(guān)。
同時(shí)，在8周的早期Tg小鼠中檢測(cè)到腎小球簇區(qū)肥大，而在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中肥大程度愈加嚴(yán)重(圖10(a))。在同齡野生型、RAGE/iNOS-Tg和megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠之間的腎小球系膜基質(zhì)/腎小球簇區(qū)比值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，但在轉(zhuǎn)基因小鼠中存在著比值增加的趨向(圖10(b))。
高megsin表達(dá)引起的腎小球細(xì)胞早期增生描述于實(shí)施例7中的腎小球細(xì)胞計(jì)數(shù)圖像分析結(jié)果顯示了在8周的早期megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加(圖10(c))。同時(shí)，與16周齡RAGE/iNOS-Tg小鼠中的細(xì)胞計(jì)數(shù)相比，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中細(xì)胞計(jì)數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少了(圖9(c))。此外，任一16周齡轉(zhuǎn)基因小鼠中腎小球細(xì)胞計(jì)數(shù)大于同齡野生型小鼠中的腎小球細(xì)胞計(jì)數(shù)。
megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中腎小球或腎小管間質(zhì)性障礙進(jìn)行免疫組織學(xué)染色用于檢測(cè)腎小球病和巨噬細(xì)胞浸潤。用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的小鼠單克隆抗體(400倍稀釋；Boehringer Mannheim；Mannheim，Germany)和抗F4/80的大鼠單克隆抗體(400倍稀釋；Caltag laboratories；Burlingame，CA，USA)染色甲基Carnoy固定的4μm切片，該α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是腎小球系膜細(xì)胞活化和腎小管間質(zhì)性纖維變性的標(biāo)記物，該F4/80是小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物。通過間接免疫過氧化物酶法使一級(jí)抗體的位置可見(Miyata T，Inagi R，等，Overexpression of the serpin megsininduces progressive mesangial cell proliferation and expansion，JCI 109，2002)。
如α-SMA免疫染色所示，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠的腎小球障礙與腎小球系膜細(xì)胞活化相關(guān)(圖11(a))。在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠腎小管和間質(zhì)細(xì)胞的某些部分中檢測(cè)到α-SMA的重新表達(dá)，這表明出現(xiàn)了腎小管間質(zhì)性纖維變性(圖11(a))。通過F4/80染色在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中檢測(cè)到炎性細(xì)胞浸潤到腎小管間質(zhì)組織中(圖11(b))。
在megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中氧化應(yīng)激增加近來研究已表明在糖尿病性腎病中氧化應(yīng)激扮演著病原的角色。因此，本發(fā)明人比較了RAGE/iNOS-Tg和megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠之間的氧化應(yīng)激狀態(tài)。對(duì)這些小鼠對(duì)象進(jìn)行尿8-OHdG測(cè)試，該8-OHdG為一種氧化應(yīng)激標(biāo)記物。利用ELISA試劑盒(8-OHdG Check(高靈敏的)；Japan Aging Controllaboratories；Shizuoka，Japan)檢測(cè)8-OHdG。利用Vivaspin(＞10,000截留分子量；Vivascience AG；Hannover，Germany)通過超濾處理該測(cè)試中使用的尿，然后測(cè)定尿中的8-OHdG水平。使用尿肌酸對(duì)測(cè)定值規(guī)范化。結(jié)果示于圖12中。
megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中平均尿8-OHdG水平較野生型小鼠高2倍或更多。該差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。當(dāng)與RAGE/iNOS-Tg小鼠比較時(shí)，megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中尿8-OHdG的增加也是相當(dāng)高的(圖12)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的模型動(dòng)物表現(xiàn)出伴嚴(yán)重腎機(jī)能障礙(白蛋白尿)和腎小球病理(腎小球系膜基質(zhì)增生，基底膜增厚以及結(jié)節(jié)性硬化損傷)的高血糖癥，特別是，表現(xiàn)出非常類似于人類糖尿病性腎病的臨床狀況。糖尿病性腎病的常規(guī)模型動(dòng)物僅表現(xiàn)出很少的病理特征。相反，本發(fā)明的模型動(dòng)物在早期就表現(xiàn)出慢性漸進(jìn)性病理。
具體地說，在本發(fā)明8周或16周的早期megsin/RAGE/iNOS表達(dá)的Tg小鼠中觀察到腎小球肥大和腎小球細(xì)胞增生，這表明腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張的加速。
上述腎小球早期形態(tài)異常引起了腎小球障礙(腎小球系膜細(xì)胞活化)、加劇了腎小管間質(zhì)性障礙(纖維變性)、間質(zhì)中巨噬細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激增加等，且16周齡三Tg小鼠表現(xiàn)出糖尿病性腎病的晚期病理癥狀(結(jié)節(jié)性損傷，以及腎小球簇和腎小囊的黏附)。
相比較的16周齡RAGE/iNOS-Tg還保留著早期病理(腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張)的病理癥狀，沒有觀察到上述晚期病理。但是，在16周齡megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠中觀察到的結(jié)節(jié)性損傷最終在36周齡的RAGE/iNOS-Tg中檢測(cè)到。
如上所述，本發(fā)明的早期megsin/RAGE/iNOS-Tg能顯示出晚期病理，因此預(yù)計(jì)該megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠對(duì)于貧乏的晚期發(fā)病機(jī)理分子病理學(xué)深入研究是有幫助的。
此外，megsin過表達(dá)加速了本發(fā)明疾病模型動(dòng)物中腎小球系膜細(xì)胞損傷，使之可以更詳細(xì)且在更寬范圍的損傷階段中比較并分析糖尿病性腎病中megsin病理生理學(xué)和腎小球系膜細(xì)胞病理生理學(xué)之間的差異。因此，本發(fā)明的megsin/RAGE/iNOS-Tg小鼠可用作開發(fā)抑制進(jìn)展至晚期病理的腎障礙的新型診斷方法和藥物的評(píng)估模型。
此外，因?yàn)橥砥诓±淼陌l(fā)病率高，因此該小鼠對(duì)于闡明糖尿病性腎病的發(fā)病/進(jìn)展機(jī)制以及藥物開發(fā)是有用的。此外，該模型動(dòng)物對(duì)于開發(fā)治療上述腎小球衰竭的伴腎機(jī)能障礙的藥物是有用的。本申請(qǐng)不僅提供了疾病模型動(dòng)物，也提供了利用該模型動(dòng)物評(píng)估腎機(jī)能障礙治療藥物的系統(tǒng)。因此，在對(duì)伴發(fā)腎機(jī)能障礙的疾病的臨床研究和藥物開發(fā)中，本發(fā)明是非常有用的。此外，本發(fā)明的疾病模型動(dòng)物表現(xiàn)出高血糖癥，因此在糖尿病臨床研究和開發(fā)治療和預(yù)防藥物中預(yù)計(jì)也是非常有用的。
序列表<110>獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)株式會(huì)社基因課題<120>表達(dá)MEGSIN/RAGE/iNOS的疾病模型動(dòng)物及借助于該動(dòng)物評(píng)估化合物的方法<130>F2-A0302P<150>JP 2003-415779<151>2003-12-12<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1143<212>DNA<213>現(xiàn)代人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1140)<223>
<400>1atg gcc tcc ctt gct gca gca aat gca gag ttt tgc ttc aac ctg ttc 48Met Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asn Ala Glu Phe Cys Phe Asn Leu Phe1 5 10 15aga gag atg gat gac aat caa gga aat gga aat gtg ttc ttt tcc tct 96Arg Glu Met Asp Asp Asn Gln Gly Asn Gly Asn Val Phe Phe Ser Ser20 25 30ctg agc ctc ttc gct gcc ctg gcc ctg gtc cgc ttg ggc gct caa gat144Leu Ser Leu Phe Ala Ala Leu Ala Leu Val Arg Leu Gly Ala Gln Asp35 40 45gac tcc ctc tct cag att gat aag ttg ctt cat gtt aac act gcc tca192Asp Ser Leu Ser Gln Ile Asp Lys Leu Leu His Val Asn Thr Ala Ser50 55 60
gga tat gga aac tct tct aat agt cag tca ggg ctc cag tct caa ctg240Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Asn Ser Gln Ser Gly Leu Gln Ser Gln Leu65 70 75 80aaa aga gtt ttt tct gat ata aat gca tcc cac aag gat tat gat ctc288Lys Arg Val Phe Ser Asp Ile Asn Ala Ser His Lys Asp Tyr Asp Leu85 90 95agc att gtg aat ggg ctt ttt gct gaa aaa gtg tat ggc ttt cat aag336Ser Ile Val Asn Gly Leu Phe Ala Glu Lys Val Tyr Gly Phe His Lys100 105 110gac tac att gag tgt gcc gaa aaa tta tac gat gcc aaa gtg gag cga384Asp Tyr Ile Glu Cys Ala Glu Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Val Glu Arg115 120 125gtt gac ttt acg aat cat tta gaa gac act aga cgt aat att aat aag432Val Asp Phe Thr Asn His Leu Glu Asp Thr Arg Arg Asn Ile Asn Lys130 135 140tgg gtt gaa aat gaa aca cat ggc aaa atc aag aac gtg att ggt gaa480Trp Val Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Asn Val Ile Gly Glu145 150 155 160ggt ggc ata agc tca tct gct gta atg gtg ctg gtg aat gct gtg tac528Gly Gly Ile Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr165 170 175ttc aaa ggc aag tgg caa tca gcc ttc acc aag agc gaa acc ata aat576Phe Lys Gly Lys Trp Gln Ser Ala Phe Thr Lys Ser Glu Thr Ile Asn180 185 190tgc cat ttc aaa tct ccc aag tgc tct ggg aag gca gtc gcc atg atg624Cys His Phe Lys Ser Pro Lys Cys Ser Gly Lys Ala Val Ala Met Met195 200 205cat cag gaa cgg aag ttc aat ttg tct gtt att gag gac cca tca atg672His Gln Glu Arg Lys Phe Asn Leu Ser Val Ile Glu Asp Pro Ser Met210 215 220
aag att ctt gag ctc aga tac aat ggt ggc ata aac atg tac gtt ctg 720Lys Ile Leu Glu Leu Arg Tyr Asn Gly Gly Ile Asn Met Tyr Val Leu225 230 235 240ctg cct gag aat gac ctc tct gaa att gaa aac aaa ctg acc ttt cag 768Leu Pro Glu Asn Asp Leu Ser Glu Ile Glu Asn Lys Leu Thr Phe Gln245 250 255aat cta atg gaa tgg acc aat cca agg cga atg acc tct aag tat gtt 816Asn Leu Met Glu Trp Thr Asn Pro Arg Arg Met Thr Ser Lys Tyr Val260 265 270gag gta ttt ttt cct cag ttc aag ata gag aag aat tat gaa atg aaa 864Glu Val Phe Phe Pro Gln Phe Lys Ile Glu Lys Asn Tyr Glu Met Lys275 280 285caa tat ttg aga gcc cta ggg ctg aaa gat atc ttt gat gaa tcc aaa 912Gln Tyr Leu Arg Ala Leu Gly Leu Lys Asp Ile Phe Asp Glu Ser Lys290 295 300gca gat ctc tct ggg att gct tcg ggg ggt cgt ctg tat ata tca agg 960Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Ser Arg305 310 315 320atg atg cac aaa tct tac ata gag gtc act gag gag ggc acc gag gct1008Met Met His Lys Ser Tyr Ile Glu Val Thr Glu Glu Gly Thr Glu Ala325 330 335act gct gcc aca gga agt aat att gta gaa aag caa ctc cct cag tcc1056Thr Ala Ala Thr Gly Ser Asn Ile Val Glu Lys Gln Leu Pro Gln Ser340 345 350acg ctg ttt aga gct gac cac cca ttc cta ttt gtt atc agg aag gat1104Thr Leu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Val Ile Arg Lys Asp355 360 365gac atc atc tta ttc agt ggc aaa gtt tct tgc cct tga1143Asp Ile Ile Leu Phe Ser Gly Lys Val Ser Cys Pro370 375 380<210>2
<211>1391<212>DNA<213>現(xiàn)代人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1215)<223>
<400>2ggg gca gcc gga aca gca gtt gga gcc tgg gtg ctg gtc ctc agt ctg 48Gly Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15tgg ggg gca gta gta ggt gct caa aac atc aca gcc cgg att ggc gag 96Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30cca ctg gtg ctg aag tgt aag ggg gcc ccc aag aaa cca ccc cag cgg144Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45ctg gaa tgg aaa ctg aac aca ggc cgg aca gaa gct tgg aag gtc ctg192Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60tct ccc cag gga gga ggc ccc tgg gac agt gtg gct cgt gtc ctt ccc240Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80aac ggc tcc ctc ttc ctt ccg gct gtc ggg atc cag gat gag ggg att288Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95ttc cgg tgc agg gca atg aac agg aat gga aag gag acc aag tcc aac336Phe Arg Cys Arg Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn100 105 110tac cga gtc cgt gtc tac cag att cct ggg aag cca gaa att gta gat384Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125
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cct gag ata ggg cct cag gac cag gga acc tac agc tgt gtg gcc acc 912Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr290 295 300cat tcc agc cac ggg ccc cag gaa agc cgt gct gtc agc atc agc atc 960His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile305 310 315 320atc gaa cca ggc gag gag ggg cca act gca ggc tct gtg gga gga tca 1008Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335ggg ctg gga act cta gcc ctg gcc ctg ggg atc ctg gga ggc ctg ggg 1056Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly340 345 350aca gcc gcc ctg ctc att ggg gtc atc ttg tgg caa agg cgg caa cgc 1104Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg355 360 365cga gga gag gag agg aag gcc cca gaa aac cag gag gaa gag gag gag 1152Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu370 375 380cgt gca gaa ctg aat cag tcg gag gaa cct gag gca ggc gag agt agt 1200Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser385 390 395 400act gga ggg cct tga ggggcccaca gacagatccc atccatcagc tcccttttct 1255Thr Gly Gly Prottttcccttg aactgttctg gcctcagacc aactctctcc tgtataatct ctctcctgta1315taaccccacc ttgccaagct ttcttctaca accagagccc cccacaatga tgattaaaca1375cctgacacat cttgca1391<210>3<211>3991<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)<220>
<221>CDS<222>(185)..(3619)<223>
<400>3aggccccacg ggacacagtg tcactggttt gaaacttctc agccaccttg gtgaagggac 60tgagctgtta gagacacttc tgaggctcct cacgcttggg tcttgttcac tccacggagt120agcctagtca actgcaagag aacggagaac gttggatttg gagcagaagt gcaaagtctc180agac atg gct tgc ccc tgg aag ttt ctc ttc aaa gtc aaa tcc tac caa 229Met Ala Cys Pro Trp Lys Phe Leu Phe Lys Val Lys Ser Tyr Gln1 5 10 15agt gac ctg aaa gag gaa aag gac att aac aac aac gtg aag aaa acc 277Ser Asp Leu Lys Glu Glu Lys Asp Ile Asn Asn Asn Val Lys Lys Thr20 25 30cct tgt gct gtt ctc agc cca aca ata caa gat gac cct aag agt cac 325Pro Cys Ala Val Leu Ser Pro Thr Ile Gln Asp Asp Pro Lys Ser His35 40 45caa aat ggc tcc ccg cag ctc ctc act ggg aca gca cag aat gtt cca 373Gln Asn Gly Ser Pro Gln Leu Leu Thr Gly Thr Ala Gln Asn Val Pro50 55 60gaa tcc ctg gac aag ctg cat gtg aca tcg acc cgt cca cag tat gtg 421Glu Ser Leu Asp Lys Leu His Val Thr Ser Thr Arg Pro Gln Tyr Val65 70 75agg atc aaa aac tgg ggc agt gga gag att ttg cat gac act ctt cac 469Arg Ile Lys Asn Trp Gly Ser Gly Glu Ile Leu His Asp Thr Leu His80 85 90 95cac aag gcc aca tcg gat ttc act tgc aag tcc aag tct tgc ttg ggg 517His Lys Ala Thr Ser Asp Phe Thr Cys Lys Ser Lys Ser Cys Leu Gly100 105 110
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<223>人工合成引物序列<400>9cgatgtcaca tgcagcttgt 20
權(quán)利要求
1.一種疾病模型動(dòng)物，其表達(dá)megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因，其中該模型動(dòng)物包括非人類哺乳動(dòng)物。
2.權(quán)利要求1的疾病模型動(dòng)物，其導(dǎo)入有megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因。
3.權(quán)利要求1或2的疾病模型動(dòng)物，表現(xiàn)出至少一種選自下列表型(a)-(f)的表型(a)腎/身體重量比增加；(b)尿白蛋白水平增加；(c)血甘油三酯水平增加；(d)體重過輕(發(fā)育不全)；(e)高血糖癥；(f)低胰島素血癥；和(g)尿8-OHdG水平增加。
4.權(quán)利要求1或2的疾病模型動(dòng)物，其腎小球系膜基質(zhì)中表現(xiàn)出至少一種下列檢測(cè)結(jié)果(a)腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張；(b)免疫球蛋白和/或補(bǔ)體沉積的增強(qiáng)；和(c)膠原蛋白、層粘連蛋白和/或纖連蛋白的增加。
5.權(quán)利要求1或2的疾病模型動(dòng)物，其在腎小管間質(zhì)組織中表現(xiàn)出表型(a)纖維變性；和/或(b)炎性細(xì)胞浸潤。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的疾病模型動(dòng)物，其中megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因來自人類。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的疾病模型動(dòng)物，其中所述疾病為糖尿病性腎病。
8.一種創(chuàng)建疾病模型動(dòng)物的方法，包括將megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因?qū)敕侨祟惒溉閯?dòng)物受精卵的步驟，其中該疾病模型動(dòng)物包括非人類哺乳動(dòng)物，在該非人類哺乳動(dòng)物中該megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因的表達(dá)增強(qiáng)了。
9.一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)腎機(jī)能障礙療效的方法，包括步驟(1)對(duì)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)檢測(cè)給服該測(cè)試化合物的該疾病模型動(dòng)物腎機(jī)能障礙的緩解效果。
10.一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)腎機(jī)能障礙療效的方法，包括步驟(1)對(duì)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)在給服該測(cè)試化合物后，測(cè)定該疾病模型動(dòng)物中腎/身體重量比、尿白蛋白水平、血甘油三酯水平和尿8-OHdG水平中的至少任一個(gè)。
11.一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)腎機(jī)能障礙療效的方法，包括步驟(1)對(duì)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)在給服該測(cè)試化合物后測(cè)定該疾病模型動(dòng)物的腎小球系膜基質(zhì)是否改變或該改變是否減小。
12.權(quán)利要求11的方法，其中腎小球系膜基質(zhì)的改變至少是以下之一(a)腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張；(b)免疫球蛋白和/或補(bǔ)體沉積的增強(qiáng)；和(c)膠原蛋白、層粘連蛋白和/或纖連蛋白的增加。
13.一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)腎機(jī)能障礙療效的方法，包括步驟(1)對(duì)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)在給服該測(cè)試化合物后測(cè)定該疾病模型動(dòng)物的腎小管間質(zhì)組織是否改變或該改變是否減小。
14.權(quán)利要求13的方法，其中腎小管間質(zhì)組織的改變是(a)纖維變性；和/或(b)炎性細(xì)胞浸潤。
15.權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)的方法，其中腎機(jī)能障礙是伴發(fā)高血糖癥的腎機(jī)能障礙。
16.一種評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)高血糖癥療效的方法，包括步驟(1)對(duì)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的疾病模型動(dòng)物給服測(cè)試化合物；和(2)在給服該測(cè)試化合物后測(cè)定該疾病模型動(dòng)物中葡萄糖或/胰島素水平。
全文摘要
本發(fā)明通過雜交megsin－Tg和RAGE/iNOS－Tg創(chuàng)建三Tg(megsin/RAGE/iNOS－Tg)。該megsin/RAGE/iNOS－Tg在早期發(fā)展為在常規(guī)模型中未曾見的顯著的糖尿病性腎病病理，并在megsin/RAGE/iNOS－Tg小鼠中同樣觀察到了多種病理癥狀(如腎小球肥大)。此外，也發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出這些癥狀的動(dòng)物可用作糖尿病性腎病的疾病模型動(dòng)物。具體地說，本發(fā)明的疾病模型動(dòng)物強(qiáng)烈表達(dá)megsin基因、編碼晚期糖基化終產(chǎn)物受體的基因以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因。結(jié)果，在早期顯現(xiàn)出腎小球衰竭的伴腎機(jī)能障礙。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1913774SQ20048004146
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2004年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者宮田敏男, 黑川清, 山本博, 岡本宏 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu), 株式會(huì)社基因課題