專利名稱：一種含持家基因的雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及定量比較基因表達(dá)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)的定量比較研究例如檢測細(xì)胞或組織在藥物處理、放射線照射或化學(xué)試劑處理后某一特定基因在mRNA水平上的變化，是新世紀(jì)分子生物學(xué)和臨床診斷的重要課題。為進行比較需要從被比較的樣品中提取總RNA或mRNA，測定RNA的含量并調(diào)節(jié)各個樣品的RNA濃度至相同，然后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA再進行PCR擴增，最后比較不同樣品的擴增產(chǎn)物數(shù)量的多少。由于RNA分離純化過程中難免有不同程度的RNA部分降解和少量的蛋白質(zhì)污染，加之反轉(zhuǎn)錄合成cDNA和PCR合成擴增產(chǎn)物時往往存在管與管之間的差異，往往不同的樣品即使由同一個人、按同一個方法并同批操作，也會因管與管之間存在的差異而使結(jié)果不可靠。由于持家基因的表達(dá)量不因藥物處理等而改變，在基因表達(dá)的定量比較研究時通常以持家基因的擴增產(chǎn)物量來校正被測基因的表達(dá)量。被廣泛應(yīng)用的持家基因至今僅限于beta-肌動球蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)和核糖體RNA(如16s-rRNA)等。前二種持家基因在各種細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄中等豐度的mRNA，其表達(dá)量比占基因總數(shù)90％以上的低豐度mRNA高一至幾個數(shù)量級，而細(xì)胞中核糖體RNA的含量則更遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于各種被測基因的表達(dá)量。由于凝膠上DNA熒光檢測的靈敏度低而PCR擴增又普遍有平臺現(xiàn)象，使得持家基因的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制或流于形式。如果PCR采用較少的循環(huán)數(shù)則目標(biāo)基因的擴增量不能被檢出，反之采用較多的循環(huán)數(shù)因持家基因擴增早已進入平臺而失去了校正的價值。本發(fā)明提出了一種簡單有效的辦法克服了大多數(shù)目標(biāo)基因和持家基因表達(dá)量相差太大、實際上無法應(yīng)用持家基因方法來校正的問題。實時熒光定量PCR根據(jù)到達(dá)閥值的循環(huán)數(shù)來比較定量，但原始模板數(shù)量相差太遠(yuǎn)導(dǎo)致熒光曲線在高于閥值後的斜率顯著不同而影響測定可靠性，本發(fā)明則可克服這種缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題由于持家基因的表達(dá)量往往比目標(biāo)基因的表達(dá)量高一或幾個數(shù)量級，影響了持家基因在基于反轉(zhuǎn)錄PCR的基因表達(dá)比較研究中的校正功能。本發(fā)明提供了一種簡單有效的解決辦法，提高和擴展了持家基因的實際應(yīng)用價值。
發(fā)明構(gòu)思PCR擴增包括變性，退火和延伸步驟，控制變性溫度低于原始模板和擴增產(chǎn)物解鏈所必須的溫度，或者控制退火溫度高于引物退火的最高允許溫度擴增就會流產(chǎn)。對于有目標(biāo)基因引物和持家基因引物并存的雙重擴增，如果設(shè)計引物使目標(biāo)基因擴增產(chǎn)物的解鏈溫度比持家基因擴增產(chǎn)物的解鏈溫度低，通過調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)的變性溫度可以控制目標(biāo)基因和持家基因進行雙重擴增或只進行目標(biāo)基因的擴增。換言之可以在PCR反應(yīng)的起始或中間階段通過控制變性溫度使目標(biāo)基因被富集使之達(dá)到與持家基因表達(dá)量相近、持平或略高的水平，從而使最終的目標(biāo)基因與持家基因的擴增產(chǎn)物物量相近。同樣，設(shè)計持家基因引物比目標(biāo)基因解鏈溫度低，就能通過控制退火溫度來達(dá)到相同的目的。
技術(shù)方案本發(fā)明PCR反應(yīng)液成份包括4種脫氧核糖核苷酸，鎂離子，緩沖液，DNA聚合酶及目標(biāo)基因引物和持家基因引物各一對。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)依次包括如下步驟(1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(2)PCR反應(yīng)液中的DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行擴增反應(yīng)；其特征在于在PCR反應(yīng)的前1-20循環(huán)，有3-15個循環(huán)中只有目標(biāo)基因的擴增而沒有持家基因的擴增。
技術(shù)方案之一設(shè)計持家基因擴增產(chǎn)物的解鏈溫度比目標(biāo)基因擴增產(chǎn)物的解鏈溫度高1-20℃，優(yōu)選值爲(wèi)2-8℃，反應(yīng)開始時控制循環(huán)變性溫度介于目標(biāo)基因擴增產(chǎn)物解鏈溫度和持家基因擴增產(chǎn)物解鏈溫度之間。持家基因擴增因不能完成變性步驟而流產(chǎn)。此階段目標(biāo)基因擴增幾至幾百倍使模板數(shù)量達(dá)到與持家基因模板數(shù)量相當(dāng)?shù)乃?。PCR其余循環(huán)的變性溫度高于持家基因擴增產(chǎn)物的解鏈溫度，在PCR擴增進入平臺前停止反應(yīng)按常規(guī)進行檢測。
技術(shù)方案之二設(shè)計持家基因引物的解鏈溫度比目標(biāo)基因引物解鏈溫度低3-25℃，優(yōu)選值爲(wèi)5-15℃。反應(yīng)開始時控制循環(huán)退火溫度高于持家基因引物的最高允許退火溫度。持家基因擴增因不能完成退火步驟而流產(chǎn)。此階段目標(biāo)基因擴增幾至幾百倍使模板數(shù)量達(dá)到與持家基因模板數(shù)量相當(dāng)?shù)乃?。PCR其余循環(huán)的退火溫度低于持家基因引物的最高允許退火溫度。在PCR擴增進入飽和前停止反應(yīng)按常規(guī)進行檢測。
有益效果通過引物設(shè)計和調(diào)節(jié)變性或退火溫度控制目標(biāo)基因和持家基因的擴增，改進了mRNA表達(dá)的定量比較研究中應(yīng)用持家基因進行校準(zhǔn)的效果，將持家基因校準(zhǔn)方法擴展至非常低度mRNA的表達(dá)研究。
具體實施實施例1實施例1以人腺苷酸環(huán)化酶的一個亞型為目標(biāo)基因(美國國家生物信息中心基因庫編號AB007882)，人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因為持家基因(美國國家生物信息中心基因庫編號XM_006959)。目標(biāo)基因引物和持家基因引物的順序和特性示于表1和2表1，實施例1引物順序

表2，實施例1引物特性

PCR反應(yīng)采用BDClonTech公司的Advantage2-PCR試劑盒，每管體積10ul，反應(yīng)液引物濃度0.4uM，每100ul反應(yīng)液加cDNA10ul，cDNA由人組織總RNA用BDColnTech公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo(dT)為引物合成，每20ul加RNAlug。對照組按常規(guī)方法首次變性94℃1分鐘，循環(huán)變性94℃15秒，退火和延伸68℃1分鐘。試驗組首次變性94℃1分鐘，前6個循環(huán)變性89℃15秒，其余循環(huán)變性94℃15秒，循環(huán)退火溫度均為68℃1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后用聚丙烯酰胺凝膠電泳用SYBR錄I染色。試驗結(jié)果示于表3。
表3，控制變性溫度使目標(biāo)與持家基因擴增量同步

結(jié)果說明按常規(guī)方法當(dāng)目標(biāo)基因產(chǎn)物出現(xiàn)條帶時持家基因已進入平臺期，試驗組通過控制變性溫度使持家基因晚于目標(biāo)基因6個循環(huán)才開始擴增，而使目標(biāo)基因和持家基因的擴增量趨于同步實施例2實施例2目標(biāo)基因與實施例1相同，以人beta肌動球蛋白基因為持家基因(美國國家生物信息中心基因庫編號BC016045)。目標(biāo)基因引物和持家基因引物的順序和特性示于表4和5
表1、抗紫外環(huán)氧組合物的組成和含量(均以重量份計)

實施例11、將實施例1～10及比較例1#制備的抗紫外環(huán)氧組合物I～X和I#于真空脫泡后，在烘箱內(nèi)130℃固化2h，隨爐冷卻后取出樣品。然后再次加熱到130℃保持2h，以去除殘余應(yīng)力和易揮發(fā)性組份。然后對樣品分別進行光老化性能、力學(xué)性能、熱性能測試，得到的數(shù)據(jù)列于表2。
結(jié)果說明按常規(guī)方法當(dāng)目標(biāo)基因產(chǎn)物出現(xiàn)條帶時持家基因已進入平臺期，試驗組通過控制退火溫度使持家基因晚于目標(biāo)基因5個循環(huán)才開始擴增，而使目標(biāo)基因和持家基因的擴增量趨于同步。
權(quán)利要求
1，一種含持家基因的雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，反應(yīng)液含一對擴增持家基因的引物和一對擴增目標(biāo)基因的引物。該雙重反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)依次包括如下步驟(1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(2)DNA模板變性解鏈；(3)引物與模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進行擴增反應(yīng)；其特徵在于反應(yīng)1至20循環(huán)內(nèi)部份循環(huán)只有目標(biāo)基因的擴增而無持家基因的擴增。
2，根據(jù)權(quán)利1所述的含持家基因的雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，所述的目標(biāo)基因引物擴增產(chǎn)物的解鏈溫度比所述的持家基因引物擴增產(chǎn)物的解鏈溫度低2℃以上。
3，根據(jù)權(quán)利1所述的含持家基因的雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，所述的目標(biāo)基因引物的最高允許退火溫度比所説的持家基因引物的最高允許退火溫度高3℃以上。
4，根據(jù)權(quán)利1至3所述的含持家基因的雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，所述的只擴增目標(biāo)基因的循環(huán)數(shù)為3至20個。
5，根據(jù)權(quán)利1至4所述的含持家基因的雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，所述的只擴增目標(biāo)基因的循環(huán)數(shù)為5至10個。
6，根據(jù)權(quán)利1至5所述的含持家基因的雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，應(yīng)用于實時熒光定量PCR。
7，根據(jù)權(quán)利1至6所述的含持家基因的雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，目標(biāo)基因有二個以上。
全文摘要
一種含持家基因的雙重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。設(shè)計引物使目標(biāo)基因擴增產(chǎn)物比持家基因擴增產(chǎn)物解鏈溫度低，或目標(biāo)基因引物比持家基因引物解鏈溫度高，通過控制前期循環(huán)的變性溫度或退火溫度，使持家基因擴增流產(chǎn)而目標(biāo)基因經(jīng)擴增得到富集。當(dāng)目標(biāo)基因模板數(shù)量與持家基因相當(dāng)時控制變性或退火溫度使持家基因也開始擴增，最終目標(biāo)擴增產(chǎn)物量與持家基因擴增產(chǎn)物量趨于接近。
文檔編號C12Q1/68GK1858220SQ20051002563
公開日2006年11月8日 申請日期2005年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月30日
發(fā)明者徐定邦, 謝文凱, 府雷宇 申請人:徐定邦, 徐文慧