專利名稱：一種生產(chǎn)l－苯丙氨酸基因工程菌及構(gòu)建方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用組成型啟動的基因工程菌制備L-苯丙氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-苯丙氨酸(英文名L-phenylalanine)是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人體和動物不能合成的必需氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥例如L-苯丙氨酸是某些氨基酸類抗癌藥物的中間體，如苯丙氨芐、甲酸溶肉瘤素等(王多仁.化工中間體2004，1(2)12～20)。又可以以氨基酸為載體，把抗癌藥物分子或基團(tuán)載入腫瘤區(qū)，達(dá)到既能抑制腫瘤生長，又能降低腫瘤藥物毒性的目的(Janet T Powell等，Eur.J Biochem.1978，(87)391～400)。L-苯丙氨酸還是復(fù)配氨基酸輸液的重要成份，也是生產(chǎn)腎上腺素和甲狀腺素的原料。也廣泛用于食品添加劑行業(yè)，特別是作為阿斯巴甜(Aspartame)和尼爾甜(Neotame)的生產(chǎn)原料，市場需求量很大。
L-苯丙氨酸的制備方法主要有微生物發(fā)酵法和微生物酶法轉(zhuǎn)化法。
微生物發(fā)酵法是借助生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通過對菌株的誘變等處理，選育出各種營養(yǎng)缺陷型及氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制與阻礙，達(dá)到過量合成L-苯丙氨酸的目的。國際上美國的Monsanto等公司已用此法進(jìn)行生產(chǎn)。但國內(nèi)尚未見有高活力的菌株報道。
基因工程菌發(fā)酵法制備L-苯丙氨酸基因工程技術(shù)在L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌選育方面的應(yīng)用在發(fā)酵法方面較多，酶法制備L-苯丙氨酸方面應(yīng)用較少?；蚬こ淘诎l(fā)酵法制備L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌選育上的應(yīng)用主要是通過基因工程的方法改變代謝調(diào)控選育L-苯丙氨酸高產(chǎn)菌，研究較多的有E.coli；Brevibacteriums；C.glutamicum等三類菌(賈紅華等，生物加工過程.2004，2(2)9～12)。其中以基因工程改造E.coli發(fā)酵制備L-苯丙氨酸的研究最受關(guān)注，例如，Sugimoto等將L-苯丙氨酸生物合成酶系的基因放到溫控啟動子的質(zhì)粒上，導(dǎo)人E.coli，通過溫度變化調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)酸，L-苯丙氨酸最高產(chǎn)量達(dá)到28.5g/L(Sugimoto S，等.FermentBioeng.1990，70(6)376～380。)。美國的Monsanto公司借著基因工程技術(shù)改良大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸，產(chǎn)酸率高達(dá)45g/L。并已經(jīng)大規(guī)模投產(chǎn)，是目前世界上最大的L-苯丙氨酸生產(chǎn)企業(yè)(楊順楷.精細(xì)與專用化學(xué)品.2001，(2)18～17)。1998，復(fù)旦大學(xué)范長勝等從一株黃色短桿菌3621出發(fā)構(gòu)建新的苯丙氨酸生產(chǎn)菌，發(fā)酵后的苯丙氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌高出1倍，最高達(dá)26.26g/L。但國內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)率底，無產(chǎn)業(yè)化報道。
酶法合成L-苯丙氨酸方面，起決定作用的步驟是由關(guān)鍵酶催化的。1986年英國Fothering.ham等率先測序鑒定了大腸桿菌中編碼芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的tyrB基因和編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶aspC基因的DNA序列；1986年美國的WaLbr將高表達(dá)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的大腸桿菌工程菌固定于明膠中用于催化苯丙酮酸。1991年日本Tsutomu Takagi等克隆了天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因并用其構(gòu)建了苯丙氨酸生產(chǎn)菌；1994藥科大學(xué)史燕東等構(gòu)建基因工程菌CTB2，催化苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率為81％，生成L-苯丙氨酸為14.4g/L；Yun-PengChao等構(gòu)建了一株基因工程菌同時表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸酶耦合體系生產(chǎn)L-苯丙氨酸，還構(gòu)建了另一株基因工程菌同時表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，提高了底物摩爾轉(zhuǎn)化率；(Yun-Peng Chao等，Biotechnol.Prog.1999，(15)453～458；Enzyme and MicrobialTechnology.2000，(27)19～25)。轉(zhuǎn)化20g/L苯丙酮酸生成18.6g/L L-苯丙氨酸，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)93％。但以上表達(dá)體系，根據(jù)文獻(xiàn)報道，需昂貴有毒的誘導(dǎo)物IPTG及昂貴的輔酶輔酶磷酸吡哆醛PLP，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
目前，國外已有構(gòu)建生物工程菌采用葡萄糖發(fā)酵法制備L-苯丙氨酸并有成功產(chǎn)業(yè)化的報道。而苯丙氨酸制備方面國內(nèi)研究工作相對落后，高效且發(fā)酵成本低廉的工程菌至今尚未見報道。
微生物酶法轉(zhuǎn)化法有三類型(1)以苯丙酮酸為前體經(jīng)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶制備L-苯丙氨酸由前體物質(zhì)苯丙酮酸經(jīng)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨生成L-苯丙氨酸，L-天冬氨酸為氨基供體時，轉(zhuǎn)氨后的產(chǎn)物草酰乙酸不穩(wěn)定，可進(jìn)一步脫羧生成丙酮酸，進(jìn)而使反應(yīng)不斷向生成L-苯丙氨酸的方向進(jìn)行。該方法中的底物苯丙酮酸可由亞芐基海因水解制備，L-天冬氨酸可由富馬酸加氨制備。本發(fā)明人已較好地解決了原料苯丙酮酸生產(chǎn)工藝。使得該苯丙氨酸合成工藝路線的突破成為可能，而催化苯丙酮酸(PPA)制備L-苯丙氨酸的高產(chǎn)生產(chǎn)菌的選育則是該工藝路線急需突破的另一瓶頸。
(2)以肉桂酸為前體經(jīng)苯丙氨酸解氨酶催化制備L-苯丙氨酸苯丙氨酸解氨酶能夠催化L-苯丙氨酸分解為肉桂酸和氨，因而可借助其逆反應(yīng)，在適當(dāng)?shù)臈l件下由肉桂酸和氨合成L-苯丙氨酸。因底物肉桂酸對苯丙氨酸解氨酶的抑制作用，因而較難實現(xiàn)L-苯丙氨酸的高濃度生產(chǎn)。中國科學(xué)院成都生物研究所楊順楷等，經(jīng)多年菌種選育，該方法已有試投產(chǎn)的報道。
(3)酶法拆分化學(xué)合成消旋中間體(如N-乙酰DL-苯丙氨酸)的基礎(chǔ)上采用酶法選擇性降解制備L-苯丙氨酸，此法成本高，無產(chǎn)業(yè)化報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提供一種高效表達(dá)、具有良好輔酶再生體系，組成型啟動子與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因連接的基因工程菌，其發(fā)酵可以省去IPTG誘導(dǎo)步驟并達(dá)到高效啟動，利于大規(guī)模發(fā)酵，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
本發(fā)明還在于提供一種具有組成型啟動子與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因連接的并具有多酶偶合串聯(lián)的基因工程菌，發(fā)酵不僅可以省去IPTG誘導(dǎo)步驟并達(dá)到高效啟動，利于大規(guī)模發(fā)酵，還可以使用更價廉的原料和促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)程，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
本發(fā)明還在于提供一種制備具有組成型啟動子與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因連接的，更進(jìn)一步具有多酶偶合串聯(lián)的基因工程菌的方法，該方法操作簡便，工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。
本發(fā)明還在于提供一種利用本發(fā)明的工程菌生產(chǎn)L-苯丙氨酸的培養(yǎng)發(fā)酵方法，可以穩(wěn)定、價廉地生產(chǎn)，有利于規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的首先是工程菌的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建方案一選擇從天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因aspC或或芳香族轉(zhuǎn)氨酶基因tyrB的一種，與自行構(gòu)建的組成型啟動子連接，插入載體，構(gòu)建出組成型表達(dá)的重組質(zhì)粒，并在不同的宿主菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到帶有組成型啟動子的轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌。利用該工程菌在合適的培養(yǎng)基中、合適的條件下進(jìn)行發(fā)酵得到發(fā)酵液，利用該發(fā)酵液發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸。其技術(shù)路線可以附圖1表示。
其中的重組質(zhì)粒的構(gòu)建可按一般通用的方法進(jìn)行構(gòu)建，例如設(shè)計引文釣取大腸桿菌K12的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因aspC，與自行構(gòu)建的組成型啟動子相連，導(dǎo)入T載體。利用T載體的HindIII和EcoR I雙酶切位點，分別插入到相同酶切后的載體。例如pUC19，pSE380，pET22b為較好的載體，構(gòu)建獲得質(zhì)粒如例獲得pUC/aspC；pET/aspC；pSE/aspC質(zhì)粒。再分別導(dǎo)入不同的宿主中獲得各種基因工程菌。宿主可選擇常用的菌，并可以根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)后取發(fā)酵液測定酶活進(jìn)行選擇。較好的宿主例如大腸桿菌宿主JM109、DH-5α、BL21、TOP10F、Sure、XL1-blue，其中E.coli BL21更好。載體選擇pET，宿主選擇E.coli BL21獲得的E.coliBL21-pET/aspC的表達(dá)酶活較高。利用這種工程菌進(jìn)行發(fā)酵，不需要使用昂貴且毒性大的IPTG誘導(dǎo)步驟，并能高效啟動，利于工業(yè)生產(chǎn)。
其中的組成型啟動子，可以用通常的方法進(jìn)行構(gòu)建，只要利于與轉(zhuǎn)氨酶基因連接適合導(dǎo)入所選載體。方便地可以利用乳糖啟動子改造，例如把乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄起始部位的+5至+17間的幾處的堿基進(jìn)行突變，可將其變?yōu)榻M成型的啟動子，可突變堿基如下，可突變堿基部位有下劃線。
TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT又例如在乳糖操縱予中也可進(jìn)行插入誘變改造為組成型的啟動子(BautistaDS等；Gene1990；87(1)155)。
也可以直接采用大腸桿菌K12的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的自帶啟動子。
工程菌的構(gòu)建方案二進(jìn)一步，在方案一中，根據(jù)需要進(jìn)行選擇合適的宿主菌，例如選擇高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303作為宿主(徐虹等，南京化工大學(xué)學(xué)報，1996；18(1)70-73)，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒例如pET/aspC插入，得到基因工程菌如例獲得E.coli ATCC11303-pET/aspC工程菌。由于天然菌E.coli ATCC11303中的高活性天冬氨酸酶(aspA)與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶相偶聯(lián)，其中的高活性天冬氨酸酶(aspA)可以用富馬酸、氨產(chǎn)生天冬氨酸，因此該工程菌可以以富馬酸和氨為原料生產(chǎn)L-苯丙氨酸，有效地降低生產(chǎn)成本。本。其技術(shù)路線可以附圖2表示。
工程菌的構(gòu)建方案三在方案一中，更進(jìn)一步，在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，將分解草酰乙酸的酶，例如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)，與氨基轉(zhuǎn)移酶，例如aspC或tyrB進(jìn)行串聯(lián)，構(gòu)建共表達(dá)重組質(zhì)粒，這樣按方案一進(jìn)行轉(zhuǎn)化而獲得工程菌，例如載體選擇pET，宿主選擇E.coli BL21獲得E.coli BL21-pET/aspC·pck工程菌。由于分解草酰乙酸的酶例如在該例中的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)能夠分解以苯丙酮酸、天冬氨酸為原料經(jīng)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化制備L-苯丙氨酸、轉(zhuǎn)化反應(yīng)的另一產(chǎn)物草酰乙酸，進(jìn)一步分解生成丙酮酸，隨著草酰乙酸分解可促進(jìn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)平衡向L-苯丙氨酸生成的方向進(jìn)行，因此可以進(jìn)一步提高L-苯丙氨酸的產(chǎn)率。技術(shù)路線可以附圖3表示。
工程菌的構(gòu)建方案四在方案一，二和三的基礎(chǔ)上，方案三的重組質(zhì)粒分解草酰乙酸的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pekA)與氨基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行串聯(lián)共表達(dá)的重組質(zhì)粒，導(dǎo)入方案二的宿主菌即例如高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303中轉(zhuǎn)化，構(gòu)建如例獲得的基因工程菌是E.coli ATCC11303-pET/aspC·pckA，在這樣的工程菌中，如例中，偶聯(lián)了天冬氨酸酶(aspA)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspC，tyrB)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)三中酶，利用該種工程菌，可以以富馬酸、氨、苯丙酮酸為底物，高產(chǎn)率直接合成L-苯丙氨酸，即降低了成本又可提高L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率。其技術(shù)路線可以用附圖4表示。
其中，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶活測定按常規(guī)方法進(jìn)行即可，典型的測定方法可以根據(jù)底物苯丙酮酸與Fe3+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)顯色的原理測定。步驟為取1ml發(fā)酵液，加入0.1ml CTAB(1％)，在恒溫振蕩器(37℃，180rpm)中反應(yīng)5min，加入1ml底物(PPA0.1mol/L，L-Asp 0.11mol/L，氨水調(diào)PH8.5)，反應(yīng)1h(37℃，180rpm)，冰浴終止反應(yīng)。取20μl反應(yīng)液到5ml顯色液(DMSD600ml，冰醋酸20ml，F(xiàn)eCl30.5g，雙蒸水定容至1L)中，反應(yīng)后用分光光度計在640nm波長處測其OD值。一個酶比活單位“μ”定義為每小時每毫升發(fā)酵液所消耗的μmolPPA的量，即μmolPPA·h-1·ml-1。酶活計算公式E＝334*(C0-OD640)，C0是將體系中的1ml發(fā)酵液換成水后的測定值。
質(zhì)粒檢測可以按一般方法進(jìn)行，也可按文獻(xiàn)方法進(jìn)行(林濤等，中國生物工程雜志.2005(增)313～315[18])，L-苯丙氨酸和苯丙酮酸的含量采用高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法測定(唐方等，北京化工大學(xué)學(xué)報.2003，30(5)21～23)。
其次，基因工程菌的發(fā)酵依據(jù)構(gòu)建工程菌方案一或二或三獲得的菌例如E.coli BL21-pET/aspC(或E.coliBL21-pET/aspC·pck)在進(jìn)行發(fā)酵時，其培養(yǎng)基可以用常用培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基按通常的劑量進(jìn)行，獲得的酶活在50～100u/mL，(典型的LB液體培養(yǎng)基(g/L)為酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，PH7.0；LB液體培養(yǎng)基(g/L)為酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，PH7.0；LB固體培養(yǎng)基(g/L)為酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂粉18，pH7.2；)也可以采用以玉米漿為主要營養(yǎng)組分的廉價高效的發(fā)酵培養(yǎng)基，作為碳源，一般不必特別限定，可用可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖等，添量為0～10g/L；作為有機(jī)氮可以用玉米漿、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、魚粉，添量為0～20g/L，玉米漿為更好。該培養(yǎng)基有利于發(fā)酵過程中的質(zhì)粒穩(wěn)定，可提高外源基因的表達(dá)，玉米漿含有水份，添量為0～60ml/L，較好為30～50ml/L。在以玉米漿為主碳氮源的培養(yǎng)基中因含各種金屬離子和無機(jī)鹽，可不添加其他的鎂、鐵離子及磷酸鹽等。也可加入少量的氯化鈉等鹽類。發(fā)酵培養(yǎng)基的初始為pH6.5～7.5。這樣獲得的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶比活在120～260u/mL。發(fā)酵過程中不需要加入基因工程菌常用的誘導(dǎo)物IPTG。
以含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303為宿主，構(gòu)建的基因工程菌即根據(jù)構(gòu)建方案二或四構(gòu)建的工程菌例如E.coli ATCC11303-pET/aspC發(fā)酵時，培養(yǎng)基中適當(dāng)入少量富馬酸進(jìn)行天冬氨酸酶的誘導(dǎo)，富馬酸添加量以發(fā)酵液體積計每升發(fā)酵液添加1～20克。這樣，可以使用富馬酸和氨水生成天冬氨酸、生產(chǎn)L-苯丙氨酸，大大降低生產(chǎn)成本。
在進(jìn)行發(fā)酵時，菌種的接種量按一般常識選擇，不必特別限定。菌種接種量按體積百分比計一般為1～10％，更好為3～6％，在150～300rpm轉(zhuǎn)速攪動下，保持溫度在30～45℃，發(fā)酵時間一般為4～20小時，發(fā)酵6～12小時較好。發(fā)酵為好氧發(fā)酵。
第三，利用工程菌生產(chǎn)L-苯丙氨酸。
按構(gòu)建方案一或三構(gòu)建的工程菌，例如基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC，發(fā)酵后可收集菌體，也可直接使用發(fā)酵液作為酶液，底物為苯丙酮酸與天冬氨酸，也可用亞芐基海因的水解物(含苯丙酮酸)直接代替苯丙酮酸。直接使用發(fā)酵液作為酶液時，酶液的添加量以體積計酶液體積與底物體積比為1∶1～1∶6，較好為1∶2～1∶4。發(fā)酵液中苯丙酮酸的含量為10～90g/L，更好為30～60g/L。直接使用水解液時苯丙酮酸的含量為10～70g/L，更好為30～50g/L。轉(zhuǎn)化液中可添加少量破壁劑(如CTAB-十六烷基三甲基溴化銨)，也可不添加破壁劑直接轉(zhuǎn)化，添加量以體積百分比計為0-0.3％。苯丙酮酸與天冬氨酸的比例為1∶1～1∶2，較好為1∶1.1～1.3。轉(zhuǎn)化液的pH為7.5～9.0。轉(zhuǎn)化液中不必添加輔酶磷酸吡哆醛。轉(zhuǎn)化溫度為30～40℃。此時，轉(zhuǎn)化時間一般為2～15小時，更好為3～7小時，經(jīng)HPLC檢測計算，每升轉(zhuǎn)化液的L-苯丙氨酸含量在12～50克，產(chǎn)率可達(dá)60～96％。
按構(gòu)建方案二或四構(gòu)建的工程菌即以含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coliATCC11303為宿主的基因工程菌，例如E.coli ATCC11303-pET/aspC，發(fā)酵后可收集菌體，也可直接使用發(fā)酵液作為酶液，底物是可以使用苯丙酮酸與天冬氨酸，為進(jìn)一步降低成本，底物也可以用苯丙酮酸、富馬酸和氨，也可用亞芐基海因的水解物、即含苯丙酮酸的反應(yīng)液、直接代替苯丙酮酸。直接使用發(fā)酵液作為酶液時，酶液的添加量以體積計為酶液體積與底物體積比為1∶1～1∶6，較好為1∶1.5～1∶4。發(fā)酵液中苯丙酮酸的含量為10～90g/L，更好為30-60g/L。直接使用水解液時苯丙酮酸的含量為10～70g/L，更好為30～50g/L。轉(zhuǎn)化液中可添加少量破壁劑(如CTAB-十六烷基三甲基溴化銨)，也可不添加破壁劑直接轉(zhuǎn)化，添加量以體積百分比計為0-0.3％。苯丙酮酸與富馬酸的比例為1∶1～1∶2，更好為1∶1.1～1∶1.5。轉(zhuǎn)化液的pH為7.5～9.0。轉(zhuǎn)化液中不必添加輔酶磷酸吡哆醛。轉(zhuǎn)化溫度為30～40℃。此時，轉(zhuǎn)化時間一般為2～20小時，更好為4～9小時，經(jīng)HPLC檢測計算，每升轉(zhuǎn)化液的L-苯丙氨酸含量在12-45克，產(chǎn)率可達(dá)60-85％。
采用氨基轉(zhuǎn)移酶與磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)串聯(lián)共表達(dá)的基因工程例如菌E.coliBL21-pET/aspC·pck，苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為L-苯丙氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率可進(jìn)一步提高，達(dá)到75～96％。
采用以天然菌E.coli ATCC11303為宿主的基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC，底物可用富馬酸和氨來代替天冬氨酸，轉(zhuǎn)化液中不必添加輔酶磷酸吡哆醛，可進(jìn)一步降低成本。
同時，菌體的培養(yǎng)條件比較簡單，易于得到活性穩(wěn)定的菌體，因此利于產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1生產(chǎn)L-苯丙氨酸的技術(shù)路線示意2生產(chǎn)L-苯丙氨酸的技術(shù)路線示意3生產(chǎn)L-苯丙氨酸的技術(shù)路線示意4生產(chǎn)L-苯丙氨酸的技術(shù)路線示意圖具體實施方式
實施例1 基因工程菌E.coli BL21-pUC/aspC的構(gòu)建天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶aspC基因調(diào)自大腸桿菌K12(標(biāo)準(zhǔn)菌株)。由NCBI檢索，根據(jù)報道的大腸桿菌K12(標(biāo)準(zhǔn)菌株)aspC序列經(jīng)VectorNTI8.0軟件設(shè)計引物如下正向引物15’ATGTTTGAGAACATTACCGC 3’反向引物25’GTTTGTCATCAGTCTCAGCC 3’。
采用PCR釣取大腸桿菌K12的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因aspC，與下述的組成型啟動子(記為P-121)相連，(該啟動子的改變堿基部位見下劃線)，TGTTGTGTGGAATTGTGAGTGGCTAACAATTTCACACA
ACAACACACCTTAACACTCACCGATTGTTAAAGTGTGT并將P121-aspC插入至TaKaRa公司pMD-18T載體中，對釣取的aspC基因進(jìn)行了測序鑒定。利用T載體的HindIII和EcoR I位點，雙酶切得到新的帶有酶切位點的片斷P121-aspC。插入到相同酶切后的載體pUC18中。獲得重組質(zhì)粒pUC/aspC。制備E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒pUC/aspC導(dǎo)入E.coli BL21中，選擇重組子E.coli BL21-pUC/aspC。
實施例2基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因aspC與下述組成型啟動子(記為P123)相連，(該啟動子的改變堿基部位見下劃線)，獲取P123-aspC。
TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATTGCAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTAACGTTAAAGTGTGTP將P123-aspC插入至TaKaRa公司pMD-18T載體中，對釣取的aspC基因進(jìn)行了測序鑒定。利用T載體的HindIII和EcoR I位點雙酶切得到新的帶有酶切位點的片斷P123-aspC。插入到相同酶切后的載體pET22b中。獲得重組質(zhì)粒pET/aspC。制備E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒pET/aspC導(dǎo)入E.coli BL21中，選擇重組子E.coli BL21-pET/aspC。
實施例3 基因工程菌E.coli ATCC11303-pUC/aspC的構(gòu)建制備含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303的感受態(tài)細(xì)胞，將實施例1中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC/aspC導(dǎo)入E.coli ATCC11303中，選擇重組子E.coliATCC11303-pUC/aspC。
實施例4基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC的構(gòu)建制備含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303的感受態(tài)細(xì)胞，將實施例2中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET/aspC導(dǎo)入E.coli ATCC11303中，選擇重組子E.coliATCC11303-pET/aspC。
實施例5基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC·pckA的構(gòu)建采用PCR釣取大腸桿菌K12的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)，與組成型啟動子P121相連，并將P121-pckA插入至TaKaRa公司pMD-18T載體中，對釣取的pckA結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行了測序鑒定。再將P121-aspC與P121-pckA連接，插入到載體pET22b中。獲得重組質(zhì)粒pET/aspC·pckA。制備E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒pET/aspC·pckA導(dǎo)入E.coli BL21中，選擇重組子E.coli BL21-pET/aspC·pckA。
實施例6基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC·pckA的構(gòu)建制備含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303的感受態(tài)細(xì)胞，將實施例5中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET/aspC·pckA導(dǎo)入E.coli ATCC11303中，選擇重組子E.coli ATCC11303-pET/aspC·pckA。
實施例7基因工程菌發(fā)酵液1基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC(基因工程菌E.coli BL21-pUC/aspC或E.coliBL21-pET/aspC·pckA)的發(fā)酵按以下重量比例配制發(fā)酵液玉米漿30ml/L，酵母膏3g/L，淀粉2g/L，NaCl 1g/L，調(diào)節(jié)pH值7.0。滅菌后接種量為3％(種子培養(yǎng)基相同、培養(yǎng)時間為8小時)，在溫度為37℃和轉(zhuǎn)速為180rpm攪拌下，發(fā)酵10小時。
實施例8基因工程菌發(fā)酵液2基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC(或E.coli ATCC11303-pET/aspC·pckA)的發(fā)酵按以下重量比例配制發(fā)酵液玉米漿25ml/L，酵母膏3g/L，淀粉2g/L，富馬酸5g/L，NaCl1g/L，調(diào)節(jié)pH值7.0。滅菌后接種量為3％(種子培養(yǎng)基相同、培養(yǎng)時間為8小時)，在溫度為37℃和轉(zhuǎn)速為180rpm攪拌下，發(fā)酵10小時。
實施例9基因工程菌發(fā)酵液3基因工程菌E.coli JM109-pET/aspC(或E.coli JM109-pET/aspC·pckA)的發(fā)酵按以下重量比例配制發(fā)酵液玉米漿30ml/L，酵母膏3g/L，淀粉2g/L，NaCl 1g/L，調(diào)節(jié)pH值7.0。滅菌后接種量為3％(種子培養(yǎng)基相同、培養(yǎng)時間為8小時)，在溫度為37℃和轉(zhuǎn)速為180rpm攪拌下，發(fā)酵10小時。
實施例10轉(zhuǎn)化實驗1基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC發(fā)酵液(基因工程菌發(fā)酵液1)直接作為酶液，與亞芐基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。轉(zhuǎn)化液中苯丙酮酸的含量為30g/L，苯丙酮酸與天冬氨酸的摩爾比例為1∶1.2，轉(zhuǎn)化液中不必添加輔酶磷酸吡哆醛。36℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))8小時，可得23.6g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩爾轉(zhuǎn)化率約79％。L-苯丙氨酸對亞芐基海因的摩爾轉(zhuǎn)化率為72.8％。
實施例11轉(zhuǎn)化實驗2
基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC·pckA發(fā)酵液(基因工程菌發(fā)酵液1)直接作為酶液，與亞芐基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。轉(zhuǎn)化液中苯丙酮酸的含量為30g/L，轉(zhuǎn)化液的pH為8.5，苯丙酮酸與天冬氨酸的摩爾比例為1∶1.2，36℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))8小時，可得26.3g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩爾轉(zhuǎn)化率約88％。L-苯丙氨酸對亞芐基海因的摩爾轉(zhuǎn)化率為79.6％。
實施例12轉(zhuǎn)化實驗3基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC·pckA發(fā)酵液(基因工程菌發(fā)酵液1)直接作為酶液，與亞芐基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。轉(zhuǎn)化液中苯丙酮酸的含量為30g/L，轉(zhuǎn)化液的pH為8.5，苯丙酮酸與天冬氨酸的摩爾比例為1∶1.2，轉(zhuǎn)化前充氮氣保護(hù)苯丙酮酸免受氧化分解，36℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))8小時，可得28.1g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩爾轉(zhuǎn)化率約94％，L-苯丙氨酸對亞芐基海因的摩爾轉(zhuǎn)化率為85.7％。
實施例13轉(zhuǎn)化實驗3基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC的發(fā)酵液(基因工程菌發(fā)酵液2)直接作為酶液，與亞芐基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。轉(zhuǎn)化液中苯丙酮酸的含量為30g/L，用富馬酸和氨替代天冬氨酸，苯丙酮酸與富馬酸的摩爾比例為1∶1.2，轉(zhuǎn)化液的pH為8.5，轉(zhuǎn)化液中不必添加輔酶磷酸吡哆醛。36℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))12小時，可得21.4g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩爾轉(zhuǎn)化率約71％，L-苯丙氨酸對亞芐基海因的摩爾轉(zhuǎn)化率為65.1％。
實施例14轉(zhuǎn)化實驗4基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC·pck的發(fā)酵液(基因工程菌發(fā)酵液2)直接作為酶液，與亞芐基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。轉(zhuǎn)化液中苯丙酮酸的含量為30g/L，用富馬酸和氨替代天冬氨酸，苯丙酮酸與富馬酸的摩爾比例為1∶1.2，36℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))12小時，可得26.1g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩爾轉(zhuǎn)化率約87％。L-苯丙氨酸對亞芐基海因的摩爾轉(zhuǎn)化率為79.4％。
實施例15轉(zhuǎn)化實驗5基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC·pck的發(fā)酵液(基因工程菌發(fā)酵液2)直接作為酶液，與亞芐基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。轉(zhuǎn)化液中苯丙酮酸的含量為30g/L，用富馬酸和氨替代天冬氨酸，苯丙酮酸與富馬酸的摩爾比例為1∶1.2，轉(zhuǎn)化前充氮氣保護(hù)苯丙酮酸免受氧化分解，36℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))12小時，可得27.3g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩爾轉(zhuǎn)化率約91％，L-苯丙氨酸對亞芐基海因的摩爾轉(zhuǎn)化率為83.5％。
實施例16轉(zhuǎn)化實驗6基因工程菌E.coli JM109-pET/aspC發(fā)酵液(基因工程菌發(fā)酵液3)直接作為酶液，與亞芐基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。轉(zhuǎn)化液中苯丙酮酸的含量為30g/L，苯丙酮酸與天冬氨酸的摩爾比例為1∶1.2，轉(zhuǎn)化液中不必添加輔酶磷酸吡哆醛。36℃振蕩反應(yīng)(或攪拌反應(yīng))8小時，可得22.5g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩爾轉(zhuǎn)化率約76％。L-苯丙氨酸對亞芐基海因的摩爾轉(zhuǎn)化率為70.2％。
權(quán)利要求
1.一種用于制備L-苯丙氨酸的基因工程菌，由表達(dá)質(zhì)粒在宿主菌中轉(zhuǎn)化而得，其特征在于其表達(dá)質(zhì)粒是用天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因aspC或芳香族轉(zhuǎn)氨酶基因tyrB中的一種與組成型啟動子連接，插入載體構(gòu)建成的組成型表達(dá)質(zhì)粒。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的用于制備L-苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于其中的載體選自pUC18、pET22b或pSE380中的一種，其中的宿主菌選自大腸桿菌宿主JM109、DH-5α、BL21、TOP10F、Sure或XL1-blue的一種。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1的用于制備L-苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于其中的宿主菌為具有高活性天冬氨酸酶aspA的天然菌E.coli ATCC11303。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1的用于制備L-苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于其中的表達(dá)質(zhì)粒中還連接了由分解草酰乙酸的酶與組成型啟動子的連接。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4的用于制備L-苯丙氨酸的基因工程，其特征在于其中的分解草酰乙酸的酶是烯醇式丙酮酸羧激酶pck。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求4的生產(chǎn)L-苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于其中的宿主為高活性天冬氨酸酶aspA的天然菌E.coli ATCC11303。
7.一種利用權(quán)利要求1或4的基因工程菌制備L-苯丙氨酸的方法，以培養(yǎng)基培養(yǎng)基因工程菌得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液加入含有苯丙酮酸和天冬氨酸的溶液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
8.一種利用權(quán)利要求3或6的基因工程菌生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，以培養(yǎng)基培養(yǎng)基因工程菌得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液加入含有富馬酸、氨和苯丙酮酸溶液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在培養(yǎng)基中添加少量富馬酸為輔助碳源，富馬酸的添加量以培養(yǎng)基體積計為1-20g/L。
9.一種利用權(quán)利要求7的基因工程菌生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，其中培養(yǎng)基選自LB培養(yǎng)基或玉米槳為主要碳氮源的培養(yǎng)基，玉米槳培養(yǎng)基的添加量為10-60ml/L。
10.一種利用權(quán)利要求8的基因工程菌生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法，其中培養(yǎng)基選自LB培養(yǎng)基或玉米槳為主要碳氮源的培養(yǎng)基，玉米槳培養(yǎng)基的添加量為10-60ml/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備L－苯丙氨酸的基因工程菌及構(gòu)建方法和生產(chǎn)應(yīng)用。該菌種由轉(zhuǎn)氨酶基因與組成型啟動子連接，插入載體而構(gòu)建的組成型表達(dá)質(zhì)粒，在合適的宿主菌中轉(zhuǎn)化而得。采用表達(dá)高活性天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因工程菌轉(zhuǎn)化苯丙酮酸制備L－苯丙氨酸，摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)65－85％。采用表達(dá)高活性天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和烯醇式磷酸丙酮酸羧激酶的基因工程菌轉(zhuǎn)化苯丙酮酸制備L－苯丙氨酸，摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)80－95％。菌體培養(yǎng)條件簡單，活性穩(wěn)定，不需要誘導(dǎo)物IPTG及輔酶磷酸吡哆醛，利于產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/70GK1757737SQ20051004080
公開日2006年4月12日 申請日期2005年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月28日
發(fā)明者何冰芳, 歐陽平凱, 李霜, 宮長斌, 姜岷, 周華, 韋萍 申請人:南京工業(yè)大學(xué)