專(zhuān)利名稱(chēng)：一種血管平滑肌的消化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血管平滑肌的消化方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法有貼塊法(explant)和酶解離法(enzymedisperse)。貼塊法具有獲得平滑肌細(xì)胞純度高，量多，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。但用貼塊法易使平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)肌絲喪失，亞細(xì)胞器增加。相反，酶解離法，由于酶的作用使細(xì)胞間失去連接，細(xì)胞內(nèi)肌絲含量豐富，保持收縮型狀態(tài)且形態(tài)分化良好，故可用于研究細(xì)胞表觀變化和影響細(xì)胞收縮的因素。
要進(jìn)行酶解離法培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，首先必須解決血管平滑肌的消化問(wèn)題?，F(xiàn)有消化方法主要有1、涂永生等“II型膠原酶/彈性蛋白酶消化法培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞”，《中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志》2001，9(5)438-440.中提出，血管平滑肌分兩次消化，首先將動(dòng)脈用Hanks液漂洗2～3次，并剪去血管外脂肪及結(jié)締組織，放入2g/L膠原酶II(1ml/aorta)消化液中消化20～30min。然后，用5號(hào)鑷子夾住外膜，向相反方向柔和拉扯除掉外膜。將動(dòng)脈(aorta)置于含10％新生牛血清(Newborn Calf Serum，NCS)的DMEM(Dulbcco’sModifed Eagle Medium，Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基)中孵育24h。然后取出動(dòng)脈，再放入含2g/L膠原酶II以及0.25g/L彈性蛋白酶的復(fù)合消化液中，每條動(dòng)脈所需的消化液的量為1.5ml，在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育2h左右。
2、高平進(jìn)等“蛋白激酶Ca與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化”，《中華心血管病雜志》1999，27(6)453-455.中提出，分離主動(dòng)脈，用膠原酶3mg/ml，彈性蛋白酶1mg/ml，大豆胰蛋白酶抑制劑1mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml分離血管平滑肌細(xì)胞。
3、李智等“大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)”，《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》1996，25(3)221-224.中提出，在通入95％O2和5％CO2的混合氣體的冰浴Hanks液中，將Sprague-Dawley(SD)大鼠肺動(dòng)脈剪成約1～2mm3的碎塊，此碎塊經(jīng)0.2％的膠原酶和0.0125％的彈性蛋白酶(1∶1)3ml消化，在37℃的恒溫震蕩水浴中孵育20min后將含有細(xì)胞及其它組織的上清液吸掉，沉淀加入0.1％的膠原酶和0.0125％的彈性蛋白酶(1∶1)3ml再孵育40min，兩次孵育過(guò)程中需通入混合氣體。上清用10％FBS(胎牛血清)一PNM(0.1M NaH2PO4，0.1M Na2HPO4(pH8.0)，0.1％Nonidet P-40；5％nonfat dry milk；0.02％sodium azide)液中止反應(yīng)；沉淀加入0.125％胰蛋白酶1ml混勻，再二氧化碳孵箱37℃孵育5min。
4、王關(guān)嵩等“2種酶消化法培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)特性的比較《第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》1999，21(10)765-767.中提出，單獨(dú)用膠原酶消化先用鐘表鑷將動(dòng)脈撕成1mm×1mm左右的小條，放入預(yù)先盛有2～3ml0.2％的膠原酶液，蓋緊瓶塞，置搖擺儀上37℃25次/min振擺10～12h。復(fù)合酶消化先用鐘表鑷將動(dòng)脈撕成1mm×1mm左右的小條，放入2ml 0.2％的復(fù)合消化酶液(包括膠原酶、彈性蛋白酶和胰蛋白酶)中，于37℃ CO2孵箱培養(yǎng)30～40分鐘。
以上幾種消化方法，有的所用的酶種類(lèi)及數(shù)量多，成本過(guò)高，步驟繁瑣，如高平進(jìn)等用膠原酶、彈性蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制劑和牛血清白蛋白消化培養(yǎng)血管平滑?。挥械南瘯r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使細(xì)胞在酶環(huán)境中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不利于細(xì)胞的存活，如王關(guān)嵩等將血管平滑肌置搖擺儀上37℃25次/min振擺10～12h；有的將血管平滑肌暴露在胰蛋白酶環(huán)境中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成大量細(xì)胞細(xì)胞膜損害，如涂永生等將血管平滑肌放入含2g/L膠原酶II以及0.25g/L彈性蛋白酶的復(fù)合消化液中(1.5ml/aorta)，在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育2h左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種血管平滑肌的消化方法，使用的酶的種類(lèi)少，成本低；步驟簡(jiǎn)便。
本發(fā)明的方法步驟如下a.將處理好的血管平滑肌組織塊置于離心管中，加入平滑肌組織體積8-10倍的、用DMEM配制的0.15％膠原酶II溶液，置于37℃水浴箱中作用1.2h-1.5h至組織呈絮狀，棄去上清液。
上述DMEM(Dulbcco’s Modifed Eagle Medium)是Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基。
b.再用平滑肌組織體積3-5倍的0.02％乙烯二胺四乙酸(ethylene diaminetetra-acetic acid，EDTA)清洗消化成絮狀的平滑肌組織，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子，以便保持胰蛋白酶的活性。
c.加入平滑肌組織體積3-5倍的0.125％胰蛋白酶溶液，于37℃水浴振蕩消化1-2次，每次10min-15min，得分散的平滑肌細(xì)胞懸液。
d.再向分散的平滑肌細(xì)胞懸液中加入新生牛血清，經(jīng)3000r離心7min-8min，棄去上清液。
上述新生牛血清是純新生牛血清或含10-20％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
純新生牛血清用量為胰蛋白酶量的1/15-1/10。
所加含10-20％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液的量為胰蛋白酶量的1/3-1/2。
e.加入含20％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，并用吸管吹打分散細(xì)胞，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×104～5×105個(gè)/ml。
f.將調(diào)整好密度的細(xì)胞懸液2～3ml，接種于25ml培養(yǎng)瓶中。放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后有少量貼壁平滑肌細(xì)胞，3-4天更換新鮮培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合，即可。
上述新鮮培養(yǎng)液是含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
以上各組分的濃度均為重量百分比。
消化好的血管平滑肌用于按常規(guī)方法傳代。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該消化方法縮短了消化時(shí)程，對(duì)細(xì)胞膜的損害程度輕，利于細(xì)胞的存活；并且兩種酶作用互補(bǔ)，消化充分，收集的細(xì)胞數(shù)量多、純度高；同時(shí)更好地保護(hù)了離體細(xì)胞的性狀和代謝。
由于該方法使用的酶的種類(lèi)少，成本低；步驟簡(jiǎn)便，效果優(yōu)于現(xiàn)有的其它消化方法，可大大提高工作的可行性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，在進(jìn)行酶解離法血管平滑肌培養(yǎng)時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明適用范圍廣，可用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域。
與其它方法相比，本方法主要有以下優(yōu)良效果①血管平滑肌在胰蛋白酶中暴露時(shí)間短，縮短了消化時(shí)程，對(duì)細(xì)胞膜的損害程度輕，利于細(xì)胞的存活。
②兩種酶作用互補(bǔ)，消化充分，收集的細(xì)胞數(shù)量多。
③具有良好的選擇性，細(xì)胞純度高。
④更好地保護(hù)離體細(xì)胞的性狀和代謝。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1材料與方法1.1試劑膠原酶II型(Sigma)0.15％；胰蛋白酶(Sigma)0.125％；D-Hanks液各成分均為市售分析純；新生牛血清(NCF)及DMEM均為哥蘭德島生物公司(Grand IslandBiological Company(GIBCO))產(chǎn)品。均為重量百分比。
1.2取材SD大鼠購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。于無(wú)菌超凈臺(tái)中打開(kāi)胸腔，剪掉心臟放血，迅速取出胸主動(dòng)脈(起于左鎖骨下，止于動(dòng)脈進(jìn)入膈的部位)，浸泡入裝有無(wú)菌DMEM的培養(yǎng)皿中，漂洗2～3次，并剪去血管外脂肪及結(jié)締組織。
1.3消化將處理好的血管平滑肌組織塊0.2ml置于10ml離心管中，加入用DMEM配制的0.15％膠原酶II溶液1.8ml，在37℃水浴箱中作用1.5h，至組織呈絮狀，棄去上清液；用1ml0.02％EDTA清洗消化成絮狀的平滑肌組織，然后，加入0.125％胰蛋白酶溶液1ml，于37℃水浴振蕩消化10min，即可得到分散的平滑肌細(xì)胞。均為重量百分比。
1.4培養(yǎng)向盛有細(xì)胞懸液的刻度離心管中，加入用DMEM配制的10％的新生牛血清0.5ml，終止酶的作用。過(guò)200目網(wǎng)，3000r離心7min，棄去上清液。加入用DMEM配制的20％新生牛血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打，并用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)(細(xì)胞密度＝細(xì)胞數(shù)/毫升原液＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10,000×稀釋倍數(shù)，通過(guò)改變稀釋倍數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞密度)細(xì)胞密度為5×104～5×105個(gè)/L，將調(diào)整好密度的細(xì)胞懸液2～3ml，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后便可看到少量貼壁平滑肌細(xì)胞，第4天更換新鮮培養(yǎng)液(用DMEM配制的10％的新生牛血清)。均為重量百分比。第6天細(xì)胞達(dá)到75％融合時(shí)即可按常規(guī)方法傳代。取第3-4代細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。
1.5鑒定將培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞滴種于培養(yǎng)皿里的事先涂好多聚賴氨酸的蓋玻片上，2～3天貼壁生長(zhǎng)后，依次做如下處理培養(yǎng)皿里加入1/3培養(yǎng)液體積的10％多聚甲醛(三蒸水配制，pH7.2)，預(yù)固定15min(在37℃培養(yǎng)箱中溫育)，傾去培養(yǎng)液并用0.01M的PBS(磷酸鹽緩沖液)漂洗3遍，每次5分鐘，再用10％多聚甲醛固定20min，然后用PBS沖洗。采用小鼠抗大鼠α-Actin免疫組織化學(xué)染色，鑒定血管平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白，以胞漿棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果。
1.6傳代細(xì)胞成活率取消化傳代的血管平滑肌細(xì)胞懸液9滴，加入1滴0.4％臺(tái)盼藍(lán)液，混勻后吸取1滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，置顯微鏡下觀察，凡著色細(xì)胞均為不正常細(xì)胞或死亡細(xì)胞。共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞成活率。
2結(jié)果2.1細(xì)胞生長(zhǎng)情況接種第2天，即可見(jiàn)到細(xì)胞貼壁，貼壁的原代細(xì)胞大小不等，形狀多樣，有梭形、三角形或星形等。核位于中央，核中有1個(gè)或數(shù)個(gè)大小不一、深色的核仁，胞漿豐富。傳代細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，24h時(shí)大多數(shù)細(xì)胞已貼壁伸展，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)透明度漸增高，并相互接觸，呈典型的“谷與峰”生長(zhǎng)。
2.2肌動(dòng)蛋白的免疫組織化學(xué)染色運(yùn)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶(SP)法對(duì)血管平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組織化學(xué)染色，96％的細(xì)胞染色陽(yáng)性。倒置顯微鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)中有較多的條絲狀物，呈棕黃色，即為肌動(dòng)蛋白。胞核為淡藍(lán)色。
2.3臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，其中30個(gè)為陽(yáng)性，有97％以上的細(xì)胞染色呈陰性，表明培養(yǎng)的細(xì)胞消化傳代成活率較高。
權(quán)利要求
1.一種血管平滑肌的消化方法，步驟如下a.將處理好的血管平滑肌組織塊置于離心管中，加入平滑肌組織體積8-10倍的、用DMEM配制的0.15％膠原酶II溶液，置于37℃水浴箱中作用1.2h-1.5h至組織呈絮狀，棄去上清液；b.再用平滑肌組織體積3-5倍的0.02％乙烯二胺四乙酸清洗消化成絮狀的平滑肌組織；然后c.加入平滑肌組織體積3-5倍的0.125％胰蛋白酶溶液，于37℃水浴振蕩消化1-2次，每次10min-15min，得分散的平滑肌細(xì)胞懸液；d.再向分散的平滑肌細(xì)胞懸液中加入新生牛血清，經(jīng)3000r離心7min-8min，棄去上清液；e.加入用DMEM配制的含20％新生牛血清的培養(yǎng)液，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×104～5×105個(gè)/ml；f.將調(diào)整好密度的細(xì)胞懸液2～3ml，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3-4天更換新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合，即可；以上各組分的濃度均為重量百分比。
2.如權(quán)利要求1所述的血管平滑肌的消化方法，其特征在于，步驟d中所述的新生牛血清是純新生牛血清或含重量百分比10-20％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
3.如權(quán)利要求1所述的血管平滑肌的消化方法，其特征在于，步驟d中所述的新生牛血清是純新生牛血清時(shí)，用量為胰蛋白酶量的1/15-1/10。
4.如權(quán)利要求1所述的血管平滑肌的消化方法，其特征在于，步驟d中所述的新生牛血清是含重量百分比10-20％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液時(shí)，用量為胰蛋白酶量的1/3-1/2。
5.如權(quán)利要求1所述的血管平滑肌的消化方法，其特征在于，步驟f中所述的新鮮培養(yǎng)液是含重量百分比10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
全文摘要
一種血管平滑肌的消化方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。向血管平滑肌組織塊中，加入用DMEM配制的0.15％膠原酶II溶液，水浴箱中作用1.5h，至組織呈絮狀，用0.02％的EDTA清洗，然后，加入0.125％胰蛋白酶溶液，于37℃水浴振蕩消化，即可得到分散的平滑肌細(xì)胞，用10％新生牛血清的培養(yǎng)液終止酶的作用。加入含20％新生牛血清的培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×10
文檔編號(hào)C12N5/08GK1673357SQ200510042438
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者邢毅, 李振中, 王鈺童, 李淑玲, 黃飛, 李永剛 申請(qǐng)人:山東大學(xué)