專利名稱：一株可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一株可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺是一種特殊的營養(yǎng)物質(zhì)，已引起人們普遍關(guān)注，成為近年來的研究熱點。
谷氨酰胺的生產(chǎn)主要有三種方法化學合成法，酶法，發(fā)酵法。
化學合成法是以谷氨酸為起始物質(zhì)，經(jīng)過酸化、氨解、酸解三步反應(yīng)生成谷氨酰胺?；瘜W合成法收率可達70％78％，但由于所需原料和試劑價格比較高，因此成本也高，并且原料產(chǎn)品有輕微的特殊的怪味不宜被食品和醫(yī)藥界接受，所以化學法生產(chǎn)谷氨酰胺距離大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的難度。
酶法合成谷氨酰胺在消耗ATP的情況下，由谷氨酰胺合成酶催化谷氨酸和NH4+向谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化。酶法合成谷氨酰胺具有許多優(yōu)點，如反應(yīng)步驟簡單、副反應(yīng)少、易于分離、容易實現(xiàn)自動化等，但上述過程中必需的ATP價格昂貴，難以在工業(yè)上應(yīng)用。
同酶法、化學合成法相比，發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺易于工業(yè)化，且其工業(yè)化水平越來越高。發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺在日本的開發(fā)與應(yīng)用尤為迅速。1977年日本利用發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺的年產(chǎn)量達100噸，1979年上升到500噸，1990年則上升到1200噸，呈逐年遞增的趨勢。篩選到高產(chǎn)的谷氨酰胺生產(chǎn)菌是發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺最為關(guān)鍵的一步。近幾年來國內(nèi)諸多科研機構(gòu)通過現(xiàn)代菌種選育技術(shù)，對谷氨酰胺生產(chǎn)菌做了大量定向選育和菌株構(gòu)建的工作。上?？萍即髮W王福源等人用黃色短桿菌ATCC14067發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺，產(chǎn)量為25g/l；徐建華等人用鈍齒狀桿菌HU7251誘變得一高產(chǎn)菌株，其生產(chǎn)水平為33～35g/l；張克旭等人利用天津短桿菌經(jīng)誘變處理得一高產(chǎn)菌株，平均產(chǎn)量可達31.4g/l；上海工業(yè)微生物研究所的李爽等以黃色短桿菌SGR和DONR抗性菌株作為出發(fā)株，谷氨酰胺產(chǎn)量為52.2g/l；汪世華等人用谷氨酸棒桿菌誘變得一高產(chǎn)菌株，其生產(chǎn)水平為56.2g/l。然而，目前，經(jīng)檢索能夠達到80g/l能力的高產(chǎn)谷氨酰胺谷氨酸棒桿菌還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株新分離的可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，該菌最高產(chǎn)谷氨酰胺為80g/l并且可耐受高達8％～10％硫酸銨的鹽濃度。
本發(fā)明涉及的可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32，已于2005年4月14日保藏在“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO.M205028。
上述可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，具有如下生物學特征形態(tài)學特征是幼時培養(yǎng)物呈現(xiàn)短桿狀，單個或成對存在，有“V”字形排列，不形成菌絲體，見圖1。革蘭氏染色陽性，但容易褪色，不運動，不生孢，不抗酸，兼性厭氧，需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其上的菌落呈凸起，半透明，毛玻璃狀表面；生理生化特征是化能異養(yǎng)菌，發(fā)酵代謝，從葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖產(chǎn)酸，接觸酶陽性，還原硝酸鹽；詳見表1。
表1 谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028的生理生化鑒定

ND*不確定上述谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028培養(yǎng)溫度為28-37℃；在LB培養(yǎng)基中生長良好；在液體種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長良好，并經(jīng)培養(yǎng)8-10小時后接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，溶解氧水平控制在10％～50％的飽和度，pH為6.0～6.6，發(fā)酵時間為35～60小時，進行通風攪拌培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)高濃度谷氨酰胺，發(fā)酵過程中利用生物膜分析儀和生化分析儀不間斷檢測發(fā)酵液中葡萄糖、谷氨酸及谷氨酰胺的濃度，并通過流加葡萄糖使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在20+5g/L(優(yōu)選20±2g/L)，當檢測知發(fā)酵液中谷氨酰胺濃度不再上升時，結(jié)束發(fā)酵；上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克氯化鈉，pH 7.0，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌15分鐘；上述液體種子培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含27克葡萄糖，10克硫酸氨，5克蛋白胨，3.5克玉米漿，0.4克硫酸鎂，1.0克磷酸二氫鉀，1.0克氯化鈉，10mL質(zhì)量百分比為0.2％的硫酸鐵，pH 7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含140克葡萄糖，98克硫酸氨，5克尿素，16克玉米漿，5克糖蜜，4.5克磷酸二氫鉀，2.25克硫酸鎂，50克碳酸鈣，10mL質(zhì)量百分比為0.1％的硫酸錳，1mL質(zhì)量百分比為0.1％的硫酸鋅，pH 7.0，115℃條件下滅菌20分鐘。
上述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為30℃。
上述在液體種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)時間優(yōu)選為9小時。
上述在發(fā)酵過程中溶解氧水平優(yōu)選控制在20％～40％的飽和度。
上述在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間優(yōu)選為45～60小時。
上在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間進一步優(yōu)選為48～57小時。
上述在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間最優(yōu)選為54小時。
本發(fā)明的菌株谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32 CCTCCNO.M205028的16S rDNA基因序列長度為1439bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
通過在美國生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查閱國際相關(guān)的基因庫，將本發(fā)明的菌株谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)G32的16S rDNA基因序列與其相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列進行比對(如表2所示)，雖有相似性，但卻不完全相同，說明本發(fā)明的菌株是首次分離鑒定。
表2 谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028的16S rDNA與GenBank提交菌株基因序列相似性比較

進一步通過軟件在美國生物工程信息中心使用BLASTN程序比對，對給出的序列使用Vector NTI軟件構(gòu)建進化樹，菌株G32和古地分枝桿菌位于同一個分支上，鑒定菌株G32為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，如附圖2所示。
本發(fā)明涉及的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32 CCTCCNO.M205028在谷氨酰胺發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028與菌株Corynebacterium glutamicum ATCC 13032相比，具有很高的發(fā)酵產(chǎn)谷氨酰胺能力，并且能耐受比菌株Corynebacterium glutamicumATCC13032高數(shù)倍濃度的硫酸銨。
本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028發(fā)酵培養(yǎng)45-60小時可積累谷氨酰胺75-80g/L，而菌株Corynebacterium glutamicumATCC13032發(fā)酵超過60小時只能積累20-30g/L的谷氨酰胺。本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028可以耐受很高的鹽濃度，最高可耐受10％濃度的硫酸銨，并且生長良好，而菌株Corynebacterium glutamicumATCC13032在含超過4％濃度的硫酸銨的培養(yǎng)基上，生長受到明顯的抑制。


本發(fā)明涉及的一株可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32，已于2005年4月14日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址湖北省武漢市武漢大學，郵政編碼430072，其保藏號為CCTCCNO.M205028。
圖1.谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028的電鏡照片其中A放大10000倍，B放大8000倍圖2.谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028在進化樹上的位置圖3.谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028發(fā)酵過程曲線A為離線數(shù)據(jù)，B為在線數(shù)據(jù)；A中符號表示意思為△葡萄糖(g/l)，口菌濁(OD610nm)，○谷氨酸(g/l)，▲谷氨酰胺(g/l)；B中各曲線分別表示攪拌轉(zhuǎn)速、pH、溫度、溶解氧的變化。
具體實施例方式
實施例1谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028菌株的篩選在培養(yǎng)到對數(shù)生長期中期的種子培養(yǎng)基中(預(yù)先加入玻璃珠)加入終濃度為300ug/ml的亞硝基胍(NTG)溶液，30℃恒溫振蕩處理30分鐘，然后取5ml加入到一無菌試管內(nèi)，立即加入0.5ml 25％的硫代硫酸鈉終止作用。取適當?shù)南♂尪?優(yōu)選105個菌體/ml)涂布篩選平板，篩選平板為LB培養(yǎng)基加上0.6g/l的磺胺胍(SG)和0.5％的LiCl，用紙包上避光，30℃倒置培養(yǎng)2～3天后，挑單菌落做搖管培養(yǎng)，搖管培養(yǎng)在30℃、轉(zhuǎn)速100r/min，沖程8cm的往復(fù)式搖床上進行，培養(yǎng)72小時后，利用YSI2700生化分析儀檢測谷氨酰胺產(chǎn)量，初選高產(chǎn)菌株。
再通過搖瓶初篩和復(fù)篩，得到20株產(chǎn)谷氨酰胺能力較高的菌株，最后經(jīng)純化和搖瓶復(fù)篩驗證，得到一株產(chǎn)谷氨酰胺能力最高的菌株，即谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)G32 CCTCC NO.M205028，經(jīng)過穩(wěn)定性實驗表明該菌株具有非常高的穩(wěn)定性，數(shù)代后產(chǎn)酸能力沒有降低。
該菌株幼時培養(yǎng)物呈現(xiàn)短桿狀，單個或成對存在。不運動，不生孢，不抗酸。嚴格好氧菌。菌落淡黃色，化能異養(yǎng)，呼吸代謝。在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中生長良好。其最適生長溫度在30℃。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克氯化鈉，16克瓊脂粉，pH 7.0。篩選培養(yǎng)基為在上述配方的基礎(chǔ)上加入0.6g/l的磺胺胍(SG)和0.5％的LiCl，121℃條件下滅菌15分鐘。
實施例2上述谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32 CCTCCNO.M205028菌株16S rDNA基因的提取培養(yǎng)5ml的細菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，取1.5ml培養(yǎng)物，6000g離心2分鐘；沉淀物加入565μl的TE緩沖液，TE緩沖液配方如下10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用鹽酸調(diào)整pH為8.0，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，加入30μl質(zhì)量體積比為10％的十二烷基磺酸鈉(SDS)和5μl 20mg/mL的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1小時；加入100μl，5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，CTAB/NaCl溶液配方如下質(zhì)量體積比為10％的十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中，混勻，于65℃溫育10分鐘；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12000g離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入一個新管中，如果難以移出上清，先用牙簽除去界面物質(zhì)；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12000g離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入一支新管中；加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻直到DNA沉淀下來，用一個封口的離心管將沉淀轉(zhuǎn)移至1ml的70％乙醇中洗滌；12000g離心5分鐘，棄上清，用凍干機稍加干燥，重溶于100μl的TE緩沖液。以提取的基因組DNA為模板，利用購自上海博亞生物技術(shù)有限公司的真細菌引物27f和1492r，進行PCR擴增，在50μl反應(yīng)體系依次混勻下列試劑35μl H2O，5μl10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液，10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)、100mmol/L的用鹽酸調(diào)整pH為8.8的Tris緩沖液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2，4μl 25mmol/L MgCl2，1μl4種dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl模板DNA即上述谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32 CCTCCNO.M205028的基因組DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混勻后離心5秒鐘。加入50μl礦物油再離心5秒鐘；將混合物在94℃加熱5分鐘。94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，總共25個循環(huán)。最后一個循環(huán)后，于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)混合物擴增充分，得到谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCCNO.M205028的16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物，將產(chǎn)物測序。
測序結(jié)果谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028菌株16S rDNA基因序列長度為1439bp，核苷酸序列如下CTCCCACTTCGACAGCTCCCCCCTAAAAAGGTTGGGCCACTGGCTTCGGGTGTTACCAACTTTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGGCCGGCTTTAAGAGATTAGCTCCACCTCACGGTGTGGCAACTCGCTGTACCGACCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCA
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將上述液體種子按體積百分比為5％的量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行通風攪拌培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)高濃度谷氨酰胺，培養(yǎng)溫度為30℃，溶解氧水平通過改變攪拌轉(zhuǎn)速及通風比率使之控制在20％～40％的飽和度，發(fā)酵時間為35-60小時。發(fā)酵初期控制pH為6.6，當菌體生長到指數(shù)中后期時(17～18小時)，通過流加1.2N的稀鹽酸將pH降為6.0并一直維持到發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中利用SBA生物膜分析儀和YSI2700生化分析儀不間斷檢測發(fā)酵液中葡萄糖、谷氨酸及谷氨酰胺的濃度，并通過流加葡萄糖使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在20±2g/L，當檢測知發(fā)酵液中谷氨酰胺濃度不再上升時，結(jié)束發(fā)酵。
本實驗中，當液體種子在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)54小時時，檢測得發(fā)酵液中的谷氨酰胺濃度最高，為80g/L。發(fā)酵過程的曲線見附圖3。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克氯化鈉，pH7.0，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌15分鐘；上述液體種子培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含27克葡萄糖，10克硫酸氨，5克蛋白胨，3.5克玉米漿，0.4克硫酸鎂，1.0克磷酸二氫鉀，1.0克氯化鈉，10mL質(zhì)量百分比為0.2％的硫酸鐵，pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含140克葡萄糖，98克硫酸氨，5克尿素，16克玉米漿，5克糖蜜，4.5克磷酸二氫鉀，2.25克硫酸鎂，50克碳酸鈣，10mL質(zhì)量百分比為0.1％的硫酸錳，1mL質(zhì)量百分比為0.1％的硫酸鋅，pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘。
序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學<120>一株可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌<141>2005-3-24<211>1439<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<221>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32 CCTCC NO.M205028 16SrDNA<222>(1)…(1439)<400>
ctcccacttc gacagctccc ccctaaaaag gttgggccac tggcttcggg tgttaccaac 60tttcatgacg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cagcgttgct 120gatctgcgat tactagcgac tccgacttca tggggtcgag ttgcagaccc caatccgaac 180tgaggccggc tttaagagat tagctccacc tcacggtgtg gcaactcgct gtaccgacca 240ttgtagcatg tgtgaagccc tggacataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct 300tcctccgagt taaccccggc agtctctcat gagtacccac cataatgtgc tggcaacata 360agacaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 420aaccatgcac cacctgtgaa ccgaccacaa gggaaaacgt atctctacgc cgatccggtc 480catgtcaagc ccaggtaagg ttcttcgcgt tgcatcgaat taatccacat gctccgccgc 540ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt tttagccttg cggccgtact ccccaggcgg 600ggcgcttaat gcgttagctg cggcacagaa gtcgtggaag acccctacac ctagcgccca 660ccgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc gctacccatg ctttcgctcc 720tcagcgtcag ttactgccca gagacctgcc ttcgccattg gtgttcctcc tgatatctgc 780gcatttcacc gctacaccag gaattccagt ctcccctaca gcactcaagt tatgcccgta 840tcgcctgcac gcccgaagtt aagccccggg atttcacaga cgacgcgaca aaccacctac 900gagctcttta cgcccagtaa ttccggacaa cgctcgcacc ctacgtatta ccgcggctgc 960tggcacgtag ttagccggtg cttcttctcc aggtaccgtc acctaaaagg tttcgtccct1020accgaaagga gtttacaacc cgaaggccgt catcccccac gcggcgtcgc tgcatcaggc1080ttgcgcccat tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt atgtgtatgg nccgtgtgtc1140agtcccaatg tggccgtaca ccctctcagg ccggctaccc gtagacgcct tggtaggcca1200ttaccccacc aacaagttga taggccgcag gctcatccca caccgcataa agctttccac1260accacccgta cggtggtgtg aatattcggt attagaccca gtttcccagg cttatcccat1320agtgtagggc agatcaccca cgtgttactc acccgttcgc cactcatcca ccaaatgcaa1380gcatttggtg tctgcgttcg acttgcatgt gttaagcacg ccgagggcgt tgtcaaggg 1439
權(quán)利要求
1.一株可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，其特征在于該菌名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32，已于2005年4月14日保藏在“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO.M205028。
2.如權(quán)利要求1所述可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，具有如下生物學特征形態(tài)學特征是幼時培養(yǎng)物呈現(xiàn)短桿狀，單個或成對存在，有“V”字形排列，不形成菌絲體，革蘭氏染色陽性，但容易褪色，不運動，不生孢，不抗酸，兼性厭氧，需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其上的菌落呈凸起，半透明，毛玻璃狀表面；生理生化特征是化能異養(yǎng)菌，發(fā)酵代謝，從葡萄糖、果糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖產(chǎn)酸，接觸酶陽性，還原硝酸鹽；該菌的16S rDNA序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，其特征是，所述谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32CCTCC NO.M205028培養(yǎng)溫度為28～37℃；在LB培養(yǎng)基中生長良好；在液體種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長良好，并經(jīng)培養(yǎng)8～10小時后接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，溶解氧水平控制在10％～50％的飽和度，pH為6.0～6.6，發(fā)酵時間為35～60小時，進行通風攪拌培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)高濃度谷氨酰胺，發(fā)酵過程中利用生物膜分析儀和生化分析儀不間斷檢測發(fā)酵液中葡萄糖、谷氨酸及谷氨酰胺的濃度，并通過流加葡萄糖使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在20±5g/L，當檢測知發(fā)酵液中谷氨酰胺濃度不再上升時，結(jié)束發(fā)酵；上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克氯化鈉，pH 7.0，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌15分鐘；上述液體種子培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含27克葡萄糖，10克硫酸氨，5克蛋白胨，3.5克玉米漿，0.4克硫酸鎂，1.0克磷酸二氫鉀，1.0克氯化鈉，10mL質(zhì)量百分比為0.2％的硫酸鐵，pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含140克葡萄糖，98克硫酸氨，5克尿素，16克玉米漿，5克糖蜜，4.5克磷酸二氫鉀，2.25克硫酸鎂，50克碳酸鈣，10mL質(zhì)量百分比為0.1％的硫酸錳，1mL質(zhì)量百分比為0.1％的硫酸鋅，pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘。
4.如權(quán)利要求3所述的可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，其特征是，所述培養(yǎng)溫度為30℃。
5.如權(quán)利要求3所述的可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，其特征是，所述在液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間為9小時。
6.如權(quán)利要求3所述的可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，其特征是，所述在發(fā)酵過程中溶解氧水平控制在20％～40％的飽和度。
7.如權(quán)利要求3所述的可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，其特征是，所述在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間為45～60小時。
8.如權(quán)利要求7所述的可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，其特征是，所述在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間為48～57小時。
9.如權(quán)利要求8所述的可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，其特征是，所述在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間為54小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株可高產(chǎn)谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌，該菌名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)G32，已于2005年4月14日保藏在“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO.M205028。該菌株幼時培養(yǎng)物呈現(xiàn)短桿狀，單個或成對存在，有“V”字形排列，不形成菌絲體，革蘭氏染色陽性，但容易褪色，不運動，不生孢，不抗酸，兼性厭氧，需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其上的菌落呈凸起，半透明，毛玻璃狀表面；該菌的16S rDNA序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。該菌發(fā)酵液中積累的谷氨酰氨量達75－80g/L，并且該菌可耐受高達8％～10％硫酸銨的鹽濃度。
文檔編號C12N1/20GK1710066SQ20051004370
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月7日
發(fā)明者許平, 馬翠卿, 楊春玉, 孫際賓, 李金山, 邱建華, 王霞 申請人:山東大學