使用含有可通過(guò)丙酸鹽誘導(dǎo)的ilvbn操縱子的重組棒桿菌生產(chǎn)L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-異 ...的制作方法
【專利說(shuō)明】使用含有可通過(guò)丙酸鹽誘導(dǎo)的M vbn操縱子的重組棒桿菌生 產(chǎn)L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、α-酮異戊酸、α-酮-β-甲 基戊酸或α-酮異己酸的方法
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用微生物生產(chǎn)氨基酸及酮酸的方法，其中通過(guò)丙酸鹽可誘導(dǎo)的 啟動(dòng)子使得某些基因可以受調(diào)節(jié)的表達(dá)。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 氨基酸和酮酸用于人體醫(yī)藥、制藥工業(yè)、化妝品、食品工業(yè)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。
[0003]許多這些化合物是通過(guò)棒狀細(xì)菌菌株特別是谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)發(fā)酵產(chǎn)生的。由于其重要性，改良生產(chǎn)方法的研究在持續(xù)進(jìn)行。方法改良可包 括發(fā)酵技術(shù)措施例如攪拌或氧供給，或者營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的成分，例如在發(fā)酵期間的糖濃度，或 者產(chǎn)物形式的加工，例如離子交換層析，或者微生物自身的固有生產(chǎn)特征。
[0004] 為了改良這些微生物的生產(chǎn)特征，使用誘變、選擇和突變體選擇的方法。以此方 式，獲得對(duì)于抗代謝物例如纈氨酸類似物2-噻唑丙氨酸或者亮氨酸類似物4-氮亮氨酸或者 5，5，5-三氟亮氨酸有抗性的菌株，所述菌株產(chǎn)生化學(xué)化合物，例如L-氨基酸L-纈氨酸或者 L-亮氨酸。
[0005] 一些年來(lái)，重組DNA技術(shù)的方法已經(jīng)同樣用于L-氨基酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌的 菌株改良，例如增加或弱化各個(gè)氨基酸生物合成基因，例如在生產(chǎn)過(guò)程中也進(jìn)行基因表達(dá) 的時(shí)序調(diào)節(jié)，以及研究對(duì)于化學(xué)化合物生產(chǎn)的影響。
[0006] 谷氨酸棒桿菌的生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物技術(shù)的概述見(jiàn)于"Handbook of Corynebacterium glutamicum"（Eds·:L·Eggeling and M.Bott,CRC Press ,Taylor& Francis，2005)、Journal of Biotechnology(Chief Editor:A.Piihler)特別出版的題目為 "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology"（Journal of Biotechnology 104/1-3,（2003))的出版物以及T.Scheper所著（Managing Editor) "Microbial Production of L-Amino Acids"（Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79，Springer Verlag,Berlin,Germany,2003)〇
[0007] 谷氛酸棒桿菌基因組的核昔酸序列在Ikeda和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99_109(2003))、ΕΡ1108790和Kalinowski et al.(Journal of Biotechnology 104/1-3，（2003))中描述。
[0008] 谷氨酸棒桿菌基因組的核苷酸序列同樣可以從美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館的國(guó)家生物 技術(shù)信息中心（NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)（86也68(^，]\?)，1]54)、日本0嫩數(shù)據(jù)庫(kù)（008幾]^811丨11^，如口311)或 者歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL, Heidelberg, Germany和Cambridge, UK)獲得。
[0009] 總的來(lái)說(shuō)，基因的表達(dá)有兩種可能性。在持續(xù)表達(dá)中，基因通過(guò)組成型啟動(dòng)子持續(xù) 表達(dá)，并且相應(yīng)的蛋白質(zhì)聚集在細(xì)胞中。
[0010] 另一方面，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子用于誘導(dǎo)表達(dá)。靶基因的表達(dá)可以通過(guò)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)。如果 (過(guò))表達(dá)對(duì)于生產(chǎn)生物體具有負(fù)面作用，則使用這種方法。導(dǎo)致這種情況的原因可能是在 生長(zhǎng)期間代謝來(lái)源的高荷載。結(jié)果是生長(zhǎng)減慢及因此延長(zhǎng)生物反應(yīng)器的運(yùn)行時(shí)間及與之相 關(guān)的在工業(yè)生產(chǎn)中的成本增加。誘導(dǎo)的表達(dá)在細(xì)胞毒性產(chǎn)物的情況中也是有益的。在此，在 誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)生細(xì)胞的自體中毒和死亡。針對(duì)生產(chǎn)方法的經(jīng)濟(jì)性，因此嘗試將該方法再分 為生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期。在生長(zhǎng)期，產(chǎn)生盡可能大量的生物量，然后在生產(chǎn)期通過(guò)啟動(dòng)子誘導(dǎo)產(chǎn) 生靶蛋白質(zhì)。以此方式，可以獲得最大產(chǎn)率，從而該方法成為明顯更經(jīng)濟(jì)的。
[0011 ] 對(duì)于可調(diào)節(jié)的大腸桿菌(Escherichia coli)啟動(dòng)子lac、APL和trp，已經(jīng)示出其可 以用于棒狀細(xì)菌中調(diào)節(jié)各個(gè)基因的表達(dá)（Tsuchiya and Morinaga，Bio/Technology 6 (1988)428-431)。
[0012] 可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的理想情況是棒狀細(xì)菌啟動(dòng)子，其由易于獲得的非昂貴的物質(zhì)調(diào) To
[0013] EP 0530765 Bl(Kyowa Hakko)描述了使用棒桿菌的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子-在此是異檸檬 酸裂合酶基因的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子-以產(chǎn)生酶如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和ICL以及生 理學(xué)活性蛋白質(zhì)，如胰島素或者α-、β_或λ-干擾素。只要培養(yǎng)基中存在不同于糖的碳源(C 源），這種啟動(dòng)子即可導(dǎo)致基因表達(dá);在存在糖的情況下其被抑制。然而，由于在一般的發(fā)酵 培養(yǎng)基中使用糖作為C源，因此有用的是獲得可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子即使在存在糖的條 件下使用非昂貴的誘導(dǎo)物也導(dǎo)致基因表達(dá)。
[0014] DE 4440118 C1(如US 5965391，F(xiàn)Z Jiilich)保護(hù)了來(lái)自棒桿菌的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子-在此是蘋(píng)果酸合酶基因 aceB的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子-生產(chǎn)蛋白質(zhì)的用途;在此誘導(dǎo)物是碳源乳酸 鹽、丙酮酸鹽或乙酸鹽。
[0015] Plassmeier等（Journal of Biotechnology 159/1-2(2012))描述了谷氨酸棒桿 菌的prpDBC2操縱子的啟動(dòng)子，其基因是在作為主要C源的丙酸鹽上生長(zhǎng)所必需的，并且編 碼酶2-甲基檸檬酸脫水酶(PrpD2)、2-甲基異檸檬酸裂合酶(PrpB2)及2-甲基檸檬酸合酶 (PrpC2)。啟動(dòng)子測(cè)試載體構(gòu)建體的分析可以鑒別prpDBC2操縱子上長(zhǎng)度為121個(gè)堿基對(duì)的 操縱子區(qū)，其是通過(guò)激活物PrpR經(jīng)丙酸鹽誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄所必需的。EMSA研究示出2-甲基檸檬 酸鹽可能發(fā)揮作為PrpR的共激活物的功能。
[0016] 發(fā)明目的
[0017]本發(fā)明基于如下目的，即生產(chǎn)L-氨基酸L-亮氨酸、L-纈氨酸或L-異亮氨酸、優(yōu)選L-纈氨酸，或者生產(chǎn)α_酮酸α-酮異戊酸，α-酮甲基戊酸或者α-酮異己酸的新方法，所述方法具 有優(yōu)選改良的產(chǎn)率和/或細(xì)胞內(nèi)和/或在培養(yǎng)基中更高的產(chǎn)物終濃度。在此，應(yīng)優(yōu)選存在比 產(chǎn)率(spezifischen Ausbeute)的改良（即相對(duì)于采用的碳源的希望的產(chǎn)物產(chǎn)率）。
[0018] 所述新方法應(yīng)優(yōu)選可以不依賴于培養(yǎng)基的主要碳源而調(diào)節(jié)L-氨基酸和/或α-酮酸 的產(chǎn)生。
[0019] 在新方法中，如果可能，則不希望的副產(chǎn)物的形成、特別是不希望的副產(chǎn)物丙氨酸 的形成應(yīng)還優(yōu)選被抑制，因?yàn)楦碑a(chǎn)物的分離是非常費(fèi)力及高成本的，并且對(duì)于肉湯的產(chǎn)物 純度和碳產(chǎn)率具有負(fù)面作用。
[0020] 使用的方法應(yīng)還優(yōu)選導(dǎo)致用于生產(chǎn)的菌株的遺傳穩(wěn)定性增加，及因此在發(fā)酵過(guò)程 (培養(yǎng)階段和主發(fā)酵罐)中可以產(chǎn)生大量世代而不降低輸出數(shù)據(jù)。
[0021] 發(fā)明描述
[0022]本發(fā)明的目的通過(guò)使用激活物PrpR結(jié)合的操縱基因調(diào)芐基因 ilvBN的表達(dá)而實(shí) 現(xiàn)。
[0023] ilvBN(EC No.4.1.3.18)是編碼乙酰乳酸合酶的亞基的基因。
[0024]本發(fā)明的目的因此是通過(guò)棒桿菌屬(Corynebacterium)微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸 或者α-酮酸的方法，所述L-氨基酸選自L-亮氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸，優(yōu)選L-纈氨酸， 所述α-酮酸選自酮異戊酸、酮甲基戊酸和酮異己酸，所述微生物含有可復(fù)制形式的具有操 縱基因活性的多核苷酸，所述多核苷酸序列與SEQ ID Ν0:1、2或3所示序列的位置1-121的 序列至少85 %、優(yōu)選至少90 %、92 %、94%或96 %、特別是至少97 %、98 %或99 %、特別優(yōu)選 100%相同，激活物PrpR與所述多核苷酸結(jié)合，并且功能上在所述多核苷酸的下游在3'末端 是具有啟動(dòng)子活性的第二個(gè)多核苷酸，以及編碼乙酰乳酸合酶亞基的基因 ilvB和ilvN，并 且所述多核苷酸隨著添加激活物PrpR而調(diào)芐基因 ilvBN的轉(zhuǎn)錄，所述激活物PrpR由培養(yǎng)基 中的共激活物2-甲基檸檬酸鹽激活，在無(wú)誘導(dǎo)物的第一階段之后，在隨后的第二階段向培 養(yǎng)基中加入丙酸鹽或者2-甲基檸檬酸鹽作為誘導(dǎo)物，由此ilvBN基因表達(dá)及因此在希望的 L-氨基酸或α-酮酸富集在培養(yǎng)基或細(xì)胞中的條件下合成希望的L-氨基酸或α-酮酸。
[0025]具有操縱基因活性的多核苷酸優(yōu)選是在棒狀細(xì)菌中天然調(diào)節(jié)2-甲基檸檬酸脫水 酶表達(dá)的操縱基因，或者衍生自這種操縱基因的多核苷酸。
[0026]具有操縱基因活性的多核苷酸優(yōu)選包含這樣的多核苷酸，其序列與SEQ ID Ν0:11 所示序列或者與SEQ ID N0:l、2或3所示序列的位置22-49的序列(在下文也稱作"IR Γ)至 少90%、優(yōu)選至少92%、94%或96%、特別至少97%、98%或99%、特別優(yōu)選100%相同，以及 還包含這樣的多核苷酸，其序列與SEQ ID Ν0:12所示序列或者與SEQ ID Ν0:1、2或3所示序 列的位置77-105的序列（在下文稱作"IR 2"）至少90%、優(yōu)選至少92%、94%或96%、特別至 少97%、98%或99%、特別優(yōu)選100%相同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，序列"IR Γ位于具有操縱 基因活性的多核苷酸的位置22-49,在優(yōu)選的實(shí)施方案中序列"IR 2"位于位置77-105。 [0027]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，具有操縱基因活性的多核苷酸是較長(zhǎng)的多核苷酸的 一部分，所述較長(zhǎng)的多核苷酸優(yōu)選與SEQ ID N0:1、2或3的位置1-177的序列具有至少90%、 優(yōu)選至少92%、94%或96%、特別是至少97%、98%或99%、特別優(yōu)選100%的序列相同性。 [0028] 基因 ilvB優(yōu)選是編碼具有與SEQ ID N0:9的氨基酸序列具有至少90%、優(yōu)選至少 92%、94%或96%、特別至少97%、98%或99%、特別優(yōu)選100%相同性的氨基酸序列的多肽 的多核苷酸。
[0029]特別優(yōu)選這樣的多核苷酸，其序列與SEQ ID N0:8的位置499-2379的序列是至少 90%、優(yōu)選至少92%、94%或96%、特別至少97%、98%或99%、特別優(yōu)選100%相同的。 [0030] 基因 ilvN優(yōu)選是編碼具有與SEQ ID N0:10的氨基酸序列具有至少90%、優(yōu)選至少 92%、94%或96%、特別至少97%、98%或99%、特別優(yōu)選100%相同性的氨基酸序列的多肽 的多核苷酸。
[0031]特別優(yōu)選這樣的多核苷酸，其序列與SEQ ID N0:8的位置2393-2911的序列至少 90%、優(yōu)選至少92%、94%或96%、特別是至少97%、98%或99%、特別優(yōu)選100%相同。 [0032]由基因 ilvB和ilvN編碼的多肽聚集在一起產(chǎn)生功能性乙酰乳酸合酶。
[0033]丙酸鹽或丙酸優(yōu)選用于誘導(dǎo)表達(dá)。在這方面，發(fā)生"丙酸鹽誘導(dǎo)"。丙酸鹽在體外被 轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)際的共激活物2-甲基檸檬酸鹽?；蛘撸?-甲基檸檬酸鹽也可以直接用于誘導(dǎo)，但是 由于其較低的可用性而不太優(yōu)選。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"丙酸鹽誘導(dǎo)"也包括用2-甲基檸檬酸 鹽誘導(dǎo)。
[0034] 在生產(chǎn)完成后，優(yōu)選分離希望的L-氨基酸或α_酮酸，發(fā)酵肉湯的其它成分和/或生 物量任選以其全部或部分(>〇至100%)保留在分離的產(chǎn)物中或者被完全除去。
[0035] 在本發(fā)明的方法中，首先發(fā)生生物量的無(wú)誘導(dǎo)培養(yǎng)階段(生長(zhǎng)期，第一階段）。在這 個(gè)階段，優(yōu)選沒(méi)有或者幾乎沒(méi)有任何氨基酸或酮酸形成(<5g/l)。在隨后的生產(chǎn)階段(誘導(dǎo) 期，第二階段），通過(guò)丙酸鹽或2-甲基檸檬酸鹽誘導(dǎo)生物合成基因 ilvBN而誘導(dǎo)生產(chǎn)。培養(yǎng)階 段包括所有培養(yǎng)步驟，從保留樣品開(kāi)始，通過(guò)優(yōu)選應(yīng)用搖瓶階段直至優(yōu)選應(yīng)用培養(yǎng)發(fā)酵罐。 培養(yǎng)階段也可以仍包括主發(fā)酵的第一階段。優(yōu)選地