專利名稱：用于表征一種氧化還原劑系統(tǒng)酶的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于表征氧化還原系統(tǒng)酶的方法和組合物。
背景技術(shù)：
對(duì)當(dāng)今社會(huì)而言，生理性液體或樣品例如血液或血液制品的分析物檢測(cè)正日益重要。分析物檢測(cè)試驗(yàn)用于多種應(yīng)用中，所述應(yīng)用包括臨床實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)、家庭化驗(yàn)等，這些化驗(yàn)結(jié)果在多種疾病的診斷和控制中充當(dāng)重要的角色。所研究的分析物包括用于糖尿病控制的葡萄糖、膽固醇等。隨著分析物檢測(cè)的日益重要，已經(jīng)研究了多種用于臨床和家庭的分析物檢測(cè)規(guī)程和裝置。
一種類型的用于分析物檢測(cè)的方法為電化學(xué)方法。在這類方法中，將一種水溶液樣品放在電化學(xué)槽的反應(yīng)區(qū)中，所述電化學(xué)槽包括至少兩個(gè)電極，即一個(gè)參比電極和一個(gè)工作電極。使待分析成分同一個(gè)電極直接反應(yīng)，或者使之同一種氧化還原劑直接或間接地反應(yīng)從而形成一種可氧化(或可還原)的物質(zhì)，所述物質(zhì)的量對(duì)應(yīng)于待分析成分、即分析物的濃度。然后用電化學(xué)方法推算存在的可氧化(或可還原)物質(zhì)的量，其與原始樣品中存在的分析物的量有關(guān)。
在許多這種用于分析物檢測(cè)的電化學(xué)方法中，使用一種分析物氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括一種酶成分和一種介質(zhì)成分，所述酶成分氧化所研究的分析物，然后向介質(zhì)傳遞一個(gè)電子，所述介質(zhì)依次將電子傳遞到電化學(xué)槽的一個(gè)電極上，從而產(chǎn)生一個(gè)電信號(hào)，可由所述電信號(hào)測(cè)定所述分析物的濃度。
在設(shè)計(jì)電化學(xué)分析物檢測(cè)試驗(yàn)和系統(tǒng)中，期望使用一種分析物特異性酶。例如對(duì)于測(cè)定葡萄糖而言，可溶解形式的吡咯并喹啉醌(PQQ)依賴的葡糖脫氫酶(后面稱之為s-GDH)是一種可在葡萄糖氧化信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)中使用的酶。s-GDH是一種弱電子受體，因此有利地，對(duì)在流體樣本中存在的氧不敏感。
然而，天然存在或“野生型”的s-GDH的缺點(diǎn)為它不僅氧化葡萄糖，還氧化其它還原糖，所述還原糖包括麥芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖以及核糖。在某些情況下，s-GDH與葡萄糖之外的糖的反應(yīng)性可損害一些糖尿病病人血糖水平檢測(cè)的精確度。例如，病人在進(jìn)行腹膜透析時(shí)用icodextrin(一種葡萄糖聚合物)處理，其血液中可能含有很高水平的麥芽糖。
s-GDH特異性的缺乏導(dǎo)致人們?cè)噲D通過產(chǎn)生變異形式的酶例如產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換來提高s-GDH的特異性。然而，在可以使用這種“轉(zhuǎn)變”酶之前，必須對(duì)其進(jìn)行測(cè)試以測(cè)定其用于分析物檢測(cè)試驗(yàn)的適宜性。
雖然費(fèi)時(shí)，但分光光度法試驗(yàn)已被用于測(cè)定s-GDH的活性，但僅在酶限制性條件下使用。在美國專利US6,103,509和歐洲專利申請(qǐng)NO.1176202A1中公開的一種分光光度法試驗(yàn)使用2，6-二氯酚吲哚酚(DCIP)和甲硫酸吩嗪(PMS)作為人工介質(zhì)。
然而，典型的使用s-GDH的商用葡萄糖測(cè)試帶不使用酶限制性條件，這是因?yàn)槊高^量存在以保證帶的長(zhǎng)期性能。通常僅生產(chǎn)少量的重組體蛋白質(zhì)，例如s-GDH的變異形式。測(cè)試這些變異形式s-GDH的反應(yīng)性涉及制備涂覆有酶的帶，以及用含有各種濃度的葡萄糖和每種可能的干擾(即還原)糖的全血或血漿測(cè)試每一批帶。制備涂覆有每種變異形式s-GDH的測(cè)試帶需要大量的每種變異體，其費(fèi)時(shí)、勞動(dòng)強(qiáng)度大、需要技術(shù)人員用人血或血漿測(cè)試所述帶，這可能產(chǎn)生生物危害。
因此，需要一種快速和便宜的底物限制性試驗(yàn)來測(cè)定是否由于特定突變酶例如s-GDH的葡萄糖特異性相對(duì)于野生型s-GDH得到了提高而使其大規(guī)模生產(chǎn)得到保證。除了摻有還原糖的全血或血漿樣品之外，所述試驗(yàn)還可用于摻有葡萄糖或干擾糖的不含血液的樣品。
因此，在本領(lǐng)域仍然需要的是一種快速和簡(jiǎn)單的方法，所述方法用于測(cè)定變異形式s-GDH的糖特異性，所述方法使用少量的酶并在一種典型的、基于電化學(xué)的測(cè)試帶上模擬底物限制性條件，用于測(cè)量流體樣品(例如全血或血漿)中的分析物(例如葡萄糖)。此外，還期望一種用于測(cè)試酶活的快速和簡(jiǎn)單的方法。
相關(guān)文獻(xiàn)美國專利文獻(xiàn)5,484,708；5,723,284；5,834,224；5,942,102；5,972,199；5,997,817；6,059,946；6,083,710；6,103,509；6,121,009；6,134,461；6,179,979；6,193,973；6,231,531；6,284,125；6,340,428；6,444,115以及6,716,577；以及其它專利文獻(xiàn)US2003/0104595；WO99/49307；WO97/18465；WO01/57510；WO01/57238；WO02/48707；WO02/50609；WO02/06788；EP0969097；EP1176202；JP091403378A和GB2304628。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于表征氧化還原劑系統(tǒng)酶的方法和組合物。在實(shí)施上述方法時(shí)，將一種包括氧化還原劑系統(tǒng)酶和已知量底物的樣品施加到一個(gè)電化學(xué)槽，所述槽包括一種無酶試劑組合物，所述組合物具有一種氧化還原劑系統(tǒng)介質(zhì)。還提供了包括上述電化學(xué)槽的電化學(xué)測(cè)試帶、包括所述帶的系統(tǒng)以及成套部件。本發(fā)明用在多種不同的應(yīng)用中，所述應(yīng)用包括氧化還原劑系統(tǒng)的表征應(yīng)用。


通過參考下述詳細(xì)的說明書和附圖，將更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，所述說明書列出了使用本發(fā)明原理的說明性實(shí)施方案，附圖中的圖1為說明根據(jù)本發(fā)明的一種代表性實(shí)施方案的工藝中連續(xù)步驟的流程圖，其用于測(cè)試變異形式的s-GDH；圖2A和2B各為測(cè)試帶的分解圖和頂視圖，可將所述帶用在根據(jù)本發(fā)明的代表性工藝中；圖3為說明根據(jù)本發(fā)明的一種代表性實(shí)施方案的工藝中連續(xù)步驟的流程圖，其用于測(cè)試野生型s-GDH及其變異體的活性；圖4為顯示野生型s-GDH和兩種變異形式s-GDH(Asn452Thr和Asp167Glu)相對(duì)于不含干擾糖對(duì)照物的絕對(duì)偏差的圖，所述絕對(duì)偏差為木糖濃度的函數(shù)，其使用常規(guī)涂覆酶的測(cè)試帶；圖5為顯示作為糖濃度函數(shù)的響應(yīng)的圖，其用于常規(guī)的涂覆酶的測(cè)試帶，其中所述酶為野生型s-GDH；圖6為顯示作為糖濃度函數(shù)的響應(yīng)的圖，其在根據(jù)本發(fā)明的工藝中使用野生型s-GDH；圖7為顯示作為糖濃度函數(shù)的響應(yīng)的圖，其在根據(jù)本發(fā)明的工藝中使用變異形式的s-GDH Asn452Thr；圖8為顯示作為糖濃度函數(shù)的響應(yīng)的圖，其在根據(jù)本發(fā)明的工藝中使用另一種變異形式的s-GDH Asp167Glu；圖9為顯示用于野生型s-GDH標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖，所述曲線在根據(jù)本發(fā)明的工藝中獲得；圖10為顯示在圖9中說明的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖，其為雙倒數(shù)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了用于表征氧化還原劑系統(tǒng)酶的方法和組合物。在實(shí)施上述方法時(shí)，將一種包括氧化還原劑系統(tǒng)酶和已知量底物的樣品施加到一電化學(xué)槽，所述槽包括一種無酶試劑組合物，所述組合物具有一種氧化還原劑系統(tǒng)介質(zhì)。還提供了包括上述電化學(xué)槽的電化學(xué)測(cè)試帶、包括所述帶的系統(tǒng)以及成套部件。所述發(fā)明用在多種不同的應(yīng)用中，所述應(yīng)用包括氧化還原劑系統(tǒng)表征應(yīng)用。
在進(jìn)一步公開本發(fā)明之前，應(yīng)該理解的是本發(fā)明不局限于本發(fā)明下述具體實(shí)施方案，因?yàn)榭蓪?duì)所述具體實(shí)施方案進(jìn)行改變，且其仍然屬于所附權(quán)利要求的范圍。還應(yīng)該理解的是所用的術(shù)語是為了公開具體實(shí)施方案，其并不意味著限制。相反，本發(fā)明的范圍將由所附權(quán)利要求確定。
在本說明書和所附權(quán)利要求中，除非上下文清楚規(guī)定，否則單數(shù)形式的“一”包括復(fù)數(shù)，除非上下文中有明確的相反說明。除非另行限定，否則對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，所有用于此處的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與常規(guī)理解相同的含義。
當(dāng)提供了一個(gè)數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，每個(gè)中間值都被包括在本發(fā)明中，包括至下限十分之一單位(除非上下文中有相反說明)的中間值，在該范圍上下限之間的中間值，以及在該指明的范圍內(nèi)的任何其它指明的值、或中間值。這些更小的范圍的上下限可以獨(dú)立地被包括在這些更小的范圍內(nèi)，并且也包括在本發(fā)明中，除非在該指明范圍內(nèi)特別排除了某個(gè)端點(diǎn)。當(dāng)該指明的范圍包括一個(gè)或兩個(gè)端點(diǎn)時(shí)，排除一個(gè)或兩個(gè)被包括的端點(diǎn)的范圍也包括在本發(fā)明中。
除非另行限定，否則對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，所有用于此處的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與常規(guī)理解相同的意思。盡管在實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明中，可使用任何與在此公開的方法、裝置和材料相似或等價(jià)的方法、裝置和材料，但現(xiàn)在將公開優(yōu)選的方法、裝置和材料。
為了說明和公開細(xì)胞系、載體以及方法，在此以引用的方式將所有在此提到的出版物包括在內(nèi)，所述細(xì)胞系、載體以及方法在所述出版物中公開，并可將之同所述發(fā)明結(jié)合使用。
如上所述，本發(fā)明提供了用于表征酶的方法和組合物。在進(jìn)一步說明本發(fā)明的過程中，首先更詳細(xì)評(píng)述上述方法及其代表性具體應(yīng)用，然后評(píng)述用于實(shí)施所述方法的代表性組合物和系統(tǒng)。
方法如上所述，本發(fā)明提供了表征酶的方法。表征一種酶意味著測(cè)定該酶的特征或參數(shù)。所述特征可為所述酶的固有特征例如它的底物選擇性，或者至少部分依賴環(huán)境的特征例如在給定流體培養(yǎng)基中酶的濃度、在給定流體培養(yǎng)基中酶的活性等。當(dāng)然，所述特征可為固有因素和環(huán)境因素的產(chǎn)物。在下面更詳細(xì)地公開具體的代表性特征，使用本發(fā)明所述的方法可測(cè)定所述代表性特征。
所述方法包括將一種含有氧化還原劑系統(tǒng)酶的樣品施加到一電化學(xué)槽，并檢測(cè)由所述槽產(chǎn)生的電信號(hào)，然后使用所述檢測(cè)到的信號(hào)來表征所述樣品中的氧化還原劑系統(tǒng)酶。
本發(fā)明的一些代表性實(shí)施方案的特征在于同所述電化學(xué)槽接觸的所述樣品包括氧化還原劑系統(tǒng)酶和已知量的酶底物，而所述電化學(xué)槽包括一種無酶試劑組合物，將所述樣品施加到所述電化學(xué)槽，所述無酶試劑組合物包括氧化還原劑系統(tǒng)的介質(zhì)成分，其中所述樣品中的酶為所述系統(tǒng)的一種組成成分。現(xiàn)在，將分別更詳細(xì)地公開上述方法的實(shí)施方案中使用的樣品和電化學(xué)槽成分。
樣品在實(shí)施上述方法中，同所述電化學(xué)槽接觸的樣品是這樣一種樣品，其包括氧化還原劑系統(tǒng)酶和已知量的底物或者至少是所述酶的可能底物即酶底物。
酶在許多實(shí)施方案中，所述樣品的酶成分是一種酶或者多種酶，所述多種酶一起氧化所研究的分析物。換句話說，所述酶成分可由單獨(dú)一種分析物氧化酶或者由兩種或多種酶的收集物組成，所述兩種或多種酶一起氧化一種給定的研究分析物，使得在電化學(xué)槽中產(chǎn)生一種電化學(xué)信號(hào)，如下所述。所研究的酶包括氧化酶、脫氫酶、脂肪酶、激酶、黃遞酶、醌蛋白酶(quinoprotein)等。所研究的更具體的代表性酶包括但不局限為葡萄糖氧化酶、葡糖脫氫酶、膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶、乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、醇氧化酶、膽紅素氧化酶、尿酸酶等。如在下面更詳細(xì)公開的一樣，在所研究的一些實(shí)施方案中，所述酶是葡糖脫氫酶例如s-GDH或其變異體。
在一些實(shí)施方案中，所述酶成分可以以大約35-大約450μM的濃度存在，通常以大約80-大約270μM的濃度存在。
酶底物在上述方法中使用的樣品還包含一種已知量的酶底物。所述酶底物可為存在于所述樣品中的酶的已知的底物或者存在于所述樣品中的酶的后備底物。例如，當(dāng)所述酶為葡糖脫氫酶時(shí)，所述樣品中的底物可為葡萄糖(已知其為所述酶的底物)或另一種糖例如麥芽糖，也就是說，或者已知其為該酶底物，或者懷疑其為該酶底物。已知量意味著所述樣品具有固定或預(yù)定量或濃度的底物。在一些實(shí)施方案中，所述樣品中的酶底物的濃度為大約0-大約50mM(大約0-大約900mg/dL)，通常為大約0-大約45mM(大約0-大約810mg/dL)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述酶底物明確存在時(shí)，樣品中所述酶底物的濃度為大約0.1-大約50mM(例如，為大約0.01-大約900mg/dL)，通常為大約0.1-大約45mM(例如，大約0.01-大約810mg/dL)。
輔酶在一些實(shí)施方案中，流體培養(yǎng)基樣品還包括一種輔酶，所述輔酶使所述酶成分活化。所研究的輔酶的一種實(shí)例為吡咯并喹啉醌(PQQ)。取決于用于測(cè)試劑的酶的類型，所研究的其它輔因子包括但不局限為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、細(xì)胞色素等。在一些實(shí)施方案中，任何輔酶的濃度可為大約60-大約670μM，通常為大約100-大約430μM。
酶輔因子在一些實(shí)施方案中，所述樣品還包括一種或多種酶輔因子。所研究的酶輔因子包括二價(jià)金屬陽離子例如Ca2+、Mg2+等。任何輔因子的濃度可為大約0.5-大約5mM。
電化學(xué)槽如上所述，在實(shí)施上述方法中，將所述樣品施加到一電化學(xué)槽，所述電化學(xué)槽包括一種無酶試劑組合物。已知多種不同類型的電化學(xué)槽配置，包括在美國專利文獻(xiàn)5,723,284；5,834,224；5,942,102；5,972,199；5,997,817；6,083,710；6,121,009；6,134,461；6,193,873以及6,716,577(在此參考引用其所公開的內(nèi)容)以及在其它專利文獻(xiàn)WO99/49307；WO97/18465；WO01/57510；WO01/57238；WO02/48707；WO02/50609；EP0969097A2以及GB2304628(在此參考引用其優(yōu)先權(quán)文獻(xiàn)，所述優(yōu)先權(quán)文獻(xiàn)為美國申請(qǐng))中公開的配置。可改進(jìn)任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這些或其它電化學(xué)槽以加入上述組合物。
在一些實(shí)施方案中，所述電化學(xué)槽存在于一種電化學(xué)測(cè)試帶中。在圖2A和2B中提供了根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)測(cè)試帶的模型。圖2A提供了一種電化學(xué)測(cè)試帶的分解圖，所述測(cè)試帶由工作電極和參比電極組成，所述電極由隔離層隔離，所述隔離層具有一剖面，所述剖面在裝備的帶上限定反應(yīng)區(qū)或范圍，將在下面進(jìn)一步公開這些要素。圖2B顯示了相同裝配形式的測(cè)試帶。現(xiàn)在，將在下面更詳細(xì)地公開多種組件中的每一個(gè)。
電極上述包括試劑組合物的電化學(xué)測(cè)試帶包括一工作電極和一參比電極。通常，工作電極和參比電極以細(xì)長(zhǎng)矩形帶的形式配置。一般地，電極的長(zhǎng)度為大約1.9-大約4.5cm，通常為大約2-大約2.8cm。電極的寬度為大約0.38-大約0.76cm，通常為大約0.51-大約0.67cm。一般地，參比電極的厚度為大約10-100nm，通常為大約18-大約22nm。在一些實(shí)施方案中，電極中的一個(gè)的長(zhǎng)度要比另一個(gè)的長(zhǎng)度短，在一些實(shí)施方案中，大約短0.32cm。
工作和參比電極的特征還在于至少面對(duì)帶中反應(yīng)區(qū)的電極表面為導(dǎo)電材料例如為金屬或其它導(dǎo)電材料，所研究的代表性材料包括但不局限為鈀、金、鉑、銀、銥、碳、摻雜氧化錫、不銹鋼等。在一些實(shí)施方案中，所述導(dǎo)電材料為金或鈀。雖然原則上整個(gè)電極可由導(dǎo)電材料組成，但通常每個(gè)電極由惰性支持材料組成，在所述惰性支持材料的表面上存在有電極的導(dǎo)電材料成分的薄層。在上述電極中，可使用任意便利的惰性襯底材料，一般地，所述材料是一種剛性材料，其能夠給電極，從而從總體上看，給電化學(xué)測(cè)試帶提供結(jié)構(gòu)支撐?？捎米饕r底的適宜材料包括塑料例如PET、PETG、聚酰亞胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、硅、陶瓷、玻璃等。
隔離層上述電化學(xué)測(cè)試帶的一個(gè)特征在于上述工作和參比電極彼此面對(duì)，且僅相隔很短的距離，以至于在電化學(xué)測(cè)試帶的反應(yīng)區(qū)或范圍中，工作和參比電極之間的距離極小。在上述測(cè)試帶中，工作和參比電極的最小間距起因于設(shè)置在或夾在工作和參比電極之間的薄隔離層的存在。所述隔離層的厚度一般為大約1-大約500μm，通常為大約100-大約200μm。切割所述隔離層從而給反應(yīng)區(qū)或范圍提供至少一個(gè)進(jìn)入所述反應(yīng)區(qū)的入口以及通常一個(gè)離開所述反應(yīng)區(qū)的出口。在圖2A和2B中可看見代表性隔離層的構(gòu)造。盡管在這些圖中顯示所述隔離層具有圓形反應(yīng)區(qū)，且所述區(qū)域被切割有側(cè)入口和出口或排出口，但為其它形狀例如正方形、橢圓形、三角形、矩形、不規(guī)則形狀的反應(yīng)區(qū)等是可能的。可用任意便利的材料制造所述隔離層，代表性的適宜材料包括PET、PETG、聚酰亞胺、聚碳酸酯等，可處理所述隔離層的表面使之粘著于各自的電極上，從而維持所述電化學(xué)測(cè)試帶的結(jié)構(gòu)。特別感興趣的是將模切雙面粘著帶用作隔離層。
反應(yīng)區(qū)上述電化學(xué)測(cè)試帶包括一反應(yīng)區(qū)或范圍，其由工作電極、參比電極以及隔離層限定，這些要素如上所述。特別地，所述工作和參比電極限定所述反應(yīng)區(qū)的頂部和底部，而所述隔離層限定所述反應(yīng)區(qū)的壁。所述反應(yīng)區(qū)的容積至少為大約0.1μl，通常至少為大約1μl，更通常為至少大約1.5μl，所述容積可為10μl大或者更大。如上所述，所述反應(yīng)區(qū)通常包括至少一個(gè)入口，在許多實(shí)施方案中還包括一個(gè)出口。入口和出口的橫截面面積可改變，只要其足夠大從而自所述反應(yīng)區(qū)提供流體的有效進(jìn)入和退出即可，但是所述橫截面面積一般為大約9×10-5-大約5×10-3cm2，通常為大約5×10-4-大約2.5×10-3cm2。
無酶試劑組合物一種無酶試劑制品存在于所述反應(yīng)區(qū)，所述試劑制品一般以干燥形式存在。無酶意味著所述制品至少不包括存在于所述樣品中的氧化還原劑系統(tǒng)酶，所述樣品將通過電化學(xué)槽進(jìn)行試驗(yàn)。同樣，如果將被施加到電化學(xué)槽的樣品包括一種葡糖脫氫酶，則存在于所述電化學(xué)槽的試劑制品不包含葡糖脫氫酶，且在許多實(shí)施方案中不包含任何酶。
存在于電化學(xué)槽的無酶試劑制品的特征在于存在一種氧化還原介質(zhì)(mediator)，所述介質(zhì)可包括一種或多種介質(zhì)試劑。所述介質(zhì)充當(dāng)一種媒介，其促進(jìn)電子從酶(在分析物氧化過程中，所述酶從所述分析物帶走一個(gè)或多個(gè)電子)到電極的轉(zhuǎn)移?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的多種不同的介質(zhì)試劑，其包括鐵氰化物、吩嗪、乙基硫酸酯、甲硫酸吩嗪、苯二胺、N，N，N’，N’-四甲基苯二胺、1-甲氧基-甲硫酸吩嗪、2，5-二甲基-1，4-苯醌、2，6-二甲基-1，4苯醌2，5-二氯-1，4-苯醌、二茂鐵衍生物、二吡啶鋨(osmium bipyridyl)絡(luò)合物、釕絡(luò)合物等。在代表性實(shí)施方案中，所述氧化還原介質(zhì)為鐵氰化物。
所述試劑組合物中的另一種成分為一種介質(zhì)穩(wěn)定緩沖成分。上述介質(zhì)穩(wěn)定緩沖成分可由一種或多種例如兩種、三種、四種或者更多種不同緩沖劑組成，在所述組合物以干燥形式貯存過程中，所述緩沖成分使介質(zhì)穩(wěn)定，從而使得在使用前例如在貯存過程中只有很少(如果有的話)介質(zhì)被還原。
在一種實(shí)施方案中，所述緩沖劑為多羧酸。多羧酸意味著所述緩沖劑包括兩種或多種羧酸官能部分(moiety)，不同羧酸官能部分的數(shù)目可為大約2-大約10個(gè)，例如大約2-大約8個(gè)，包括大約2-大約6個(gè)。上述緩沖劑的羧酸基團(tuán)或官能部分可連在許多不同結(jié)構(gòu)上，所述結(jié)構(gòu)包括脂肪族、脂環(huán)族、芳香族以及雜環(huán)結(jié)構(gòu)。多于一個(gè)羧酸基團(tuán)的存在對(duì)為所述緩沖劑提供至少一個(gè)期望范圍內(nèi)的pKa值具有有利影響。所研究的特定多羧酸包括但不局限為苯六羧酸、檸康酸、馬來酸等。
當(dāng)所述試劑組合物為一種干燥試劑制品時(shí)，例如在下面更詳細(xì)描述的電化學(xué)帶中可能存在的那樣，存在于所述干燥組合物中緩沖成分的量一般為大約0.01-大約40.00，通常為大約1-大約10％wt/wt。
所述試劑組合物還可包含一種或多種下述附加成分潤(rùn)濕劑、洗滌劑穩(wěn)定劑、粘度調(diào)節(jié)劑或其混合。
在一些實(shí)施方案中，可將所述潤(rùn)濕劑同洗滌劑一起添加到所述試劑組合物中，從而促進(jìn)所述試劑組合物在電化學(xué)測(cè)試帶上的均勻涂覆。也可使用一種或多種試劑混合物。所用試劑可提高試驗(yàn)試劑的溶解性以及增強(qiáng)毛細(xì)管充填帶的毛細(xì)管特性。所述試劑包括本領(lǐng)域已知的一些試劑例如聚合物、消泡劑以及表面活性劑。所研究的代表性類型的表面活性劑/洗滌劑包括但不局限為Tritons、Macols、Tetronics、Silwets、Zonyls以及Pluronics。適宜的試劑包括Pluronic材料，其為聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物。Pluronic材料的實(shí)例包括Pluronic P103以及Pluronic F87 Prill，前者具有很好的潤(rùn)濕性能，后者具有很好的洗滌性能。Pluronic P103和F87Prill都具有高于80℃的霧點(diǎn)溫度，由于在干燥過程中，這種性能可避免在組合物中的相變，所以期望這種性能。
可將穩(wěn)定劑添加到試劑組合物中，從而幫助所述酶的穩(wěn)定并阻止蛋白質(zhì)的變性。所述穩(wěn)定劑還可以幫助介質(zhì)的氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定，特別是氧化的氧化還原介質(zhì)的穩(wěn)定。穩(wěn)定劑的實(shí)例包括但不局限為碳水化合物(例如蔗糖、海藻糖、甘露糖醇以及乳糖)、氨基酸、蛋白質(zhì)(例如BSA以及清蛋白)、有機(jī)化合物例如EDTA等。
可將粘度調(diào)節(jié)劑添加到所述試劑中以調(diào)節(jié)液體試劑的流變能力。這種藥劑的實(shí)例包括聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、右旋糖酐、BSA等。
方法在實(shí)施上述方法中，第一步為將大量流體培養(yǎng)基或樣品引入到電化學(xué)槽(例如電化學(xué)測(cè)試帶中的電化學(xué)槽)的反應(yīng)區(qū)。樣品制備和施加到反應(yīng)區(qū)之間的時(shí)間段可以改變，但在一些代表性實(shí)施方案中為大約30秒-大約8小時(shí)，例如為大約5分鐘-大約3小時(shí)，包括大約30分鐘-大約60分鐘。引入到電化學(xué)槽反應(yīng)區(qū)的樣品的量可以改變，但一般為大約0.05-大約10μl，通常為大約0.5-大約1.6μl?？墒褂萌魏伪憷囊?guī)程將所述樣品引入到所述反應(yīng)區(qū)，所述樣品可被注射、通過毛細(xì)作用等便利的方式進(jìn)入到所述反應(yīng)區(qū)。
在將所述樣品施加到所述反應(yīng)區(qū)之后，使用參比和工作電極進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試。所進(jìn)行的電化學(xué)測(cè)試取決于所述試驗(yàn)和裝置的特殊屬性例如取決于所述試驗(yàn)是否為庫侖法、安培法或電位法而改變，所述裝置與電化學(xué)測(cè)試帶一起使用。一般地，通常在將樣品引入到所述反應(yīng)區(qū)之后，在給定的一個(gè)時(shí)期內(nèi)，所述電化學(xué)測(cè)試將測(cè)量電荷(庫侖法)、電流(安培法)或電壓(電位法)。用于進(jìn)行上述電化學(xué)測(cè)試的方法還在美國專利Nos.4,224,125；4,545,382；5,266,179以及WO97/18465；WO99/49307中公開，在此參考引用其所公開的內(nèi)容。
在檢測(cè)上述反應(yīng)區(qū)中產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)之后，以某種方式使用該信號(hào)來表征樣品中的酶，例如檢測(cè)酶的底物特異性、檢測(cè)施加到所述槽的樣品中酶的濃度等，在下面更詳細(xì)地公開這兩種代表性應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，通過一種裝置自動(dòng)進(jìn)行上述電化學(xué)信號(hào)測(cè)量步驟和酶表征步驟，所述裝置被設(shè)計(jì)成可與所述測(cè)試帶一起工作以便在將樣品施加到電化學(xué)槽之后，來進(jìn)行這些步驟。此外，在美國專利No.6,193,873中公開了一種代表性讀數(shù)裝置，所述裝置用于自動(dòng)實(shí)施所述步驟中的至少一些步驟，在此參考引用其所公開的內(nèi)容。
實(shí)用性如上所述，發(fā)現(xiàn)上述方法用在多種不同的應(yīng)用中，在所述代表性應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)上述方法可用于上述酶表征應(yīng)用。
通過上述方法可實(shí)現(xiàn)的第一種代表性酶表征應(yīng)用為同一種或多種添加酶相比，檢測(cè)第一種酶的底物或分析物特異性，例如同其它還原糖如麥芽糖相比，葡糖脫氫酶突變體對(duì)葡萄糖的特異性，其中相對(duì)于第二種葡糖脫氫酶如野生型脫氫酶確定所述特異性。
在實(shí)施本發(fā)明的這些代表性應(yīng)用中，制備一系列流體樣品，所述樣品至少包含第一和第二種酶，所述酶同第一和第二種酶底物組合，然后在電化學(xué)槽中單獨(dú)測(cè)試每一個(gè)制好的樣品。單獨(dú)測(cè)試意味著在其自己的或分離的電化學(xué)槽中測(cè)試系列中的每一個(gè)樣品。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本方法被制備，然后被分別施加到電化學(xué)槽中的樣品系列至少包括(i)一種樣品，其含有第一氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第一濃度的第一酶底物；(ii)一種樣品，其含有第一氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第一濃度的第二酶底物；(iii)一種樣品，其含有第二氧化還原劑系統(tǒng)酶以及所述已知的第一濃度的第一酶底物；以及(iv)一種樣品，其含有第二氧化還原劑系統(tǒng)酶以及所述已知的第一濃度的第二酶底物。
在一些實(shí)施方案中，所述特異性試驗(yàn)包括在第一和第二酶底物的不同濃度如在第一和第二酶的多種不同濃度下測(cè)試每一種酶。在這些實(shí)施方案中，至少制備和測(cè)試下述附加樣品(i)一種樣品，其含有第一氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第二濃度的第一酶底物；(ii)一種樣品，其含有第一氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第二濃度的第二酶底物；(iii)一種樣品，其含有第二氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第二濃度的第一酶底物；以及(iv)一種樣品，其含有第二氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第二濃度的第二酶底物。
這些應(yīng)用的代表性實(shí)施方案為針對(duì)底物特異性評(píng)估不同的s-GDH酶，所述底物特性即利用葡萄糖作為底物但不競(jìng)爭(zhēng)還原糖的能力。在圖1中進(jìn)一步說明了這種實(shí)施方案。圖1為方法100的流程圖，所述方法用于根據(jù)本發(fā)明的示范型實(shí)施方案，測(cè)試野生型和變異形式的s-GDH。方法100包括如在步驟110中所示提供一電化學(xué)槽。如分別在圖2A和2B中的分解圖和頂視圖所示，可以測(cè)試帶200的形式提供用于根據(jù)本發(fā)明方法的典型電化學(xué)槽。測(cè)試帶200包括一工作電極202和一參比電極204，所述電極被隔離層206隔開。工作電極202包括干燥試劑帶208，所述帶含有緩沖介質(zhì)、表面活性劑以及穩(wěn)定劑。隔離層206包括一剖面，在裝配的帶上，所述剖面在電化學(xué)槽210中，限定了所述反應(yīng)區(qū)。
如上所述，用于參比電極的204的適宜材料包括上述所列用于工作電極202的材料。用于以對(duì)電極形式存在的參比電極204的材料通常為鈀或金。在一種電化學(xué)槽形式中，其中電極在同一平面，參比電極204通常為碳。
參比電極204通常涂覆有一種穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑在其分子結(jié)構(gòu)中含有硫部分。所述涂層還可包括親水基和間隔基，所述間隔基在含硫部分和所述親水基之間。在參比電極204涂層中有用的化合物實(shí)例包括但不局限為2-巰基乙烷磺酸、2-巰基乙醇、2-巰基乙胺、3-巰基丙酸、噻吩、4-羧基噻吩、半胱氨酸、同型半胱氨酸以及胱氨酸。參比電極204通常由涂覆有2-巰基乙烷磺酸的金組成。
通過如在歐洲專利申請(qǐng)EP1324038A2中公開的開縫涂覆，可將干燥試劑208涂覆在工作電極202上，在此參考引用其所公開的內(nèi)容。涂覆試劑的其它方法包括但不局限為噴墨和針涂覆。
切割隔離層206以提供一反應(yīng)區(qū)，所述反應(yīng)區(qū)具有至少一個(gè)進(jìn)入其中的入口以及通常一個(gè)離開所述反應(yīng)區(qū)的出口。隔離層206如圖2A和2B所示，其具有一圓形反應(yīng)區(qū)，所述反應(yīng)區(qū)被切割有側(cè)入口和出口。其它反應(yīng)區(qū)形狀包括但不局限為正方形、橢圓形、三角形、矩形以及不規(guī)則形狀的反應(yīng)區(qū)。可由任何適宜的材料制造隔離層206，所述材料包括但不局限為PET、PETG、聚酰亞胺以及聚碳酸酯，由此，可處理隔離層206的表面從而使之具有粘性。隔離層206一般是模切雙面有粘性。
所述介質(zhì)可為鐵氰化物、吩嗪乙基硫酸酯、甲硫酸吩嗪、苯二胺、N，N，N’，N’-四甲基苯二胺、1-甲氧基-甲硫酸吩嗪、2，5-二甲基-1，4-苯醌、2，6-二甲基-1，4-苯醌、2，5-二氯代-1，4-苯醌、二茂鐵衍生物、二吡啶鋨絡(luò)合物、釕絡(luò)合物等。適宜的緩沖劑對(duì)二價(jià)金屬陽離子(例如Ca2+)幾乎沒有粘合吸引力，其可以為檸康酸鹽(citraconate)、檸檬酸、蘋果酸、馬來酸、磷酸鹽、“Good”緩沖劑等。此外，所述緩沖溶液可包括表面活性劑或潤(rùn)濕劑以及穩(wěn)定劑，所述表面活性劑包括Triton、Macol、Tetronic、Silwet、Zonyl以及Pluronic，所述穩(wěn)定劑包括蔗糖、海藻糖或甘露糖醇。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述介質(zhì)為鐵氰化物，所述緩沖劑為檸康酸鹽，所述表面活性劑為Pluronic以及所述穩(wěn)定劑為蔗糖。
接著，如方法100中的步驟120所示，將緩沖溶液中的野生型或者至少一種變異形式的s-GDH同輔酶、輔因子以及不同濃度的第一還原糖(例如葡萄糖)相混合。第一還原糖可為但不局限為葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、木糖或乳糖。所述輔酶可為PQQ，所述輔因子可為鈣。
根據(jù)本發(fā)明，在所述方法中使用的s-GDH可為任何一種天然或變異形式的s-GDH，所述方法包括方法100和300(見下面)，在所述變異形式的s-GDH中進(jìn)行天然酶氨基酸順序的至少一種改變，所述改變包括但不局限為進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換或刪除從而提高葡萄糖特異性?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)進(jìn)行s-GDH的改變，所述技術(shù)在上述美國專利No.6,103,509和歐洲專利申請(qǐng)No.EP1176202A1中公開，在此參考引用其所公開的內(nèi)容，制備野生型酶變異體的一般方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。
如在圖1的步驟130中所示，將酶/糖溶液各自添加到分離的電化學(xué)槽中，所述電化學(xué)槽含有緩沖介質(zhì)、表面活性劑以及穩(wěn)定劑。接著，測(cè)量電流響應(yīng)，并如步驟140所示，將之作為糖濃度的函數(shù)制圖。由于酶和介質(zhì)之間的反應(yīng)速度很快，在測(cè)量電流響應(yīng)之前，將所述酶/糖溶液同所述介質(zhì)分離是有利的。如果在將所述溶液添加到電化學(xué)槽之前，將酶同介質(zhì)混合，在能測(cè)量所述電流響應(yīng)之前，所述反應(yīng)將已完成或接近完成。然后如在步驟150(參見實(shí)施例2-4)中所示，針對(duì)至少一種附加的還原糖和至少一種附加的變異形式的s-GDH，重復(fù)步驟110-140。所述至少一種附加的還原糖可為但不局限為半乳糖、麥芽糖、木糖或乳糖。接著，如在步驟160和170中所示，選擇至少一種變異形式的s-GDH，所述s-GDH對(duì)至少一種附加糖具有降低的響應(yīng)。
以這種方式，可很容易地測(cè)定變異s-GDH相對(duì)于野生型s-GDH的特異性。
在另一種代表性應(yīng)用中，使用上述方法來測(cè)定流體樣品中酶的濃度或活性。在實(shí)施這種方法中，將一種流體樣品施加到電化學(xué)槽中，所述樣品含有一未知量的酶和已知量的底物。在施加之后，使用檢測(cè)到的電信號(hào)來測(cè)定所施加樣品中分析物的濃度，例如通過將所述檢測(cè)到的電信號(hào)同一參考值相比。
圖3為說明根據(jù)本發(fā)明的方法300中的一系列步驟的流程圖，所述方法用于測(cè)量樣品中野生型s-GDH及其變異體的活性。方法300包括如步驟310所示，提供一種含有干燥介質(zhì)的電化學(xué)槽，所述干燥介質(zhì)在緩沖液中，且所述緩沖液具有表面活性劑和穩(wěn)定劑。接著如步驟320所示，將濃度增加的野生型s-GDH或變異形式的s-GDH同恒定量的葡萄糖混合。然后如步驟330所示，將每一酶/葡萄糖樣品添加到分離的電化學(xué)槽中。如在步驟340中所示，測(cè)量每一個(gè)樣品的電流響應(yīng)，并將所述響應(yīng)作為酶濃度的函數(shù)制圖從而制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，在后續(xù)步驟中，可將所述標(biāo)準(zhǔn)曲線用作參考值。接著如步驟350所示，針對(duì)至少一批附加野生型或變異形式的s-GDH，重復(fù)步驟310-340。如在步驟360中所示，然后例如通過將所述測(cè)定信號(hào)同所述參考值相比，從所述標(biāo)準(zhǔn)曲線或參考值讀取至少一批附加野生型或變異形式的s-GDH的酶濃度。
系統(tǒng)本發(fā)明還提供用于實(shí)施上述方法的系統(tǒng)，如上所述，所述系統(tǒng)包括至少一種樣品或流體培養(yǎng)基和電化學(xué)槽，所述樣品包括一種氧化還原劑系統(tǒng)酶，所述電化學(xué)槽包括一種無酶試劑組合物。
上述系統(tǒng)還可以包括一種用于電化學(xué)分析樣品的裝置，其使用上述試劑組合物。
上述系統(tǒng)的裝置或儀表通常為電化學(xué)測(cè)量裝置。上述儀表通常包括(a)用于向已將所述樣品引入到其中的電化學(xué)槽施加電勢(shì)的裝置；(b)用于在所述槽中測(cè)量槽電流的裝置。在美國專利文獻(xiàn)5,723,284；5,834,224；5,942,102；5,972,199；5,997,817；6,083,710；6,121,009；6,134,461以及6,193,873中公開了代表性電化學(xué)儀表或裝置，在此參考引用其所公開的內(nèi)容；其它專利文獻(xiàn)WO99/49307；WO97/18465；WO01/57510；WO01/57238；WO02/48707；WO02/50609；EP0969097A2以及GB2304628中也公開了代表性電化學(xué)儀表或裝置。
以說明而非限制的方式提供下述實(shí)施例。
試驗(yàn)實(shí)施例1--涂覆有野生型或變異形式s-GDH的常規(guī)測(cè)試帶的表現(xiàn)為了發(fā)展一種用于篩選具有不同的糖特異性的變異形式s-GDH的試驗(yàn)，首先以一種常規(guī)的涂覆酶的葡萄糖測(cè)試帶形式測(cè)試野生型或變異形式的s-GDH對(duì)還原糖的響應(yīng)。所述篩選試驗(yàn)理想地模擬使用常規(guī)酶涂覆的帶、用摻有還原糖的全血或血漿測(cè)試時(shí)顯示的響應(yīng)。所述被測(cè)的變異形式的s-GDH含有一個(gè)氨基酸突變，分別為Asn452Thr和Asp167Glu。通過一種基于網(wǎng)狀的方法(web-based)來制備所述測(cè)試帶，在所述方法中，用緩沖試劑溶液縫隙涂覆(slot coating)所述工作電極(金)，所述溶液含有大約50-500Ku/ml的野生型或變異s-GDH，與GDH的摩爾比率為2∶1的PQQ，2mMCaCl2，750mM鐵氰化物，67mM pH為6.8的檸康酸鹽，0.1％Pluronics以及75mM蔗糖。調(diào)節(jié)試劑溶液中野生型或變異s-GDH的濃度，從而使得可使用大約13活性單位/電化學(xué)槽，因此，所述試劑溶液的活性單位/ml依賴于所使用酶的活性單位/克而改變。每一種酶的活性基于一種分光光度法試驗(yàn)，所述試驗(yàn)在pH為6.8的50mMPIPES(吩嗪，N，N’-二-(2-乙基磺酸))緩沖液中，使用DCIP(2，6-二氯靛酚(dichlorophenolindophenol))和PES(吩嗪乙基硫酸酯)。在所述試驗(yàn)中，監(jiān)控600nmDCIP吸光率的變化，并將吸光率的下降速度認(rèn)為是所述酶的反應(yīng)速度。將在1分鐘內(nèi)使1mmolDCIP還原的酶活性定義為1個(gè)單位。在pH為6.8時(shí)，DCIP的摩爾吸光系數(shù)為17.4mM-1。將COBAS FARA II離心分析器用于所述分光光度法試驗(yàn)。
如在歐洲專利申請(qǐng)No.EP1324038中公開的一樣，使用一種紅外能源來干燥工作電極上的試劑，在此充分參考引用其所公開的內(nèi)容。通過用干燥試劑將所述工作電極粘附在一金對(duì)(counter)電極上，從而形成電化學(xué)槽(或測(cè)試帶)，所述對(duì)電極含有干燥的MESA以抑制對(duì)電極上的污垢。
在具有大約80mg/dL內(nèi)生葡萄糖的(或者4.4mM)全血中摻入高治療水平(大約60mg/dL或4mM)或高治療水平三倍(大約180mg/dL或12mM)的干擾糖木糖。將所述攙雜樣品投配到上述測(cè)試帶上，并通過計(jì)時(shí)安培分析法測(cè)定葡萄糖的濃度，在所述方法中，施加-0.3V的電位達(dá)10秒鐘，接著施加+0.3V的電位達(dá)5秒鐘。如在圖4中所示，計(jì)算每一種酶與不含木糖的對(duì)照樣品的絕對(duì)偏差，并將之表示為木糖濃度的函數(shù)。絕對(duì)偏差和木糖干擾糖之間線性相關(guān)，所述木糖用于野生型s-GDH和Asn452Thr變異體，這表明野生型s-GDH和Asn452Thr變異體既可識(shí)別木糖也可識(shí)別葡萄糖。但是，Asp167Glu變異體對(duì)木糖的反應(yīng)降低。兩種變異形式都顯示絕對(duì)偏差和半乳糖或麥芽糖(數(shù)據(jù)未顯示)之間線性相關(guān)。這表明這些碳水化合物同葡萄糖一樣可被識(shí)別。因此，一種用于篩選s-GDH變異形式的試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)給出與在圖4中獲得的結(jié)果相似的結(jié)果，因?yàn)橹挥蠥sp167Glu應(yīng)表現(xiàn)出對(duì)木糖的反應(yīng)下降。
在圖4中顯示的結(jié)果不包括糖的濃度在整個(gè)生理學(xué)相關(guān)范圍(即高達(dá)720mg/dL或40mM)的測(cè)試，因此進(jìn)行了更多常規(guī)測(cè)試帶的測(cè)試以擴(kuò)展糖的濃度范圍，所述帶涂覆有野生型s-GDH。用最多40mM的五種還原糖中的每一種攙雜具有大約80mg/dL(或4.4mM)內(nèi)生葡萄糖的血漿，所述還原糖為葡萄糖、麥芽糖、木糖、半乳糖以及乳糖。將所述攙雜樣品投配到上述測(cè)試帶上，并通過上述計(jì)時(shí)安培分析法測(cè)定葡萄糖的濃度。如圖5所示，將測(cè)得的電流響應(yīng)作為糖濃度的函數(shù)制圖。如圖4所示，小于大約10mM時(shí)，野生型s-GDH同五種測(cè)試還原糖中的每一種都一樣反應(yīng)。但是，當(dāng)用上述DCIP/PES分光光度試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試時(shí)，在相同糖濃度范圍內(nèi)，s-GDH同木糖和半乳糖的反應(yīng)性很低(結(jié)果未示出)，這表明不能將分光光度試驗(yàn)用于模擬酶對(duì)干擾糖的響應(yīng)，所述干擾糖用于常規(guī)涂覆酶的測(cè)試帶。如前所述，分光光度試驗(yàn)使用酶限制性條件，而常規(guī)涂覆酶的測(cè)試帶過量使用酶，因此，這解釋了在每一種試驗(yàn)形式中糖響應(yīng)的不同。
實(shí)施例2--野生型s-GDH對(duì)還原糖響應(yīng)的測(cè)試，在所述方法中，使用根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)槽使用電化學(xué)槽(即測(cè)試帶)測(cè)量野生型s-GDH對(duì)還原糖的響應(yīng)，通過一種基于網(wǎng)狀的方法制造所述電化學(xué)槽，在所述方法中，用一種緩沖試劑溶液縫隙涂覆所述工作電極(金)，所述溶液含有750mM鐵氰化物，67mM pH為6.8的檸康酸鹽，0.1％的Pluronics以及75mM蔗糖。如在實(shí)施例1中，使用一種紅外能源來干燥工作電極上的試劑。通過用干燥試劑將所述工作電極粘附在一金對(duì)電極上，從而形成電化學(xué)槽，所述對(duì)電極含有干燥的MESA以抑制對(duì)電極上的污垢。
將pH為6.8的67mM檸康酸鹽中的野生型s-GDH和同生理學(xué)相關(guān)濃度(最高40mM或720mg/dL)的下述糖中的一種混合，所述檸康酸鹽中PQQ與GDH的摩爾比率為2∶1，還含有2mM CaCl2，所述糖為葡萄糖、木糖、半乳糖、麥芽糖或乳糖。調(diào)節(jié)每一種溶液中野生型s-GDH的濃度，從而使得使用大約13活性單位/電化學(xué)槽。將每一種含酶/糖的溶液投配到電化學(xué)槽上，所述槽含有干燥的鐵氰化物、檸康酸鹽、Pluronics以及蔗糖，但不含酶(參見上述濃度)。測(cè)量電流響應(yīng)，并如圖6所示，將三次測(cè)量的平均值作為糖濃度的函數(shù)制圖。在木糖濃度低于10mM時(shí)，所述結(jié)果與在實(shí)施例1中由涂覆有s-GDH的帶獲得的結(jié)果(參見圖4)相似，因?yàn)樗雒缚赏咸烟呛湍咎且粯臃磻?yīng)。而且，利用所有這些還原糖，可獲得與圖5中獲得的結(jié)果相似的結(jié)果。因此，該試驗(yàn)?zāi)M了用常規(guī)的涂覆野生型酶的測(cè)試帶獲得的響應(yīng)，具有下述優(yōu)點(diǎn)(1)涂覆酶的測(cè)試帶不必用酶的每一種形式制備，從而節(jié)省了時(shí)間和資源(設(shè)備和技術(shù)人員)，并且使用很少的酶；以及(2)可將基于緩沖液的樣品替代有生物危險(xiǎn)性的全血或摻糖血漿，所述樣品含有變化濃度的還原糖。
實(shí)施例3--Asn452Thr(s-GDH的變異形式)對(duì)還原糖響應(yīng)的測(cè)試，在所述方法中，使用根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)槽使用與上述實(shí)施例2相同的一批電化學(xué)槽(即槽含有干燥鐵氰化物、檸康酸鹽、Pluronics以及蔗糖，但不含酶)來測(cè)量Asn452Thr對(duì)還原糖的響應(yīng)。將Asn452Thr同生理相關(guān)濃度(最高大約40mM或720mg/dL)的下述糖中的一種混合，所述糖為葡萄糖、麥芽糖、木糖、半乳糖以及乳糖。調(diào)節(jié)每一種溶液中Asn452Thr的濃度，從而使得使用大約13活性單位/電化學(xué)槽。將每一種含酶/糖的溶液投配到電化學(xué)槽上，所述槽含有干燥的鐵氰化物、檸康酸鹽、Pluronics以及蔗糖，但不含酶。測(cè)量電流響應(yīng)，并如圖7所示，將之作為糖濃度的函數(shù)制圖。所獲得的結(jié)果與在實(shí)施例1中在木糖低于10mM(即大約高治療水平的三倍)時(shí)用涂覆有Asn452Thr的帶獲得的結(jié)果(參見圖4)相似，因?yàn)橥吧兔敢粯樱珹sn452Thr可同葡萄糖和木糖一樣反應(yīng)。所述數(shù)據(jù)還顯示，在糖濃度低于10mM時(shí)，s-GDH的變異形式同所有試驗(yàn)糖一樣反應(yīng)。因此，所述試驗(yàn)?zāi)M了用涂覆有Asn452Thr的帶獲得的結(jié)果，且具有上述優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例4--Asp167Glu(s-GDH的另一種變異形式)對(duì)還原糖響應(yīng)的測(cè)試，在所述方法中，使用根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)槽如上述實(shí)施例3所述來測(cè)量Asp167Glu對(duì)還原糖的響應(yīng)。將Asp167Glu同生理相關(guān)濃度(最高大約40mM或720mg/dL)的下述糖中的一種混合，所述糖為葡萄糖、麥芽糖、木糖、半乳糖以及乳糖，并將之投配到電化學(xué)槽上，所述槽含有干燥的鐵氰化物、檸康酸鹽、Pluronics以及蔗糖，但不含酶。如圖8所示，測(cè)量電流響應(yīng)并將之作為糖濃度的函數(shù)制圖。在木糖濃度低于10mM(即大約高治療水平的三倍)時(shí)，所述結(jié)果與在實(shí)施例1中，用涂覆有Asp167Glu的帶獲得的結(jié)果(參見圖4)相似，因?yàn)閟-GDH的這種變異形式對(duì)木糖顯示了降低的響應(yīng)。這種變異體還可同所有其它試驗(yàn)的還原糖一樣反應(yīng)。因此，所述試驗(yàn)再次有利地、但以很快且易于使用的形式模擬了用涂覆有Asp167Glu的帶獲得的結(jié)果。
上述實(shí)施例說明可將所述方法可用于模擬涂覆有酶的帶的性能，并且可將之用于篩選s-GDH的變異形式對(duì)糖的響應(yīng)。
下述實(shí)施例說明了如何使用所述方法來測(cè)量酶的活性。
實(shí)施例5--用于電化學(xué)槽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)本發(fā)明的方法，用野生型s-GDH投配所述槽通過用增加濃度的野生型s-GDH投配電化學(xué)槽來產(chǎn)生野生型s-GDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見圖9)，所述電化學(xué)槽含有干燥的鐵氰化物、檸康酸鹽、Pluronics以及蔗糖，但不含酶(參見上述濃度)，所述野生型s-GDH的濃度為大約0-10mg/mL。將葡萄糖的濃度維持在450mg/dL。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到還可構(gòu)造用于任何s-GDH變異形式的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
由圖9中的標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)造一種雙倒數(shù)曲線圖(即1/響應(yīng)作為1/酶濃度的函數(shù))，并在圖10中顯示所述曲線圖。在電化學(xué)槽響應(yīng)和野生型s-GDH的量之間存在強(qiáng)線性相關(guān)(r2＝0.9986)。通過測(cè)量電流響應(yīng)和從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取濃度，可很容易地檢測(cè)該批測(cè)試酶的濃度。
在一種電化學(xué)形式中，用于s-GDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線的產(chǎn)生有利地用于測(cè)量輸入的酶的活性，用于測(cè)量涂覆在干燥帶上的酶的穩(wěn)定性，以及用于解決潛在帶涂覆問題，所述輸入的酶用于制備常規(guī)測(cè)試帶，所述問題與酶的活性有關(guān)。
上述結(jié)果和討論說明本發(fā)明提供了便利且經(jīng)濟(jì)合算的、用于表征氧化還原劑系統(tǒng)酶的方式。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括成本低和不使用血或血制品進(jìn)行測(cè)試的能力。因此，本發(fā)明為本領(lǐng)域帶來了重大的貢獻(xiàn)。
如同明確、單獨(dú)地表明參考引用每一個(gè)出版物或?qū)＠粯樱诖藚⒖家谜f明書中引用的所有出版物和專利。對(duì)任一出版物的引用都是由于其公開于申請(qǐng)日之前，因此，不應(yīng)將其理解為由于在前發(fā)明，本發(fā)明就不能先于這些公開出版物。
盡管為了清楚地理解，通過說明圖表和實(shí)施例的方式詳細(xì)說明前述發(fā)明，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，不違背所附權(quán)利要求的實(shí)質(zhì)和范圍，顯然可以進(jìn)行一些變化和改造。
權(quán)利要求
1.一種方法，包括(a)將樣品施加到電化學(xué)槽中，所述樣品包括第一氧化還原劑系統(tǒng)酶和已知量的酶底物，所述電化學(xué)槽包括無酶試劑組合物，所述組合物包括所述氧化還原劑系統(tǒng)的介質(zhì)；以及(b)檢測(cè)由所述槽產(chǎn)生的電信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酶為氧化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述氧化酶選自氧化酶和脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述樣品還包括一種酶輔因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述方法還包括使用所述檢測(cè)到的電信號(hào)來測(cè)定所述第一氧化還原劑系統(tǒng)酶的分析物特異性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述方法包括檢測(cè)電信號(hào)，所述電信號(hào)至少由下述樣品產(chǎn)生(i)一種樣品，其含有第一氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第一濃度的第一酶底物；(ii)一種樣品，其含有所述第一氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第一濃度的第二酶底物；(iii)一種樣品，其含有第二氧化還原劑系統(tǒng)酶以及所述已知的第一濃度的所述第一酶底物；以及(iv)一種樣品，其含有所述第二氧化還原劑系統(tǒng)酶以及所述已知的第一濃度的所述第二酶底物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述方法還包括檢測(cè)電信號(hào)，所述電信號(hào)由下述樣品產(chǎn)生(i)一種樣品，其含有所述第一氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第二濃度的所述第一酶底物；(ii)一種樣品，其含有所述第一氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知的第二濃度的所述第二酶底物；(iii)一種樣品，其含有所述第二氧化還原劑系統(tǒng)酶以及所述已知的第二濃度的所述第一酶底物；以及(iv)一種樣品，其含有所述第二氧化還原劑系統(tǒng)酶以及所述已知的第二濃度的所述第二酶底物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所測(cè)得的所述第一氧化還原劑系統(tǒng)酶的所述分析物特異性是相對(duì)于所述第二氧化還原劑系統(tǒng)酶而言的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述第一氧化還原劑系統(tǒng)酶為非天然的氧化還原劑系統(tǒng)酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述第二氧化還原劑系統(tǒng)酶為天然的氧化還原劑系統(tǒng)酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括使用所述檢測(cè)到的電信號(hào)來測(cè)定所述樣品中所述酶的活性。
12.一種電化學(xué)槽，包括無酶試劑組合物，所述組合物包括氧化還原劑系統(tǒng)介質(zhì)。
13.一種系統(tǒng)，包括(a)電化學(xué)槽，其包括無酶試劑組合物，所述組合物包括氧化還原劑系統(tǒng)介質(zhì)；以及(b)流體培養(yǎng)基，其包括氧化還原劑系統(tǒng)酶以及已知量的酶底物。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于表征氧化還原劑系統(tǒng)酶的方法和組合物。在實(shí)施上述方法的過程中，將包括氧化還原劑系統(tǒng)酶和已知量底物的樣品施加到一電化學(xué)槽中，所述電化學(xué)槽包括無酶試劑組合物，所述組合物具有氧化還原劑系統(tǒng)介質(zhì)。還提供了電化學(xué)測(cè)試帶、包括所述帶的系統(tǒng)以及成套部件，所述帶包括所述電化學(xué)槽。本發(fā)明用在多種不同的應(yīng)用中，所述應(yīng)用包括氧化還原劑系統(tǒng)的表征應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK1725006SQ20051008106
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2005年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者P·拜爾德, S·錢, T·P·哈茨 申請(qǐng)人:生命掃描有限公司