專利名稱：一種人梭曼水解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和酶學(xué)領(lǐng)域中一種人梭曼水解酶。
背景技術(shù)：
磷酸三酯酶(PTE3.1.8)是一種可水解有機(jī)磷化學(xué)戰(zhàn)劑的酶，由于它們的化學(xué)性質(zhì)和序列不同，因而這些酶被國際生化和分子生物學(xué)組織(IUBMB)分成為對氧磷酶(Pon)(EC3.1.8.1)和二異丙基氟磷酸酶(DFPase，DFP酶)(EC3.1.8.2)，后者又進(jìn)一步被分為Mazur型DFPase(40-90KDa)和魷魚型DFPase(35-40KDa)。
梭曼水解酶屬于A酯酶，國際酶學(xué)會將之歸入二異丙基氟磷酸(DFP)酶類(E.C3.1.1)，它可催化DFP、梭曼(一種國際上公認(rèn)的難防難治的神經(jīng)性毒劑)、沙林等含P-F鍵的G類有機(jī)磷毒劑。故又稱G類有機(jī)磷毒劑水解酶(簡稱G酶)。G類有機(jī)磷毒劑是強(qiáng)烈的速殺性化學(xué)戰(zhàn)劑，能不可逆地抑制體內(nèi)膽堿酯酶的活性，并阻斷假性膽堿酯酶、及真性膽堿酯酶等B類酯酶而引起中毒。有機(jī)磷化合物水解酶對有機(jī)磷化合物污染的凈化及消毒、G類有機(jī)磷殺蟲劑和神經(jīng)性毒劑中毒的防護(hù)方面的潛在用途已引起人們的很大關(guān)注。
具有水解梭曼活性的酶包括Pseudomonas diminuta的磷酸三酯酶PTE(EC3.1.8)，Alteromonas的脯氨肽酶，及魷魚神經(jīng)系統(tǒng)、肝胰臟及頭足綱唾液腺線中的魷魚型DFPase(EC3.1.8.2)。近來一種Sencscence Marker蛋白-30從小鼠、大鼠及人體中分離出來，這三種蛋白序列具有高同源性，并且都具有水解梭曼的活性。Hoskin等從魷魚中純化了二異丙基氟磷酸酶(Hoskin，F(xiàn).G.C.，andLong，R.J..Purification of aDFP-hydrolyzing enzyme from squid head ganglion.Arch.Biochem.Biophys.1972，150.548-555)，另有幾種細(xì)菌、小鼠、大鼠和人(Qingding Wang，Manji Sun，HanZhang，and Cuifen Huang，Purification and properties of Soman-HydrolyzingEnzyme from human liver.J biochemmolecular toxicology，1998，12(4)213-217)的DFPase被純化。但國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見到有關(guān)人源的DFPase的序列的報道。
目前，在蛋白質(zhì)的分析中常采用的方法有凝膠內(nèi)酶切，肽質(zhì)量指紋圖譜，基體輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)等。
凝膠內(nèi)酶切的靈敏度高(Hoskin F.C.G.，Rosenberg P.，and Brzin M.Re-examination of the effect of DFP on electrical and cholinesterase activityof squid giant axon.Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1966，551231-1234)，是當(dāng)前廣泛采用的的樣品制備方法。最常用的蛋白酶切是胰蛋白酶，它在蛋白質(zhì)主鏈上精氨酸和賴氨酸殘基的C端進(jìn)行切割。
肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprinting，PMF)最初由Henzel及其同事提出(Hoskin F.C.G.Diisopropylfluorophosphate and Tabun..Enzymatichydrolysis and nerve function.Science，1971，1721243-1245)，肽質(zhì)量指紋譜是指蛋白質(zhì)被酶切位點(diǎn)專一的蛋白酶水解后所得全部肽段的質(zhì)量圖譜。分析時用基體輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定凝膠內(nèi)酶切后多肽混合物的質(zhì)量，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜。蛋白質(zhì)酶切后多肽混合物的質(zhì)量，可以在蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行理論預(yù)測，并對質(zhì)譜實(shí)測多肽混合物的質(zhì)量與理論預(yù)測的數(shù)據(jù)相比較，質(zhì)譜實(shí)測到足夠肽段的質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫中某個蛋白質(zhì)理論預(yù)測肽段的質(zhì)量匹配時，可明確鑒定為同一蛋白質(zhì)，并獲得高分。這一方法中用質(zhì)譜分析的是蛋白質(zhì)被酶切后的多肽混合物，而不是分析蛋白質(zhì)本身。電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)很難從凝膠上洗脫下來進(jìn)行質(zhì)譜分析，而且僅用蛋白質(zhì)的分子量在數(shù)據(jù)庫中檢索鑒別是很不充分的。與之相反，多肽容易從凝膠上洗脫下來，相同質(zhì)量蛋白質(zhì)被酶切后生成的一組多肽的質(zhì)量，能提供足夠的信息在數(shù)據(jù)庫檢索鑒定。
基體輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜MALDI-TOF-MS適合分析絕大多數(shù)蛋白質(zhì)，它具有靈敏度高，分辨率好、質(zhì)量準(zhǔn)確、高通量、譜峰簡單等特點(diǎn)，是測定肽質(zhì)量指紋譜十分有效的質(zhì)譜儀，常規(guī)分析時多肽的靈敏度可達(dá)femtomol、attomol或更低。數(shù)據(jù)庫檢索時，實(shí)測蛋白質(zhì)的酶切肽段與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中所有蛋白的理論酶切肽段相比較，當(dāng)與某個蛋白質(zhì)的理論酶切肽段匹配達(dá)一定程度時，則被鑒定為該蛋白。
蛋白質(zhì)的兩步質(zhì)譜快速鑒定中，MALDI-TOF-MS的PMF法是第一步。因?yàn)镻MF法有它不足的地方，如數(shù)據(jù)庫中可用的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)不足時不能明確鑒定，小的酸性蛋白質(zhì)酶切后不能產(chǎn)生足夠的肽段時也不能明確鑒定，分離后凝膠上的一個斑點(diǎn)由于共分離作用含多個蛋白質(zhì)時也不能鑒定。
電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)進(jìn)行多肽的部分序列信息分析具有更高的專屬性，它利用氨基酸的序列信息來查詢數(shù)據(jù)庫，一般兩個肽段的MS/MS數(shù)據(jù)就可確定一個蛋白質(zhì)，理論上一個9肽以上的肽段的MS/MS數(shù)據(jù)如檢索不出結(jié)果，則很有可能為新蛋白。納升電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜Q-TOF比常用的三極四極串聯(lián)質(zhì)譜具有更高的分辯率和質(zhì)量準(zhǔn)確度，質(zhì)量范圍和線性范圍寬，適合與HPLC聯(lián)用而實(shí)現(xiàn)真正的蛋白質(zhì)鑒定。可進(jìn)行自動化串聯(lián)質(zhì)譜分析以獲得準(zhǔn)確性很高的肽段序列(HoskinF.C.G.and Long R.J.Purification of a DFP--hydrolyzing enzyme from squid headganglion.Arch.Biochem.Biophys.1972，150548-555)，從而保證數(shù)據(jù)庫檢索鑒定的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人梭曼水解酶。
本發(fā)明所提供的人梭曼水解酶，來源于人，分子量在35-37KD之間，具有序列表中的序列1的N-末端氨基酸序列；其氨基酸組成中包括30個L殘基，27個K殘基，24個G殘基，各21個E、V和A殘基，18個I殘基，各15個D、S、R、T、P和F殘基，12個Y殘基，9個H殘基，6個M殘基以及3個C殘基。
序列表中的序列1是由15個氨基酸殘基組成的多肽，N-末端的第一個氨基酸為S，其中氨基酸殘基F、P、L和M為疏水性氨基酸，N末端親水性氨基酸較多(9/15)，疏水性氨基酸較少(6/15)。
梭曼水解酶的氨基酸組成中親水性氨基酸較多，約156分子，疏水性氨基酸較少約126分子，所以梭曼水解酶屬于親水性蛋白質(zhì)，這與它的催化功能是一致的；其中堿性氨基酸約有51個，酸性氨基酸約有36個，所以它屬于偏堿性的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)在pH 7.0-9.5之間。
所述人梭曼水解酶含有具有序列表中序列2、序列3和序列4的氨基酸殘基序列的3個肽段肽段1、肽段2和肽段3。肽段1由13個氨基酸殘基組成，親水性氨基酸和疏水性氨基酸的比例基本相同；肽段2由16個氨基酸殘基組成，肽段3由17個氨基酸殘基組成，肽段2、3中親水性氨基酸較多，疏水性氨基酸較少。
位于肽段2的DKDGDGYLSAAELR序列(即序列3中的自氨基端第3位-16位氨基酸殘基)是鈣結(jié)合位點(diǎn)。
位于肽段2的DKDGDGY序列(即序列3中的自氨基端第3位-9位氨基酸殘基)是酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。
位于肽段3的GTLTTK序列(即序列4中的自氨基端第12位-17位氨基酸殘基)是?；稽c(diǎn)，這一位點(diǎn)與其催化功能緊密相關(guān)。
位于肽段3的FSLFDKDGDG序列(即序列4中的自氨基端第3位-12位氨基酸殘基)為上述人梭曼水解酶的活性中心部位。
編碼上述人梭曼水解酶的DNA序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明從人肝中分離純化了梭曼水解酶，并獲得了人梭曼水解酶的由15個氨基酸殘基組成的N-末端氨基酸序列，含有鈣結(jié)合位點(diǎn)和酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)的16肽，含有酰基化位點(diǎn)及活性中心部位的17肽，以及一個13肽。本發(fā)明對于研究G類有機(jī)磷水解酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、體內(nèi)代謝及毒理學(xué)，以及最終用于人體農(nóng)藥中毒和化學(xué)戰(zhàn)劑中毒的防護(hù)均具有非常重要的理論和實(shí)際意義。


圖1a為經(jīng)過30KD的中空纖維超率后的人肝組織上清液的梭曼水解酶活性曲線圖1b為經(jīng)過150KD的中空纖維超率后的人肝組織上清液的梭曼水解酶活性曲線圖2為人肝組織上清液的大于30KD小于150KD的超濾液的Sephadex G-50柱層析的洗脫峰的梭曼水解酶酶活性測定曲線圖3為Sephadex G-50所得活性部分的Sephadex G-75柱層析的洗脫峰的梭曼水解酶酶活性測定曲線圖4為Sephadex G-75所得活性部分的DEAE-Sepharose CL-6B線性梯度柱層析洗脫峰的梭曼水解酶酶活性測定曲線圖5為DEAE-Sepharose CL-6B所得活性部分的Sephacryl-200HR柱層析洗脫峰的梭曼水解酶酶活性測定曲線圖6為純化的人梭曼水解酶的SDS-PAGE圖譜圖7a-7b為人梭曼水解酶的N-端氨基酸序列檢測8為梭曼水解酶的氨基酸組成分析9a-圖9b為圖16的肽質(zhì)量指紋譜的Mascot Search結(jié)果圖10a為ESI-MS/MS圖譜圖10b為M/Z 793的帶雙電荷的肽段1的ESI-MS/MS圖譜圖10c為M/Z 878的帶雙電荷的肽段2的ESI-MS/MS圖譜圖10d為M/Z 923的帶雙電荷的肽段3的ESI-MS/MS圖譜圖11為用Clustal W軟件比較鈣調(diào)蛋白和人梭曼水解酶的氨基酸序列結(jié)果圖12為人梭曼水解酶肽段序列與Prosite蛋白質(zhì)序列庫中的已知位點(diǎn)序列進(jìn)行相似性檢索結(jié)果圖13為CLUSTAL W軟件分析不同種屬具有相同梭曼水解酶活性的進(jìn)化樹圖14為通過BLAST服務(wù)器進(jìn)行人梭曼水解酶與魷魚型的DFP酶的序列相似性比較結(jié)果圖15a為計(jì)算機(jī)模擬的魷魚型的DFP酶肽段IELFGPDGGQ的空間結(jié)構(gòu)圖15b為計(jì)算機(jī)模擬的人梭曼水解酶肽段FSLFDKDGDG的空間結(jié)構(gòu)圖16為梭曼水解酶的MALDI-TOF-MS分析所得的肽質(zhì)量指紋譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、人梭曼水解酶的分離及純化材料
DEAE-Sepharose CL 6B，Sephacryl S-200HR為Pharmacia公司產(chǎn)品；Sephadex G-50，Sephadex G-75為sigma公司產(chǎn)品；中空纖維柱(30KDa，150Kda北京旭成超濾設(shè)備廠)；Ultradex為Pharmacia公司產(chǎn)品；兩性電解質(zhì)(該兩性電解質(zhì)的具體組成成分為Ampholyes)為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院產(chǎn)品。
器材微型紫外記錄儀，日本ATTO公司產(chǎn)品；UV-250分光光度計(jì)為日本島津公司產(chǎn)品；高速及超速冷凍離心機(jī)，日立公司產(chǎn)品。
1.人肝細(xì)胞可溶性提取液的制備取交通事故死亡后人的肝組織，-75℃保存，使用前去除大的血管組織及纖維組織，取約60g，剪碎，按1∶9(w/v)加入67mM磷酸鈉鉀緩沖液(PB，pH 7.2)，在組織勻漿機(jī)中勻漿1分鐘×5次后，4℃，1600g離心20min，所得上清液再于超速冷凍離心機(jī)中，4℃，200000g離心1h，棄沉淀，上清保存于冰水中備用。
2.將人肝組織上清液進(jìn)行低分子量(30KD)及高分子量(150KD)中空纖維超濾流速L/h，分別收集超濾后的兩部分，進(jìn)行活性追蹤。(反應(yīng)總體積為3ml，37℃恒溫恒速攪拌，200ul酶樣品預(yù)先加入反應(yīng)緩沖液中，加18mlM Co2+溶液100ul，加入100ul梭曼至終濃度為1.6×10-2M。觀察記錄15分鐘)。結(jié)果如圖1a和圖1b所示，表明大于30KD，小于150KD的部分是活性帶。其中，大于30KD的部分與未加酶樣品的空白對照相比P＜0.05X±SD，n＝3；小于于150KD的部分與未加酶樣品的空白對照相比P＜0.05X±SD，n＝3。將活性部分保存于冰水中進(jìn)行制備型平板等電聚焦。
3.制備型平板等電聚焦(1)取人肝組織上清液超濾后大于30KD小于150KD的活性部分(共含蛋白約2000mg)，4g Ultrodex加入95ml水及樣品液+5ml載體兩性電解質(zhì)。
(2)稱重后制板，根據(jù)Ultrodex瓶上標(biāo)明的蒸發(fā)線吹膠至一定重量后，開始聚焦。
(3)聚焦條件8000V，3mA；陽極液磷酸1mol/L；陰極液氫氧化鈉1mol/L。
(4)取膠將膠板固定在聚焦平板上，固定好后按不同梯度逐條刮取到洗脫小柱中，用67mM磷酸鈉鉀緩沖液(PBS，pH 7.2)洗脫后每一梯度逐一量取pH值，以確定其pH范圍，用以設(shè)定相應(yīng)的非酶對照(67mM磷酸鈉鉀緩沖液(PBS，pH 7.2)按各洗脫液的pH范圍加0.1M氫氧化鈉液調(diào)pH值，不加酶洗脫液，設(shè)為非酶對照)。
結(jié)果如表1所示，表明在pH7.0-9.5間聚焦的酶有催化活性，pH3.5-7.0間聚焦的酶沒有催化活性。
表1.超濾后活性部分的制備型平板等電聚焦活性(請將表中的英文譯為中文)

4、SephadexG-50，SephadexG-75，DEAE-Sepharose CL 6B，Sephacryl-200層析分離(1)Sephadex G-50柱層析分離將人肝組織上清液超濾所得的大于30KD小于150KD的超濾液上預(yù)先以67mM的磷酸鈉鉀緩沖液(pH 7.2)平衡的Sephadex G-50柱(2.5×120cm，柱床體積約300ml)。每次上樣20ml，以平衡緩沖液洗脫，280nm檢測，流速2.5ml/min，用部分收集器收集洗脫液，每管7ml，結(jié)果得到兩個洗脫峰，其中第一個洗脫峰在500Min，第二洗脫峰在1200Min。對兩個洗脫峰進(jìn)行梭曼水解酶活性測定，結(jié)果如圖2所示，表明梭曼水解酶活性集中在第一洗脫峰(70ml)中。活性部分又經(jīng)超濾濃縮，保存于冰水中備用。
(2)Sephadex G-75柱層析分離將Sephadex G-50所得活性部分上預(yù)先以67mM的磷酸鈉鉀緩沖液(pH 7.2)平衡的Sephadex G-75柱。(1.5×100cm，柱床體積約150ml)，每次上樣15ml，以平衡緩沖液洗脫，280nm檢測，流速1.4ml/min，用部分收集器收集洗脫液，每管7ml，結(jié)果得到三個洗脫峰，其中第一個洗脫峰在500min，第二洗脫峰在800min，第三洗脫峰在1200min。對三個洗脫峰進(jìn)行梭曼水解酶活性測定，結(jié)果如圖3所示，表明梭曼水解酶活性集中在第二洗脫峰(35ml)中。活性部分經(jīng)超濾濃縮，保存于冰水中備用。
(3)DEAE-Sepharose CL-6B線性梯度柱層析分離DEAE-Sepharose CL-6B(2.5×20cm，柱床體積約50ml)事先用67mMPB(pH7.2)平衡。將濃縮后的上述(2)中的第2峰活性組分上柱，每次上樣5ml，用含有NaCl(0-1.5mol/L)的67mM PB(pH 7.2)進(jìn)行線性梯度洗脫，流速0.5ml/min，用部分收集器收集洗脫組分，每管1ml，結(jié)果得到三個洗脫峰，其中第一個洗脫峰在100min，第二洗脫峰在200min，第三洗脫峰在400min。對三個洗脫峰進(jìn)行梭曼水解酶活性測定，結(jié)果如圖4所示，表明梭曼水解酶活性集中在第二洗脫峰(5ml)中。將活性組分經(jīng)超濾濃縮后保存于冰水中備用。
(4)Sephacryl-200HR柱層析分離Sephacryl-200HR(1.6×120cm，柱床體積約190ml)先用67mM PB(pH 7.2)平衡，將濃縮后的上述(3)中的第2峰活性組分上柱，每次上樣5ml，用67mM PB(pH7.2)洗脫，流速為0.3mL/min，用部分收集器收集洗脫組分，每管收集3ml，結(jié)果得到二個洗脫峰，其中第一個洗脫峰在400min，第二洗脫峰在1000min。對二個洗脫峰進(jìn)行梭曼水解酶活性測定，結(jié)果如圖5所示，表明梭曼水解酶活性集中在第一洗脫峰(10ml)中。將活性組分超濾濃縮后保存。
人肝中的梭曼水解酶是低豐度蛋白，所以分離純化非常困難，由于人肝中的梭曼水解酶主要存在于細(xì)胞的可溶性部分，所以本實(shí)施例首先采用超速離心法提取人肝溶漿中的可溶性部分，以便去除大量存在于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的許多種蛋白質(zhì)，從而減少了后續(xù)純化工作中的困難；同時考慮到過多的步驟有可能對酶活性的影響，所以將超速離心后的上清液直接上柱。但由于樣品體積較大使得純化工作量增大。隨后選擇用超濾結(jié)合活性追蹤的方法將不具活性的小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)除去，又采用制備型平板等電聚焦的方法從等電點(diǎn)的角度進(jìn)行大規(guī)模制備，這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)是制備量大，并且分別從分子量和等電點(diǎn)水平去除了大量不具活性的蛋白，初步的大規(guī)模制備保證了以后在繁雜的制備步驟中有足夠量的蛋白舍棄。通過上述兩種方法初步制備后的樣品再經(jīng)凝膠過濾后，進(jìn)一步對分子量不同的蛋白進(jìn)行篩選，使活性提高了10倍；對蛋白再一次根據(jù)電荷不同進(jìn)行DEAE-Sepharose梯度洗脫，經(jīng)活性追蹤證明三個峰中的第二個峰是活性峰，使活性提高了24.6倍；酶比活性達(dá)135nmol/min/mg，此步純化后經(jīng)SDS-PAGE和毛細(xì)管電泳證明活性峰含兩種蛋白。再經(jīng)S-200凝膠將其分離，特異催化活性達(dá)1070nmol/min/mg，純化212.7倍(表2)。
在分離過程中發(fā)現(xiàn)，人肝中的梭曼水解酶性質(zhì)較為穩(wěn)定，4℃時等電聚焦20小時催化活性不變，而且在長達(dá)幾天的分離純化、濃縮過程中，催化活性仍較穩(wěn)定。
表2.人梭曼水解酶的純化結(jié)果

實(shí)施例2、人梭曼水解酶的生化性質(zhì)試劑DEAE-Sepharose CL 6B，Sephacryl-200HR為Pharmacia公司產(chǎn)品；SephadexG-50，Sephadex G-75為sigma公司產(chǎn)品。
器材Beckman 121 MB型氨基酸自動分析儀(Beckman公司產(chǎn)品)，微型紫外記錄儀(日本ATTO公司產(chǎn)品)；UV-250分光光度計(jì)(日本島津公司產(chǎn)品)；高速及超速冷凍離心機(jī)(日立公司產(chǎn)品)；毛細(xì)管電泳儀MALDI-TOF-MS；ESI-MS/MS Reflex III加速電壓為20kV，反射式正離子檢測方式，(Bruker公司產(chǎn)品)；ESI-MS/MS的正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-TOF2(英國Micromass公司)。
1.SDS-PAGE采用5-15％聚丙烯酰胺梯度膠做垂直板電泳，電極緩沖液為Tris-甘氨酸-SDS(pH8.9)系統(tǒng)。每孔上樣2ug。標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker分別為溶菌酶(14.4KD)、碳酸酐酶(31KD)、卵清蛋白(43KD)、牛血清白蛋白(67KD)及堿性磷酸酶b(97.4KD)。樣品與等量樣品緩沖液混合，加二硫蘇糖醇(DTT)使成20mM終濃度。沸水浴中煮沸5分鐘，冷卻后上樣。電泳完畢后，用10％TCA固定，0.1考馬斯亮蘭染色液染色。結(jié)果如圖6所示，表明純化的人梭曼水解酶為一條帶，分子量在35-37KD之間。圖中，泳道1為純化的人梭曼水解酶，泳道2為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker。
HPCE IEF分析結(jié)果表明出純化的人梭曼水解酶(第一峰)已為純品。
2.N-末端氨基酸序列分析先將純化的人梭曼水解酶溶液對10mM的PB(PH 7.2)透析以降低鹽濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電印跡轉(zhuǎn)印PVDF膜，用蛋白質(zhì)序列分析儀測定N-端氨基酸序列。結(jié)果如圖7a和圖7b所示，共測定了15個氨基酸殘基，其序列如序列表中的序列1所示，N-末端的第一個氨基酸為S，其中氨基酸殘基F、P、L和M為疏水性氨基酸，N末端親水性氨基酸較多(9/15)，疏水性氨基酸較少(6/15)。經(jīng)蛋白質(zhì)氨基酸序列數(shù)據(jù)庫檢索與已知蛋白質(zhì)的序列無同源性。
3.人梭曼水解酶的氨基酸組成將約含有100ug的酶樣品溶液對水透析后凍干，加0.4ml 57mol/L HCl溶解，移到水解管中，抽成真空并封口，110℃水解24小時。取出后冷卻，抽干HCl，加0.2ml檸檬酸緩沖液(pH 2.0)，溶解后用Beckman 121 MB型氨基酸自動分析儀分析氨基酸組成成份。結(jié)果如表3和圖8所示，表明共測出17種氨基酸，梭曼水解酶中親水性氨基酸較多，約156分子，疏水性氨基酸較少約126分子，所以梭曼水解酶屬于親水性蛋白質(zhì)。這與它的催化功能是一致的；其中堿性氨基酸約有51個。酸性氨基酸約有36個，所以它屬于偏堿性的蛋白質(zhì)，這一結(jié)果也可從實(shí)施例1的等電聚焦結(jié)果(表1)得到證實(shí)，具有活性的酶在負(fù)極聚焦，等電點(diǎn)在pH 7.0-9.5之間。
表3.人梭曼水解酶的氨基酸組成


注N、Q及W不能測出4.人梭曼水解酶的膠內(nèi)酶切、數(shù)據(jù)庫查尋及部分肽片序列(1)人梭曼水解酶的膠內(nèi)酶切脫色將SDS-PAGE中分子量為36KD的蛋白帶切下并切成小塊，水洗三次，用含50％乙腈的25ml碳酸氫銨溶液浸泡膠片，振蕩10min，棄去溶液，重復(fù)1-3遍至膠片中的藍(lán)色褪盡。
酶切真空離心將膠片干燥，加入5-10μl胰蛋白酶(0.01μg/μl溶解在25mmol/L碳酸氫銨溶液中(pH8.9)，4℃冰箱中放置15-30min，待酶液完全被吸收，37℃保溫反應(yīng)12小時以上。
肽提取加5％TFA50-100ul，于37℃保溫1小時，吸出上清液冰凍干燥。
MALDI-TOF-MS的肽質(zhì)量指紋譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索用5％TFA溶液3-6μl溶解樣品，以CHCA為基質(zhì)用MALDI-TOF-MS分析，MALDI-TOF-MS為Bruker公司的Reflex III，加速電壓為20kV。反射式正離子檢測方式。檢測結(jié)果如圖16所示，圖16是經(jīng)上述方法提取的肽經(jīng)MALDI-TOF-MS分析所得的肽質(zhì)量指紋圖譜。
數(shù)據(jù)庫檢索將MALDI-TOF-MS分析所得的肽質(zhì)量指紋譜通過Mascot搜索引擎查詢數(shù)據(jù)庫Swissprot和NCBI進(jìn)行分析，結(jié)果如圖9a和圖9b所示，表明所提供的兩次肽指紋圖譜分別得分為56分和52分，而Mascot Search有意義的結(jié)果分別應(yīng)為65分(圖9a)和72分(圖9b)，所以可初步確定為未知蛋白。用MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋譜鑒定蛋白質(zhì)的成功率為50％，用此方法得到鑒定結(jié)果時，需要選用專屬性更高的ESI-MS/MS方法進(jìn)行鑒定。
(2)納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜的ESI-MS/MS序列分析及數(shù)據(jù)庫檢索溶解后的樣品(純化后的梭曼水解酶)用Millipore的C18從Ziptip脫鹽后進(jìn)行序列分析，首先做一個一級MS譜(圖10a)，選擇強(qiáng)度較高的M/Z 793、878、923的帶雙電荷的肽段進(jìn)行MS/MS分析，經(jīng)Maxent 3處理后又借助Masseq軟件分析，獲得的譜圖及序列分析結(jié)果如圖10b、圖10c和圖10d所示，得到分別具有序列表中序列2、3和4的氨基酸殘基序列的3個肽段肽段1、肽段2和肽段3。圖中峰793為分離得到的肽段1，峰878為分離到得的肽段2，峰923為分離得到的肽段3。肽段1由13個氨基酸殘基組成，親水性氨基酸和疏水性氨基酸的比例基本相同；肽段2由16個氨基酸殘基組成，肽段3由17個氨基酸殘基組成，肽段2、3中親水性氨基酸較多，疏水性氨基酸較少。
將上述三序列通過Mascot查詢SWISSPROT和NCBInr數(shù)據(jù)庫，均未得到有意義的結(jié)果，表明測試樣品為新蛋白質(zhì)。
本實(shí)施例對純化的人梭曼水解酶采用SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明酶的分子量為36KD；氨基酸組份分析結(jié)果表明人肝中梭曼水解酶是一個堿性氨基酸組份較多的蛋白質(zhì)；N-末端氨基酸序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與蛋白庫中的蛋白無同源性，氨基酸分析表明組成它的親水性氨基酸較多9/15，是親水性肽段；選用胰蛋白酶進(jìn)行凝膠內(nèi)酶切，獲得的肽指紋圖譜重復(fù)性較好，獲得的肽指紋圖譜信息在數(shù)據(jù)庫檢索沒有得到有意義的結(jié)果，推測可能為未知蛋白；選用電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)與HPLC聯(lián)用共獲得了準(zhǔn)確性很高的三個肽段序列，肽段1、2、3結(jié)果表明肽段1親水性氨基酸和疏水性氨基酸比例大致相同，肽段2、3親水性氨基酸較多，疏水性氨基酸較少。對上述三序列通過Mascot查詢SWISSPROT和NCBInr數(shù)據(jù)庫，查詢結(jié)果表明測試樣品為未知蛋白，這種查詢方式的功能最為強(qiáng)大，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中查不出有意義的結(jié)果，則表明測試樣品為新蛋白質(zhì)。
本實(shí)施例通過N-末端氨基酸序列分析、肽質(zhì)量指紋圖譜及電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜3種測試手段均證明本發(fā)明分離純化的人梭曼水解酶是一個新的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3、人梭曼水解酶的活性位點(diǎn)預(yù)測及計(jì)算機(jī)檢索將人梭曼水解酶酶解后得到的肽段N端肽段SFCDLKSPHGLQMLN；肽段1LDQLHWVSLAEFK；肽段2VFDKDGDGDGYLSAAELR；肽段3EAFSLFDKDGDGTLTTK進(jìn)行以下分析。
1.BLAST服務(wù)器(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)通過BLAST服務(wù)器將人梭曼水解酶序列與蛋白質(zhì)序列庫中的已知序列進(jìn)行序列相似性檢索，結(jié)果表明人梭曼水解酶的一級結(jié)構(gòu)與鈣調(diào)蛋白有一定相似性。將得分最高的鈣調(diào)蛋白序列與人梭曼水解酶的一級結(jié)構(gòu)用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比較，結(jié)果如圖11所示，表明人梭曼水解酶的一級結(jié)構(gòu)與鈣調(diào)蛋白有一定相似性，而且C端殘基保守性明顯高于N端，這一結(jié)果提示肽段2、3位于接近C端處，而且酶活性中心可能在靠近C端處。
2.SWISS-PROT Prosite服務(wù)器通過Prosite服務(wù)器分別將人梭曼水解酶肽段序列與Prosite蛋白質(zhì)序列庫中的已知位點(diǎn)序列進(jìn)行相似性檢索，結(jié)果如圖12所示，表明梭曼水解酶的肽段序列中共有三個特異位點(diǎn)，分別是鈣結(jié)合位點(diǎn)(位于肽段2的DKDGDGYLSAAELR序列，即序列3中的自氨基端第3位-16位氨基酸殘基)、磷酸化位點(diǎn)(位于肽段2的DKDGDGY序列，即序列3中的自氨基端第3位-9位氨基酸殘基)及?；稽c(diǎn)(位于肽段3的GTLTTK序列，即序列4中的自氨基端第12位-17位氨基酸殘基)，它們都位于肽段2及3上，說明肽段2及3可能是人梭曼水解酶的活性片段。圖12中，大寫字母是相似的位點(diǎn)，小寫字母是非相似位點(diǎn)。
3.用Clustal W軟件對來源于不同種屬具有相同梭曼水解酶活性的酶進(jìn)行多序列比較，結(jié)果表明梭曼水解酶與魷魚型的DFP酶之間具有很高的序列相似性(圖13)，而且C端的保守性明顯高于N端。
4.通過BLAST服務(wù)器進(jìn)行人梭曼水解酶與魷魚型的DFP酶的序列相似性比較通過BLAST服務(wù)器進(jìn)行人梭曼水解酶與魷魚型的DFP酶的序列相似性比較，結(jié)果如圖14所示，表明人梭曼水解酶序列與魷魚的DFP酶的序列具有很高的相似性，C端的保守性明顯高于N端，其中肽段2、3DGDG序列是高度保守的，這一保守序列在圖12的檢索結(jié)果中為鈣結(jié)合位點(diǎn)，據(jù)文獻(xiàn)報道魷魚的DFP酶具有兩個鈣結(jié)合位點(diǎn)，第一個是低親和力位點(diǎn)，與Glu21、Asn120、Asn175、Asp229結(jié)合，另一個是高親和力位點(diǎn)，與Asp232、Leu273、His274結(jié)合，所以推測與魷魚型DFP酶220-240間的DGDGDGYLSAAE保守序列的相對應(yīng)人梭曼水解酶序列是鈣結(jié)合位點(diǎn)，而KDGDGDGY在圖12的檢索結(jié)果中為磷酸化位點(diǎn)。這也說明肽段2、3可能是含活性中心的肽段。
5.分別對兩個可能含活性中心的肽段2、3與魷魚型DFPase配比率較高的部分結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬，魷魚型的DFP酶肽段IELFGPDGGQ的空間結(jié)構(gòu)如圖15a所示，人梭曼水解酶肽段FSLFDKDGDG的空間結(jié)構(gòu)如圖15b所示，它們的計(jì)算機(jī)模擬參數(shù)比較結(jié)果如表4所示，表明人梭曼水解酶可能含活性中心的肽段序列與魷魚型的DFP酶的三維結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，模擬參數(shù)相似，說明人梭曼水解酶肽段FSLFDKDGDG可能是人梭曼水解酶的活性中心部位。
表4.魷魚型的DFP酶肽段IELFGPDGGQ與人梭曼水解酶肽段FSLFDKDGDG計(jì)算機(jī)模擬參數(shù)比較

本實(shí)施例將人梭曼水解酶序列與蛋白質(zhì)序列庫中的已知序列進(jìn)行序列相似性檢索，結(jié)果表明人梭曼水解酶的一級結(jié)構(gòu)與鈣調(diào)蛋白有一定相似性。但純化的人梭曼水解酶的分子量(36KD)與鈣調(diào)蛋白的分子量(15KD)相差較大，兩者不是一種蛋白，推測可能是編碼人梭曼水解酶的部分基因與鈣調(diào)蛋白是共同的。
純化的人梭曼水解酶經(jīng)過與不同種屬具有相同梭曼水解酶活性的酶進(jìn)行多序列比較，結(jié)果表明梭曼水解酶與魷魚型的DFP酶之間具有很高的序列相似性，與其它種的具有相同梭曼水解酶活性酶的序列相似性較小。
純化的人梭曼水解酶經(jīng)過Swiss-Protsite位點(diǎn)檢索結(jié)果表明位于第二肽段的DGDGDGYLSAAELR序列是鈣結(jié)合位點(diǎn)，這段序列與魷魚型的DFP酶的序列也是保守的，位于第二肽段的DGDGDGDGY序列是酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，這段序列與魷魚型的DFP酶的序列也是保守的。位于第三肽段GTLTTK的序列是?；稽c(diǎn)，這一位點(diǎn)與其催化功能緊密相關(guān)。
純化的人梭曼水解酶與已知的魷魚型的DFP酶部分保守序列的空間結(jié)構(gòu)相比較，結(jié)果表明兩者的鈣結(jié)合位點(diǎn)序列與酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)無論一級結(jié)構(gòu)還是空間結(jié)構(gòu)相似性很高，各項(xiàng)力學(xué)參數(shù)也表明兩者的伸展度、轉(zhuǎn)角、非范得華力及總能量一致，說明這段保守結(jié)構(gòu)從結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、疏水特性等性質(zhì)方面非常相似，結(jié)構(gòu)保守性也表明這段序列具有共同的功能。
從系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果看，梭曼水解酶與魷魚型的DFP酶之間具有很高的序列相似性。
序列表<160>4<210>1<211>15<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1Ser Phe Cys Asp Leu Lys Ser Pro His Gly Leu Gln Met Leu Asn1 5 10 15<210>2<211>13<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2Leu Asp Gln Leu His Trp Val Ser Leu Ala Glu Phe Lys1 5 10<210>3<211>16<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>3Val Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ala Ala Glu Leu Arg1 5 10 15<210>4
<211>17<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>4Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Leu Thr Thr1 5 10 15Lys
權(quán)利要求
1.一種人梭曼水解酶，分子量在35-37KD之間，具有序列表中的序列1的N-末端氨基酸序列；其氨基酸組成中包括30個L殘基，27個K殘基，24個G殘基，各21個E、V和A殘基，18個I殘基，各15個D、S、R、T、P和F殘基，12個Y殘基，9個H殘基，6個M殘基以及3個C殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述人梭曼水解酶還含有具有序列表中序列2、3和4的氨基酸殘基序列的3個肽段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述人梭曼水解酶的等電點(diǎn)在pH 7.0-9.5之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述序列3中的自氨基端第3位-16位氨基酸殘基為鈣結(jié)合位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述序列3中的自氨基端第3位-9位氨基酸殘基序列為酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述序列4中的自氨基端第12位-17位氨基酸殘基為酰基化位點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人梭曼水解酶，其特征在于所述序列4中的自氨基端第3位-12位氨基酸殘基為所述人梭曼水解酶的活性中心部位。
8.編碼權(quán)利要求1-7所述人梭曼水解酶的DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人梭曼水解酶。本發(fā)明所提供的人梭曼水解酶，分子量在35－37KD之間，具有序列表中的序列1的N－末端氨基酸序列，其氨基酸組成中包括30個L殘基，27個K殘基，24個G殘基，各21個E、V和A殘基，18個I殘基，各15個D、S、R、T、P和F殘基，12個Y殘基，9個H殘基，6個M殘基以及3個C殘基。該人梭曼水解酶還含有分別具有序列表中序列2、3和4的氨基酸殘基序列的3個肽段。本發(fā)明對于研究G類有機(jī)磷水解酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、體內(nèi)代謝及毒理學(xué)，以及最終用于人體農(nóng)藥中毒和化學(xué)戰(zhàn)劑中毒的防護(hù)均具有非常重要的理論和實(shí)際意義。
文檔編號C12N15/55GK1900275SQ200510084249
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月18日
發(fā)明者劉敏, 孫曼霽 申請人:中國人民解放軍防化指揮工程學(xué)院