專(zhuān)利名稱(chēng)：一種固定化重組高溫β－半乳糖苷酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種固定化重組高溫β-半乳糖苷酶的制備方法，屬于高溫β-半乳糖苷酶的固定化及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)俗稱(chēng)乳糖酶，能水解β-1，4-半乳糖苷鍵而具有重要的工業(yè)用途。耐熱β-半乳糖苷酶，或稱(chēng)高溫乳糖酶，以其良好的熱穩(wěn)定性和較高溫度下的水解特性使之具有常溫乳糖酶無(wú)法比擬的優(yōu)越性。與常溫酶的固定化相比，高溫酶因其在較高操作溫度下使用，因此在交聯(lián)劑選擇、固定化參數(shù)和條件方面具有更大的難度。
β-半乳糖苷酶主要來(lái)自植物、動(dòng)物臟器、細(xì)菌、酵母(胞內(nèi))、真菌或霉菌(胞外)。高溫β-半乳糖苷酶一般是指最適溫度在50℃以上的β-半乳糖苷酶。高溫β-半乳糖苷酶主要來(lái)源于一些高溫菌，如棲熱菌，嗜熱菌(嗜熱鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等)。
β-半乳糖苷酶的用途主要是在食品工業(yè)中水解牛奶中乳糖生產(chǎn)低乳糖乳制品，牛奶中乳糖被水解成葡萄糖和半乳糖后可以為乳糖不耐癥人群順利吸收。β-半乳糖苷酶還可以用于水解干酪生產(chǎn)時(shí)的副產(chǎn)物乳清中的乳糖，有利于綜合利用和環(huán)境保護(hù)。利用β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用，以牛乳或乳清中的乳糖為底物，可以生成低聚半乳糖。低聚半乳糖具有許多重要的生理功能，如抑制有害菌群、促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)鈣吸收，改善血清脂質(zhì)等。
乳糖的酶解既可用固定化乳糖酶水解，也可用非固定化乳糖酶水解。對(duì)于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，雖然游離乳糖酶水解工藝簡(jiǎn)單，但是酶在溶液中很難回收，不僅使牛乳摻入外來(lái)蛋白質(zhì)，并且會(huì)影響乳制品的風(fēng)味，而且成本較高；而用固定化乳糖酶進(jìn)行水解，則可克服上述缺點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)的半乳糖苷酶都受乳糖的水解產(chǎn)物(D-葡萄糖，D-半乳糖)抑制，應(yīng)用固定化床進(jìn)行連續(xù)操作時(shí)，產(chǎn)物抑制可降到最低，從而大大提高了生產(chǎn)效率。固定化乳糖酶與非固定化乳糖酶相比，還具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)有良好的機(jī)械強(qiáng)度，可在攪拌或者裝柱的方式下進(jìn)行作用。
(2)可用于工業(yè)化生產(chǎn)，適應(yīng)連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)的要求。
(3)產(chǎn)物純度高、副反應(yīng)少，因此產(chǎn)率較高。
(4)可反復(fù)使用，提高了酶的利用率，降低了低乳糖乳制品的生產(chǎn)成本。
(5)當(dāng)酶被固定后，它的三級(jí)結(jié)構(gòu)得到穩(wěn)定使酶的穩(wěn)定性有顯著提高。
(6)固定化酶應(yīng)用于生產(chǎn)后，產(chǎn)物中不含有酶，因此省去了熱處理使酶失活步驟，對(duì)于提高食品的質(zhì)量極為有利。
用于β-半乳糖苷酶的固定化方法有很多，如吸附法、包埋法、共價(jià)法、戊二醛交聯(lián)法等。
在固定化乳糖酶的工業(yè)化應(yīng)用中，應(yīng)該注意固定化酶的清洗問(wèn)題，以防止固定化酶被微生物污染。然而固定化高溫酶時(shí)則不會(huì)遇到類(lèi)似問(wèn)題，固定化高溫乳糖酶的工業(yè)應(yīng)用目前還是空白關(guān)于高溫乳糖酶的固定化國(guó)內(nèi)外也有少量報(bào)道。目前高溫β-半乳糖苷酶的固定化及其應(yīng)用研究正成為熱點(diǎn)之一。與常溫酶的固定化相比，高溫酶因其在較高操作溫度下使用，因此在交聯(lián)劑選擇、固定化參數(shù)和條件方面具有更大的難度。目前未見(jiàn)有用三羥甲基膦作為殼聚糖交聯(lián)劑固定化高溫酶的應(yīng)用，尤其是對(duì)來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的重組高溫β-半乳糖苷酶的固定化未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以三羥甲基膦(tris(hydroxymethyl)phosphine，THP)作為交聯(lián)劑，以殼聚糖為固定化載體，以重組高溫β-半乳糖苷酶為固定化對(duì)象，確定固定化參數(shù)和條件，以期為高溫乳糖酶的固定化方法尋找一條有效的途徑。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種固定化重組高溫β-半乳糖苷酶的制備方法，是以殼聚糖為載體，用三羥甲基膦(THP)為交聯(lián)劑，選擇對(duì)高溫β-半乳糖苷酶進(jìn)行固定化處理，采取先用交聯(lián)劑活化殼聚糖載體，然后再將酶固定在活化好的載體上的固定化順序，所述固定化工藝為(1)配制殼聚糖凝膠載體稱(chēng)一定量的殼聚糖，用2％醋酸溶解浸泡過(guò)夜，使殼聚糖終濃度為2％，在劇烈攪拌下滴加濃度為6mol/L的NaOH溶液中和，使殼聚糖凝膠析出，以去離子水洗滌，抽干得到處理好的殼聚糖凝膠。
(2)載體活化稱(chēng)取0.32g四羥甲基氯化膦(THPC)溶液，加入95mL水，在劇烈攪拌下逐滴加入等摩爾的濃度為1.0mol/L的KOH溶液1.68mL，迅速加入12g上述殼聚糖凝膠，緩慢攪動(dòng)5min，抽濾、水洗三次，再抽濾，其中三羥甲基膦濃度為0.31-1.25mg/mL，活化時(shí)間5min。四羥甲基氯化膦和KOH等摩爾反應(yīng)生成三羥甲基膦。
(3)固定化酶取一定量β-半乳糖苷酶溶解于pH6.5-7.2、0.05-0.15mol/L的磷酸鈉緩沖液至濃度為40-100U/mL，按酶液與殼聚糖v/w為1∶5的比例混合，室溫輕微震蕩10min，去離子水洗滌，然后用濃度為1mol/L的NaCL洗滌三次，抽干得到固定化重組高溫β-半乳糖苷酶。
固定化酶的最優(yōu)條件以三羥甲基膦為交聯(lián)劑，其濃度為0.625mg/mL，固定化緩沖液選擇0.1mol/L、pH6.8的磷酸鈉緩沖液，在室溫下交聯(lián)固定10min，制備得到的固定化酶的活力回收率可達(dá)到90％以上。
本發(fā)明的有益效果高溫β-半乳糖苷酶的固定化及其應(yīng)用目前正成為研究熱點(diǎn)。與常溫酶的固定化相比，高溫酶因其在較高操作溫度下使用，因此在交聯(lián)劑選擇、固定化參數(shù)和條件方面具有更大的難度。目前未見(jiàn)有用三羥甲基膦作為殼聚糖交聯(lián)劑固定化高溫半乳糖苷酶的應(yīng)用，尤其是對(duì)來(lái)源于重組菌表達(dá)的高溫β-半乳糖苷酶的固定化未見(jiàn)報(bào)道。以THP作交聯(lián)劑時(shí)，固定化酶制備方便、簡(jiǎn)捷，酶活回收率達(dá)90％以上，且具有良好的熱穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性，70℃保溫處理5小時(shí)，固定化酶活力保留80％以上；以乳糖為水解底物，70℃下使用九個(gè)循環(huán)后，固定化酶活保留60％以上。


圖1 THP作交聯(lián)劑制備固定化酶的熱穩(wěn)定性。
圖2戊二醛作交聯(lián)劑制備固定化酶的熱穩(wěn)定性。
圖3固定化β-半乳糖苷酶使用穩(wěn)定性(70℃)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1按照說(shuō)明書(shū)上述的條件配制殼聚糖載體、用THP進(jìn)行載體活化，選用來(lái)源于編碼嗜熱脂肪芽孢桿菌β-半乳糖苷酶基因的重組枯草芽孢桿菌WB600/pMA5-bgaB(該菌株見(jiàn)“工業(yè)微生物”雜志2004年第34卷第1期)生產(chǎn)的高溫β-半乳糖苷酶，進(jìn)行固定化酶處理。
影響固定化酶活回收率的因素有交聯(lián)劑濃度、活化時(shí)間、固定化緩沖液pH、離子強(qiáng)度、交聯(lián)溫度、固定化時(shí)間、順序等。由單因素試驗(yàn)得到固定化酶較優(yōu)的參數(shù)條件是THP濃度0.625mg/mL，活化時(shí)間5-10min，固定化緩沖液pH6.5-7.2，離子強(qiáng)度0.1-0.2mol/L，交聯(lián)溫度20-30℃，固定化時(shí)間5-10min。并且THP濃度、固定化緩沖液pH、離子強(qiáng)度是主要影響因素，為此再安排正交試驗(yàn)L9(33)，從而得出最優(yōu)的固定化條件。
表1 正交試驗(yàn)因素和水平的選取

表2 正交試驗(yàn)方案和結(jié)果

從極差分析可以知道，影響因素的主次順序?yàn)門(mén)HP濃度(A)、緩沖液pH值(B)、緩沖液離子強(qiáng)度(C)。由此確定最佳的固定化條件為A2B2C2，按此最佳固定化條件得到的固定化酶活力回收率為92.6％。
交聯(lián)劑濃度影響最顯著，THP濃度過(guò)高，會(huì)造成多點(diǎn)交聯(lián)，影響酶活性部位的構(gòu)象，從而使活力回收率降低；固定化緩沖液pH值的變化會(huì)影響到酶蛋白氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響底物的結(jié)合和進(jìn)一步的催化反應(yīng)，使酶活力受到影響；離子強(qiáng)度影響說(shuō)明鹽鍵不是維持酶蛋白構(gòu)象的主要的次級(jí)鍵。因此得到THP為交聯(lián)劑固定化酶最優(yōu)條件為T(mén)HP濃度0.625mg/mL，pH6.8，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液固定化10min，制備得到的固定化酶的活力回收率可達(dá)到90％以上。
以THP作交聯(lián)劑制備得到的固定化酶，與以戊二醛作交聯(lián)劑制備得到的固定化酶相比，THP交聯(lián)制備的固定化酶具有更好的熱穩(wěn)定性，在70℃下保溫處理5小時(shí)后，THP固定化酶仍保留80％左右的活力(圖1)，而戊二醛交聯(lián)制備的固定化酶70℃保溫處理1小時(shí)，酶活還不到原來(lái)的20％，2h后基本無(wú)活力保留(圖2)。
對(duì)乳糖的分批水解試驗(yàn)結(jié)果表明，THP固定化酶具有較好的使用穩(wěn)定性，在使用九個(gè)循環(huán)后，THP固定化酶保留60％以上的酶活，而戊二醛固定化酶僅有40％左右(圖3)。
實(shí)施例2以實(shí)施例1中的固定化參數(shù)條件為參照，對(duì)重組大腸桿菌(Escherichia coliMV1184)表達(dá)的棲熱菌(Thermus sp.A4)β-半乳糖苷酶(以質(zhì)粒pUC118/119為載體，該菌株及質(zhì)粒見(jiàn)“Bioscience Biotechnology & Biochemistry”雜志1998年62卷第8期1539-1545頁(yè))進(jìn)行酶固定化。因該酶最適溫度為85℃，因此也是高溫β-半乳糖苷酶。該高溫重組酶的最優(yōu)固定化條件為T(mén)HP濃度為0.625mg/mL，固定化緩沖液pH值6.8，濃度為0.1mol/L，交聯(lián)溫度為室溫，固定化時(shí)間為10min。按此條件制備得到的固定化酶的活力回收率為92％，最適溫度為85℃，70℃下保溫處理5小時(shí)酶活幾乎沒(méi)有損失，對(duì)乳糖水解循環(huán)使用十次后酶活仍保留80％。
權(quán)利要求
1.一種固定化重組高溫β-半乳糖苷酶的制備方法，其特征是以殼聚糖為載體，用三羥甲基膦為交聯(lián)劑，選擇對(duì)高溫β-半乳糖苷酶進(jìn)行固定化處理，采取先用交聯(lián)劑活化殼聚糖載體，然后再將酶固定在活化好的載體上的固定化順序，所述固定化工藝為(1)配制殼聚糖凝膠載體稱(chēng)一定量的殼聚糖，用2％醋酸溶解浸泡過(guò)夜，使殼聚糖終濃度為2％，在劇烈攪拌下滴加濃度為6mol/L的NaOH溶液中和，使殼聚糖凝膠析出，以去離子水洗滌，抽干得到處理好的殼聚糖凝膠；(2)載體活化稱(chēng)取0.32g四羥甲基氯化膦溶液，加入95mL水，在劇烈攪拌下逐滴加入等摩爾的1.0mol/L濃度的KOH溶液1.68mL，迅速加入12g上述殼聚糖凝膠，緩慢攪動(dòng)5min，抽濾、水洗三次，再抽濾，其中三羥甲基膦濃度為0.31-1.25mg/mL，活化時(shí)間5min；(3)固定化酶取一定量β-半乳糖苷酶溶解于pH6.5-7.2、0.05-0.15mol/L的磷酸鈉緩沖液至濃度為40-100U/mL，按酶液與殼聚糖v/w為1∶5的比例混合，室溫輕微震蕩10min，去離子水洗滌，然后用濃度為1mol/L的NaCL洗滌三次，抽干得到固定化重組高溫β-半乳糖苷酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化重組高溫β-半乳糖苷酶的制備方法，其特征是固定化酶的條件為以三羥甲基膦為交聯(lián)劑，其濃度為0.625mg/mL，固定化緩沖液選擇0.1mol/L、pH6.8的磷酸鈉緩沖液，在室溫下交聯(lián)固定10min，制備得到的固定化酶的活力回收率達(dá)到90％以上。
全文摘要
一種固定化重組高溫β－半乳糖苷酶的制備方法，屬于高溫β－半乳糖苷酶的固定化及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以殼聚糖為載體，用三羥甲基膦(THP)為交聯(lián)劑，選擇對(duì)高溫β－半乳糖苷酶進(jìn)行固定化處理，采取先用交聯(lián)劑活化殼聚糖載體，然后再將酶固定在活化好的載體上的固定化順序獲得固定化重組高溫β－半乳糖苷酶。以THP作交聯(lián)劑時(shí)，固定化酶制備方便、簡(jiǎn)捷，酶活回收率可達(dá)90％以上，且具有良好的熱穩(wěn)定性和使用穩(wěn)定性，70℃保溫處理5小時(shí)，固定化酶活力保留80％以上；以乳糖為水解底物，70℃下使用九個(gè)循環(huán)后，固定化酶活保留60％以上。
文檔編號(hào)C12N11/04GK1769440SQ200510094480
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2005年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日
發(fā)明者陳衛(wèi), 田豐偉, 黃文利, 張灝, 趙建新, 楊靜 申請(qǐng)人:江南大學(xué)