專(zhuān)利名稱：堿性蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為洗凈劑配合酶有用的堿性蛋白酶，將其編碼的基因及含有該堿性蛋白酶的洗凈劑組合物。
背景技術(shù)：
產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中使用蛋白酶的歷史悠久，從以衣料用洗滌劑為首的洗凈劑至作為纖維的改性劑，皮革處理劑，化妝材料，沐浴劑，食品改性劑或藥品的利用，涉及得非常多。其中，最大量地工業(yè)化生產(chǎn)的是洗滌劑用蛋白酶，例如，已知堿性蛋白酶(alcalase)、Savinase(注冊(cè)商標(biāo)Novozymes)、Maxacal(注冊(cè)商標(biāo)Genencor)、Blap(注冊(cè)商標(biāo)Henkel)、與KAP(花王)等。
在洗滌劑中配合蛋白酶的目的，是為了分解在衣料上附著的以蛋白質(zhì)為主要成分的污垢，將其低分子化，促進(jìn)源自表面活性劑的溶液化。但是，實(shí)際的污垢不僅是蛋白質(zhì)，還有來(lái)自皮脂的脂質(zhì)、固體粒子等，是其中包含著混入有機(jī)物與無(wú)機(jī)物的多種成分的復(fù)合污垢，因此，期望有對(duì)這樣的復(fù)合污垢洗凈性高的洗凈劑。
出于這樣的觀點(diǎn)，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)了幾種即使在高濃度的脂肪酸存在下，仍然保持充分的酪蛋白分解活性，不僅對(duì)蛋白質(zhì)，而且對(duì)皮脂等混合存在的復(fù)合污垢也具有優(yōu)異洗凈性的分子量約43,000的堿性蛋白酶，在先已申請(qǐng)專(zhuān)利(參閱專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。這樣的堿性蛋白酶群，在其分子量、一次結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)、具有非常強(qiáng)的耐氧化性方面，與已知的是來(lái)自桿菌屬細(xì)菌的絲氨酸蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)不同，提議分類(lèi)為新的枯草桿菌蛋白酶亞科(subfamily)(參閱非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
上述堿性蛋白酶群，即使在皮脂污垢等混合存在的條件下也具有高的洗凈能力，但事實(shí)上還在謀求更高的洗凈性能。另外，為在工業(yè)上大量生產(chǎn)這樣的洗凈性優(yōu)異的蛋白酶，也必須提高生產(chǎn)率。作為提高生產(chǎn)率的方法，可以列舉通過(guò)生產(chǎn)菌的突變育種的改良，改變編碼蛋白酶的基因或相關(guān)其發(fā)現(xiàn)控制的基因，提高蛋白質(zhì)分泌量的方法，改變編碼蛋白酶的基因，使比活性提高的方法。因此，本發(fā)明者們針對(duì)上述堿性蛋白酶的基因改變進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)提高蛋白質(zhì)分泌能力與比活性的突變堿性蛋白酶(專(zhuān)利文獻(xiàn)2、3)。
但是，生產(chǎn)大量且價(jià)格低廉的酶，更優(yōu)選提高生產(chǎn)率，因此，致力于進(jìn)一步提高比活性、提高分泌量或提高洗凈能力等。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1 國(guó)際公開(kāi)第99/18218號(hào)小冊(cè)子專(zhuān)利文獻(xiàn)2 特開(kāi)2004-000122號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 特開(kāi)2004-057195號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 Saeki等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，279，313-319，2000發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種堿性蛋白酶，在具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶或功能上與其等效的堿性蛋白酶中，取代和/或插入選自下述(a)～(e)的1種以上的氨基酸殘基組成，且與具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶相比具有更高的比活性和/或洗凈性，(a)將133位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基；(b)在133位與134位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基之間插入其它氨基酸殘基；(c)將插入前的134位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基；(d)將插入前的135位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基；和(e)將132位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基。
此外，本發(fā)明還提供編碼該堿性蛋白酶的基因、含有該基因的媒介物、含有該媒介物的轉(zhuǎn)化體。
再者，本發(fā)明還提供含有該堿性蛋白酶的洗凈劑組合物。


圖1是與序列號(hào)1表示的氨基酸序列同源性高的蛋白酶的氨基酸序列的排列圖。
圖2-1是表示本發(fā)明堿性蛋白酶的洗凈能力的圖。
圖2-2是表示本發(fā)明堿性蛋白酶的洗凈能力的圖。
圖2-3是表示本發(fā)明堿性蛋白酶的洗凈能力的圖。
圖2-4是表示本發(fā)明堿性蛋白酶的洗凈能力的圖。
圖2-5是表示本發(fā)明堿性蛋白酶的洗凈能力的圖。
圖2-6是表示本發(fā)明堿性蛋白酶的洗凈能力的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種可以進(jìn)一步提高對(duì)復(fù)合污垢有效的堿性蛋白酶的洗凈性能，通過(guò)提高酶的比活性，同時(shí)具有高洗凈性能和生產(chǎn)率的堿性蛋白酶。
本發(fā)明人在被提議分類(lèi)為新的枯草桿菌蛋白酶亞科的分子量約為43,000的堿性蛋白酶中，通過(guò)對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐帕?，嘗試選擇成為改變候補(bǔ)的氨基酸，進(jìn)行了任意氨基酸的取代、插入、缺失等位點(diǎn)專(zhuān)一的突變導(dǎo)入。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)某種堿性蛋白酶中，為使比活性提高，該氨基酸序列中的特定位置上必須有特定的氨基酸殘基。本發(fā)明者們還發(fā)現(xiàn)，為提高洗凈性能，該氨基酸序列中的特定位置上必須插入特定的氨基酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)提高對(duì)復(fù)合污垢也具有優(yōu)異洗凈性的堿性蛋白酶的洗凈性能和酶的比活性，可以提供一種適合于配合洗凈劑的堿性蛋白酶。
本發(fā)明的堿性蛋白酶，在具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶或與其功能等價(jià)的堿性蛋白酶中，取代和/或插入選自下述(a)～(e)的1種以上的氨基酸殘基組成，優(yōu)選與具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶相比具有更高比活性或洗凈性，還優(yōu)選進(jìn)一步提高比活性與洗凈性。
(a)將133位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基；(b)在133位與134位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基之間插入其它氨基酸殘基；(c)將插入前的134位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基；(d)將插入前的135位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基；(e)將132位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基。
這樣的堿性蛋白酶可以是野生型，野生型的突變體或施以人工突變的突變體。
此外，作為選自上述(a)～(e)的2種以上的氨基酸殘基的取代和/或插入的適合的組合，例如可舉出以下的1)～5)。
1)(a)表示的氨基酸殘基的取代和(b)表示的氨基酸殘基的插入的組合；2)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入和(c)表示的氨基酸殘基的取代的組合；3)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入，(c)表示的氨基酸殘基的取代和(d)表示的氨基酸殘基的取代的組合；4)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合；5)(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合。
作為本發(fā)明的堿性蛋白酶優(yōu)選的具體例子，還可以列舉以下述6)～16)所表示的物質(zhì)。
6)(a)表示的氨基酸殘基的取代，其它的氨基酸殘基是賴氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，纈氨酸，亮氨酸或異亮氨酸。
7)(b)表示的氨基酸殘基的插入，其它的氨基酸殘基是賴氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或精氨酸。
8)(a)表示的氨基酸殘基的取代和(b)表示的氨基酸殘基的插入的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基，分別是(a)脯氨酸/(b)異亮氨酸、(a)亮氨酸/(b)絲氨酸、(a)亮氨酸/(b)甘氨酸、(a)亮氨酸/(b)蘇氨酸、(a)絲氨酸/(b)丙氨酸、(a)絲氨酸/(b)天冬酰胺、(a)絲氨酸/(b)谷氨酰胺、(a)絲氨酸/(b)色氨酸、(a)絲氨酸/(b)組氨酸、(a)絲氨酸/(b)甘氨酸、(a)賴氨酸/(b)絲氨酸、(a)蘇氨酸/(b)絲氨酸、(a)異亮氨酸/(b)絲氨酸、(a)蛋氨酸/(b)絲氨酸、(a)甘氨酸/(b)絲氨酸、(a)精氨酸/(b)絲氨酸、(a)谷氨酸/(b)絲氨酸、(a)天冬酰胺/(b)絲氨酸、(a)苯基丙氨酸/(b)絲氨酸、(a)色氨酸/(b)絲氨酸、(a)賴氨酸/(b)丙氨酸、(a)精氨酸/(b)丙氨酸、(a)賴氨酸/(b)甘氨酸或(a)絲氨酸/(b)絲氨酸。
9)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入與(c)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基，分別是(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(c)蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸或丙氨酸。
10)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入，(c)表示的氨基酸殘基的取代與(d)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(c)絲氨酸/(d)丙氨酸、(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(c)絲氨酸/(d)精氨酸與(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(c)絲氨酸/(d)蛋氨酸。
11)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入與(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(e)絲氨酸、(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(e)谷氨酰胺與(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(e)蛋氨酸。
12)(b)表示的氨基酸殘基的插入與(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(b)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或亮氨酸/(e)絲氨酸。
13)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入與(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)異亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)組氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)絲氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)精氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)賴氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸或(a)賴氨酸/(b)絲氨酸/(e)絲氨酸。
14)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入與(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)異亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)天冬酰胺或(a)脯氨酸/(b)丙氨酸/(e)天冬酰胺。
15)(b)表示的氨基酸殘基的插入與(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(b)丙氨酸/(e)蛋氨酸或蘇氨酸。
16)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入與以(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)賴氨酸/(b)絲氨酸/(e)天冬酰胺或異亮氨酸。
作為具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶，例如可舉出蛋白酶KP43[來(lái)自桿菌sp KSM-KP43(FERM BP-6532)，WO99/18218，GenBank accession no.AB051423]。
作為與具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶功能等價(jià)的堿性蛋白酶，也可以是野生型或野生型的突變體。例如，可舉出在序列號(hào)1中，在132位、133位、134位或135位或相當(dāng)于這些位置以外的氨基酸殘基1個(gè)～幾個(gè)缺失、取代或加成的氨基酸序列組成的堿性蛋白酶，或與序列號(hào)1表示的氨基酸序列，具有80％以上，優(yōu)選87％以上，更優(yōu)選90％以上，特別優(yōu)選95％以上的同源性的堿性蛋白酶，與具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶具有同樣性質(zhì)的物質(zhì)。特別優(yōu)選在pH8以上的堿性區(qū)域作用的，具有耐氧化性的，在50℃、pH10時(shí)處理10分鐘時(shí)表示80％以上的殘存活性，受二異丙基氟磷酸(DFP)及苯甲基磺酰氟(PMSF)阻礙，由SDS-PAGE測(cè)定的分子量為43,000±2,000的物質(zhì)。這里，作為具有耐氧化性，可以列舉30℃下，將該堿性蛋白酶放置在含有50mM過(guò)氧化氫，5mM氯化鈣的20mM的Britton-Robinson緩沖液(pH10)中20分鐘后的殘存活性至少保持50％以上。
作為“具有與序列號(hào)1表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列的堿性蛋白酶”，例如可舉出來(lái)自蛋白酶KP9860[桿菌spKSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218，GenBank accessionno.AB046403]，蛋白酶E-1[來(lái)自桿菌No.D-6(FERM P-1592)，特開(kāi)昭49-71191，GenBank accession no.AB046402]，蛋白酶Ya[來(lái)自桿菌sp Y(FERM BP-1029)，特開(kāi)昭61-280268，GenBank accessionno.AB046404]，蛋白酶SD521[來(lái)自桿菌SD521(FERM P-11162)，特開(kāi)平3-191781，GenBank accession no.AB046405]，蛋白酶A-1[來(lái)自NCIB12289，WO88/01293，GenBank accession no.AB046406]，蛋白酶A-2[來(lái)自NCIB 12531，WO98/56927]，蛋白酶9865[來(lái)自桿菌sp KSM-9865(FERM P-18566)，GenBank accession no.AB084155]，和特開(kāi)2002-218989，特開(kāi)2002-306176，特開(kāi)2003-125783，特開(kāi)2004-000122，特開(kāi)2004-057195中所述的突變蛋白酶，將序列號(hào)1的氨基酸序列63位取代為絲氨酸的突變體，將89位取代為組氨酸的突變體，將120位取代為精氨酸的突變體，將63位與187位取代為絲氨酸的突變體，將226位取代為酪氨酸的突變體，將296位取代為纈氨酸的突變體，將304位取代為絲氨酸的突變體(特開(kāi)2004-305175)，將序列號(hào)1的氨基酸序列的15位取代為組氨酸的突變體，將16位取代為蘇氨酸或谷氨酰胺的突變體，將166位取代為甘氨酸的突變體，將167位取代為纈氨酸的突變體，將346位取代為精氨酸的突變體，將405位取代為天冬酰胺酸的突變體(特開(kāi)2004-305176)等。
此外，氨基酸序列的同源性，由Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))計(jì)算。具體地，使用基因信息處理軟件Genetyx-Win(Ver.5.1.1；軟件開(kāi)發(fā))的同源性解析(Search homology)程序，將Unit size to compare(ktup)作為1進(jìn)行解析并由此計(jì)算。
另外，本發(fā)明中，作為確定“相當(dāng)位置的氨基酸殘基”的方法，可以由使用例如Lipman-Pearson法等公知的算法(algorithm)，比較氨基酸序列，通過(guò)在各堿性蛋白酶的氨基酸序列中存在的保存氨基酸殘基中給予最大相同性進(jìn)行。以這樣的方法使蛋白酶的氨基酸序列整列，不僅能夠在氨基酸序列中的插入、缺失，而且能夠決定在相同氨基酸殘基的各蛋白酶序列中的位置。相同位置，可以認(rèn)為在三維結(jié)構(gòu)中存在于相同位置，可以推定具有有關(guān)對(duì)象蛋白酶的特異功能類(lèi)似的效果。
即，以上述方法，如圖1使氨基酸序列整列，(1)序列號(hào)1的132位的氨基酸殘基是丙氨酸殘基，相當(dāng)該位置的氨基酸殘基，通過(guò)使用上述方法可以特定為例如在蛋白酶E-1中131位的丙氨酸殘基。
(2)序列號(hào)1的133位的氨基酸殘基是丙氨酸殘基，相當(dāng)該位置的氨基酸殘基，通過(guò)使用上述方法可以特定為例如在蛋白酶Ya中132位的脯氨酸殘基。
(3)序列號(hào)1的134位的氨基酸殘基是纈氨酸殘基，相當(dāng)該位置的氨基酸殘基，通過(guò)使用上述方法可以特定為例如在蛋白酶KP9860中134位的纈氨酸殘基。
(4)序列號(hào)1的135位的氨基酸殘基是天冬酰胺殘基，相當(dāng)該位置的氨基酸殘基，通過(guò)使用上述方法可以特定為例如在蛋白酶SD521中134位的天冬酰胺殘基。
相當(dāng)于蛋白酶KP43的氨基酸序列的(1)132位、(2)133位、(3)134位、(4)135位的位置及氨基酸殘基的具體例子在上述例示的蛋白酶KP9860，蛋白酶E-1，蛋白酶Ya，蛋白酶SD521，蛋白酶A-1，蛋白酶A-2，蛋白酶9865中表示(表1)。
表1

本發(fā)明的堿性蛋白酶是突變體時(shí)，作為實(shí)施突變前的堿性蛋白酶(有時(shí)稱為親堿性蛋白酶)，作為符合以“具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的蛋白酶”或上述的“與其功能等價(jià)的堿性蛋白酶”表示的蛋白酶，通過(guò)在此上實(shí)施目的部位的突變可以得到本發(fā)明的堿性蛋白酶。
例如，對(duì)以蛋白酶KP43的序列號(hào)1表示的氨基酸序列，可以進(jìn)行上述以6)～16)表示的氨基酸殘基的取代和/或插入，或?qū)εc其功能等價(jià)的堿性蛋白酶的氨基酸序列中的相當(dāng)該位置的位置的氨基酸殘基，可以進(jìn)行同樣的取代和/或插入而得到。
本發(fā)明堿性蛋白酶，可以由例如以下的方法得到。即，對(duì)編碼無(wú)性繁殖的親堿性蛋白酶的基因(序列編號(hào)2)實(shí)施突變，使用得到的突變基因轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)換的宿主，從培養(yǎng)物中采取得到。編碼親堿性蛋白酶的基因的無(wú)性繁殖，可以使用通常的基因重組技術(shù)，例如可以根據(jù)WO99/18218、WO98/56927記載的方法進(jìn)行。
作為編碼親堿性蛋白酶基因的突變方法，可以采用通常進(jìn)行的位點(diǎn)專(zhuān)一的突變方法的任意一種。更具體地，可以使用例如Site-DirectedMutagenesis System Mutan-Super Express Km成套工具(kit)(TaKaRa)等進(jìn)行。另外，通過(guò)使用PCR(polymerase chain reaction)法(PCRprotocols，Academic Press，New York，1990)，可以將基因的任意序列與相當(dāng)于其它基因的該任意序列的序列取代。
作為使用得到的突變基因的本發(fā)明蛋白酶的生產(chǎn)方法，可以采用例如將該突變基因連接在可穩(wěn)定放大的DNA媒介物上轉(zhuǎn)化宿主菌的方法，或?qū)⒃撏蛔兓驅(qū)肟煞€(wěn)定維持的宿主菌的染色體DNA上等的方法。作為滿足該條件的宿主，例如，可舉出桿菌屬細(xì)菌，大腸菌，霉，酶，放線菌等，使用這些菌株，可以在含有可同化性的碳源，氮源及其它必須營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基接種，用常規(guī)方法培養(yǎng)。
這樣得到的本發(fā)明的堿性蛋白酶，具有耐氧化性，不受高濃度脂肪酸引起的酪蛋白分解活性的阻礙，由SDS-PAGE確認(rèn)的分子量是43,000±2,000，在堿性區(qū)域具有活性的同時(shí)，與親堿性蛋白酶相比，是可以確認(rèn)新獲得了比活性提高和/或洗凈能力提高的性質(zhì)。
因此，本發(fā)明的堿性蛋白酶，作為各種洗滌劑組合物配合用酶有用。
洗凈劑組合物中配合的本發(fā)明品蛋白酶的配合量，只要是堿性蛋白酶表示活性的量就沒(méi)有特別限制，對(duì)每1kg洗凈劑組合物，可以配合O.1～5000PU，但考慮到經(jīng)濟(jì)性等，優(yōu)選500PU以下。
本發(fā)明的洗凈劑組合物，在本發(fā)明品蛋白酶以外，也可以并用各種酶。例如，加水分解酶，氧化酶，還原酶，轉(zhuǎn)移酶，裂解酶，異構(gòu)酶，連接酶，合成酶等。其中，優(yōu)選本發(fā)明以外的蛋白酶，纖維素酶，角蛋白酶，酯酶，角質(zhì)酶，淀粉酶，脂肪酶，支鏈淀粉酶，果膠酶，甘露聚糖酶，糖苷酶，聚糖酶，膽固醇氧化酶，過(guò)氧化物酶，漆酶等，特別優(yōu)選蛋白酶，纖維素酶，淀粉酶，脂肪酶。作為蛋白酶，可以列舉市售的Alcalase，Esperase、Savinase、Everlase、Kannase(注冊(cè)商標(biāo)；Novozymes社生產(chǎn))，Properase，Purafect(注冊(cè)商標(biāo)；Genencor生產(chǎn))，及KAP(花王生產(chǎn))等。作為纖維素酶，可以列舉Celluzyme，Carezyme(注冊(cè)商標(biāo)；Novozyme社生產(chǎn))，另外有KAC，特開(kāi)平10-313859號(hào)公報(bào)記載的桿菌sp KSM-S237株生產(chǎn)的堿性纖維素酶，特開(kāi)2003-313592號(hào)公報(bào)記載的突變堿性纖維素酶(以上均為花王生產(chǎn))等。作為淀粉酶，可以列舉Termamyl，Duramyl，Stainzyme(注冊(cè)商標(biāo)；Novozymes社生產(chǎn))，Purastar(注冊(cè)商標(biāo)；Genencor生產(chǎn))，KAM(花王)等。作為脂肪酶，可以列舉Lipolase、Lipolase Ultra，Lipex(注冊(cè)商標(biāo)；Novozymes社生產(chǎn))等。
洗凈劑組合物中，并用本發(fā)明品蛋白酶以外的蛋白酶時(shí)的配合量，優(yōu)選每1kg洗凈劑組合物0.1～500PU。并用纖維素酶時(shí)，基于特開(kāi)平10-313859號(hào)公報(bào)的〔0020〕段落中記載的酶活性測(cè)定方法決定的單位(KU)，優(yōu)選每1kg洗凈劑組合物300～3000000KU。
另外，并用淀粉酶時(shí)，基于特開(kāi)平11-43690號(hào)公報(bào)的〔0040〕段落中記載的淀粉酶活性測(cè)定方法決定的單位(IU)，優(yōu)選每1kg洗凈劑組合物50～500000IU。
并用脂肪酶時(shí)，基于特表平8-500013號(hào)公報(bào)的實(shí)施例1中記載的脂肪酶活性測(cè)定方法決定的單位(LU)，優(yōu)選每1kg洗凈劑組合物10000～1000000LU。
本發(fā)明的洗凈劑組合物中，可以配合公知的洗凈劑成分，作為該公知的洗凈劑成分，可以列舉例如以下物質(zhì)。
(1)表面活性劑在洗凈劑組合物中，表面活性劑配合0.5～60質(zhì)量％，特別在粉末狀洗凈劑組合物中優(yōu)選配合10～45質(zhì)量％，在液體洗凈劑組合物中優(yōu)選配合20～50質(zhì)量％。另外，本發(fā)明洗凈劑組合物是漂白劑或自動(dòng)洗碗機(jī)用洗凈劑時(shí)，表面活性劑一般是1～10質(zhì)量％，優(yōu)選配合1～5質(zhì)量％。
作為本發(fā)明洗凈劑組合物中可以使用的表面活性劑，可以列舉陰離子型表面活性劑，非離子型表面活性劑，兩性表面活性劑，陽(yáng)離子型表面活性劑的1種或組合，優(yōu)選的是陰離子型表面活性劑，非離子型表面活性劑。
作為陰離子型表面活性劑，優(yōu)選碳原子數(shù)10～18的醇的硫酸酯鹽，碳原子數(shù)8～20的醇的烷氧基化物的硫酸酯鹽，烷基苯磺酸鹽，鏈烷烴磺酸鹽，α-鏈烯烴磺酸鹽，α-磺基脂肪酸鹽，α-磺基脂肪酸烷基酯鹽或脂肪酸鹽。本發(fā)明中特別優(yōu)選烷基鏈的碳原子數(shù)10～14的，更優(yōu)選12～14的直鏈烷基苯磺酸鹽，作為相對(duì)離子，優(yōu)選堿金屬鹽與胺類(lèi)，特別優(yōu)選鈉和/或鉀，一乙醇胺，二乙醇胺。
作為非離子表面活性劑，優(yōu)選聚氧化烯烷基(碳原子數(shù)8～20)醚，烷基多葡糖苷，聚氧化烯烷基(碳原子數(shù)8～20)苯基醚，聚氧化烯山梨糖醇酐脂肪酸(碳原子數(shù)8～22)酯，聚亞氧烷基二醇脂肪酸(碳原子數(shù)8～22)酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物。作為非離子型表面活性劑，特別優(yōu)選碳原子數(shù)10～18的醇上加成4～20摩爾〔HLB值(以Griffin法算出)成為10.5～15.0，優(yōu)選11.0～14.5〕環(huán)氧乙烷與環(huán)氧丙烷等烯化氧的聚氧化烯烷基醚。
(2)二價(jià)金屬離子清除劑(scavenger)二價(jià)金屬離子清除劑以0.01～50質(zhì)量％，優(yōu)選以5～40質(zhì)量％配合。作為在本發(fā)明洗凈劑組合物中可以使用的二價(jià)金屬離子清除劑，可以列舉三聚磷酸鹽，焦磷酸鹽，正磷酸鹽等的縮合磷酸鹽，沸石等的鋁硅酸鹽，合成層狀結(jié)晶性硅酸鹽，氮川三乙酸鹽，乙二胺四乙酸鹽，檸檬酸鹽，異檸檬酸鹽，聚縮醛羧酸鹽等。其中，特別優(yōu)選結(jié)晶性鋁硅酸鹽(合成沸石)，A型，X型，P型沸石中，特別優(yōu)選A型。合成沸石，優(yōu)選使用平均一次粒徑為0.1～10μm的，特別優(yōu)選使用0.1～5μm的。
(3)堿劑堿劑以0.01～80質(zhì)量％，優(yōu)選以1～40質(zhì)量％配合。粉末洗凈劑時(shí)，可以列舉重灰與輕灰總稱為碳酸鈉等的堿金屬碳酸鹽，以及JIS1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)等的非結(jié)晶的堿金屬硅酸鹽。這些無(wú)機(jī)性的堿劑在洗凈劑干燥時(shí)，在粒子骨架的形成中有效果，可以得到比較硬的，流動(dòng)性優(yōu)異的洗凈劑。作為此外的堿，可以列舉倍半碳酸鈉，碳酸氫鈉等，另外，三聚磷酸鹽等的磷酸鹽也可以作為堿劑使用。此外，作為在液體洗凈劑中使用的堿劑，除上述堿劑外，其它的可以使用氫氧化鈉，以及一，二或三乙醇胺，也可以作為活性劑的相對(duì)離子使用。
(4)防止再污染劑防止再污染劑以0.001～10質(zhì)量％，優(yōu)選以1～5質(zhì)量％配合。作為本發(fā)明洗凈劑組合物可以使用的防止再污染劑，可以列舉聚乙二醇，羧酸類(lèi)聚合物，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮等。其中，羧酸類(lèi)聚合物，除防止再污染能力之外，還具有捕捉金屬離子的功能，使固體粒子污垢從衣料分散到洗滌溶液中的作用。羧酸類(lèi)聚合物是丙烯酸，甲基丙烯酸，衣康酸等的均聚物及共聚物，作為共聚物優(yōu)選上述單體與馬來(lái)酸的共聚物，分子量?jī)?yōu)選數(shù)千～10萬(wàn)。除上述羧酸類(lèi)聚合物以外，從具有金屬離子捕捉劑、分散劑以及防止再污染能力方面考慮，優(yōu)選聚縮水甘油酸鹽等的聚合物，羧甲基纖維素等的纖維素衍生物以及聚天冬酰胺酸等的氨基羧酸類(lèi)的聚合物。
(5)漂白劑優(yōu)選配合例如過(guò)氧化氫、過(guò)碳酸鹽等的漂白劑1～10質(zhì)量％。使用漂白劑時(shí)，可以配合0.01～10質(zhì)量％的四乙?；叶?TAED)和特開(kāi)平6-316700號(hào)公報(bào)記載等的漂白活性化劑(活化劑)。
(6)熒光劑作為在本發(fā)明洗凈劑組合物中可以使用的熒光劑，可以列舉苯基型熒光劑(例如Tinopal CBS-X等)和二苯乙烯型熒光劑(例如DM型熒光染料等)。熒光劑優(yōu)選配合0.001～2質(zhì)量％。
(7)其它成分本發(fā)明品洗凈劑組合物中，可以含有衣料用洗凈劑領(lǐng)域公知的增效劑、柔軟劑、還原劑(亞硫酸鹽等)、抑制泡沫用劑(硅氧烷等)，香料，其它的添加劑。
本發(fā)明的洗凈劑組合物，可以組合以上述方法得到的本發(fā)明品蛋白酶及上述公知的洗凈劑成分，根據(jù)常法制造。洗凈劑的形態(tài)可以根據(jù)用途選擇，例如可以制成液體，粉體，顆粒，膏狀，固體等。
這樣得到的本洗凈劑組合物，可以作為衣料洗凈劑、漂白劑、硬質(zhì)表面洗凈用洗凈劑、排水管洗凈劑、假牙洗凈劑、醫(yī)療器具用的殺菌洗凈劑等使用。
實(shí)施例實(shí)施例1從氨基酸序列的排列結(jié)果(圖1)，對(duì)含有直到來(lái)自桿菌spKSM-KP43株的堿性蛋白酶結(jié)構(gòu)基因的終止密碼子的約2.0kb(序列號(hào)2)，導(dǎo)入位點(diǎn)專(zhuān)一的突變氨基酸殘基，特定在63位、101位、133位，以導(dǎo)入任意氨基酸的方式設(shè)計(jì)引物。63位的突變導(dǎo)入中，使用引物1(序列號(hào)3)、引物2(序列號(hào)4)與引物3(序列號(hào)5)、引物4(序列號(hào)6)進(jìn)行PCR；101位的突變導(dǎo)入中，使用引物1與引物5(序列號(hào)7)與引物6(序列號(hào)8)及引物4進(jìn)行PCR；133位的突變導(dǎo)入中，使用引物1、引物7(序列號(hào)9)與引物8(序列號(hào)10)、引物4進(jìn)行PCR。在引物1中，在讀出有義鏈的5’末端一側(cè)附有BamHI接頭，在引物4中，在反義鏈的5’末端一側(cè)附有XbaI接頭，在引物2與引物3、引物5與引物6、引物7與引物8，分別從5’末端以10～15bp的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)成互補(bǔ)狀。作為PCR的DNA聚合酶，使用Pyrobest(TakaRa)，PCR的條件，在94℃，使模型DNA變性2分鐘后，使以94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘為1循環(huán)，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。在PCR productpurification kit(Roche)中精制放大DNA斷片后，分別只以對(duì)應(yīng)的放大斷片，在94℃使DNA變性2分鐘后，使以94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘為1循環(huán)，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，進(jìn)行重組(recombinate)PCR。對(duì)得到的放大斷片，由引物1與引物4進(jìn)行PCR。94℃使模型DNA變性2分鐘后，以94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘為1個(gè)循環(huán)，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，得到導(dǎo)入突變的全長(zhǎng)基因。精制放大斷片后，通過(guò)BamHI、XbaI(Roche)切割在末端附著的限制酶接頭。與預(yù)先以BamHI、XbaI處理放大DNA斷片的質(zhì)粒pHA64(專(zhuān)利第349293號(hào)在啟動(dòng)子64的下流具有BamHI、XbaI切割部位)混合后，由Ligation High(東洋紡)進(jìn)行連接酶反應(yīng)。使用從反應(yīng)液由醇沉淀回收的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌桿菌sp KSM9865株(FERM P-18566)。
使9865株的轉(zhuǎn)化體在含有脫脂乳(skim milk)的堿瓊脂培養(yǎng)基[脫脂乳(Difco)1％(w/v)，細(xì)菌用胰化胨(bactotryptone)(Difco)1％，酶提取物(Difco)0.5％，氯化鈉1％，瓊脂1.5％，碳酸鈉0.05％，四環(huán)素15ppm]中培育，由暈(halo)的形成狀況，判斷有無(wú)導(dǎo)入突變的蛋白酶基因。轉(zhuǎn)化體在5mL的種母培養(yǎng)基[6.0％(w/v)聚蛋白胨S，0.05％酶提取液，1.0％麥芽糖，0.02％硫酸鎂七水合物，0.1％磷酸二氫鉀，0.25％碳酸鈉，30ppm四環(huán)素]中植菌，30℃，進(jìn)行16小時(shí)的搖床培養(yǎng)。接著，在30mL的主培養(yǎng)基[8％聚蛋白胨S，0.3％酶提取液，10％麥芽糖，0.04％硫酸鎂七水合物，0.2％磷酸二氫鉀，1.5％無(wú)水碳酸鈉，30ppm四環(huán)素]中將1％(v/v)種母培養(yǎng)液植菌，30℃，進(jìn)行3日的搖床培養(yǎng)。
離心分離得到的培養(yǎng)液，測(cè)定培養(yǎng)上清液中的蛋白酶活性。蛋白酶活性由以Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(以下，AAPF∑)為基質(zhì)的活性測(cè)定法測(cè)定，蛋白質(zhì)量使用蛋白質(zhì)化驗(yàn)組合(和光純藥)測(cè)定。通過(guò)與以相同條件培養(yǎng)具有野生型酶基因的轉(zhuǎn)化體時(shí)的培養(yǎng)上清的值比較，選出可以確認(rèn)蛋白酶活性提高的突變蛋白酶基因。
使用High pure plasmid isolation kit(Roche)，從選出的轉(zhuǎn)化體中回收質(zhì)粒，確定堿基序列。以質(zhì)粒DNA300ng為模型，使用適當(dāng)合成的引物與Big Dye DNA sequencing kit(Applied Biosystem)，在20μL的反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行PCR，供給使用DNA Sequencer 377型(Applied Biosystem)的解析。
其結(jié)果，蛋白酶活性提高的突變體133位的丙氨酸是谷氨酰胺、天冬酰胺、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸。稀釋該培養(yǎng)液的一部分，以含有2mM氯化鈣的10mM鹽酸緩沖液(pH7.5)增加平衡化的DEAE-Toyopearl(Tosoh Corporation)柱，回收非吸附成分，得到幾乎均勻的蛋白酶。測(cè)定精制酶的蛋白質(zhì)量、AAPF分解活性的結(jié)果，確認(rèn)由于導(dǎo)入上述突變，比活性分別提高1.2倍～2倍(表2)。
表2

氨基酸以數(shù)字1表示，以數(shù)值表示取代氨基酸的部位。數(shù)值前表示取代前的氨基酸，數(shù)值后表示取代后的氨基酸。例如，A133Q，表示133位的丙氨酸取代為谷氨酰胺的突變體。以下，表3以及圖2-1～2-6中表示相同的含義。
接著，為了提供133位的突變的多樣性導(dǎo)入以下的突變(1)在133位與134位之間插入任意的1個(gè)氨基酸；(2)將133位取代為任意的氨基酸，再插入任意的1個(gè)氨基酸；(3)將133位取代為任意的氨基酸，再插入任意的1個(gè)氨基酸，將134位取代為任意的氨基酸；(4)將133位取代為任意的氨基酸，再插入任意的1個(gè)氨基酸，將134位與135位取代為任意的氨基酸；(5)將132位取代為任意的氨基酸，在133位與134位之間再插入任意的1個(gè)氨基酸；(6)將132位與133位取代為任意的氨基酸，再插入任意的1個(gè)氨基酸；在(1)的突變導(dǎo)入中使用引物1、引物7與引物9(序列號(hào)11)、引物4；在(2)的突變導(dǎo)入中使用引物1、引物7與引物10(序列號(hào)12)、引物4；在(3)的突變導(dǎo)入中使用引物1、引物7與引物11(序列號(hào)13)、引物4；在(4)的突變導(dǎo)入中使用引物1、引物7與引物12(序列號(hào)14)、引物4；在(5)的突變導(dǎo)入中使用引物1、引物13(序列號(hào)15)及引物14(序列號(hào)16)、引物4；在(6)的突變導(dǎo)入中引物1、引物7及引物15(序列號(hào)17)、引物4，通過(guò)上述那樣的重組PCR，得到突變導(dǎo)入組成的基因。結(jié)合上述pHA64后，通過(guò)轉(zhuǎn)化9865株，進(jìn)行培養(yǎng)并由此進(jìn)行突變體的評(píng)價(jià)。
其結(jié)果，確認(rèn)在以下的突變體中超過(guò)野生型的蛋白酶活性的提高。
從(1)的突變導(dǎo)入，133位與134位之間的插入氨基酸殘基賴氨酸、酪氨酸；從(2)的突變導(dǎo)入，133位+插入氨基酸殘基脯氨酸+異亮氨酸、亮氨酸+絲氨酸、亮氨酸+甘氨酸、亮氨酸+蘇氨酸、絲氨酸+絲氨酸、賴氨酸+絲氨酸、異亮氨酸+絲氨酸、精氨酸+絲氨酸、賴氨酸+丙氨酸、賴氨酸+甘氨酸；
從(3)的突變導(dǎo)入，133位+插入氨基酸殘基/134位絲氨酸+絲氨酸/蘇氨酸、絲氨酸+絲氨酸/絲氨酸、絲氨酸+絲氨酸/甘氨酸、絲氨酸+絲氨酸/丙氨酸；從(4)的突變導(dǎo)入，133位+插入氨基酸殘基/134位/135位絲氨酸+絲氨酸/絲氨酸/丙氨酸、絲氨酸+絲氨酸/絲氨酸/精氨酸、絲氨酸+絲氨酸/絲氨酸/蛋氨酸；從(5)的突變導(dǎo)入，132位/133位與134位之間插入氨基酸殘基絲氨酸/丙氨酸、絲氨酸/甘氨酸、蛋氨酸/丙氨酸、蘇氨酸/丙氨酸；從(6)的突變導(dǎo)入，132位/133位+插入氨基酸殘基絲氨酸/絲氨酸+絲氨酸、谷氨酰胺/絲氨酸+絲氨酸、蛋氨酸/絲氨酸+絲氨酸、絲氨酸/異亮氨酸+丙氨酸、絲氨酸/賴氨酸+丙氨酸、絲氨酸/賴氨酸+絲氨酸、天冬酰胺/脯氨酸+丙氨酸、天冬酰胺酸/賴氨酸+絲氨酸、異亮氨酸/賴氨酸+絲氨酸。
在上述的方法中，求得比活性的結(jié)果，確認(rèn)在這些突變體中，提高野生型的1.2倍～4.8倍的比活性(表3)。
表3

以+表示133位與134位之間插入的氨基酸。例如，A133P+I時(shí)，表示將133位取代為脯氨酸，再插入異亮氨酸的突變體，+K時(shí)，表示133位與134位之間有插入賴氨酸的突變體。在圖2-1～2-6表示同樣的含義。
評(píng)價(jià)突變體洗凈能力的結(jié)果，確認(rèn)例如在以下的突變體中有超過(guò)野生型的洗凈性能(圖2-1～2-6)。
(1)132位異亮氨酸、纈氨酸；
(2)133位與134位之間插入氨基酸殘基賴氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、精氨酸；(3)133位+插入氨基酸殘基絲氨酸+絲氨酸、絲氨酸+丙氨酸、絲氨酸+天冬酰胺、絲氨酸+谷氨酰胺、絲氨酸+色氨酸、絲氨酸+組氨酸、絲氨酸+甘氨酸、亮氨酸+絲氨酸、賴氨酸+絲氨酸、蘇氨酸+絲氨酸、異亮氨酸+絲氨酸、蛋氨酸+絲氨酸、甘氨酸+絲氨酸、精氨酸+絲氨酸、谷氨酸+絲氨酸、天冬酰胺+絲氨酸、苯基丙氨酸+絲氨酸、色氨酸+絲氨酸、賴氨酸+丙氨酸、精氨酸+丙氨酸、賴氨酸+甘氨酸；(4)133位+插入氨基酸殘基/134位絲氨酸+絲氨酸/絲氨酸、絲氨酸+絲氨酸/蘇氨酸；(5)133位+插入氨基酸殘基/134位/135位絲氨酸+絲氨酸/絲氨酸/蛋氨酸；(6)132位/133位與134位之間插入的氨基酸殘基絲氨酸/丙氨酸、絲氨酸/精氨酸、絲氨酸/甘氨酸、絲氨酸/亮氨酸、蘇氨酸/丙氨酸；(7)132位/133位+插入氨基酸殘基絲氨酸/組氨酸+丙氨酸、絲氨酸/絲氨酸+丙氨酸、絲氨酸/亮氨酸+丙氨酸、絲氨酸/精氨酸+丙氨酸、絲氨酸/賴氨酸+丙氨酸、絲氨酸/賴氨酸+絲氨酸、天冬酰胺/異亮氨酸+丙氨酸、天冬酰胺/脯氨酸+丙氨酸、天冬酰胺酸/賴氨酸+絲氨酸。
另外，測(cè)定在2mM氯化鈣水溶液中，75℃，熱處理10分鐘后的AAPF的分解活性，算出以未處理的酶樣品作為100％時(shí)的殘存活性，研究其耐熱性。其結(jié)果，相對(duì)于野生型的殘存活性50％，133位+插入氨基酸殘基的組合絲氨酸+絲氨酸的突變體是76％，可以確認(rèn)有約1.5倍的殘存活性的提高。
上述本發(fā)明堿性蛋白酶突變體使相對(duì)AAPF的分解活性提高，洗凈能力提高(133位+插入氨基酸殘基的組合為絲氨酸+絲氨酸的突變體，使耐熱性進(jìn)一步提高)以外，親堿性蛋白酶的特性，即，具有耐氧化性，由高濃度脂肪酸引起的酪蛋白分解活性不受阻礙，由SDS-PAGE確認(rèn)的分子量為43,000±2,000，確認(rèn)在堿性區(qū)域，保持著具有活性的性質(zhì)。
試驗(yàn)例1蛋白酶活性測(cè)定法(合成基質(zhì)法)加入100mM AAPF(溶解在DMSO中最終濃度3mM)、0.2M硼酸緩沖液(pH10.5，最終濃度50mM)及50μL適當(dāng)稀釋的培養(yǎng)上清液，配制到100μL后，一邊微量培養(yǎng)板(microplate)(iEMS Reader MF；Labsystems社制)，30℃搖床15分鐘，一邊定時(shí)地測(cè)定414nm的吸光度，求出每單位時(shí)間的吸光度的變化(OD414/min)。得到的斜率乘以酶的稀釋率的值作為蛋白酶的效價(jià)，進(jìn)行突變體的相對(duì)評(píng)價(jià)。
試驗(yàn)例2蛋白酶活性測(cè)定法(酪蛋白法)30℃，5分鐘恒溫1mL含有1％(w/v)酪蛋白(Hammerstein法Merck)的50mM硼酸緩沖液(pH10.5)后，添加0.1mL的酶液，開(kāi)始反應(yīng)。反應(yīng)15分鐘后，加入2mL的反應(yīng)停止液(0.11M三氯乙酸/0.22M乙酸鈉/0.33M乙酸)。在室溫放置30分鐘，用Whatman.No1濾紙過(guò)濾沉淀物。分解產(chǎn)物由Lowry等的方法定量。即，在0.5mL的濾液中加入2.5mL的堿性銅溶液(1％羅謝爾鹽∶1％硫酸銅五水合物∶2％碳酸鈉/0.1N氫氧化鈉溶液＝1∶1∶100)，30℃恒溫10分鐘后，添加0.25mL的苯酚試劑[在去離子水中將市售的苯酚試劑(關(guān)東化學(xué))稀釋為2倍的溶液]，充分?jǐn)嚢瑁?0℃放置30分鐘。此后，測(cè)定在660nm的吸光度。1單位(1PU)蛋白酶，為在上述反應(yīng)條件下，1分鐘內(nèi)生成相當(dāng)于1mmol酪氨酸的酸可溶性蛋白質(zhì)所必須的酶量。
試驗(yàn)例3相對(duì)洗凈率突變酶的洗凈能力評(píng)價(jià)，使用Terg-O-Tometer(上島制作所生產(chǎn))進(jìn)行。在將從市售的洗衣用洗凈劑(Attack花王，2002年10月制造)除去所配合的酶顆粒后配制為規(guī)定的使用濃度的溶液中，添加酶使其最終濃度40mPU/L。接著，添加將污染布EMPA117(EMPA社生產(chǎn)，血液/乳劑/碳)剪裁為6×6cm的布?jí)K，特別是在20℃進(jìn)行不間斷的洗凈(80rpm)。通過(guò)自來(lái)水漂洗后，用色彩色差計(jì)(MINOLTA，CM3500d)測(cè)定亮度，從洗凈前后的亮度變化，計(jì)算洗凈率(下式)。
洗凈率(％)＝(L2-L1)/(L0-L1)×100L0污染布的原來(lái)布的亮度L1洗凈前的污染布的亮度L2洗凈后的污染布的亮度相對(duì)洗凈率是將野生型酶的洗凈率作為100時(shí)突變體的洗凈率。
序列表<110>花王株式會(huì)社<120>堿性蛋白酶<130>CGJPL51184<150>日本2004-297023<151>2004-10-08<160>17<170>Patentln Ver.3.1<210>1<211>434<212>PRT<213>桿菌sp.KSM-KP43<400>1Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser1 5 10 15Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly20 25 30Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly35 40 45Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp50 55 60Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly65 70 75 80Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser85 90 95Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln100 105 110Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn115 120 125Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn130 135 140Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala145 150 155 160Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala165 170 175Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe
180 185 190Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg195 200 205Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly210 215 220Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe225 230 235 240Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met245 250 255Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe260 265 270Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala275 280 285Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn290 295 300Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr305 310 315 320Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser325 330 335Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser340 345 350Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu355 360 365Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp370 375 380Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu385 390 395 400Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val405 410 415Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile420 425 430Val Asn<210>2<211>1923<212>DNA<213>桿菌sp.KSM-KP43<220>
<221>CDS<222>(1)..(1920)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(618)<223>
<220>
<221>mat_peptide<222>(619)..()<223>
<400>2atg aga aag aag aaa aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca 45Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala-205-200-195gcg att ttg tcg act gtt gcg tta agt aat cca tct gca ggt ggt 90Ala Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly-190-185-180gca agg aat ttt gat ctg gat ttc aaa gga att cag aca aca act 135Ala Arg Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr-175-170-165gat gct aaa ggt ttc tcc aag cag ggg cag act ggt gct gct gct 180Asp Ala Lys Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala-160-155-150ttt ctg gtg gaa tct gaa aat gtg aaa ctc cca aaa ggt ttg cag 225Phe Leu Val Glu Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln-145-140-135aag aag ctt gaa aca gtc ccg gca aat aat aaa ctc cat att atc 270Lys Lys Leu Glu Thr Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile-130-125-120caa ttc aat gga cca att tta gaa gaa aca aaa cag cag ctg gaa 315Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu-115-110-105aaa aca ggg gca aag att ctc gac tac ata cct gat tat gct tac att 363Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile-100-95 -90gtc gag tat gag ggc gat gtt aag tca gca aca agc acc att gag cac 411
Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His-85 -80 -75 -70gtg gaa tcc gtg gag cct tat ttg ccg ata tac aga ata gat ccc cag 459Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu Pro Ile Tyr Arg lle Asp Pro Gln-65 -60 -55ctt ttc aca aaa ggg gca tca gag ctt gta aaa gca gtg gcg ctt gat 507Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp-50 -45 -40aca aag cag aaa aat aaa gag gtg caa tta aga ggc atc gaa caa atc 555Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile-35 -30 -25gca caa ttc gca ata agc aat gat gtg cta tat att acg gca aag cct 603Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro-20 -15 -10gag tat aag gtg atg aat gat gtt gcg cgt gga att gtc aaa gcg gat 651Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp-5 -1 1 5 10gtg gct cag agc agc tac ggg ttg tat gga caa gga cag atc gta gcg 699Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala15 20 25gtt gcc gat aca ggg ctt gat aca ggt cgc aat gac agt tcg atg cat 747Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His30 35 40gaa gcc ttc cgc ggg aaa att act gca tta tat gca ttg gga cgg acg 795Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr45 50 55aat aat gcc aat gat acg aat ggt cat ggt acg cat gtg gct ggc tcc 843Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser60 65 70 75gta tta gga aac ggc tcc act aat aaa gga atg gcg cct cag gcg aat 891Val Leu Gly Asn Gly Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn80 85 90cta gtc ttc caa tct atc atg gat agc ggt ggg gga ctt gga gga cta 939
Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu95 100 105cct tcg aat ctg caa acc tta ttc agc caa gca tac agt gct ggt gcc 987Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala110 115 120aga att cat aca aac tcc tgg gga gca gca gtg aat ggg gct tac aca1035Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr125 130 135aca gat tcc aga aat gtg gat gac tat gtg cgc aaa aat gat atg acg1083Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr140 145 150 155atc ctt ttc gct gcc ggg aat gaa gga ccg aac ggc gga acc atc agt1131Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser160 165 170gca cca ggc aca gct aaa aat gca ata aca gtc gga gct acg gaa aac1179Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn175 180 185ctc cgc cca agc ttt ggg tct tat gcg gac aat atc aac cat gtg gca1227Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala190 195 200cag ttc tct tca cgt gga ccg aca aag gat gga cgg atc aaa ccg gat1275Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp205 210 215gtc atg gca ccg gga acg ttc ata cta tca gca aga tct tct ctt gca1323Val Met Ala Pro Gly Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala220 225 230 235ccg gat tcc tcc ttc tgg gcg aac cat gac agt aaa tat gca tac atg1371Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met240 245 250ggt gga acg tcc atg gct aca ccg atc gtt gct gga aac gtg gca cag1419Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln255 260 265ctt cgt gag cat ttt gtg aaa aac aga ggc atc aca cca aag cct tct1467
Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser270 275 280cta tta aaa gcg gca ctg att gcc ggt gca gct gac atc ggc ctt ggc1515Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly285 290 295tac ccg aac ggt aac caa gga tgg gga cga gtg aca ttg gat aaa tcc1563Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser300 305 310 315ctg aac gtt gcc tat gtg aac gag tcc agt tct cta tcc acc agc caa1611Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln320 325 330aaa gcg acg tac tcg ttt act gct act gcc ggc aag cct ttg aaa atc1659Lys Ala Thr Tyr Ser Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile335 340 345tcc ctg gta tgg tct gat gcc cct gcg agc aca act gct tcc gta acg1707Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr350 355 360ctt gtc aat gat ctg gac ctt gtc att acc gct cca aat ggc aca cag1755Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln365 370 375tat gta gga aat gac ttt act tcg cca tac aat gat aac tgg gat ggc1803Tyr Val Gly Asn Asp Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly380 385 390 395cgc aat aac gta gaa aat gta ttt att aat gca cca caa agc ggg acg1851Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr400 405 410tat aca att gag gta cag gct tat aac gta ccg gtt gga cca cag acc1899Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr415 420 425ttc tcg ttg gca att gtg aat taa1923Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn430
<210>3<211>47<212>DNA<213>人造序列<220>
<222>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>3aaatggatcc gtgaggaggg aaccgaatga gaaagaagaa aaaggtg 47<210>4<211>21<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR反義引物<400>4attattcgtc cgtcccaatg c 21<210>5<211>34<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>5ggacgaataa tgccnnngat ccgaatggtc atgg 34<210>6<211>36<212>DNA
<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR反義引物<400>6atattctaga cgattaccat attaattcct ctaccc 36<210>7<211>21<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR反義引物<400>7ctatccatga tagattggaa g 21<210>8<211>38<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>8tctatcatgg atagcnnngg gggacttgga ggactacc 38<210>9<211>20<212>DNA<213>人造序列
<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR反義引物<400>9gctccccagg agtttgtatg 20<210>10<211>37<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>10caaactcctg gggagcannn gtgaatgggg cttacac 37<210>11<211>40<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>11caaactcctg gggagcagca nnngtgaatg gggcttacac 40<210>12<211>40<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>12caaactcctg gggagcannn nnngtgaatg gggcttacac 40<210>13<211>40<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>13caaactcctg gggagcannn nnnnnnaatg gggcttacac 40<210>14<211>43<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>14caaactcctg gggagcannn nnnnnnnnng gggcttacac aac 43<210>15<211>23<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR反義引物
<400>15tccccaggag tttgtatgaa ttc 23<210>16<211>40<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>16caaactcctg gggannngca nnngtgaatg gggcttacac 40<210>17<211>40<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>低聚核苷酸作為從桿菌sp.KSM-KP43堿性蛋白酶基因的核苷序列設(shè)計(jì)的PCR正義引物<400>17caaactcctg gggannnnnn nnngtgaatg gggcttacac 40
權(quán)利要求
1.一種堿性蛋白酶，具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶或功能上與其等效的堿性蛋白酶，其特征在于，由取代和/或插入選自下述(a)～(e)的一種以上的氨基酸殘基組成，并且與具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶相比具有更高的比活性和/或洗凈性(a)將133位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基；(b)在133位與134位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基之間插入其它氨基酸殘基；(c)將插入前的134位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基；(d)將插入前的135位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基；(e)將132位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的堿性蛋白酶，其特征在于，氨基酸殘基的取代和/或插入如下述1)～5)所示1)(a)表示的氨基酸殘基的取代和(b)表示的氨基酸殘基的插入的組合；2)(a)表示的氨基酸殘基的取代、(b)表示的氨基酸殘基的插入和(c)表示的氨基酸殘基的取代的組合；3)(a)表示的氨基酸殘基的取代、(b)表示的氨基酸殘基的插入、(c)表示的氨基酸殘基的取代和(d)表示的氨基酸殘基的取代的組合；4)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合；5)(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合。
3.如權(quán)利要求1所述的堿性蛋白酶，其特征在于，氨基酸殘基的取代和/或插入如下述6)～16)所示6)(a)表示的氨基酸殘基的取代，其它的氨基酸殘基是賴氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸；7)(b)表示的氨基酸殘基的插入，其它的氨基酸殘基是賴氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或精氨酸；8)(a)表示的氨基酸殘基的取代與(b)表示的氨基酸殘基的插入的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)脯氨酸/(b)異亮氨酸、(a)亮氨酸/(b)絲氨酸、(a)亮氨酸/(b)甘氨酸、(a)亮氨酸/(b)蘇氨酸、(a)絲氨酸/(b)丙氨酸、(a)絲氨酸/(b)天冬酰胺、(a)絲氨酸/(b)谷氨酰胺、(a)絲氨酸/(b)色氨酸、(a)絲氨酸/(b)組氨酸、(a)絲氨酸/(b)甘氨酸、(a)賴氨酸/(b)絲氨酸、(a)蘇氨酸/(b)絲氨酸、(a)異亮氨酸/(b)絲氨酸、(a)蛋氨酸/(b)絲氨酸、(a)甘氨酸/(b)絲氨酸、(a)精氨酸/(b)絲氨酸、(a)谷氨酸/(b)絲氨酸、(a)天冬酰胺/(b)絲氨酸、(a)苯基丙氨酸/(b)絲氨酸、(a)色氨酸/(b)絲氨酸、(a)賴氨酸/(b)丙氨酸、(a)精氨酸/(b)丙氨酸、(a)賴氨酸/(b)甘氨酸或(a)絲氨酸/(b)絲氨酸；9)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入和(c)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(c)蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸或丙氨酸；10)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入，(c)表示的氨基酸殘基的取代和(d)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(c)絲氨酸/(d)丙氨酸、(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(c)絲氨酸/(d)精氨酸或(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(c)絲氨酸/(d)蛋氨酸；11)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(e)絲氨酸、(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(e)谷氨酰胺或(a)絲氨酸/(b)絲氨酸/(e)蛋氨酸；12)(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(b)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或亮氨酸/(e)絲氨酸；13)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)異亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)組氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)絲氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)精氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)賴氨酸/(b)丙氨酸/(e)絲氨酸、(a)賴氨酸/(b)絲氨酸/(e)絲氨酸；14)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)異亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)天冬酰胺或(a)脯氨酸/(b)丙氨酸/(e)天冬酰胺；15)(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(b)丙氨酸/(e)蛋氨酸或蘇氨酸；16)(a)表示的氨基酸殘基的取代，(b)表示的氨基酸殘基的插入和(e)表示的氨基酸殘基的取代的組合，被取代及插入的其它氨基酸殘基分別是(a)賴氨酸/(b)絲氨酸/(e)天冬酰胺或異亮氨酸。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的堿性蛋白酶，其特征在于，具有與序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶功能等價(jià)的堿性蛋白酶，由序列號(hào)1中132位、133位、134位或135位或與這些位置相當(dāng)位置以外的氨基酸殘基1個(gè)～幾個(gè)缺失、取代或加合的氨基酸序列組成。
5.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的堿性蛋白酶，其特征在于，具有與序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶功能等價(jià)的堿性蛋白酶，具有與序列號(hào)1表示的氨基酸序列80％以上的同源性。
6.一種編碼權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的堿性蛋白酶的基因。
7.一種含有權(quán)利要求6所述的基因的重組載體。
8.一種導(dǎo)入權(quán)利要求7所述的載體的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主是微生物。
9.一種含有權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的堿性蛋白酶的洗凈劑組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供可同時(shí)具有高洗凈性與高生產(chǎn)率的堿性蛋白酶。在具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶或功能上與其等價(jià)的堿性蛋白酶中，通過(guò)取代和/或插入選自下述(a)～(e)的1種以上的氨基酸殘基構(gòu)成，且與具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿性蛋白酶相比具有更高的比活性與洗凈性。(a)將133位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它的氨基酸殘基，(b)在133位與134位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基之間插入其它的氨基酸殘基，(c)將插入前的134位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它的氨基酸殘基，(d)將插入前的135位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它的氨基酸殘基，(e)將132位或與其相當(dāng)位置的氨基酸殘基取代為其它的氨基酸殘基。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1757721SQ200510108240
公開(kāi)日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2005年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月8日
發(fā)明者奧田光美, 佐藤剛, 瀧村靖, 住友伸行, 小林徹 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社