專(zhuān)利名稱(chēng)：聚3－羥基丁酸羥基己酸酯的一種新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚3-羥基丁酸羥基己酸酯的一種新用途。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯(PHA)是很多細(xì)菌在特定條件下合成的一種細(xì)菌胞內(nèi)高分子聚酯(Chen GQ，Wu Q，Zhao K，Yu HP&Chan A.Chinese J of Polymer Science 18(2000)389-396)，是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌的生物能量來(lái)源之一，具有非常優(yōu)良的性質(zhì)，其生物可降解性、生物可相容性等特性已引起了學(xué)術(shù)界，特別是生物醫(yī)學(xué)界的濃厚興趣(Deng Y，Zhao K，Zhang XF，Hu P，Chen GQ.Biomaterials 23(20)(2002)4049-4056；Zheng Z，Deng Y，Lin XS，Zhang LX，Chen GQ.J Biomater Sci.PolymerEdn 14(2003)615-624)。其在藥物緩釋材料、可植入人體生物材料等高附加值方面的應(yīng)用開(kāi)發(fā)正在全球范圍內(nèi)展開(kāi)，在人工器官，整形外科，創(chuàng)傷愈合上的應(yīng)用前景尤其廣闊(王常勇，袁曉輝，劉爽.中華外科雜志38(2000)269-271；Rivard CH，Chaput C，Rhalmis.Ann Chir 50(1996)651-658；顏曉慧，洪華容.北京生物醫(yī)學(xué)工程19(2000)123-128；Knowles JC.J Med Engin Technol 17(1993)128-137)。
PHA具有以下的基本結(jié)構(gòu)(Williams SF，Martin DP，Horowitz DM，et al.Int.J.Biol.Macromol.，1999，25111-121)-[CHR-(CH2)m-COO]n-m通常為1，當(dāng)R為甲基時(shí)，PHA單體為羥基丁酸(HB)；R為乙基時(shí)為羥基戊酸(HV)；R為丙基時(shí)為羥基己酸(HH)；R為戊基時(shí)為羥基辛酸(HO)；R也可為飽和或不飽和，直鏈或含側(cè)鏈及官能團(tuán)的不同鏈長(zhǎng)的烷基。少數(shù)情況下，m可為2或3。
3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚物(3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯，聚3-羥基丁酸羥基己酸酯，PHBHHx)是PHA中的一種。PHBHHx具有良好的機(jī)械性能，是一種理想的可降解的“塑料”(Lageveen RG，Huisman GW，Preusting H，et al.Appl.Environ.Microbiol.，1988，542924-2932)。前期研究工作中發(fā)現(xiàn)，聚羥基丁酸羥基己酸PHBHHx以及PHB/PHBHHx共混物對(duì)細(xì)胞具有良好的親和性，具有作為組織工程材料的應(yīng)用潛力(Deng Y，Lin XS，Zheng Z，Deng JG，Chen JC，Ma H，ChenGQ.Biomaterials 24(2003)4273-4281；Wang YW，Chen GQ，Wu Q.Biomaterials24(2003)4621-4629)。并且發(fā)現(xiàn)，PHBHHx對(duì)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等具有比PHB和聚乳酸PLA有更好的生物相容性(Yang XS，Zhao K，ChenGQ.Biomaterials 23(5)(2002)1391-1397；Zheng Z，Deng Y，Lin XS，Zhang LX，Chen GQ.J Biomater Sci.Polymer Edn 14(2003)615-624)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)的一種新用途。
本發(fā)明所提供的聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)的新用途是其在促進(jìn)動(dòng)物組織細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
所述的聚3-羥基丁酸羥基己酸酯是由下述結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元，以55-955-45的摩爾比組成的重均分子量為50,000到1,200,000的線型無(wú)規(guī)共聚物； 所述聚3-羥基丁酸羥基己酸酯可以是單一立體結(jié)構(gòu)的化合物，如R型，或S型，也可以是內(nèi)消旋化合物，還可為外消旋結(jié)構(gòu)的化合物，其中，優(yōu)選為R型，即聚(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯。
所述聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒直徑為5nm-180μm，如5nm、10nm、65nm、500nm、5μm、75μm或180μm等。
所述聚3-羥基丁酸羥基己酸酯的使用濃度為0.001-0.1g/L培養(yǎng)基，優(yōu)選為0.01g/L或0.02g/L培養(yǎng)基。
所述的組織細(xì)胞選自下述細(xì)胞中的任意一種成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞和腎細(xì)胞。
所述的組織細(xì)胞可為體外培養(yǎng)細(xì)胞、組織或器官中所用的細(xì)胞。
所述組織或器官包括成纖維組織、腺體、肺、卵巢、神經(jīng)、骨組織、腦組織、血管、肝和腎。
在促進(jìn)動(dòng)物組織細(xì)胞生長(zhǎng)的應(yīng)用中，聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)可單獨(dú)使用，也可與輔料制成組合物。
上述聚3-羥基丁酸羥基己酸酯的顆粒粒徑范圍為5nm-180μm，顆粒懸濁液可以通過(guò)聚3-羥基丁酸羥基己酸酯有機(jī)溶液與水混合后揮發(fā)去除有機(jī)溶劑的方法來(lái)獲得?？捎脛?dòng)態(tài)光散射方法(R.H.Marchessault，F(xiàn).G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142.)檢測(cè)聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的粒徑。
實(shí)驗(yàn)證明，添加了本發(fā)明的聚3-羥基丁酸羥基己酸酯后，細(xì)胞的生長(zhǎng)量明顯增加。聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒在一定范圍內(nèi)隨著濃度的升高，細(xì)胞的生長(zhǎng)量也在提高，但過(guò)高的濃度并不能使細(xì)胞的生長(zhǎng)量持續(xù)增加，而且具有成本低的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞工程和組織工程以及真核細(xì)胞和組織器官的體外培養(yǎng)。


圖1a為粒徑為180μm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液不同濃度對(duì)纖維細(xì)胞L929生長(zhǎng)的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖1b為粒徑為75μm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液不同濃度對(duì)纖維細(xì)胞L929生長(zhǎng)的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖1c為粒徑為5μm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液不同濃度對(duì)纖維細(xì)胞L929生長(zhǎng)的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖2a為粒徑為500nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液不同濃度對(duì)纖維細(xì)胞L929生長(zhǎng)的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖2b為粒徑為65nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液不同濃度對(duì)纖維細(xì)胞L929生長(zhǎng)的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖2c粒徑為10nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液不同濃度對(duì)纖維細(xì)胞L929生長(zhǎng)的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖3a為結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為95∶5的PHBHHx顆粒不同濃度下對(duì)L929細(xì)胞增殖影響的柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異**p＜0.01)。
圖3b為結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為55∶45的PHBHHx顆粒不同濃度下對(duì)L929細(xì)胞增殖影響的柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異**p＜0.01)。
圖4為不同分子量聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液對(duì)L929細(xì)胞生長(zhǎng)的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異**p＜0.01)。
圖5a為不同濃度的75μm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液對(duì)肝細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖5b為不同濃度的65nm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液對(duì)肝細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖6a為不同濃度的75μm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液對(duì)乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05)。
圖6b為不同濃度的65nm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液對(duì)乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖7a為不同濃度的75μm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖7b為不同濃度的65nm聚-(R)3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響柱狀圖(x±S.D.(n＝8)，顯著性差異*p＜0.05)。
圖8為流式細(xì)胞法檢測(cè)不同濃度的75μm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液對(duì)成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞周期變化的影響柱狀圖。
圖9為流式細(xì)胞法檢測(cè)不同濃度的75μm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞系PC12細(xì)胞周期變化的影響柱狀圖。
具體實(shí)施例方式
下面將參考附圖詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是意圖舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。
下述實(shí)施例中所述的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、不同粒徑的聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖的影響一、不同粒徑聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒懸濁液的制備聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的制備方法參見(jiàn)(R.H.Marchessault，F(xiàn).G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142.)該步驟中所用的PHBHHx是聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(重均分子量為500,000；結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為88∶12；購(gòu)自汕頭聯(lián)億公司)。
將0.4g上述PHBHHx溶于400ml丙酮(分析純)，60℃水浴回流加熱20min，加入100ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，劇烈攪拌混勻。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將丙酮除去，形成穩(wěn)定的濃度為4g/L的PHBHHx懸濁液，90℃高溫蒸汽滅菌40min。經(jīng)過(guò)動(dòng)態(tài)光散射分析表明顆粒平均粒徑(直徑)為180μm，其中動(dòng)態(tài)光散射分析按照文獻(xiàn)(R.H.Marchessault，F(xiàn).G.Morin，S.Wonget al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142)描述的方法進(jìn)行。
將0.4g PHBHHx溶于400ml丙酮(分析純)，60℃水浴回流加熱20min，在功率為30W超聲中緩慢加入100ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，超聲20min混勻。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將丙酮除去，形成穩(wěn)定的濃度為4g/L的PHBHHx懸濁液，90℃高溫蒸汽滅菌40min。動(dòng)態(tài)光散射分析表明顆粒平均平均粒徑(直徑)為75μm，其中動(dòng)態(tài)光散射分析按照文獻(xiàn)(R.H.Marchessault，F(xiàn).G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142)描述的方法進(jìn)行。
將0.4g PHBHHx溶于400ml丙酮(分析純)，60℃水浴回流加熱20min，在300W超聲中緩慢加入100ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，超聲20min混勻。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將丙酮除去，形成穩(wěn)定的濃度為4g/L的PHBHHx懸濁液，90℃高溫蒸汽滅菌40min。動(dòng)態(tài)光散射分析表明顆粒平均粒徑為5μm。
將2mg PHBHHx溶于40ml氯仿(分析純)，60℃水浴回流加熱20min。在超聲中將PHBHHx氯仿溶液緩慢滴加到800ml含5mM溴化十六烷三甲基銨(CTAB)的PBS溶液中，600W超聲混勻30min后靜止10min后，再600W超聲混勻30min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，得到濃度為0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx懸濁液，1.5×104g離心10min，倒掉上清，去離子水洗滌2次除去CTAB，沉淀重懸于去離子水中，90℃高溫蒸汽滅菌40min。動(dòng)態(tài)光散射分析測(cè)得顆粒平均粒徑為10nm。
2mg PHBHHx溶于40ml氯仿(分析純)，60℃水浴回流加熱20min。在超聲中將PHBHHx氯仿溶液緩慢滴加到800ml含5mM CTAB的PBS溶液中，600W超聲混勻30min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx懸濁液，1.5×104g離心10min，倒掉上清，去離子水洗滌2次除去CTAB，沉淀重懸于去離子水中，90℃高溫蒸汽滅菌40min。動(dòng)態(tài)光散射分析測(cè)得顆粒平均粒徑為65nm。
2mg PHBHHx溶于40ml氯仿(分析純)，60℃水浴回流加熱20min。在超聲中將PHBHHx氯仿溶液緩慢滴加到800ml含5mM CTAB的PBS溶液中，500W超聲混勻10min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx懸濁液，1.5×104g離心10min，倒掉上清，去離子水洗滌2次除去CTAB，沉淀重懸于去離子水中，90℃高溫蒸汽滅菌40min。動(dòng)態(tài)光散射分析測(cè)得顆粒平均粒徑為500nm。
逐級(jí)稀釋法將以上PHBHHx顆粒懸濁液配制成0.5，1，2，4g/L PHBHHx母液，4℃保存。
二、不同微米級(jí)粒徑聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)微米顆粒對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖的影響粒徑分別為5、75、180μm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為88∶12)顆粒制備如步驟一。
細(xì)胞系成纖維細(xì)胞L929(購(gòu)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)。
DMEM血清培養(yǎng)基DMEM(GIBC0)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHC03，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10％胎牛血清(購(gòu)自武漢三利)。
DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHC03，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素。
DMEM消化液DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，0.2％胰蛋白酶。
沖洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素。
MTT染液5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)。
裂解液DMSO粒徑為5、75、180μm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒的添加濃度為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培養(yǎng)條件37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱。
成纖維細(xì)胞L929(購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)用DMEM血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，將細(xì)胞消化，然后以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種48孔板，同時(shí)添加PHBHHx顆粒，培養(yǎng)72h后測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)量。
用MTT法(李明，邢飛躍，李巖，實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005(2)，1616-14)測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)量1)染色細(xì)胞在48孔板中培養(yǎng)72h后，取出樣品，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0.25ml無(wú)菌的PBS(PH＝7.4)蕩洗3次。再加入0.05ml MTT染液和0.5ml不含血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中保存4h。
2)吸去上清，加入0.5ml DMSO，室溫下放置30min，使顏色顆粒充分溶解。
3)取0.2ml待測(cè)液加入到96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀550nm下測(cè)定吸光度值。
結(jié)果如圖1a，1b，1c所示，表明在添加了粒徑為180、75或5μm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯的作用組中，均產(chǎn)生了一定的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用，最佳添加濃度為0.02g/L，細(xì)胞培養(yǎng)72h后，對(duì)照組吸光度值分別為0.75、0.79、0.79，PHBHHx(0.02g/L)作用組吸光度值分別升高到1.09、1.16、1.07。
三、不同納米級(jí)粒徑聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)納米級(jí)顆粒對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖的影響粒徑為10nm、65nm、500nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為88∶12)顆粒制備見(jiàn)步驟一。
細(xì)胞系成纖維細(xì)胞L929。
粒徑為500nm、65nm、10nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒的添加濃度分別為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。
成纖維細(xì)胞L929(購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)用DMEM血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，將細(xì)胞消化，然后以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種48孔板，同時(shí)添加PHBHHx顆粒，培養(yǎng)72h后測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)量。
培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)條件、MTT測(cè)定方法同步驟二。
粒徑為500nm、65nm、10nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2a，2b，2c所示，表明在添加了粒徑為500nm、65nm、10nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯的作用組中，均產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用，最佳添加濃度均為0.01g/L，細(xì)胞培養(yǎng)72h后，對(duì)照組吸光度值分別為1.04、0.89、0.78，PHBHHx(0.01g/L)作用組吸光度值升高到1.50、1.01、0.97。
實(shí)施例2、結(jié)構(gòu)式II表示的結(jié)構(gòu)單元不同含量的聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖的影響一、結(jié)構(gòu)式II表示的結(jié)構(gòu)單元不同含量的聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒的制備聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的制備方法參見(jiàn)(R.H.Marchessault，F(xiàn).G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142.)聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(重均分子量為500,000；結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為95∶5或55∶45；購(gòu)自汕頭聯(lián)億公司)。
2mg PHBHHx(結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為95∶5)溶于40ml氯仿，60℃水浴回流加熱20min。在超聲中將PHBHHx氯仿溶液緩慢滴加到800ml含5mMCTAB的PBS溶液中，600W超聲混勻30min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx懸濁液，1.5×104g離心10min，倒掉上清，去離子水洗滌2次除去CTAB，沉淀重懸于去離子水中，90℃高溫蒸汽滅菌40min。動(dòng)態(tài)光散射分析測(cè)得顆粒平均粒徑為67nm。
2mg PHBHHx(結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為55∶45)溶于40ml氯仿，60℃水浴回流加熱20min。在超聲中將PHBHHx氯仿溶液緩慢滴加到800ml含5mMCTAB的PBS溶液中，600W超聲混勻1h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx懸濁液，1.5×104g離心10min，倒掉上清，去離子水洗滌2次除去CTAB，沉淀重懸于去離子水中，90℃高溫蒸汽滅菌40min。動(dòng)態(tài)光散射分析測(cè)得顆粒平均粒徑為89nm。
逐級(jí)稀釋法將以上PHBHHx納米顆粒懸濁液配制成0.5，1，2，4g/LPHBHHx母液，4℃保存。
二、結(jié)構(gòu)式II表示的結(jié)構(gòu)單元不同含量的的聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖的影響實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系成纖維細(xì)胞L929。
結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為95∶5或55∶45的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒的添加濃度為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)條件、MTT測(cè)定方法同實(shí)施例1。
成纖維細(xì)胞L929(購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)用DMEM血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，將細(xì)胞消化，然后以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種48孔板，同時(shí)添加PHBHHx顆粒，培養(yǎng)72h后測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)量。
結(jié)果如圖3a，3b所示，表明在添加了結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為95∶5或55∶45的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯的作用組中，均產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用，最佳添加濃度均為0.01g/L，細(xì)胞培養(yǎng)72h后，對(duì)照組吸光度值分別為0.67、0.79，PHBHHx(0.01g/L)作用組吸光度值升高到0.89、1.10。
實(shí)施例3、不同分子量聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)制備的顆粒對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖的影響一、不同分子量的聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的制備聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的制備方法參見(jiàn)(R.H.Marchessault，F(xiàn).G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbi lo.41(Suppl.1)(1995)138-142.)聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(重均分子量為50,000、500,000、1,200,000；結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為88∶12；由汕頭聯(lián)億公司提供)。
2mg PHBHHx(重均分子量為50,000或500,000)溶于40ml氯仿，60℃水浴回流加熱20min。在超聲中將PHBHHx氯仿溶液緩慢滴加到800ml含5mM CTAB的PBS溶液中，600W超聲混勻30min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx懸濁液，1.5×104g離心10min，倒掉上清，去離子水洗滌2次除去CTAB，沉淀重懸于去離子水中，90℃高溫蒸汽滅菌40min。動(dòng)態(tài)光散射分析結(jié)果表明重均分子量為50,000的PHBHHx制備的顆粒平均粒徑為55nm，重均分子量為500,000的PHBHHx制備的顆粒平均粒徑為69nm。
將0.4g PHBHHx(重均分子量為1,200,000)溶于400ml丙酮，60℃水浴回流加熱20min，在300W超聲中緩慢加入100ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，超聲20min混勻。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將丙酮除去，形成穩(wěn)定的PHBHHx懸濁液(4g/L)，90℃高溫蒸汽滅菌40min。動(dòng)態(tài)光散射分析顆粒平均粒徑為90μm。
二、不同分子量的聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖的影響實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系成纖維細(xì)胞L929。
PHBHHx重均分子量分別為50,000、500,000、1,200,000的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒的添加濃度為0.02g/L。
成纖維細(xì)胞L929(購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)用DMEM血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，將細(xì)胞消化，然后以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種48孔板，同時(shí)添加PHBHHx顆粒，培養(yǎng)72h后測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)量。
培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)條件、MTT測(cè)定方法同實(shí)施例1的步驟二。
結(jié)果如圖4所示，表明在添加了不同分子量的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯的作用組中，均產(chǎn)生-定的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用，分子量為50,000和500,000的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯制備的顆粒對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用大于分子量為1,200,000的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒，但并沒(méi)有顯著性差異，所以PHBHHx促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用與分子量大小無(wú)關(guān)。圖4中，control為未添加PHBHHx的對(duì)照。
實(shí)施例4、聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒懸濁液對(duì)肝細(xì)胞HepG2增殖的影響結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為88∶12的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯粒徑為75μm和65nm的顆粒制備如實(shí)施例1的步驟一。
細(xì)胞系肝細(xì)胞HepG2(購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)。
1640血清培養(yǎng)基1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，5％胎牛血清(武漢三利)。
1640無(wú)血清培養(yǎng)基1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素1640消化液1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，0.2％胰蛋白酶沖洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素。
MTT染液5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)。
裂解液DMSO粒徑為75μm和65nm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的添加濃度為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。
肝細(xì)胞HepG2用1640血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，將細(xì)胞消化，然后以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種48孔板，同時(shí)添加PHBHHx顆粒，培養(yǎng)72h后測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)量。
MTT檢測(cè)方法同實(shí)施例1的步驟二。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5a、5b，表明在添加了粒徑為75μm和65nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的作用組中，產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用，最佳的添加濃度分別為0.02g/L，0.01g/L，培養(yǎng)72h后對(duì)細(xì)胞的吸光度值分別從0.67，0.59增加到了1.35，0.85。
實(shí)施例5、聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒懸濁液對(duì)乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的影響傳代細(xì)胞乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞酒精浸泡處死并消毒3-5天齡的NewZealand乳兔(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXX(京)2002-0003)，裸露關(guān)節(jié)股骨與脛骨面，游離關(guān)節(jié)表面的軟骨組織，將軟骨組織收集于PBS內(nèi)，切成小塊。用0.2％的II型膠原酶溶液消化關(guān)節(jié)軟骨碎片，獲得軟骨細(xì)胞懸液。
DMEM血清培養(yǎng)基DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰氨酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10％胎牛血清(武漢三利)DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-a天冬酰氨酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素消化液DMEM(GIBCO)，0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素沖洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素培養(yǎng)條件37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱，接種量為1×104個(gè)/孔(48孔板)培養(yǎng)72hr。
MTT染液5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)裂解液DMSO結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為88∶12的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯粒徑為75μm和65nm的顆粒制備如實(shí)施例1的步驟一。
獲得的傳代乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用DMEM血清培養(yǎng)基培養(yǎng)約2-3天，待鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶(25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，Coster，USA)后，將細(xì)胞消化，以1×104接種量接種48孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Coster)，同時(shí)添加PHBHHx顆粒，培養(yǎng)72h后，MTT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)量。詳細(xì)步驟見(jiàn)實(shí)施例1的步驟二，MTT染液為5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)，裂解液為DMSO。
聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)懸濁液的添加濃度為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。MTT檢測(cè)方法同實(shí)施例1的步驟二。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6a、6b，表明在添加了粒徑為75μm和65nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的作用組中，產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用，最佳的添加濃度分別為0.02g/L，0.01g/L，培養(yǎng)72h后對(duì)細(xì)胞的吸光度值分別從0.349，0.512增加到了0.547，0.693。
實(shí)施例6、聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響傳代細(xì)胞人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞人臍帶由北京市海淀婦產(chǎn)醫(yī)院提供。足月、平產(chǎn)、健康新鮮新生兒臍帶，長(zhǎng)度不小于20cm，無(wú)菌條件下擠出殘血，0.1％的I型膠原酶37℃處理10min，獲得人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液。
原代培養(yǎng)基M199(GIBCO)，2.3g/L NaHCO3，15mmol/L HEPES，2mg/L ECGF，5mg/L肝素，2mmol/L L-Gin，1mmol/L丙酮酸鈉，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，20％胎牛血清(武漢三利)。
繼代培養(yǎng)基M199(GIBCO)，2.3g/L NaHCO3，15mmol/L HEPES，2mg/L ECGF，5mg/L肝素，2mmol/L L-Gin，1mmol/L丙酮酸鈉，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，15％胎牛血清(武漢三利)。
無(wú)血清培養(yǎng)基M199(GIBCO)，2.3g/L NaHCO3，15mmol/L HEPES，2mg/L ECGF，5mg/L肝素，2mmol/L L-Gin，1mmol/L丙酮酸鈉，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素。
沖洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素消化液PBS，0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素終止液PBS，5％胎牛血清(武漢三利)培養(yǎng)條件37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在原代培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，換用繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液一次。在48孔板中接種量為1×104個(gè)/孔，同時(shí)添加PHBHHx顆粒，培養(yǎng)72h后MTT方法檢測(cè)，詳細(xì)步驟見(jiàn)實(shí)施例1的步驟二，MTT染液為5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)，裂解液為DMSO。
結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為88∶12的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯粒徑為75μm和65nm的顆粒制備如實(shí)施例1的步驟一。
聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)懸濁液的添加濃度為0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。MTT法同實(shí)施例1的步驟二。徑為75μm和65nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7a、7b表明，在添加了粒徑為75μm和65nm的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的作用組中，產(chǎn)生一定的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用，最佳的添加濃度分別為0.02g/L，0.01g/L，培養(yǎng)72h后對(duì)細(xì)胞的吸光度值分別從0.631，0.456增加到了0.960，0.664。
實(shí)施例7、聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞系L929細(xì)胞周期的影響結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為88∶12、粒徑為75μm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒制備如實(shí)施例1的步驟一。
細(xì)胞系成纖維細(xì)胞L929。培養(yǎng)條件同實(shí)施例1的步驟二。
用流式細(xì)胞法分析細(xì)胞周期的變化1)細(xì)胞培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板中接種5×104/ml細(xì)胞，在2ml培養(yǎng)液體系中形成不同濃度的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯懸濁液(0.005，0.01，0.02，0.05，0.1g/L)，培養(yǎng)72h。
2)將細(xì)胞消化，置于1.5ml eppendorf管中1500rpm離心5min，棄上清，加入1ml PBS洗去殘留的培養(yǎng)液。
3)加入1ml 75％乙醇(無(wú)水乙醇∶PBS＝3∶1)4℃固定過(guò)夜。
4)加入0.25ml 0.2mg/ml RNase，37℃水浴30min除去RNA。
5)冰浴終止反應(yīng)，加入0.25ml 0.04mg/ml碘化丙啶(Sigma)冰浴30min。
6)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞在G0/G1，S，G2/M幾個(gè)周期細(xì)胞數(shù)目的分布。所得的數(shù)據(jù)由軟件Cellquest software(Becton Dickinson，San Jose，CA)處理。
結(jié)果如圖8所示，0.005-0.02g/L濃度范圍聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯作用的各組，隨著聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯濃度的升高處于S期的細(xì)胞比例增大，在0.02g/L濃度出現(xiàn)S期的細(xì)胞比例峰值；而處于G0/G1期的細(xì)胞比例逐漸減小，在0.02g/L濃度出現(xiàn)G0/G1期的細(xì)胞比例最低值。聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯濃度更高的各組(0.05-0.1g/L)，隨著聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯濃度的升高處于S期的細(xì)胞比例減少，而處于G0/G1期的細(xì)胞比例逐漸增多。
以上結(jié)果表明，低濃度聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒(0.005-0.02g/L)對(duì)鼠成纖維細(xì)胞L929的DNA合成促進(jìn)作用與濃度成正相關(guān)，低濃度聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒有助于細(xì)胞通過(guò)阻滯點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而進(jìn)一步提高濃度對(duì)細(xì)胞DNA合成無(wú)明顯促進(jìn)作用。
實(shí)施例8、聚3-羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)顆粒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12細(xì)胞周期的影響細(xì)胞系神經(jīng)細(xì)胞PC12(購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所)。
1640培養(yǎng)基1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10％胎牛血清(武漢三利)，10％馬血清(Hyclone)1640無(wú)血清培養(yǎng)基1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素1640消化液1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，0.2％胰蛋白酶沖洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素。
結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為88∶12、粒徑為75μm聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒制備如實(shí)施例1的步驟一。
神經(jīng)細(xì)胞PC12在6孔培養(yǎng)板中接種1×105/ml細(xì)胞，在2ml培養(yǎng)液體系中形成不同濃度的聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯懸濁液(0.005，0.01，0.02，0.05，0.1g/L)，培養(yǎng)72h。
培養(yǎng)條件同實(shí)施例3。
用流式細(xì)胞法分析細(xì)胞周期變化的方法同實(shí)施例7。
結(jié)果如圖9所示，低濃度聚-(R)-3-羥基丁酸羥基己酸酯(0.005-0.02g/L)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12的DNA合成具有促進(jìn)作用，最好的作用濃度為0.02g/L。而進(jìn)一步提高濃度對(duì)細(xì)胞DNA合成無(wú)明顯促進(jìn)作用。
權(quán)利要求
1.聚3-羥基丁酸羥基己酸酯在促進(jìn)動(dòng)物組織細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述聚3-羥基丁酸羥基己酸酯是由下述結(jié)構(gòu)式I和II表示的結(jié)構(gòu)單元，以55-95∶5-45的摩爾比組成的重均分子量為50,000到1,200,000的線型無(wú)規(guī)共聚物；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述聚3-羥基丁酸羥基己酸酯為R型，或S型，或內(nèi)消旋化合物，或外消旋結(jié)構(gòu)的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述聚3-羥基丁酸羥基己酸酯為R型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述聚3-羥基丁酸羥基己酸的酯顆粒直徑為5nm-180μm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的應(yīng)用，其特征在于所述聚3-羥基丁酸羥基己酸的酯顆粒直徑為5nm、10nm、65nm、500nm、5μm、75μm或180μm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的使用濃度為0.001-0.1g/L培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述聚3-羥基丁酸羥基己酸酯顆粒的使用濃度為0.01g/L或0.02g/L培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述的組織細(xì)胞選自下述細(xì)胞中的任意一種成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞和腎細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述組織或器官包括成纖維組織、腺體、肺、卵巢、神經(jīng)、骨組織、腦組織、血管、肝和腎。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了聚3－羥基丁酸羥基己酸酯的一種新用途。該新用途是聚3－羥基丁酸羥基己酸酯在促進(jìn)動(dòng)物組織細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明的聚3－羥基丁酸羥基己酸酯可使細(xì)胞的生長(zhǎng)量明顯增加，而且具有成本低的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞工程和組織工程以及真核細(xì)胞和組織器官的體外培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1778904SQ20051010929
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者陳國(guó)強(qiáng), 程杉, 趙艷, 吳瓊 申請(qǐng)人:清華大學(xué)