專利名稱：一種培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程學(xué)中獲得種子細胞的方法。
背景技術(shù)：
血管疾病是臨床常見的疾病之一。隨著人口老齡化進程的加速，膳食習(xí)慣的改變，動脈粥樣硬化的發(fā)病率進一步增高并威脅越來越多人的健康，有統(tǒng)計在60歲以上人群中，動脈粥樣硬化的發(fā)病率將為80％，而由此引起的肢體動脈缺血性疾病的發(fā)病率亦高達7-20％；同時，糖尿病與肥胖病的發(fā)病率也在逐年增高，而與動脈缺血性疾病相關(guān)的高危因素居高不下。僅在美國，每年接受血管移植的患者就超過一百萬之多，但長期以來，缺乏理想的血管移植物嚴重制約了上述疾病的治療效果。
臨床已經(jīng)應(yīng)用的血管移植材料有自體血管、異體血管、和人工高分子材料管道(如滌綸Dacron、膨化聚四氟乙烯ePTEF)，盡管能改善和延長患者的生命，但均未達到理想的程度。目前認為Dacron、ePTEF在臨床大口徑血管移植中效果可靠，有肯定的遠期通暢率，但移植后失敗率高。自體血管雖然有較好的遠期通暢率，卻存在來源不足的問題。隨著近年來組織工程學(xué)的發(fā)展，構(gòu)建組織工程人工血管日益受到重視。
組織工程化血管是由細胞材料復(fù)合物構(gòu)建的血管替代品，在生物材料降解后所形成的血管由活細胞所構(gòu)成，具有與正常生理性血管相似的特性，可以隨機體的生長而生長。目前，組織工程化血管的構(gòu)建主要是應(yīng)用自體組織的同源細胞作為種子細胞來源，存在著來源有限、易老化、不能大規(guī)模擴增以及取材對機體造成創(chuàng)傷等問題，種子細胞來源困難已成為阻礙組織工程進一步發(fā)展的瓶頸問題。
因此，本領(lǐng)域迫切需要一種將胚胎干細胞(ES)培養(yǎng)為血管內(nèi)皮細胞的方法，為組織工程化血管提供新的種子細胞；也迫切需要一種理想的血管移植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種將hES培養(yǎng)成為血管內(nèi)皮細胞的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種血管內(nèi)皮細胞及其用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，包括步驟a.在基本上不含有動物血清和含維甲酸的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)人胚胎干細胞，形成擬胚體；b.用含β1-轉(zhuǎn)化生長因子的培養(yǎng)液將擬胚體培養(yǎng)成具有血管樣結(jié)構(gòu)的血管內(nèi)皮細胞。
在另一優(yōu)選例中，步驟a中所述培養(yǎng)基基本上不含動物血清是指哺乳動物血清的體積濃度為0-2％，較佳地0-1％，更佳地0-0.5％，最佳地0％。
在另一優(yōu)選例中，步驟a中所用的維甲酸濃度為0.1-3×10-9mol/L。
在另一優(yōu)選例中，步驟a和b中的培養(yǎng)是在37±2℃，和5±1％CO2條件下培養(yǎng)1-7天。
在另一優(yōu)選例中，步驟b中所用的β1-轉(zhuǎn)化生長因子濃度為1-5ng/ml。
在另一優(yōu)選例中，在步驟a和b之間還包括步驟將擬胚體進行貼壁培養(yǎng)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用本發(fā)明上述方法制得的血管內(nèi)皮細胞。
在本發(fā)明的第三方面，提供了用上述方法得到的血管內(nèi)皮細胞的用途，它們用作構(gòu)建組織工程化血管的種子細胞。
或者，所述的血管內(nèi)皮細胞被用于制備血管移植物。本發(fā)明所述的移植物用于治療血管性疾病。
在另一優(yōu)選例中，步驟b中的培養(yǎng)條件為37±2℃，5±2％CO2，培養(yǎng)1-7天上述的培養(yǎng)方法中，步驟c中所用的β1-轉(zhuǎn)化生長因子濃度為1-5ng/ml。
在另一優(yōu)選例中，步驟c中先將擬胚體貼壁培養(yǎng)。
由此，本發(fā)明提供了一種將hES培養(yǎng)成為血管內(nèi)皮細胞的方法，并且提供了一種血管移植物，并可將血管內(nèi)皮細胞用于治療血管性疾病。


圖1顯示了hES在胎鼠成纖維細胞(MEF)細胞的飼養(yǎng)層上的生長，放大60倍。
圖2顯示了所形成的擬胚體(EB，embryonic body)，左圖為第2天放大100倍，右圖為第5天放大100倍。
圖3顯示了EB周圍的上皮樣和圓形細胞，放大100倍。
圖4顯示了EB貼壁第3天，血管樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，放大100倍。
圖5顯示了EB貼壁第4、5天，血管樣結(jié)構(gòu)漸成交叉網(wǎng)狀，a1、a2為第4天，b1、b2為第5天；a1、b1放大40倍、a2、b2放大100倍。
圖6顯示了管道由圓形細胞組成。
圖7顯示了內(nèi)皮樣細胞圍成的管腔。
圖8顯示了內(nèi)皮樣細胞緊密連接。
圖9顯示了細胞間緊密連接。
圖10顯示了正常人毛細血管。
圖11顯示了抗vWF抗體免疫熒光呈陽性，放大100倍，a為vWF抗體免疫熒光陽性、b為陽性對照，c為陰性對照。
圖12顯示了抗Flk-1抗體免疫熒光呈陽性，放大100倍，a為Flk-1抗體免疫熒光陽性、b為陽性對照，c為陰性對照。
圖13顯示了抗CD31抗體免疫熒光呈陽性，放大100倍，a為CD31抗體免疫熒光陽性、b為陽性對照，c為陰性對照。
圖14顯示了Dil-Ac-LDL攝取實驗陽性，放大100倍，右圖為陰性對照。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，在基本上不含動物血清和含RA培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞，然后在含TGF-β1的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，可形成具有血管樣結(jié)構(gòu)的血管內(nèi)皮細胞。在本發(fā)明中，盡管基本上不含動物血清(如FBS)，然后通過低濃度RA和TGF-β1協(xié)同作用，足以誘導(dǎo)人ES細胞分化為具有血管樣結(jié)構(gòu)的血管內(nèi)皮細胞。該方法為研究胚胎時期體內(nèi)的血管發(fā)生及其機制建立了一個良好的模型，且為組織工程化血管提供新的種子細胞。
本發(fā)明所述的血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法包括步驟a.在基本上不含有動物血清和含維甲酸的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)人胚胎干細胞，形成擬胚體；b.用含β1-轉(zhuǎn)化生長因子的培養(yǎng)液將擬胚體培養(yǎng)成具有血管樣結(jié)構(gòu)的血管內(nèi)皮細胞。
在本發(fā)明中，使用的培養(yǎng)基是基本上不含動物血清(如哺乳動物胎兒血清)的培養(yǎng)基。
當(dāng)然，在培養(yǎng)hES的培養(yǎng)基中可以加入一些已知生長因子。此外，所述生長因子可來源于成纖維細胞飼養(yǎng)層。雖然所述生長因子較佳是成纖維細胞生長因子，但是它也可以是其它物質(zhì)，如設(shè)計用來激活成纖維細胞生長因子受體的某些合成的小肽(如由重組DNA變體或突變體產(chǎn)生的肽)。
本發(fā)明可提供采用上述步驟a衍生獲得的血管內(nèi)皮細胞系?！把苌痹诖耸褂闷鋸V義含義，覆蓋了直接或間接衍生的細胞系。
本發(fā)明所述的hES的建立可采用本領(lǐng)域所知的方法制備或直接購買獲得(例如購自ATCC等保藏中心)。
本發(fā)明中RA和TGF-β1可誘導(dǎo)人ES細胞分化為內(nèi)皮細胞及血管樣結(jié)構(gòu)。TGF-β1為胚胎干細胞向內(nèi)皮細胞定向誘導(dǎo)分化的有效刺激因子。本發(fā)明先由未分化的胚胎干細胞分化成為血管細胞(angioblast)，再形成內(nèi)皮細胞，彼此組成管道狀結(jié)構(gòu)。在誘導(dǎo)環(huán)境持續(xù)存在的情況下。血管形成(vasculogenesis)和血管新生或芽殖(angiogenesis)先后或同時存在，這一現(xiàn)象與胚胎發(fā)育中血管形成過程相似。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞的方法中，在培養(yǎng)EB時使用RA，所述的RA為低濃度，是0.1-3.0×10-9mol/L，優(yōu)選0.5-1.5×10-9mol/L，更優(yōu)選1.0×10-9mol/L。
轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)是由112個氨基酸組成的多肽為亞單位，并通過二硫鍵相連的雙聚體分子。近年研究發(fā)現(xiàn)，有不少蛋白分子或基因的結(jié)構(gòu)和功能與TGF密切相關(guān)，組成擁有20余個成員的TGF-β家族。TGF-β家族有很多同工異構(gòu)體，其中以TGF-β1研究最多，屬于具有多種生理功能的多肽生長因子，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化和免疫反應(yīng)。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法中，優(yōu)選使用TGF-β1，其濃度為1-5ng/ml，更優(yōu)選3ng/ml。
本發(fā)明所述的EB培養(yǎng)的一個優(yōu)選例是取生長良好的hES細胞，機械法分割成小塊，接種到預(yù)先鋪過1％瓊脂的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液敲除(knock-out)DMEM，去除bFGF，加RA至終濃度為1×10-9mol/L，37℃、5％CO2培養(yǎng)3-5天，收集生長較好的EB，均等地移植到預(yù)先用0.1％明膠鋪過的培養(yǎng)皿中，加含3ng/mlTGF-β1的無血清DMEM，每隔兩天換液培養(yǎng)。
在本發(fā)明的另一個方面是用上述的培養(yǎng)方法所獲得的血管內(nèi)皮細胞，所述的血管內(nèi)皮細胞可以作為組織工程化血管的種子細胞；可以制備血管移植物；也可用于治療血管性疾病，治療中可直接注入所述的血管內(nèi)皮細胞，或含有上述血管內(nèi)皮細胞的組合物。
所述的血管移植物包括(a)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料；和(b)用上述的培養(yǎng)方法所獲得的血管內(nèi)皮細胞。所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料包括(但并不限于)(i)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚對二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(ii)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細胞基質(zhì)；(iii)可注射性材料，如Pluronic(一種市售的聚環(huán)氧乙丙烯商品)、藻酸鈣凝膠等；(iv)上述材料的混合物或復(fù)合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料，以及固體材料與可注射性材料的復(fù)合材料。
本發(fā)明所用術(shù)語von Willebrand因子(vWF)是存在于血漿中的大分子糖蛋白，在內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的vWF單體分子量為260KD，在高爾基復(fù)合體中加工后降解為230KD。由這些單體聚合形成多聚體主義到W-P小體儲存，最后分泌到細胞外。它與凝血因子VIII結(jié)合后，以復(fù)合物的形式存在于循環(huán)血液中。vWF不僅是因子VIII的載體，而且在血小板黏附于內(nèi)皮下組織的過程中也起重要的作用。vWF主要由內(nèi)皮細胞合成，因此vWF被作為鑒定內(nèi)皮細胞的特異性標(biāo)記。
本發(fā)明所用術(shù)語CD31是一種相對分子質(zhì)量為110kD的糖基化跨膜糖蛋白，出現(xiàn)在人類造血祖細胞和血管內(nèi)皮細胞上，CD31內(nèi)皮細胞抗原在毛細血管、小血管內(nèi)皮細胞呈穩(wěn)定強陽性，被認為是目前血管內(nèi)皮細胞的最可靠標(biāo)記。
本發(fā)明所用術(shù)語Flk-1是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的酪氨酸激酶受體，VEGF酪氨酸激酶受體分為兩類，VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-1(Flk-1)，大多分布在內(nèi)皮細胞的表面。VEGF與受體結(jié)合后，受體的酪氨酸激酶磷酸化，通過細胞漿內(nèi)信號傳導(dǎo)鏈，引起細胞核分裂，血管內(nèi)皮細胞增殖、移行，血管新生。
Yamaguchi等用RT-PCR的方法篩選出在小鼠胚胎干細胞的受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)，這些酶可能在小鼠早期發(fā)育中涉及到細胞系的方向和分化。Flk-1是flt相關(guān)的基因，用原位雜交發(fā)現(xiàn)在胚胎原條期(primitive streak stage)時Flk-1在近外側(cè)中胚層表達，其組織將向心臟衍生；在頭褶(head fold)期時，F(xiàn)lk-1表達明確定于原始心內(nèi)膜以及內(nèi)臟卵黃囊(visceral yolk sac)和尿囊(allantois)；然后是在胚胎和胚胎外的習(xí)慣內(nèi)皮表達；在早期器官形成時期，flk-1在血管豐富的組織首先表達，如腦、肝臟、肺和胎盤(placente)。由于Flk-1在早期中胚層細胞表達，所以它是內(nèi)皮前體細胞的標(biāo)志。
本發(fā)明所用術(shù)語1’二(十八烷基)-3，3’，3’，3’-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽(1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI)是一種親脂性碳花青染料，容易嵌進生物質(zhì)膜內(nèi)并在膜內(nèi)做定向擴散運動從而標(biāo)記整個細胞。熒光染料DiI標(biāo)記的低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL)，即Dil-LDL被廣泛應(yīng)用于內(nèi)皮細胞的鑒定。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
1.本發(fā)明提供用于hES的培養(yǎng)條件，其中，所述條件變化少，并使得形成血管內(nèi)皮細胞的效率更高；2.發(fā)明的培養(yǎng)體系作用于人ES細胞，可在體外模擬人胚胎時期血管形成的演變過程；3.本發(fā)明用hES培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞；4.該培養(yǎng)方法重復(fù)性高。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。
實施例1用人胚胎干細胞培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞a.將人胚胎干細胞(ES細胞)(購自上海組織工程研究與開發(fā)中心，上海，中國)，接種到預(yù)先鋪過1％瓊脂的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為knockout-DMEM(購自Gibco公司)，其中加入20％SR(購自Gibco公司)，1％非必需氨基酸(購自Gibco公司)，1mML-glutamine(購自Sigma公司)，0.1mMβ-mercaptoethanol(購自Sigma公司)，并加RA(購自Sigma公司)至終濃度為1×10-9mol/L。在37℃、5％CO2培養(yǎng)3-5天，收集生長較好的擬胚體(EB)；b.將步驟a中收集的EB均等地移植到預(yù)先用0.1％明膠鋪過的培養(yǎng)皿中，加含3ng/mlTGF-β1(購自R&D公司)的無血清DMEM(即用TGF-β1替換RA，其他成分同步驟a)，每隔兩天換液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察照相，并做相關(guān)檢測。
實施例2檢測一、倒置相差顯微鏡觀察體外誘導(dǎo)hES細胞定向分化時，每天在熒光倒置相差顯微鏡(購自Zeiss公司)下觀察、記錄EB的形成，及血管內(nèi)皮細胞的分化過程。
二、電鏡檢測1.掃描電鏡檢測取誘導(dǎo)后分化出的上皮樣和圓形細胞及血管樣結(jié)構(gòu)，以2％戊二醛固定，PBS漂洗，1％鋨酸固定，PBS漂洗，梯度酒精脫水，醋酸正戊酯置換，CO2臨界點干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡觀察。
2.透射電鏡檢測取誘導(dǎo)后分化出的上皮樣和圓形細胞及血管樣結(jié)構(gòu)，2％戊二醛固定24小時，收集標(biāo)本，1％鋨酸后固定1小時，梯度酒精脫水，1∶1丙酮包埋液滲透，EPON包埋，常規(guī)超薄切片，透射電鏡(JEM-1200EX)觀察細胞與血管的超微結(jié)構(gòu)。
三、免疫熒光檢測將EB放置在0.1％明膠包被的蓋玻片上貼壁，按上述條件進行誘導(dǎo)分化。然后將EB爬片分實驗組(滴加一抗)、空白對照組(未加一抗)；并以小鼠成纖維細胞作陰性對照組。具體步驟如下1.EB爬片置PBS(購自Hyclone公司)中洗滌，2min×5次；2.4％多聚甲醛固定30min；3.PBS漂洗2min×5次；4.0.25％Triton-100，5％DMSO-PBS作用10min；5.PBS漂洗5min×3次；6.1.5％H2O2-PBS，37℃，15min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；7.PBS漂洗3min×3次；8.滴加綿羊血清(10％血清-PBS)，置濕盒內(nèi)，37℃，45min；9.棄去血清，實驗組與陰性對照組細胞爬片滴加一抗(兔抗人VIII因子抗體(購自Santcruz公司)(1∶100)和鼠抗人CD31單抗(購自Santcruz公司)(1∶50)，空白組滴加PBS；三組爬片置濕盒內(nèi)37℃反應(yīng)45分鐘；10.PBS漂洗5min×3次；11.滴加二抗(羊抗兔IgG-FITC，羊抗鼠IgG-羅丹明)(購自華美公司)，37℃，30min；12.PBS洗3min×3次；13.熒光顯微鏡下觀察并拍照。
四、Dil-Ac-LDL標(biāo)記檢測以無血清DMEM稀釋Dil-Ac-LDL為10ug/ml，加至已分化出血管樣結(jié)構(gòu)的EB培養(yǎng)皿中，37℃孵育4小時，將其去除，無血清DMEM洗3遍，熒光顯微鏡觀察，照相。
結(jié)果一、hES細胞體外誘導(dǎo)EB形成hES細胞在MEF細胞的飼養(yǎng)層上呈巢穴狀生長，見圖1。
結(jié)果顯示，接種于1％軟瓊脂鋪底的培養(yǎng)皿內(nèi)呈懸浮生長，經(jīng)含1×10-9mol/L RA的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，小細胞團細胞增殖，體積漸大；在第5天時形成球形的胚體，好的胚體透亮、邊緣光潔，見圖2。
二、hES細胞體外誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞hES細胞形成EB后移至白明膠包被的培養(yǎng)皿中貼壁生長。在TGF-β1誘導(dǎo)下，第2天EB周圍有上皮樣細胞和圓形細胞出現(xiàn)，見圖3；第3天開始出現(xiàn)由圓形細胞構(gòu)成短小的管狀結(jié)構(gòu)，管道狀結(jié)構(gòu)自EB向周圍呈輻射狀生長，見圖4；漸呈交叉網(wǎng)狀，見圖5。
三、電鏡檢測1.掃描電鏡結(jié)果顯示，管狀結(jié)構(gòu)的管壁最初由許多圓形細胞和扁平狀細胞組成，隨著管狀結(jié)構(gòu)的延伸，細胞逐漸減少，管壁變得光滑，見圖6。
2.透射電鏡透射電鏡結(jié)果顯示，誘導(dǎo)出的血管樣結(jié)構(gòu)由幾個內(nèi)皮樣細胞圍成，見圖7；細胞呈扁平樣，表面較光滑，見圖8；相臨細胞間有緊密連接，見圖9。與正常毛細血管結(jié)構(gòu)非常相似，(圖10)，證明本發(fā)明可成功誘導(dǎo)出血管。
四、免疫熒光檢測hES細胞誘導(dǎo)分化的管狀結(jié)構(gòu)經(jīng)vWF、CD31、Flk-1抗體免疫熒光檢測均呈陽性，見圖11-13，證明由人ES誘導(dǎo)分化而來的細胞具內(nèi)皮細胞性質(zhì)。
五、Dil-Ac-LDLDil-Ac-LDL攝取實驗結(jié)果呈紅色熒光，見圖14，為陽性。證明hES細胞定向誘導(dǎo)分化的細胞具有內(nèi)皮細胞的功能。
本實施例中，vWF免疫熒光染色和Dil-LDL直接熒光檢測結(jié)果均為陽性，表明構(gòu)成管樣結(jié)構(gòu)的細胞具有內(nèi)皮細胞性質(zhì)，表明低濃度RA和TGF-β1可誘導(dǎo)人ES細胞分化為內(nèi)皮細胞及血管樣結(jié)構(gòu)。
實施例3血管內(nèi)皮細胞-生物材料復(fù)合物的制備將原代、第一代、第二代、第三代、第四代、第五代、第六代的細胞懸液分別離心(1500r/min)，傾去上清，將細胞沉淀與可注射性生物材料Pluronic F-127(一種市售的聚環(huán)氧乙烯商品)在4℃下充分混合，濃度為5×107個細胞/ml，制成細胞-聚環(huán)氧乙烯復(fù)合物。用2ml注射器吸取復(fù)合物備用。
實施例4含血管內(nèi)皮細胞的組合物的制備將實施例1所得的血管內(nèi)皮細胞與血管平滑肌細胞混合，制得組合物，將該組合物配制成濃度為5×107個細胞/ml的細胞懸液，取1ml注入體內(nèi)缺血部位(如心肌梗塞部位)，用于治療血管性疾病。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括步驟a.在基本上不含有動物血清和含維甲酸的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)人胚胎干細胞，形成擬胚體；b.用含β1-轉(zhuǎn)化生長因子的培養(yǎng)液將擬胚體培養(yǎng)成具有血管樣結(jié)構(gòu)的血管內(nèi)皮細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟a中所述培養(yǎng)基基本上不含動物血清是指哺乳動物血清的體積濃度為0-2％。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟a中所用的維甲酸濃度為0.1-3×10-9mol/L。
4.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟a和b中的培養(yǎng)是在37±2℃，和5±1％CO2條件下培養(yǎng)1-7天。
5.如權(quán)利要求1或4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟b中所用的β1-轉(zhuǎn)化生長因子濃度為1-5ng/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟a和b之間還包括步驟將擬胚體進行貼壁培養(yǎng)。
7.一種如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法所得的血管內(nèi)皮細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法得到的血管內(nèi)皮細胞的用途，其特征在于，用作構(gòu)建組織工程化血管的種子細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法得到的血管內(nèi)皮細胞的用途，其特征在于，用于制備血管移植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述的移植物用于治療血管性疾病。
全文摘要
一種培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞的方法涉及組織工程學(xué)中獲得種子細胞的方法，本發(fā)明在基本上不含有動物血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細胞，然后利用RA和TGF－β培養(yǎng)出血管內(nèi)皮細胞，為組織工程化種子細胞的獲得開辟了新的來源。
文檔編號C12N5/08GK1990858SQ200510112069
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者曹誼林, 叢笑倩, 王彥, 吳春芳, 唐鄭雅, 張文杰, 劉偉, 崔磊 申請人:上海國睿生命科技有限公司