專(zhuān)利名稱(chēng)：一種體外誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建軟骨的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地涉及利用人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)構(gòu)建組織工程化軟骨及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
外傷、感染、腫瘤或骨軟骨炎等疾病均可以導(dǎo)致軟骨的損傷，由于軟骨組織中缺少干細(xì)胞和血供，損傷后自我修復(fù)能力很低，即使在某些區(qū)域存在少量自身修復(fù)的現(xiàn)象(如小面積關(guān)節(jié)軟骨損傷后可以再生)，但修復(fù)的組織往往是纖維組織和軟骨組織并存的復(fù)合物，缺少完整的化學(xué)組分和足夠的力學(xué)特性，無(wú)法發(fā)揮正常軟骨的功能。而某些支架性軟骨如耳廓軟骨，在損傷或感染后更是完全喪失修復(fù)能力，導(dǎo)致器官外形嚴(yán)重畸形。因此，軟骨損傷性或缺損性疾病的治療向臨床醫(yī)生提出了巨大的挑戰(zhàn)。
到目前為止，較為多用的治療手段包括自體軟骨的游離或帶蒂移植(主要取自肋軟骨)、異體軟骨的游離移植、自體和異體的軟骨細(xì)胞注射移植、骨膜或軟骨膜移植、體內(nèi)應(yīng)用IGF等生長(zhǎng)因子促再生治療、關(guān)節(jié)軟骨下骨鉆孔法等。尚有應(yīng)用贗復(fù)體治療方法，如使用膨體聚四氟乙烯等高分子材料制成的耳廓支架，或固體硅橡膠制成的鼻背形支架來(lái)進(jìn)行局部支撐或充填。
但這些方法均存在明顯的缺點(diǎn)，如自體軟骨移植是以犧牲正常組織為代價(jià)的，植入后軟骨在體內(nèi)會(huì)發(fā)生一定程度的縮小和變形?；颊卟坏谌〔臅r(shí)遭受另外一次手術(shù)的痛苦，還容易出現(xiàn)氣胸、胸廓塌陷和瘢痕等供區(qū)并發(fā)癥。此外，更為關(guān)鍵的是自體軟骨來(lái)源非常有限。異體和異種移植物不但具有免疫原性可引起受體的免疫排斥反應(yīng)，而且有傳播艾滋病、肝炎等病原體的危險(xiǎn)。
雖然人工合成的軟骨組織代用品具有制作簡(jiǎn)單，使用方便的優(yōu)點(diǎn)，但是替代材料只具備充填、支持及維持美觀的作用，缺少軟骨生物學(xué)功能，不是真正意義上的結(jié)構(gòu)與功能重建，而且，作為異物，它的組織相容性差，經(jīng)常出現(xiàn)移植部位疼痛、人工代用品外露等問(wèn)題，無(wú)法滿足患者的治療要求。
組織工程技術(shù)綜合了細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)、材料學(xué)和外科學(xué)等學(xué)科，在體外或體內(nèi)應(yīng)用有活力的種子細(xì)胞、可降解的生物材料和信號(hào)分子等來(lái)獲得有活力有功能的組織。它的優(yōu)點(diǎn)在于從病人損傷相對(duì)輕微的部位獲取少量標(biāo)本，分離出其中的細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)及大規(guī)模擴(kuò)增。再將擴(kuò)增后的活細(xì)胞接種到具有合適的化學(xué)成分和物理構(gòu)型的，天然或人工合成的可降解、生物相容性良好的高分子材料上，通過(guò)體外培養(yǎng)或同時(shí)加入各類(lèi)生物活性因子及生物力學(xué)刺激，構(gòu)建出組織工程化移植物，并用于組織或器官缺損的功能重建。它為軟骨損傷性或缺損性疾病的治療帶來(lái)了新的希望。
按照組織工程的原則，Vacanti等已經(jīng)用牛軟骨細(xì)胞和聚乙酸、聚乳酸復(fù)合支架成功構(gòu)建出透明軟骨組織。曹誼林等應(yīng)用組織工程技術(shù)在裸鼠的背上成功地再造了精確人耳形態(tài)的軟骨，之后的大量研究表明，在高等大型哺乳動(dòng)物甚至人體內(nèi)也可以利用組織工程技術(shù)再生軟骨組織，但這些研究所應(yīng)用的種子細(xì)胞均為軟骨細(xì)胞，在臨床的應(yīng)用受到了很大的限制，主要是因?yàn)樽泽w或異體軟骨細(xì)胞來(lái)源有限取材創(chuàng)傷大，體外大量擴(kuò)增又會(huì)發(fā)生老化與去分化，失去軟骨細(xì)胞的表型。生長(zhǎng)因子雖可在一定程度上擴(kuò)增軟骨細(xì)胞，但其費(fèi)用昂貴，所形成組織在體內(nèi)的長(zhǎng)期效果尚不肯定。
許多作者嘗試應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)動(dòng)物BMSCs向軟骨細(xì)胞分化進(jìn)行，動(dòng)物包括兔、馬、大鼠、豬、羊等，應(yīng)用的生長(zhǎng)因子主要為T(mén)GF-β1、IGF-I、PDGF、TGF-β3、BMP-6、地塞米松等。文獻(xiàn)報(bào)道中大多應(yīng)用三維立體的條件培養(yǎng)，包括micromass微團(tuán)塊培養(yǎng)或者不同工藝材料的三維支架培養(yǎng)。經(jīng)6周以上時(shí)間的誘導(dǎo)培養(yǎng)后形成了具有典型的軟骨組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)具備一定含量軟骨特異性基質(zhì)成分和一定力學(xué)強(qiáng)度的軟骨組織，說(shuō)明了利用外源性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)BMSCs構(gòu)建軟骨組織是完全可行的。我們采用豬BMSCs為種子細(xì)胞，首次建立了包括TGF-β1、IGF-I和地塞米松等誘導(dǎo)因子的組合誘導(dǎo)劑，體外成功構(gòu)建出結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性良好的軟骨組織，并進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了體外構(gòu)建軟骨移植體內(nèi)后可以進(jìn)一步成熟，證實(shí)了豬BMSCs構(gòu)建軟骨完全可行。
但是，人BMSCs與動(dòng)物細(xì)胞具有本質(zhì)上的區(qū)別，包括細(xì)胞的增殖能力、分化能力、細(xì)胞表面抗原、對(duì)外源性誘導(dǎo)劑的反應(yīng)能力等等，雖然許多作者嘗試應(yīng)用人BMSCs構(gòu)建軟骨組織，但是存在以下幾方面關(guān)鍵性問(wèn)題1、生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)效能不佳；2、生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)作用缺乏特異性；3、軟骨特異性的基質(zhì)合成和分泌量少；4、體外構(gòu)建組織力學(xué)強(qiáng)度不佳；5、構(gòu)建組織內(nèi)外分布不均勻；6、構(gòu)建特殊形狀(如耳廓、鼻翼等)軟骨較困難。這些困難嚴(yán)重影響了人BMSCs的體外軟骨構(gòu)建和臨床應(yīng)用。
因此本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)安全性高、組織相容性好、具有生物學(xué)功能的組織工程化人軟骨移植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種使用安全、制備簡(jiǎn)便的組織工程化軟骨。
本發(fā)明的另一目的就是提供所述組織工程化軟骨的制法方法和用途。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種組織工程化軟骨移植物，它包括(a)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞hBMSCs；(b)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料。
其中所述的hBMSCs是自體細(xì)胞，來(lái)源于髂骨、胸骨、肋骨等松質(zhì)骨。
在另一優(yōu)選例中，所述的移植物為固態(tài)細(xì)胞材料復(fù)合物，且hBMSCs在復(fù)合物中的濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/cm3-5×108個(gè)細(xì)胞/cm3，優(yōu)選2×107個(gè)細(xì)胞/cm3-7×107個(gè)細(xì)胞/cm3。hBMSCs在復(fù)合物中的含量為1×106個(gè)細(xì)胞/克-5×108個(gè)細(xì)胞/克，優(yōu)選2×107個(gè)細(xì)胞/克-7×107個(gè)細(xì)胞/克。
在本發(fā)明所述的移植物中，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其共聚物或混合物。
其中所述的移植物外形為人耳廓、鼻背、鼻翼、下頦、顴弓、眉弓、管狀、菱形、片狀、圓柱等多種形狀但不僅限于此。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種如上所述的組織工程化軟骨移植物的制備方法，包括步驟將hBMSCs與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，形成復(fù)合物，其中hBMSCs在復(fù)合物中的濃度為2×107-5×107個(gè)細(xì)胞/cm3。
所述的制備方法中聯(lián)合應(yīng)用體外誘導(dǎo)劑，所述的體外誘導(dǎo)劑包含TGF-β1、IGF-I和地塞米松。
在另一優(yōu)選例中，所述的體外誘導(dǎo)劑中TGF-β1的濃度為20-50ng/ml、IGF-I的濃度為100-500ng/ml、地塞米松的濃度為10-60ng/ml。
在另一優(yōu)選例中，所述的體外誘導(dǎo)劑的應(yīng)用時(shí)間為細(xì)胞接種到材料上之后24-148小時(shí)，體外誘導(dǎo)時(shí)間為4-10周。
在另一優(yōu)選例中，將體外誘導(dǎo)劑以直接脈沖的方式滴加在復(fù)合物上在另一優(yōu)選例中，直接脈沖方式滴加在復(fù)合物上的間隔時(shí)間為24-96小時(shí)，更佳地24-48小時(shí)在另一優(yōu)選例中，體外誘導(dǎo)劑的應(yīng)用時(shí)間為細(xì)胞接種到材料上之后24-48小時(shí)，體外誘導(dǎo)時(shí)間為6-8周在上述的制備方法中，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其共聚物或混合物，但不僅限于此。
由此本發(fā)明獲得了一種安全、制備簡(jiǎn)便的組織工程化軟骨，并可將它用于軟骨移植中。


圖1顯示了體外誘導(dǎo)培養(yǎng)8周的大體標(biāo)本。
圖2顯示了體外誘導(dǎo)培養(yǎng)8周的HE染色結(jié)果。
圖3顯示了體外誘導(dǎo)培養(yǎng)8周的Safranin-O染色結(jié)果。
圖4顯示了體外誘導(dǎo)培養(yǎng)8周的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果。
圖5顯示了體外誘導(dǎo)培養(yǎng)8周的II型膠原免疫組化染色結(jié)果。
圖6顯示了軟骨特異性胞外基質(zhì)均染均勻而豐富。
圖7顯示了軟骨特異性胞外基質(zhì)均染均勻而豐富。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)，hBMSCs獲取容易，可以通過(guò)密度梯度離心或者貼壁法分離出骨髓中的hBMSCs，經(jīng)體外的擴(kuò)增后細(xì)胞數(shù)量明顯增加，在第2代時(shí)可達(dá)到原細(xì)胞量的30-100萬(wàn)倍，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特性鑒定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞仍能夠保持干細(xì)胞特性，具有自我更新的能力，更為重要的是細(xì)胞能夠在TGF-β1、地塞米松和IGF-I等生長(zhǎng)因子聯(lián)合誘導(dǎo)下分化為軟骨樣細(xì)胞，并能夠分泌II型膠原和蛋白聚糖。說(shuō)明這種細(xì)胞具備作為軟骨構(gòu)建種子細(xì)胞的條件，進(jìn)而將細(xì)胞接種到PGA為主要材料做成的三維多孔支架上，再進(jìn)行三維誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能夠很好地與材料粘附并分泌蛋白聚糖和II型膠原等軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)，在基質(zhì)逐漸增多包埋細(xì)胞和支架的同時(shí)，PGA纖維等支架逐步降解消失，最終在體外形成了成熟的軟骨組織，這完全符合組織工程技術(shù)的基本原理。為了解這種成體干細(xì)胞構(gòu)建的軟骨能否在皮下環(huán)境中長(zhǎng)期存留，我們將體外構(gòu)建4周的軟骨植入裸鼠皮下，4周后發(fā)現(xiàn)植入的軟骨仍能夠保持原有的大小和形狀，而且生物力學(xué)性質(zhì)有了明顯改進(jìn)。最近，體外構(gòu)建較大的片狀軟骨(30mm×20mm)也獲得成功。
人們注意到骨髓基質(zhì)中有一類(lèi)被稱(chēng)為是“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)”的非造血細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞能夠在體內(nèi)或體外進(jìn)行擴(kuò)增和誘導(dǎo)，最終分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和生血基質(zhì)等。在有地塞米松、TGF-β1、TGF-β3等誘導(dǎo)因子存在下，BMSCs亦能在體外直接被誘導(dǎo)成為軟骨樣細(xì)胞。相比軟骨細(xì)胞，BMSCs具有更多的優(yōu)點(diǎn)，它們來(lái)源廣泛，取材時(shí)供區(qū)損傷輕微，在體外又能夠大量擴(kuò)增，最終可得到活力好、數(shù)量充足的細(xì)胞。這為我們構(gòu)建自體或同種異體軟骨提供了一個(gè)新的種子細(xì)胞來(lái)源。
術(shù)語(yǔ)本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)”和“骨髓基質(zhì)干細(xì)胞”可相互替換使用。
術(shù)語(yǔ)“hBMSCs的分離”指將存在于動(dòng)物骨髓中的基質(zhì)干細(xì)胞由骨髓的多種細(xì)胞群體中選取出來(lái)的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“hBMSCs的擴(kuò)增”指為了獲取大量hBMSCs而在體外環(huán)境中大量增殖的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)”指提供特殊的生化環(huán)境，將具有多向分化能力的干細(xì)胞等細(xì)胞群體轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N功能特性不同的細(xì)胞群體的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“接種”指將細(xì)胞均勻分布于三維支架材料上的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“自體移植”指將所需生物活體材料(如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞)從某個(gè)體中取出并再施用于同一個(gè)體的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“直接脈沖式滴加”指將生長(zhǎng)因子按著要求劑量配制好之后直接滴加在細(xì)胞材料復(fù)合物上，然后后添加培養(yǎng)液，間隔一段時(shí)間后重復(fù)滴加生長(zhǎng)因子。
hBMSCs本發(fā)明中hBMSCs的來(lái)源沒(méi)有特別限制，一種優(yōu)選的來(lái)源是來(lái)自自體的骨髓。
分離獲得hBMSCs的方法是文獻(xiàn)多次報(bào)道的公認(rèn)方法。一種優(yōu)選的方法是全麻下或局麻下骨髓穿刺抽取自體骨髓，以密度梯度離心法分離出其中的有核細(xì)胞，加入適合的培養(yǎng)液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml的DMEM培養(yǎng)液)，制成細(xì)胞懸液，以約2×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37℃、5％CO2、100％飽和濕度的條件下培養(yǎng)。48小時(shí)后首次換液，以后隔日換液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)近匯合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×104/cm2的密度接種進(jìn)行細(xì)胞傳代。優(yōu)選第2～15代細(xì)胞用于制備人工軟骨。
一類(lèi)優(yōu)選的hBMSCs分離培養(yǎng)方法是全骨髓分離培養(yǎng)法，在抽取骨髓后進(jìn)行多次洗滌，以約6×105個(gè)有核細(xì)胞/cm2的密度(但不僅限于此密度)經(jīng)上述培養(yǎng)液稀釋后接種于培養(yǎng)皿中，靜態(tài)培養(yǎng)5天左右，使多數(shù)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(包括骨髓基質(zhì)干細(xì)胞)充分貼壁，再經(jīng)多次沖洗和換液去除紅細(xì)胞及其它未貼壁的細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)近匯合后常規(guī)消化、傳代，在培養(yǎng)擴(kuò)增過(guò)程中可使hBMSCs逐步純化。優(yōu)選體外培養(yǎng)的第2代～第9代hBMSCs進(jìn)行軟骨構(gòu)建，此時(shí)的hBMSCs有較強(qiáng)的增殖能力并具有多向分化的潛能，包括向軟骨細(xì)胞分化的潛能。
生物可降解材料可用于本發(fā)明的組織工程化軟骨的材料是醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、聚對(duì)二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽以及各種脫細(xì)胞基質(zhì)等；(c)上述材料的共聚物或復(fù)合型材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù)合材料，以及固體材料與可注射性材料的復(fù)合材料。
優(yōu)選的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是固體材料或固、液體復(fù)合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原等。本發(fā)明中的材料可預(yù)制成各種精確的大小與形狀，以適應(yīng)不同大小和形狀的軟骨組織構(gòu)建。當(dāng)材料為固體型材料時(shí)，可以直接將材料預(yù)制成需要的大小與形狀，也可以通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助及快速成型技術(shù)定制的模型對(duì)材料進(jìn)行精確的塑性。
hBMSCs-生物材料復(fù)合物本發(fā)明中hBMSCs-生物材料復(fù)合物的細(xì)胞接種濃度通常約為2×107/ml至7×107/ml或更高。材料為固體性材料或者固、液體復(fù)合材料，以培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，然后與固體性材料混合，其中混合時(shí)培養(yǎng)液與固體性材料的比例沒(méi)有特別限制，但是以該固體材料所能夠吸附培養(yǎng)液的最大量為準(zhǔn)。當(dāng)支架材料為特殊三維形狀時(shí)，如耳廓或鼻背形，按實(shí)際體積的大小來(lái)進(jìn)行計(jì)算。
制備方法本發(fā)明的組織工程化軟骨的制備方法簡(jiǎn)便，將一定數(shù)量的所述hBMSCs與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，再經(jīng)體外誘導(dǎo)即可。
在本發(fā)明的組織工程化軟骨移植物構(gòu)建軟骨過(guò)程中，主要以TGF-β1、IGF-I和地塞米松等生長(zhǎng)因子進(jìn)行體外誘導(dǎo)，也可優(yōu)選添加或復(fù)合其它各種細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，如BMP-2、CDMP等，從而加速誘導(dǎo)過(guò)程及提高細(xì)胞外基質(zhì)合成能力等。
一定劑量的TGF-β1、IGF-I和地塞米松誘導(dǎo)組合可以高效誘導(dǎo)hBMSCs成軟骨分化，但是誘導(dǎo)豬BMSCs的劑量應(yīng)用于hBMSCs無(wú)法達(dá)到良好的誘導(dǎo)效能，必須要加大生長(zhǎng)因子的應(yīng)用劑量。在一個(gè)優(yōu)選例中，TGF-β1的濃度為20-50ng/ml、IGF-I的濃度為100-500ng/ml、地塞米松的濃度為10-60ng/ml可以達(dá)到穩(wěn)定高效的誘導(dǎo)效能。
既往在豬BMSCs接種到材料上7天后開(kāi)始誘導(dǎo)，但應(yīng)用于hBMSCs后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)合成量明顯低下，在一個(gè)優(yōu)選例中，細(xì)胞接種到材料上之后24-48小時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)明顯促進(jìn)胞外基質(zhì)合成量，增加組織成熟度。
既往對(duì)豬BMSCs采取持續(xù)性體外誘導(dǎo)劑刺激，但是該誘導(dǎo)方法對(duì)hBMSCs的誘導(dǎo)效能不強(qiáng)，優(yōu)選地，采用直接脈沖式滴加在復(fù)合物上的方法，間隔時(shí)間為24-48小時(shí)，明顯增強(qiáng)誘導(dǎo)效能。
本發(fā)明的組織工程化軟骨移植物構(gòu)建軟骨過(guò)程中，主要為靜態(tài)培養(yǎng)，或者以離心或振蕩的方式加入力學(xué)刺激，也可以通過(guò)軟骨生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)軟骨的力學(xué)環(huán)境，對(duì)體外構(gòu)建的軟骨施加類(lèi)似的力學(xué)刺激，促進(jìn)軟骨的成熟與力學(xué)性質(zhì)的改進(jìn)。
用本發(fā)明方法形成的組織工程化軟骨，即hBMSCs與固體性生物材料構(gòu)成的復(fù)合物，該復(fù)合物經(jīng)體外充分誘導(dǎo)后可植入體內(nèi)皮下或軟骨缺損部位。
一例用hBMSCs與培養(yǎng)液制成濃度為5×107/ml的細(xì)胞懸液(不僅限于此濃度)，然后與聚羥基乙酸(PGA)為主的生物支架材料形成復(fù)合物(復(fù)合物大小、形狀依照軟骨缺損的大小及形狀確定)。該復(fù)合物經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)6周至8周(不僅限于此時(shí)間，期間每3至4天換液一次，以保證細(xì)胞營(yíng)養(yǎng))，當(dāng)體外組織工程化軟骨初步形成時(shí)植入體內(nèi)皮下或相應(yīng)的軟骨缺損部位。亦可將材料制作成具有精細(xì)結(jié)構(gòu)外形的三維支架，再接種hBMSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)，經(jīng)6-8周(不僅限于此時(shí)間)后植入體內(nèi)軟骨缺損部位。
應(yīng)用本發(fā)明確定的方法，可以成功誘導(dǎo)hBMSCs構(gòu)建出了具有良好組織學(xué)結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)組成和力學(xué)強(qiáng)度的軟骨組織，這種組織能夠滿足皮下移植不變形的要求。通過(guò)這些條件優(yōu)化組合，取得的誘導(dǎo)效果相當(dāng)穩(wěn)定而特異，這為軟骨缺損的修復(fù)重建提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)基礎(chǔ)。
應(yīng)用方法hBMSCs與可降解固態(tài)生物材料形成復(fù)合物后，在體外進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，當(dāng)適合軟骨缺損大小和形狀的組織工程化軟骨形成后，再植入體內(nèi)軟骨缺損部位。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)應(yīng)用自體細(xì)胞，且一次取材既可獲得足夠的細(xì)胞量；
(2)骨髓穿刺操作簡(jiǎn)單，對(duì)病人損傷極小，無(wú)需住院，且可以重復(fù)取材；(3)體外培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單易學(xué)，便于推廣應(yīng)用；(4)體外誘導(dǎo)方法操作簡(jiǎn)便，誘導(dǎo)效果確切可靠；(5)可按軟骨缺損大小和形狀預(yù)制移植物的大小和形狀，以達(dá)到精確的修復(fù)；(6)培養(yǎng)過(guò)程便于標(biāo)準(zhǔn)化，易于形成產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)品。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1hBMSCs的獲取和培養(yǎng)細(xì)胞取自人胸骨或者髂骨，供體年齡8-36歲，身體健康，無(wú)惡性腫瘤、傳染性疾病及血液系統(tǒng)疾病。
(1)取材麻醉滿意后，常規(guī)消毒鋪巾，16號(hào)穿刺針于胸骨或者髂骨部位穿刺，抽取骨髓6～8ml，置于肝素化的離心管中。
(2)分離有核細(xì)胞(以密度梯度離心法為例)將抽取的骨髓先后用5ml和1ml空針?lè)磸?fù)抽吸數(shù)次，轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，加入少量的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，混勻，3000rpm離心10分鐘，輕輕吸除脂肪及大部分上清液，注意不要攪動(dòng)下方的沉淀物，重新振蕩混勻，在另一15ml離心管內(nèi)加入新鮮配制的Percol分離液(購(gòu)自Pharmacia公司)，分離液表面輕輕加入上述的骨髓細(xì)胞懸液(體積為分離液的一半)，900g離心30分鐘，此時(shí)離心管內(nèi)液體分為四層第一層主要是血清和少量的培養(yǎng)液，第二層為有核細(xì)胞層，第三層為Percol分離液，第四層主要是沉淀下來(lái)的紅細(xì)胞。輕輕吸取第二層的有核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，加入適量的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液洗滌離心二次。
(3)接種棄上清，細(xì)胞以含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml的DMEM(購(gòu)自Gibco，Gland Island，NY，USA)培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，取少量細(xì)胞懸液用4％乙酸等體積稀釋破壞殘存的紅細(xì)胞，常規(guī)計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)，以2.5×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，常用的100mm塑料培養(yǎng)皿接種有核細(xì)胞1.5×107左右，加入細(xì)胞懸液9～10ml既可。
(4)培養(yǎng)與傳代將接種好的培養(yǎng)皿置于37℃、5％CO2、100％飽和濕度的條件下，培養(yǎng)48小時(shí)后首次換液，此時(shí)在低倍鏡下可清楚地見(jiàn)到多個(gè)克隆形成，吸除舊培養(yǎng)液，PBS洗滌2～3次，加入新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)，隔日更換三分之二量的培養(yǎng)液，一般4～5天后可達(dá)到融合狀態(tài)，可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)吸除培養(yǎng)液，以少量PBS洗滌一次，加入1.5-2.0ml的消化液(含0.02％EDTA及0.25％胰蛋白酶的PBS)，鏡下見(jiàn)大部分細(xì)胞胞質(zhì)回縮、形態(tài)變圓后，輕輕吸除消化液，加入適量的含血清的DMEM條件培養(yǎng)液中止消化，收集細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)，以1.5×104/cm2細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)。隔日更換三分之二量的培養(yǎng)液，一般4～5天后又可達(dá)到融合狀態(tài)，可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。以第2～6代細(xì)用于實(shí)驗(yàn)效果較佳。
倒置顯微鏡下觀察，hBMSCs呈長(zhǎng)梭形或多角形，原代細(xì)胞多呈克隆樣生長(zhǎng)，傳代后可形成單層，細(xì)胞接近會(huì)合時(shí)排列呈旋渦形。
實(shí)施例2PGA三維支架的制作無(wú)紡PGA纖維購(gòu)自Albany公司(Albany，NY，USA)，真空保存。纖維直徑13-15μm。將PGA纖維精確稱(chēng)量為6mg/塊，用特制的模具壓制成直徑5mm、厚2mm的圓柱體小塊，待形狀固定后，將材料支架完全浸入到75％乙醇中消毒30分鐘。PBS沖洗3遍，再用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基浸泡10分鐘，吸干后準(zhǔn)備接種細(xì)胞。
實(shí)施例3細(xì)胞接種、復(fù)合物誘導(dǎo)培養(yǎng)單層培養(yǎng)的第二代hBMSCs達(dá)到90％匯合時(shí)，應(yīng)用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化。細(xì)胞收集后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示活細(xì)胞數(shù)多于95％，1500rpm離心5min使細(xì)胞沉淀，棄去上清液，振蕩分散細(xì)胞，按5×107個(gè)細(xì)胞/cm3的密度將細(xì)胞懸液接種到圓柱形支架上。共制作24塊hBMSCs-PGA復(fù)合物，均于接種后在37℃、5％CO2、100％濕度的環(huán)境中靜態(tài)培養(yǎng)24小時(shí)。其中20塊復(fù)合物培養(yǎng)液應(yīng)用軟骨誘導(dǎo)液直接脈沖式滴加誘導(dǎo)刺激，具體成分包括高糖DMEM，10％FBS，50ng/ml TGF-β1，100ng/ml IGF-I和40ng/ml地塞米松。其余4塊復(fù)合物繼續(xù)應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基。所有構(gòu)建復(fù)合物在體外培養(yǎng)8周后取材檢測(cè)。
(a)、大體觀察體外誘導(dǎo)培養(yǎng)4周時(shí)，誘導(dǎo)組細(xì)胞-材料復(fù)合物能夠保持原有的大小和形狀，外觀已類(lèi)似軟骨組織，質(zhì)地柔韌并有一定彈性；未誘導(dǎo)組細(xì)胞-材料復(fù)合物明顯縮小變形，暗褐色，質(zhì)地柔軟無(wú)彈性。8周后，復(fù)合物仍能夠維持原大小與形狀，外觀上與正常軟骨更為接近，硬度與彈性均有所提高。見(jiàn)圖1(b)、組織學(xué)檢查HE染色體外誘導(dǎo)4周時(shí)即可見(jiàn)軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，但成熟的軟骨陷窩數(shù)量少，PGA纖維仍較多見(jiàn)，中央部位無(wú)細(xì)胞和基質(zhì)沉積，未誘導(dǎo)組含有大量纖維組織和支架材料，極少見(jiàn)到成熟的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)。8周后，成熟軟骨陷窩數(shù)量明顯增多，胞外基質(zhì)染色加深。見(jiàn)圖2Safranin-O染色本發(fā)明培養(yǎng)組新生軟骨均有陽(yáng)性染色。見(jiàn)圖3甲苯胺藍(lán)染色體外誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞外基質(zhì)中均有大量膠原沉積，而未誘導(dǎo)組染色明顯偏淡。見(jiàn)圖4II型膠原免疫組化體外誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞外基質(zhì)中較強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表明有大量軟骨特異性II型膠原沉積，而未誘導(dǎo)組為陰性。見(jiàn)圖5實(shí)施例4細(xì)胞-生物支架復(fù)合物形成及體內(nèi)植入與取材單層培養(yǎng)的第二代hBMSCs達(dá)到90％匯合時(shí)，應(yīng)用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化。細(xì)胞收集后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示活細(xì)胞數(shù)多于95％，1500rpm離心5min使細(xì)胞沉淀，棄去上清液，振蕩分散細(xì)胞，按5×107個(gè)細(xì)胞/cm3的密度將細(xì)胞懸液接種到圓柱形支架上。共制作24塊hBMSCs-PGA復(fù)合物，均于接種后在37℃、5％CO2、100％濕度的環(huán)境中靜態(tài)培養(yǎng)24小時(shí)。其中20塊復(fù)合物培養(yǎng)液應(yīng)用軟骨誘導(dǎo)液直接脈沖式滴加誘導(dǎo)刺激，具體成分包括高糖DMEM，10％FBS，50ng/mlTGF-β1，100ng/mlIGF-I和40ng/ml地塞米松。其余4塊復(fù)合物繼續(xù)應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基。4周后所有構(gòu)建復(fù)合物行裸鼠皮下移植，體內(nèi)培養(yǎng)4周后取材，對(duì)所形成的軟骨組織進(jìn)行評(píng)價(jià)。
大體觀察及組織學(xué)檢查體內(nèi)植入4周后，誘導(dǎo)后的細(xì)胞材料復(fù)合物可在裸鼠皮下形成組織工程化軟骨，新生軟骨均呈乳白色，質(zhì)實(shí)，有一定的彈性，周?chē)@軟組織膜，未見(jiàn)明顯的血管長(zhǎng)入軟骨內(nèi)。并且構(gòu)建組織與正常軟骨組織學(xué)形態(tài)相近，均有成熟的軟骨陷窩形成，軟骨特異性胞外基質(zhì)均染均勻而豐富(圖6，7)。
討論通過(guò)上述實(shí)例可以證實(shí)，hBMSCs與PGA三維支架材料制成的細(xì)胞-材料復(fù)合物，在體外培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)性給予TGFβ1、IGF-I等外源性生長(zhǎng)因子以及甾體類(lèi)激素的刺激與誘導(dǎo)，8周時(shí)能夠形成結(jié)構(gòu)完整的成熟軟骨組織，并在軟骨組織形成過(guò)程中PGA逐漸被降解；未誘導(dǎo)組細(xì)胞-材料復(fù)合物在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸收縮，組織學(xué)及免疫組化結(jié)果只見(jiàn)到及少量的軟骨樣組織形成。這表明接種在三維支架上的hBMSCs在TGFβ1等誘導(dǎo)因子作用下可以被誘導(dǎo)成為軟骨樣細(xì)胞，并且分泌軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)成分，最終在體外形成成熟的軟骨組織。
為觀察hBMSCs構(gòu)建的組織工程化軟骨能否在體內(nèi)皮下環(huán)境中較長(zhǎng)期存留且保持一定的外形，我們將體外誘導(dǎo)培養(yǎng)4周時(shí)構(gòu)建的軟骨樣組織植入裸鼠皮下，體內(nèi)4周后發(fā)現(xiàn)所形成的組織更加接近于體內(nèi)正常軟骨組織，說(shuō)明體外構(gòu)建的軟骨完全可以用于體內(nèi)移植及軟骨缺損的修復(fù)。這些結(jié)果充分證實(shí)了體外應(yīng)用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)hBMSCs構(gòu)建軟骨組織是可行的。當(dāng)然，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。如果再結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)與生物反應(yīng)器技術(shù)，則體外構(gòu)建的軟骨會(huì)更加成熟，而且成本也會(huì)大大降低，并有可能形成產(chǎn)業(yè)化的組織工程化軟骨產(chǎn)品。
本發(fā)明為應(yīng)用hBMSCs構(gòu)建軟骨提供了一個(gè)確實(shí)可行的技術(shù)體系，使用這種技術(shù)提供的簡(jiǎn)便方法，可以有效地體外誘導(dǎo)hBMSCs形成軟骨組織并能夠在體內(nèi)進(jìn)一步成熟。本發(fā)明人認(rèn)為T(mén)GF-β1、IGF-I和地塞米松等誘導(dǎo)因子均可能在不同程度上啟動(dòng)和維持了hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化的過(guò)程，而IGF-I更可能體現(xiàn)在對(duì)軟骨樣細(xì)胞功能表達(dá)的促進(jìn)作用上，本發(fā)明確定的生長(zhǎng)因子應(yīng)用劑量和方法恰恰能夠充分發(fā)揮各誘導(dǎo)劑對(duì)hBMSCs的促分化作用。而今后在本研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用轉(zhuǎn)染TGF-β1和/或IGF-I基因的hBMSCs作為種子細(xì)胞，不但克服了外源性細(xì)胞因子分布不均的缺點(diǎn)，而且節(jié)約成本，更加具有實(shí)際的應(yīng)用意義。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種組織工程化軟骨移植物，其特征在于，它包括(a)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞hBMSCs；(b)藥學(xué)上可接受的生物可降解材料。
2.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的hBMSCs是自體細(xì)胞，來(lái)源于髂骨、胸骨、肋骨等松質(zhì)骨。
3.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物為固態(tài)細(xì)胞材料復(fù)合物，且hBMSCs在復(fù)合物中的濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/cm3-5×108個(gè)細(xì)胞/cm3。
4.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其共聚物或混合物。
5.如權(quán)利要求1所述的移植物，其特征在于，移植物外形為人耳廓、鼻背、鼻翼、下頦、顴弓、眉弓、管狀、菱形、片狀、圓柱等多種形狀但不僅限于此。
6.一種如權(quán)利要求1所述的組織工程化軟骨移植物的制備方法，其特征在于，包括步驟將hBMSCs與藥學(xué)上可接受的生物可降解材料混合，形成復(fù)合物，其中hBMSCs在復(fù)合物中的濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/cm3-5×108個(gè)細(xì)胞/cm3。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，聯(lián)合應(yīng)用體外誘導(dǎo)劑，所述的體外誘導(dǎo)劑包含TGF-β1、IGF-I和地塞米松。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的體外誘導(dǎo)劑中TGF-β1的濃度為20-50ng/ml、IGF-I的濃度為100-500ng/ml、地塞米松的濃度為10-60ng/ml。
9.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，體外誘導(dǎo)劑的應(yīng)用時(shí)間為細(xì)胞接種到材料上之后24-148小時(shí)，體外誘導(dǎo)時(shí)間為4-10周。
10.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其共聚物或混合物，但不僅限于此。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種組織工程化軟骨移植物，它包括(a)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow stem cells，hBMSCs)；(b)藥學(xué)上可接受的，生物相容性良好的可降解材料。本發(fā)明的組織工程化軟骨可有效地進(jìn)行軟骨缺損的移植治療。本發(fā)明還提供了該組織工程化軟骨的具體構(gòu)建方法和多種用途。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1990054SQ200510112068
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者曹誼林, 周廣東, 劉天一, 劉偉, 崔磊 申請(qǐng)人:上海國(guó)睿生命科技有限公司