專利名稱：利用親水/疏水復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用親水/疏水復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)進(jìn)行脂肪酶固定化的方法，屬于生物工程中的酶固定化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂肪酶可在油-水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換、多肽合成及高聚物合成等多種有機(jī)反應(yīng)，已被廣泛應(yīng)用于食品、精細(xì)化工及制藥工業(yè)中。作為重要的生物催化劑，脂肪酶應(yīng)用的有效性和經(jīng)濟(jì)性很大程度上取決于酶的固定化。作為固定酶的載體很多，以膜作為脂肪酶固定的載體，結(jié)合了膜的分離功能、載體功能和分隔功能，具有其他載體不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。
在目前的研究中，從親水到疏水的各種平板或中空纖維膜材料用于脂肪酶的固定化已被報(bào)道。親水膜包括纖維素、聚酰胺和聚丙烯腈，疏水膜包括聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯和聚砜等。與其他類型的載體一樣，酶的固定法方法有吸附法、交聯(lián)法和包埋法等等。其中吸附法和交聯(lián)法是應(yīng)用較多的方法。但是化學(xué)方法(交聯(lián)和共價(jià)結(jié)合)固定酶無(wú)可避免的會(huì)導(dǎo)致酶部分活性位點(diǎn)的損失，從而降低酶的活力。同時(shí)還帶來(lái)制備成本高，而載體無(wú)法重復(fù)使用的問題。而吸附法雖然能很好的保持酶的活性，但是由于材料吸附性能的局限，酶的負(fù)載量太小，使得單位面積固定化酶膜的活力較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種利用特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜，用物理的手段實(shí)現(xiàn)脂肪酶固定化的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方按如下1)將親水性膜材料醋酸纖維素溶解在二甲基甲酰胺中，制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％-20％的膜液，靜置脫除氣泡；2)將疏水性聚四氟乙烯膜平鋪在玻璃板上，將步驟1)制備的親水性膜液刮涂在其表面，利用干-濕相轉(zhuǎn)換法使其成膜，制備得到由致密親水層和多孔疏水層組成的復(fù)合膜；3)將脂肪酶溶解在磷酸鈉緩沖溶液中，充分溶解后濾去溶液中的不溶物，得到酶蛋白濃度為84-167mg/L的脂肪酶溶液；4)將步驟2)制備的親水/疏水復(fù)合膜裝入一個(gè)死端過濾器，使其疏水層向上，將不同體積步驟3)制備的脂肪酶溶液注入過濾器，在0.3-0.6Mpa壓力下進(jìn)行過濾，實(shí)現(xiàn)脂肪酶的固定化。
上述技術(shù)方案中，步驟1)中所述的醋酸纖維素的優(yōu)選質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％。步驟2)中所述的干-濕相轉(zhuǎn)換法成膜是在溫度25℃，濕度40％條件下?lián)]發(fā)20分鐘，然后浸入去離子水凝膠浴固化成膜；步驟2)中所述的致密親水層的厚度為65-135μm。步驟2)中采用的疏水性聚四氟乙烯膜的孔徑0.1-1.0μm，厚度65-85μm，孔隙率50％-65％)。步驟3)中所述的磷酸鈉緩沖溶液為0.05M，pH7.3～7.7。
本發(fā)明與現(xiàn)有的固定化脂肪酶膜制備方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及突出效果①利用致密親水層的截留效果，使脂肪酶在過濾的過程中沉積在親水層和疏水層的結(jié)合面上和疏水層的膜孔中，利用物理的方法實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的固定化，方法簡(jiǎn)單，成本低；②脂肪酶在固定化過程中活力損失小，制備得到的固定化脂肪酶膜活力及其活力回收率高；③酶的負(fù)載量容易控制，范圍在0.002-0.08mg/cm2之間；④固定化酶膜的使用穩(wěn)定性較好；⑤載體可以再生重復(fù)使用，降低了成本。


圖1為親水/疏水復(fù)合膜固定化脂肪酶示意圖，其中1為多孔疏水層，2為致密親水層，2為固定化脂肪酶。
圖2為固定化脂肪酶膜的動(dòng)力學(xué)曲線。
圖3為脂肪酶負(fù)載量與固定化酶膜活力關(guān)系曲線。
圖4為固定化脂肪酶膜重復(fù)使用穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明設(shè)計(jì)并制備了以多孔聚四氟乙烯膜為疏水層，以醋酸纖維素制備致密親水層的復(fù)合膜，利用過濾的方法將脂肪酶截留并沉積在親水層和疏水層的結(jié)合面上和疏水層的膜孔中。通過對(duì)復(fù)合膜結(jié)構(gòu)(如親水層與疏水層的厚度、孔徑等)的調(diào)節(jié)對(duì)脂肪酶固定化環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化。酶的負(fù)載量通過改變脂肪酶溶液的濃度和過濾體積來(lái)控制。
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明。
實(shí)施例1采用平均孔徑0.1μm，孔隙率50％，厚度為85μm的聚四氟乙烯膜作為疏水層。親水層制膜液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％，控制醋酸纖維素親水層厚度為65μm，在溫度25℃，濕度40％條件下?lián)]發(fā)20分鐘，然后浸入去離子水凝膠浴固化成膜。將脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸鈉緩沖溶液中，得到酶蛋白濃度為167mg/L的脂肪酶溶液。將面積為26cm2膜裝入過濾器，加入15ml脂肪酶溶液，在0.6MPa下進(jìn)行過濾。復(fù)合膜對(duì)脂肪酶的一次過濾截留率為20％，得到脂肪酶蛋白負(fù)載量為0.0201mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
將固定化酶膜裝入兩相酶膜反應(yīng)器，油相采用0.05-1.0M(酯鍵濃度)橄欖油的異辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸鈉緩沖溶液，在37℃下，兩相流量為15ml/min，兩相循環(huán)進(jìn)行活力測(cè)定4h，得到固定化脂肪酶膜的動(dòng)力學(xué)曲線，如圖4所示。其中底物濃度為0.5M時(shí)，活力為1.24μmol-FFA/min cm2。
實(shí)施例2采用平均孔徑0.1μm，孔隙率50％，厚度為85μm的聚四氟乙烯膜作為疏水層。親水層制膜液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％，控制醋酸纖維素親水層厚度為135μm，在溫度25℃，濕度40％條件下?lián)]發(fā)20分鐘，然后浸入去離子水凝膠浴固化成膜。將脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸鈉緩沖溶液中，得到酶蛋白濃度為167mg/L的脂肪酶溶液。將面積為26cm2膜裝入過濾器，加入15ml脂肪酶溶液，在0.6MPa下進(jìn)行過濾。復(fù)合膜對(duì)脂肪酶的一次過濾截留率為22％，得到脂肪酶蛋白負(fù)載量為0.0212mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
將固定化酶膜裝入兩相酶膜反應(yīng)器，油相采用0.05-1.0M(酯鍵濃度)橄欖油的異辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸鈉緩沖溶液，在37℃下，兩相流量為15ml/min，兩相循環(huán)進(jìn)行活力測(cè)定4h，得到固定化脂肪酶膜的動(dòng)力學(xué)曲線，如圖4所示。其中底物濃度為0.5M時(shí)，活力為0.875μmol-FFA/min cm2。
實(shí)施例3采用平均孔徑0.1μm，孔隙率50％，厚度為85μm的聚四氟乙烯膜作為疏水層。親水層制膜液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％，控制醋酸纖維素親水層厚度為65μm，在溫度25℃，濕度40％條件下?lián)]發(fā)20分鐘，然后浸入去離子水凝膠浴固化成膜。將脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸鈉緩沖溶液中，得到酶蛋白濃度為84mg/L的脂肪酶溶液。將面積為26cm2膜裝入過濾器，加入10ml脂肪酶溶液，在0.3MPa下進(jìn)行過濾。復(fù)合膜對(duì)脂肪酶的一次過濾截留率為14.3％，得到脂肪酶蛋白負(fù)載量為0.0046mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
將固定化酶膜裝入兩相酶膜反應(yīng)器，油相采用橄欖油的異辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸鈉緩沖溶液，在37℃下，兩相流量為15ml/min，兩相循環(huán)進(jìn)行活力測(cè)定4h，底物濃度為0.5M時(shí)，得到固定化脂肪酶膜活力為0.25μmol-FFA/min cm2。
實(shí)施例4采用平均孔徑0.1μm，孔隙率50％，厚度為65μm的聚四氟乙烯膜作為疏水層。親水層制膜液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％，控制醋酸纖維素親水層厚度為65μm，在溫度25℃，濕度40％條件下?lián)]發(fā)20分鐘，然后浸入去離子水凝膠浴固化成膜。將脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸鈉緩沖溶液中，得到酶蛋白濃度為167mg/L的脂肪酶溶液。將面積為26cm2膜裝入過濾器，加入15ml脂肪酶溶液，在0.6MPa下進(jìn)行過濾。復(fù)合膜對(duì)脂肪酶的一次過濾截留率為20％，得到脂肪酶蛋白負(fù)載量為0.0201mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
將固定化酶膜裝入兩相酶膜反應(yīng)器，油相采用橄欖油的異辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸鈉緩沖溶液，在37℃下，兩相流量為15ml/min，兩相循環(huán)進(jìn)行活力測(cè)定4h，底物濃度為0.5M時(shí)，得到固定化脂肪酶膜活力為1.27μmol-FFA/min cm2。
實(shí)施例5采用平均孔徑1.0μm，孔隙率65％，厚度為85μm的聚四氟乙烯膜作為疏水層。親水層制膜液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％，控制醋酸纖維素親水層厚度為65μm，在溫度25℃，濕度40％條件下?lián)]發(fā)20分鐘，然后浸入去離子水凝膠浴固化成膜。將脂肪酶溶解在0.05M，pH7.5的磷酸鈉緩沖溶液中，得到酶蛋白濃度為84mg/L的脂肪酶溶液。將面積為26cm2膜裝入過濾器，加入20ml脂肪酶溶液，在0.6MPa下進(jìn)行過濾。復(fù)合膜對(duì)脂肪酶的一次過濾截留率為16.8％，得到脂肪酶蛋白負(fù)載量為0.0108mg/cm2的固定化脂肪酶膜。
將固定化酶膜裝入兩相酶膜反應(yīng)器，油相采用橄欖油的異辛烷溶液，水相采用0.05M，pH7.0的磷酸鈉緩沖溶液，在37℃下，兩相流量為15ml/min，兩相循環(huán)進(jìn)行活力測(cè)定4h，底物濃度為0.5M時(shí)，得到固定化脂肪酶膜活力為0.51μmol-FFA/min cm2。
權(quán)利要求
1.一種利用親水/疏水復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶的方法，該方法按如下步驟進(jìn)行1)將親水性膜材料醋酸纖維素溶解在二甲基甲酰胺中，制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％-20％的膜液，靜置脫除氣泡；2)將疏水性聚四氟乙烯膜平鋪在玻璃板上，將步驟1)制備的親水性膜液刮涂在其表面，利用干—濕相轉(zhuǎn)換法使其成膜，制備得到由致密親水層和多孔疏水層組成的復(fù)合膜；3)將脂肪酶溶解在磷酸鈉緩沖溶液中，充分溶解后濾去溶液中的不溶物，得到酶蛋白濃度為84-167mg/L的脂肪酶溶液；4)將步驟2)制備的親水/疏水復(fù)合膜裝入一個(gè)死端過濾器，使其疏水層向上，將不同體積步驟3)制備的脂肪酶溶液注入過濾器，在0.3-0.6Mpa壓力下進(jìn)行過濾，實(shí)現(xiàn)脂肪酶的固定化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用親水/疏水復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶的方法，其特征在于步驟1)中所述的醋酸纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用親水/疏水復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶的方法，其特征在于步驟2)中所述的干—濕相轉(zhuǎn)換法成膜是在溫度25℃，濕度40％條件下?lián)]發(fā)20分鐘，然后浸入去離子水凝膠浴固化成膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用親水/疏水復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶的方法，其特征在于步驟2)中所述的致密親水層的厚度為65-135μm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用親水/疏水復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶的方法，其特征在于步驟2)中采用的疏水性聚四氟乙烯膜的孔徑0.1-1.0μm，厚度65-85μm，孔隙率50％-65％)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用親水/疏水復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶的方法，其特征在于步驟3)中所述的磷酸鈉緩沖溶液為0.05M，pH7.3～7.7。
全文摘要
一種利用親水/疏水復(fù)合膜中的微結(jié)構(gòu)固定化脂肪酶的方法，屬于生物工程中的酶固定化領(lǐng)域。本發(fā)明先將親水性膜材料醋酸纖維素溶解在二甲基甲酰胺中，制成親水性膜液，再將疏水性聚四氟乙烯膜平鋪在玻璃板上，將親水性膜液刮涂在其表面，利用干－濕相轉(zhuǎn)換法制備得到由致密親水層和多孔疏水層組成的復(fù)合膜，并通過過濾的方法，利用其微結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)脂肪酶的固定化。本發(fā)明與現(xiàn)有的脂肪酶膜固定化方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)利用物理的方法實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的固定化，方法簡(jiǎn)單，成本低；脂肪酶在固定化過程中活力損失小，制備得到的固定化脂肪酶膜活力及其活力回收率高；酶的負(fù)載量容易控制；固定化酶膜的使用穩(wěn)定性較好；載體可以再生重復(fù)使用，降低了成本。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1800341SQ20051012636
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者王玉軍, 徐堅(jiān), 駱廣生, 戴猷元 申請(qǐng)人:清華大學(xué)