專利名稱::變異芽孢桿菌屬細菌的制作方法
技術領域:
:本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)有用的蛋白質(zhì)或多肽的宿主微生物、重組微生物、以及蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)方法。
背景技術:
:利用微生物的有用物質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn),以酒精飲料和味噌、醬油等的食品類為代表,還有氨基酸、有機酸、核酸相關物質(zhì)、抗菌素、糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等,其種類跨越多方面,而且關于其用途也擴展到廣泛的領域直至食品、醫(yī)藥和洗滌劑、化妝品等的日用品或各種化學合成品原料。在這樣的利用微生物的有用物質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)中,其生產(chǎn)率的提高是重要的課題之一,作為其手段,可以進行利用突變等的遺傳學手段的生產(chǎn)菌的育種。另一方面,由于微生物遺傳學、生物技術的發(fā)展,特別是最近,進行了使用基因重組技術等的更有效的生產(chǎn)菌的育種,推動了用于基因重組的宿主微生物的開發(fā)。作為使用基因重組技術的生產(chǎn)菌育種的方法,已知的有增強調(diào)節(jié)基因的表達的轉(zhuǎn)錄因子、特別是RNA聚合酶的σ因子的例子,例如,有報告例如下在熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)中,通過在營養(yǎng)增殖期中增加編碼參與生育所必需的基因的轉(zhuǎn)錄的主要σ因子(管家σ因子,housekeepingsigmafactor)的rpoD基因的復制數(shù),從而增加藤黃綠膿菌素(pyoluteorin)和2,4-二乙酰間苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol)等的抗菌素的生產(chǎn)量(例如,參照非專利文獻1)以及,還有報告例如下在谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicus)中,通過使管家的sigA基因過量表達,從而增加L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)量(例如,參照專利文獻1)。但是,這些都是在營養(yǎng)增值期中增強管家σ因子基因的表達。此外,在以枯草桿菌(Bacillussubtilis)為代表的芽孢桿菌屬細菌中,通過增強σ因子來增加有用物質(zhì)的生產(chǎn)量這樣的報告到目前為止還沒有。國際公開第2003/054179號小冊子[非專利文獻1]J.Bacteriol.,177,5387,(1995)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種變異芽孢桿菌屬細菌,其基因組或質(zhì)粒上具有在sigA基因或與該基因相當?shù)幕虻纳嫌芜B接有在孢子形成期被特異地識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列而形成的DNA。此外,本發(fā)明提供一種在該變異芽孢桿菌屬細菌中導入編碼異種蛋白質(zhì)或多肽的基因的重組微生物,以及,利用該重組微生物的蛋白質(zhì)或多肽的制造方法。此外,本發(fā)明提供一種變異芽孢桿菌屬細菌的構建方法,其特征在于,在芽孢桿菌屬細菌的基因組上或質(zhì)粒上具有在sigA基因或與該基因相當?shù)幕虻纳嫌芜B接有在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列而形成的DNA。是表示在孢子形成過程中的依次的σ因子的活化的示意圖;[圖2]是表示本發(fā)明sigA基因的構建例的概念圖。具體實施例方式本發(fā)明涉及提供一種使蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)率提高可能的變異芽孢桿菌屬細菌,在該變異芽孢桿菌屬細菌中導入了編碼異種蛋白質(zhì)或多肽的基因的重組微生物,以及,利用該重組微生物的蛋白質(zhì)或多肽的制造方法。芽孢桿菌屬細菌具有多個作為RNA聚合酶的亞單位、參與啟動子序列的識別的σ因子。識別不同的啟動子的σ因子,被認為與由除了σ因子以外的多個亞單位構成的RNA聚合酶軸心復合體(corecomplex)結合,從而轉(zhuǎn)錄不同的基因,由此,對于在基因組上存在數(shù)千個的基因,根據(jù)狀況進行基因的表達控制。例如,已知在芽孢桿菌屬細菌中,在枯草桿菌中鑒定有17個σ因子,以在營養(yǎng)增殖期中參與生長所必需的基因的轉(zhuǎn)錄的主要σ因子(管家σ因子)SigA為代表,還存在著控制孢子形成過程的σ因子SigH、SigF、SigE、SigG、SigK、控制鞭毛形成和細胞壁溶解的σ因子SigD、控制某種氨基酸和糖的代謝的σ因子SigL、控制對環(huán)境變化的響應的σ因子SigB或稱為ECFσ的σ因子等(BacillussubtilisandItsClosestRelativesFromGenestoCells,EditedbyA.L.Sonenshein,AmericanSocietyforMicrobiology,pp289,(2002))。其中,已知控制孢子形成過程的σ因子,如圖1所示地伴隨孢子形成過程的進行而依次表達、活化。即,當枯草桿菌陷于營養(yǎng)饑餓狀態(tài)時,首先經(jīng)過在稱為磷酸中繼系統(tǒng)(phospho-relaysystem)的多個蛋白質(zhì)間的多級磷酸傳遞系統(tǒng),而引起孢子形成起始控制因子Spo0A的磷酸化(Cell,64,545,(1991))。伴隨著磷酸化Spo0A(Spo0A~P)的濃度上升,抑制SigH的結構基因(sigH)的表達的抑制劑AbrB的誘導被抑制,結果,sigH的轉(zhuǎn)錄依賴于SigA而被誘導(J.Bacteriol.,173,521,(1991))。SigH被活化后,由于形成非對象隔膜,枯草桿菌的細胞質(zhì)分割為母細胞側(cè)和子細胞側(cè),隨后在子細胞側(cè)Spo0A~P與SigH共軛以誘導含有SigF的結構基因(sigF)的操縱子(spoIIAA-spoIIAB-sigF)的轉(zhuǎn)錄(Gene,101,113,(1991)),在母細胞側(cè)Spo0A~P和SigA共軛以誘導含有SigE前體的結構基因(sigE)的操縱子(spoIIGA-sigE)的轉(zhuǎn)錄(J.Bacteriol.,169,3329,(1987))。SigF通過抗-σ因子spoIIAB和抗-抗-σ因子spoIIAA、進而通過SpoIIAA的脫磷酸化酶SpoIIE控制活化(GenesCells,1,881(1996)),活化了的SigF誘導信號傳遞蛋白SpoIIR的結構基因(spoIIR)的轉(zhuǎn)錄。有研究認為,從子細胞側(cè)分泌的SpoIIR將局限在母細胞側(cè)的非對象隔膜處的SigE前體活化蛋白酶SpoIIGA活化,由此,引發(fā)SigE的活化(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92,2012,(1995)。而且,雖然在子細胞側(cè),SigF誘導SigG的結構基因(sigG)的轉(zhuǎn)錄,在母細胞側(cè),SigE誘導SigK的結構基因(sigK)的轉(zhuǎn)錄,但是在子細胞側(cè)的SigG的活化發(fā)生在母細胞側(cè)的SigE的活化之后,在母細胞側(cè)SigK的活化在其后引發(fā)(Mol.Microbiol.,31,1285,(1999))。有報告稱,在營養(yǎng)增殖期內(nèi),主要是SigA與RNA聚合酶軸心復合體會合,并誘導具有SigA識別的啟動子的基因或操縱子的轉(zhuǎn)錄,但是由于如上所述的結構,當進入孢子形成期而其它σ因子被活化時,引發(fā)與RNA聚合酶軸心復合體會合的σ因子的置換,與SigA會合的RNA聚合酶的量相對下降(J.Bacteriol.,179,4969,(1999))。因此,認為在孢子形成期以后,來自由SigA識別的啟動子的轉(zhuǎn)錄量相對下降。這種狀況之下,本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)通過將在孢子形成期中被特異識別、表達的啟動子與主要在營養(yǎng)增殖期內(nèi)參與生殖所必需的基因的轉(zhuǎn)錄的主要σ因子SigA的基因連接,可以在營養(yǎng)增殖期后的孢子形成期內(nèi)增強SigA的基因的表達,使該σ因子與RNA聚合酶軸心復合體的結合量增加,由此,實現(xiàn)孢子形成期以后的異種蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)率的提高。根據(jù)本發(fā)明的微生物,能夠有效生產(chǎn)該異種蛋白質(zhì)或多肽。在本發(fā)明中,氨基酸序列和堿基序列的同一性(identity),通過Lipman-Pearson法(Science,227,1435,(1985))計算。具體地說,通過使用遺傳信息處理軟件Genetyx-Win(軟件開發(fā))的同源性解析(Searchhomology)程序,將參數(shù)Unitsizetocompare(ktup)設為2進行分析而算出。本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌是如下構建的在其基因組上或者質(zhì)粒上具有在sigA基因或與該基因相當?shù)幕虻纳嫌翁庍B接有在孢子形成期內(nèi)特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列而形成的DNA。作為用于構建該變異芽孢桿菌屬細菌的親本微生物,如果是以進行孢子形成為特征的芽孢桿菌,則其來源沒有限定,可以是野生型的也可以是實施了變異的。其中,在本發(fā)明中使用的芽孢桿菌屬細菌的優(yōu)選例,可以舉出全基因組信息明確的、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、仙人掌桿菌(Bacilluscereus)、halodulans桿菌(Bacillushalodulans)等,特別是從基因工程學、基因組工程學技術已確立的觀點、或者具有在細菌體外分泌生產(chǎn)蛋白質(zhì)的能力的觀點出發(fā),優(yōu)選枯草桿菌??莶輻U菌的sigA基因是指編碼序列號1所示的氨基酸序列的基因,與該基因相當?shù)幕虮硎揪幋a在序列號1所示的氨基酸序列中具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98%以上的同源性的氨基酸序列的基因。雖然在該sigA基因或與該基因相當?shù)幕虻纳嫌翁庍B接有在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列,但是作為在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列,可以是天然來源的,也可以是對天然來源進行了改變的,或者也可以是化學合成的。例如,在枯草桿菌中,可以舉出具有以下(1)~(6)的任意一項特征的啟動子序列。(1)伴隨Spo0A~P濃度的上升,通過AbrB的轉(zhuǎn)錄抑制被解除,并且通過SigA識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列(2)通過SigH識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列(3)通過SigF識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列(4)通過SigE識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列(5)通過SigG識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列(6)通過SigK識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列通常,σ因子識別并結合存在于轉(zhuǎn)錄起始點的上游10堿基和35堿基附近的數(shù)個堿基的序列,分別稱為-10區(qū)域、-35區(qū)域。兩區(qū)域的序列、兩區(qū)域間隔的距離,已知每個σ因子各自具有共通的特征,稱為共有序列。因此,在上述(1)~(6)的啟動子序列中,可以示例,(1’)伴隨Spo0A~P濃度的上升而通過AbrB的轉(zhuǎn)錄抑制被解除,且含有SigA的共有序列的序列;(2’)含有SigH的共有序列的序列;(3’)含有SigF的共有序列的序列;(4’)含有SigE的共有序列的序列;(5’)含有SigG的共有序列的序列;(6’)含有SigK的共有序列的序列等。在表1中示出到此為止所報告的枯草桿菌的各個σ因子的共有序列。表1(BacillusSubtilisandItsClosestRelativesFromGenestoCells,EditedbyA.L.Sonenshein,AmericanSocietyforMicrobiology,pp289,(2002))序列中,R表示A或G,W表示A或T,N表示任意的堿基。此外,大寫字母表示保存性高,小寫字母表示保存性低。此外,到此為止報告的AbrB的識別結合序列用WaWWtttWCAAaaaaW表示(W表示A或T。此外,大寫字母表示保存性高,小寫字母表示保存性低)(J.Bacteriol.,177,6999,(1995))。如上所述,在本發(fā)明中的在孢子形成期中被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列是具有上述(1)~(6)或(1’)~(6’)的任意一種特征的啟動子序列。具有(1)或(1’)的任意一種的特征的啟動子序列中,作為天然來源的啟動子序列,可以舉出在表2中示出的枯草桿菌的基因或操縱子的啟動子;具有(2)或(2’)的任意一種的特征的啟動子序列中,作為天然來源的啟動子序列,可以舉出在表3中示出的枯草桿菌的基因或操縱子的啟動子;具有(3)或(3’)的任意一種的特征的啟動子序列中,作為天然來源的啟動子序列,可以舉出在表4中示出的枯草桿菌的基因或操縱子的啟動子;具有(4)或(4’)的任意一種的特征的啟動子序列中,作為天然來源的啟動子序列,可以舉出在表5中示出的枯草桿菌的基因或操縱子的啟動子;具有(5)或(5’)的任意一種的特征的啟動子序列中,作為天然來源的啟動子序列,可以舉出在表6中示出的枯草桿菌的基因或操縱子的啟動子;具有(6)或(6’)的任意一種的特征的啟動子序列中,作為天然來源的啟動子序列,可以舉出在表7中示出的枯草桿菌的基因或操縱子的啟動子。此外,表中的各個基因的名稱、編號和功能等基于Nature,390,249-256,(1997)所報告、且由JAFANJapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillusSubtilis(BSORFDB)因特網(wǎng)公開(http://bacillus.genome.ad.jp/,2003年6月17日更新)的枯草桿菌基因組數(shù)據(jù)而記載。表2(BacillusSubtilisandothergram-positivebacteria;biochemistry,physiology,andmoleculargenetics,EditedbyA.L.Sonenshein,AmericanSocietyforMicrobiology,pp757,(1993);J.Bacteriol.,177,6999,(1995))表中,關于操縱子,示出了轉(zhuǎn)錄單位的前端的基因名稱。表3(BacillussubtilisandItsClosestRelativesFromGenestoCells,EditedbyA.L.Sonenshein,AmericanSocietyforMicrobiology,pp289,(2002))表中,關于操縱子,示出了轉(zhuǎn)錄單位的前端的基因名。表4(BacillussubtilisandItsClosestRelativesFromGenestoCells,EditedbyA.L.Sonenshein,AmericanSocietyforMicrobiology,pp289,(2002))表中,關于操縱子,示出了轉(zhuǎn)錄單位的前端的基因名。表5(BacillussubtilisandItsClosestRelativesFromGenestoCells,EditedbyA.L.Sonenshein,AmericanSocietyforMicrobiology,pp289,(2002))表中,關于操縱子,示出了轉(zhuǎn)錄單位的前端的基因名。表6(BacillussubtilisandItsClosestRelativesFromGenestoCells,EditedbyA.L.Sonenshein,AmericanSocietyforMicrobiology,pp289,(2002))表中,關于操縱子,示出了轉(zhuǎn)錄單位的前端的基因名。表7(BacillussubtilisandItsClosestRelativesFromGenestoCells,EditedbyA.L.Sonenshein,AmericanSocietyforMicrobiology,pp289,(2002))表中,關于操縱子,示出了轉(zhuǎn)錄單位的前端的基因名。如上所述,作為在本發(fā)明中所使用的在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的適合的例子,可以舉出具有上述(1)~(6)或(1’)~(6’)的任意一種的特征的啟動子。另一方面,由于也有報告例在枯草桿菌中,SigE對RNA聚合酶顯示比SigA更高的親和性(J.Bacteriol.,179,4969,(1999)),因此更適合地,優(yōu)選利用在SigE活化以前轉(zhuǎn)錄活化的啟動子。作為更優(yōu)選的該啟動子序列,可以舉出,伴隨Spo0A~P濃度的上升通過AbrB的轉(zhuǎn)錄抑制被解除、并且通過SigA識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列(與上述(1)或(1’)相當)、或者通過SigH識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列(與上述(2)或(2’)相當)。具有上述(1)或(1’)的任意一種的特征的啟動子序列中,作為天然來源的啟動子序列,可以舉出表1中所示的枯草桿菌的基因或操縱子的啟動子序列,其中作為特別適合的例子,可以舉出枯草桿菌的sigH的啟動子序列??莶輻U菌的sigH的啟動子序列為含有序列號2所示的堿基序列中的堿基號987~1027的堿基序列、優(yōu)選堿基號987~1047的堿基序列、更優(yōu)選堿基號1~1047的堿基序列的、堿基長度在5000個堿基對以內(nèi)、優(yōu)選在2000個堿基對以內(nèi)、更優(yōu)選在1047個堿基對以內(nèi)的堿基序列,并且其具有與該基因的啟動子同源的啟動子功能。此外,具有上述(2)或(2’)的任意一種的特征的啟動子序列中,作為天然來源的啟動子序列,可以舉出表2中所示的枯草桿菌的基因或操縱子的啟動子,其中作為特別適合的例子,可以舉出枯草桿菌的spoIIAA-spoIIAB-sigF操縱子(spoIIA操縱子)的啟動子序列??莶輻U菌的spoIIA操縱子的啟動子序列,是含有序列號3所示的堿基序列中的堿基號為1081~1110的堿基序列、優(yōu)選堿基號為1081~1118的堿基序列、更優(yōu)選堿基號為1~1143個的堿基序列的、堿基長度在5000個堿基對以內(nèi)、優(yōu)選在2000個堿基對以內(nèi)、更優(yōu)選在1143個堿基對以內(nèi)的堿基序列,并且是具有與該基因的啟動子同源的啟動子功能的堿基序列。此外,作為在本發(fā)明中使用的孢子形成期內(nèi)被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列,含有與表1~表6記載的枯草桿菌的各基因或各操縱子的啟動子序列相當?shù)男蛄?。例如,作為與枯草桿菌的sigH基因的啟動子序列相當?shù)男蛄?,是含有對序列?所示的堿基序列中的堿基號為987~1027的堿基序列、優(yōu)選堿基號為1081~1118的堿基序列、更優(yōu)選堿基號為1~1143的堿基序列,1個或多個堿基被置換、缺失或插入的堿基序列的、堿基長度在5000個堿基對以內(nèi)、優(yōu)選在2000個堿基對以內(nèi)、更優(yōu)選在1047個堿基對以內(nèi)的堿基序列,并且可以舉出具有與該基因的啟動子同源的啟動子功能的DNA片段。此外,作為與spoIIA操縱子的啟動子序列相當?shù)男蛄?,是對含有序列?所示的堿基序列中的堿基號為1081~1110的堿基序列、優(yōu)選堿基號為1081~1118的堿基序列、更優(yōu)選堿基號為1~1143的堿基序列,1個或多個堿基被置換、缺失或插入的堿基序列的、堿基長度在5000個堿基對以內(nèi)、優(yōu)選在2000個堿基對以內(nèi)、更優(yōu)選在1118個堿基對以內(nèi)的堿基序列,并且可以舉出具有與該操縱子的啟動子同源的啟動子功能的DNA片段。而且,通過在本發(fā)明中使用的特異性地參與孢子形成期的轉(zhuǎn)錄的σ因子而識別的啟動子序列中,也可以含有構成表2或表3記載的枯草桿菌的基因或枯草桿菌的操縱子的基因的直向同源(ortholog)基因的啟動子序列,優(yōu)選芽孢桿菌屬細菌來源的該直向同源基因的啟動子序列。直向同源基因可以通過使用在因特網(wǎng)上公開的微生物基因組數(shù)據(jù)庫(MicrobialGenomeDatabase,MBGD,http://mbgd.genome.ad.jp/)的Create/viewOrthologousgenetable程序而發(fā)現(xiàn)。作為枯草桿菌sigH基因的直向同源基因的例子,可以舉出halodulans桿菌的sigH(BH0115)基因以及仙人掌桿菌的BC0114基因等。此外,作為構成枯草桿菌的spoIIA操縱子的各基因的直向同源基因,可以舉出,halodulans桿菌的sigF(BH1538)基因、spoIIAB(BH1537)基因、或spoIIAA(BH1536),以及仙人掌桿菌的BC4072基因、BC4073基因以及BC4074基因等。通過特異性參與在該孢子形成期中的轉(zhuǎn)錄的σ因子而識別的啟動子序列,除了單獨使用上述啟動子序列,還可以組合多種而使用。在孢子形成期中被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列結合在枯草桿菌的sigA基因或與該基因相當?shù)幕虻纳嫌味纬傻腄NA,例如,可以在原始枯草桿菌基因組上存在的sigA基因的上游存在的SigA識別的啟動子序列的上游或下游,通過插入含有在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的DNA片段,而在基因組上構建。并且,插入含有在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的DNA片段的部位可以為sigA基因或與該基因相當?shù)幕虻纳嫌?,但是?yōu)選在sigA結構基因的上游側(cè)鄰接的2000個堿基對以內(nèi)的區(qū)域、更優(yōu)選1000個堿基對以內(nèi)的區(qū)域、進一步優(yōu)選500個堿基對以內(nèi)的區(qū)域、特別優(yōu)選1~198個堿基對以內(nèi)的區(qū)域。但是,在含有在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的DNA片段不含有適當?shù)暮颂求w結合部位的序列的情況下,優(yōu)選將該DNA片段插入自sigA結構基因15個堿基對以上的上游處。此外,將在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的連接到sigA基因或與該基因相當?shù)幕虻纳嫌蝹?cè)的DNA可以通過PCR等方法構建。并且,來源于從連接部位到sigA結構基因之間的、原始枯草桿菌基因組上存在的sigA基因的上游序列的序列,優(yōu)選為0~2000個堿基對,更優(yōu)選0~1000個堿基對、進一步優(yōu)選0~500個堿基對、特別優(yōu)選0~198個堿基對。但是,在含有在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的DNA片段不含有適當?shù)暮颂求w結合部位的序列的情況下,優(yōu)選來源于從連接部位到sigA結構基因之間的、在原始枯草桿菌基因組上存在的sigA基因的上游序列的序列為15個堿基對以上。為了構建本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌,可以將由此構建的DNA重新導入親本芽孢桿菌屬細菌中。例如,可以采用的方法如下通過PCR等方法制備連接了含有在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的DNA片段和含有sigA基因等的DNA片段的DNA片段,并將其克隆而攝入至可在親本芽孢桿菌屬細菌內(nèi)復制的質(zhì)粒載體上。特別地,在作為用于構建本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌的親本芽胞桿菌屬細菌而使用枯草桿菌的情況下,作為可以復制的質(zhì)粒載體,可以采用以pUB110(Plasmid,15,93,(1986))、pC194(J.Bacteriol.,150,815,(1982))、pTX14-3(Plasmid,30,119,(1993))為代表而已報告的許多質(zhì)粒載體,?;蛘撸梢詫⒑性阪咦有纬善诒惶禺愖R別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的DNA片段連接至含有sigA基因等的DNA片段的上游的DNA片段,通過同源重組等方法導入基因組上。關于利用同源重組將DNA片段導入基因組上的方法,已經(jīng)有若干報告(Mol.Gen.Genet.,223,268(1990)等),根據(jù)報告中的方法,可以得到本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌。以下,更具體地說明,制備連接有通過SOE(重疊延伸拼接法,splicingbyoverlapextension)-PCR法(Gene,77,51,1989)制備的含有在孢子形成期被特異地識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的DNA片段和含有sigA基因的DNA片段的DNA片段,通過利用同源重組將該DNA片段導入基因組上的方法,但是在本發(fā)明中的該DNA片段的導入方法并不限于下述內(nèi)容。在本發(fā)明中,首先,通過第一次的PCR制備,含有在孢子形成期被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的DNA片段、管家σ因子的結構基因片段、以及耐藥標記基因片段3個片段,但是,此時例如使用,按照在含有該啟動子序列的DNA片段的下游末端添加管家σ因子的結構基因片段的上游側(cè)10~30個堿基對序列,在耐藥標記基因片段的上游末端逆向添加管家σ因子的結構基因片段的下游側(cè)10~30個堿基對序列的方式設計的引物(圖2)。隨后,將第一次制備的3種PCR片段作為模板,通過使用含有該啟動子序列的片斷的上游側(cè)引物和耐藥標記基因片段的下游側(cè)引物進行第二次PCR,在含有該啟動子序列的片段的下游末端和耐藥標記基因片段的上游末端添加的sigA基因片段序列中,發(fā)生與sigA基因片段的復性,PCR擴增的結果,可以得到,在sigA基因的上游連接有通過特異性參與孢子形成期的轉(zhuǎn)錄的σ因子而識別的啟動子序列、并且在其下游連接有耐藥標記基因的DNA片段。作為在孢子形成期內(nèi)被特異識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列,使用枯草桿菌的sigH基因或spoIIA操縱子的啟動子,作為耐藥標記基因,使用耐氯霉素基因的情況下,例如,可以通過使用表8中所示的引物組,使用PyrobestDNA聚合酶(寶酒造)等通常的PCR用酶試劑盒等,根據(jù)出版物(PCRProtocols.CurrentMethodsandApplications.,EditedbyB.A.White,HumanaPress,pp251(1993)、Gene,77,61,(1989)等)所示的通常的條件進行SOE-PCR,而得到希望的DNA片段。將由此得到的DNA片段導入例如枯草桿菌基因組上的情況下,克隆至在枯草桿菌細胞內(nèi)不能夠復制的質(zhì)粒載體例如pMW219(JapanGene),通過細胞感受態(tài)法(competent法)攝入至細胞內(nèi)時,在質(zhì)粒上的管家σ因子的基因區(qū)域和基因組上的sigA基因區(qū)域之間發(fā)生同源重組,通過根據(jù)耐藥標記基因的選擇,可以分離含有結合有在孢子形成期內(nèi)被特異地識別、轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的sigA基因的DNA片段被和質(zhì)粒載體一起共同導入在基因組上的細胞(圖2)。即,將克隆用表3所示的引物組制備的DNA片段至pMW219上的質(zhì)粒攝入枯草桿菌細胞內(nèi)時,分離在含有氯霉素的瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落,可以通過將基因組作為模板的PCR法等確認,連接有sigH基因或spoIIA操縱子的啟動子區(qū)域和sigA基因的DNA片段被導入到基因組上。以上主要表示了使用枯草桿菌作為親本芽孢桿菌屬細菌的情況,但是對于其它芽孢桿菌屬細菌,也同樣可以得到本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌。通過使用由此得到的芽孢桿菌屬細菌,在異種蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)中,由于進行編碼異種蛋白質(zhì)或多肽的基因的轉(zhuǎn)錄以及參與蛋白質(zhì)生產(chǎn)的各種基因的轉(zhuǎn)錄的SigA在孢子形成期被表達增強,所以可以達到生產(chǎn)率的提高。即,在通過SigA識別的啟動子的下游結合了編碼作為目標的蛋白質(zhì)或多肽的基因后,通過將其導入根據(jù)本發(fā)明得到的變異芽孢桿菌屬細菌中,由于不僅在營養(yǎng)增殖期而且在孢子形成期目標蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)連續(xù),所以與親本芽胞桿菌屬細菌相比,生產(chǎn)大量的目標蛋白質(zhì)或多肽。目標蛋白質(zhì)或多肽的基因,沒有特別限制,包括洗劑、食品、纖維、飼料、化學品、醫(yī)療、診斷等各種工業(yè)用酶以及生物活性肽等。此外,按照工業(yè)用酶的功能種類,包括氧化還原酶(Oxidoreductase)、轉(zhuǎn)移酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、裂合酶(Lyase)、異構酶(Isomerase)、合成酶(Ligase/Synthetase)等,但是優(yōu)選的可以舉出纖維素酶、α-淀粉酶、蛋白酶等水解酶的基因。具體地說,可以舉出屬于多糖水解酶的分類(Biochem.J.,280,309(1991))中第5族的纖維素酶,可以舉出其中微生物來源、特別是芽孢桿菌屬細菌來源的纖維素酶。作為更具體的例子,可以舉出由序列號4或序列號6所表示的氨基酸序列所組成的、芽孢桿菌sp(Bacillussp.)KSM-S237株(FERMBP-7875)或芽胞桿菌sp(Bacillussp.)KSM-64株(FERMBP-2886)來源的堿性纖維素酶,或者由與該氨基酸序列具有70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98%以上的同一性的氨基酸序列構成的纖維素酶。此外,作為α-淀粉酶的具體例子,可以舉出微生物來源的α-淀粉酶,特別優(yōu)選芽胞桿菌屬細菌來源的液化型淀粉酶。作為更具體的例子,可以舉出由序列號19所表示的氨基酸序列構成的芽胞桿菌屬sp(Bacillussp.)KSM-K38株(FERMBP-6946)來源的堿性淀粉酶,或者與該氨基酸序列具有70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98%以上的同一性的氨基酸序列所構成的淀粉酶。而且,氨基酸序列的同一性通過Lipman-Pearson法(Science,227,1435,(1985))計算。此外,作為蛋白酶的具體例子,可以舉出微生物來源的、特別是芽胞桿菌屬細菌來源的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。作為更具體的例子,可以舉出由序列號21所表示的氨基酸序列組成的克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)KSM-K16株(FERMBP-3376)來源的堿性蛋白酶,或者由與該氨基酸序列具有70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98%以上的同一性的氨基酸序列所組成的蛋白酶。另一方面,如前所述的目標蛋白質(zhì)或多肽基因,需要在其上游結合通過SigA等的管家σ因子識別的啟動子序列,而且,還希望適當結合與翻譯、分泌有關的控制區(qū)域,即,含有核糖體結合部位和起始密碼子的翻譯起始區(qū)域和分泌用信號肽區(qū)域。例如,希望含有由日本特開2000-210081號公報和日本特開平4-190793號公報等中記載的芽孢桿菌屬細菌、即KSM-S237株(FERMBP-7875)、KSM-64株(FERMBP-2886)來源的纖維素酶基因的管家σ因子轉(zhuǎn)錄的啟動子的轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)域、翻譯起始區(qū)域、分泌用信號肽區(qū)域,更具體地說,由序列號5所表示的堿基序列的堿基號為1~659的堿基序列、序列號7所表示的堿基序列所組成的纖維素酶基因的堿基號為1~696的堿基序列,或者對該堿基序列具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98%以上的同一性的堿基序列所構成的DNA片段,或者由上述任意堿基序列的一部分缺失的堿基序列組成的DNA片段,與目標蛋白質(zhì)或多肽的結構基因適當?shù)亟Y合??梢酝ㄟ^將結合了含有上述目標蛋白質(zhì)或多肽基因的DNA片段和適當?shù)馁|(zhì)粒載體的重組質(zhì)粒,按照一般的轉(zhuǎn)化法攝入到本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌中,從而使目標蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)率提高。此外,通過使用在該DNA片段上將與本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌基因組的適當?shù)耐磪^(qū)域相結合的DNA片段,直接編入本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌基因組中,從而使目標蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)率提高。將本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌作為宿主的目標蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn),可以通過將該菌株接種到含有同化性的碳源、氮源以及其它必需成分的培養(yǎng)基中,按照常規(guī)的微生物培養(yǎng)方法培養(yǎng),培養(yǎng)結束后,采取·精制蛋白質(zhì)或多肽而進行。根據(jù)以上所述,可以構建在孢子形成期的sigA基因的轉(zhuǎn)錄效率提高的芽孢桿菌屬細菌,如果用該變異芽孢桿菌屬細菌作為重組生產(chǎn)的宿主細胞,可以有效生產(chǎn)有用的蛋白質(zhì)或多肽。以下,用實施例對本發(fā)明的變異芽孢桿菌屬細菌的構建方法以及使用該變異芽孢桿菌屬細菌作為宿主的纖維素酶的生產(chǎn)方法進行具體說明。實施例實施例1用于將具有在孢子形成期被特異轉(zhuǎn)錄的啟動子的sigA基因?qū)氲娇莶輻U菌基因組上的質(zhì)粒的構建與圖2所示的方法同樣,進行用于利用1次交叉的同源重組而向枯草桿菌基因組上導入在sigA結構基因的上游連接有sigH基因啟動子或spoIIA操縱子啟動子的DNA片段的質(zhì)粒的構建。即,將從枯草桿菌168株提取的基因組DNA作為模板,用表8中所示的sigAf和sigAr的引物組通過PCR制備含有sigA基因的1.2kb片段(A)。同樣用如表8所示的sigHUf和sigHUr-sigA的引物組,制備含有在基因組上的sigH基因的上游處鄰接的sigH基因的啟動子的1.0kb片段(B)。同樣用如表8所示的sigFUf和sigFUr-sigA的引物組,制備含有在基因組上的spoIIA操縱子的上游處鄰接、控制sigF基因的轉(zhuǎn)錄的spoIIA操縱子的啟動子的1.1kb片段(C)。此外,將質(zhì)粒pC194(J.Bacterio.150(2),815(1982))作為模板,用表8中所示的CmFW和Cmr-sigA的引物組制備含有耐氯霉素抗基因的0.9kb片段(D)。隨后,將得到的(A)(B)(D)3片段混合后作為模板,通過進行用表8中所示的sigHUf和CmFW的引物組的SOE-PCR,按照使3片段成為(B)(A)(D)的順序結合,sigH基因的啟動子連接在sigA結構基因的上游處,更進一步得到在其下游逆向結合有耐氯霉素基因的3.1kb的DNA片段(E)。同樣將(A)(C)(D)3片段混合后作為模板,通過進行使用表8中所示的sigFUf和CmFW的引物組的SOE-PCR,按照成為(C)(A)(D)的順序的方式將3片段結合,得到spoIIA操縱子啟動子連接在sigA結構基因的上游,而且在其下游逆向結合有耐氯霉素基因的3.2kb的DNA片段(F)。將3.1kb的DNA片段(E)和3.2kb的DNA片段(F)分別插入不能在枯草桿菌細胞內(nèi)復制的大腸桿菌用質(zhì)粒載體pMW219的SmaI限制性內(nèi)切酶的切斷點,構建用于將具有在孢子形成期被特異轉(zhuǎn)錄的啟動子的sigA基因?qū)肟莶輻U菌基因組上的質(zhì)粒pMWPHsigA和pMWPFsigA。此外,上述引物中,通過分別用表8中所示的sigAmf和sigFUr-sigAm取代sigAf和sigFUr-sigA而進行同樣的操作,構建將pMWPFsigA中的sigA基因的起始密碼子(ATG)置換為作為起始密碼子不被識別的(ATA)的pMWPFsigAm。實施例2將具有在孢子形成期被特異轉(zhuǎn)錄的啟動子的sigA基因向枯草桿菌168株的基因組的導入使用將具有在孢子形成期被特異轉(zhuǎn)錄的啟動子的sigA基因或起始密碼子(ATG)被置換為(ATA)的sigA基因(sigAm)導入到枯草桿菌基因組上的質(zhì)粒pMWPHsigA、pMWPFsigA和pMWPFsigAm,通過細胞感受態(tài)法(competent法),分別進行枯草桿菌168株的轉(zhuǎn)化,將在含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落作為轉(zhuǎn)化體分離。通過將從所得的轉(zhuǎn)化體提取的基因組作為模板進行PCR,根據(jù)基因組上的sigA基因和質(zhì)粒上的sigA基因或sigAm之間的同源重組,確認,具有在孢子形成期被特異轉(zhuǎn)錄的啟動子的sigA或sigAm,與1.2kb片段(D)一起被插入基因組內(nèi),命名為168PHsigA株、168PFsigA株和168PFsigAm株。實施例3枯草桿菌變異株的堿性纖維素酶的分泌生產(chǎn)評價在實施例2中所得的3種枯草桿菌變異株(168PHsigA株、168PFsigA株和168PFsigAm株)和作為對照的的枯草桿菌168株中,通過轉(zhuǎn)化法導入在穿梭載體pHY300PLK(Yakult)的BamHI限制性內(nèi)切酶的切斷點處插入有編碼芽孢桿菌sp(Bacillussp.)KSM-S237株(FERMBP-7875)來源的堿性纖維素酶(日本特開2000-210081號公報)的DNA片段(3.1kb)的重組質(zhì)粒pHY-S237。將由此得到的菌株在10mL的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜,并將該培養(yǎng)液0.05mL接種到50mL的2×L-麥芽糖培養(yǎng)基(2%胰胨、1%酵母提取物、1%NaCl、7.5%麥芽糖、7.5ppm硫酸錳4-5水合物和15ppm四環(huán)素)中,在30℃進行振蕩培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后,測定通過離心分離除去菌體的培養(yǎng)液上清液的堿性纖維素酶活性,從而求得通過培養(yǎng)在菌體外分泌生產(chǎn)的堿性纖維素酶的量。其結果,如表9所示,和對照的168株(野生型)的情況相比,作為宿主使用168PHsigA株或168PFsigA株的情況可以看到高的堿性纖維素酶的分泌生產(chǎn)。另一方面,從作為宿主使用168PFsigAm的情況下的堿性纖維素酶的分泌量與對照的168株(野生型)相等,可以推測,在168PHsigA株或168PFsigA株中的高生產(chǎn)化,通過具有在基因組上新添加的sigH基因或spoIIA操縱子的啟動子的sigA基因,從而生產(chǎn)了SigA而引起的。表8表9實施例4枯草桿菌變異株的堿性蛋白酶的分泌生產(chǎn)的評價為了確認在實施例3中證明了堿性纖維素酶的生產(chǎn)率的提高的168PHsigA株和168PFsigA株在其它蛋白質(zhì)或多肽生產(chǎn)中的有效性,如以下那樣進行芽孢桿菌屬細菌來源的堿性蛋白酶的生產(chǎn)率的評價。將從克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)KSM-K16株(FERMBP-3376)提取的基因組DNA作為模板,用表10中所示的S237pKAPpp-F和KAPter-R(BglII)的引物組進行PCR,擴增編碼具有序列號21所示的氨基酸序列的堿性蛋白酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.,43,473,(1995))的1.3kb的DNA片段(G)。此外,將從芽孢桿菌sp(Bacillussp.)KSM-S237株(FERMBP-7875)提取的基因組DNA作為模板,用表10中所示的S237ppp-F2(BamHI)和S237pKAPpp-R的引物組進行PCR,擴增含有堿性纖維素酶基因(日本特開2000-210081號公報)的啟動子區(qū)域的0.6kb的DNA片段(H)。隨后,將所得的(G)(H)2個片段混合作為模板,通過進行用表10中所示的S237ppp-F2(BamHI)和KAPter-R(BglII)的引物組的SOE-PCR,得到在堿性纖維素酶基因的啟動子區(qū)域的下游處連接有堿性蛋白酶基因的1.8kb的DNA片段(I)。將得到的1.8kb的DNA片段(I)插入穿梭載體pHY300PLK(Yakult)的BamHI-BglII限制性內(nèi)切酶的切斷點,構建堿性蛋白酶生產(chǎn)率評價用的質(zhì)粒pHYKAP(S237p)。將構建的質(zhì)粒pHYKAP(S237p),通過轉(zhuǎn)化體細胞感受態(tài)法導入168PHsigA株、168PFsigA株和作為對照的枯草桿菌168株中。將由此得到的菌株按照與實施例3相同的條件,振蕩培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后,測定通過離心分離除去細胞體的培養(yǎng)液上清液的堿性蛋白酶活性,從而求得通過培養(yǎng)在細胞體外分泌生產(chǎn)的堿性蛋白酶的量。結果,如表11所示,確認和對照的168株(野生型)的情況相比較,使用作為宿主的168PHsigA株和168PFsigA株的情況下,堿性蛋白酶的分泌生產(chǎn)高。表10表11實施例5枯草桿菌變異株的堿性淀粉酶的分泌生產(chǎn)的評價在實施例3和4中證明了堿性纖維素酶和堿性蛋白酶的生產(chǎn)率提高,為了進一步確認168PHsigA株和168PFsigA株在生產(chǎn)其它蛋白質(zhì)或多肽中的有效性,以下進行芽孢桿菌屬細菌來源的堿性淀粉酶的生產(chǎn)率的評價。將從芽孢桿菌sp(Bacillussp.)KSM-K38株(FERMBP-6946)提取的基因組DNA作為模板,用表10中所示的K38matu-F2(ALAA)和SP64K38-R(XbaI)的引物組進行PCR,擴增為具有序列號19所示的氨基酸序列的編碼堿性淀粉酶(Appl.Environ.Microbiol.,67,1744,(2001))的1.5kb的DNA片段(J)。此外,將從芽孢桿菌sp(Bacillussp.)KSM-S237株(FERMBP-7875)提取的基因組DNA作為模板,用表10中所示的S237ppp-F2(BamHI)和S237ppp-R2(ALAA)的引物組進行PCR,擴增含有堿性纖維素酶基因(日本特開2000-210081號公報)的啟動子區(qū)域和編碼分泌信號序列的區(qū)域的0.6kb的DNA片段(K)。隨后,將所得的(J)(K)的2個片段混合后作為模板,用表10中所示的S237ppp-F2(BamHI)和SP64K38-R(XbaI)的引物組通過進行SOE-PCR,在堿性纖維素酶基因的啟動子區(qū)域和編碼分泌信號序列的區(qū)域的下游處連接堿性淀粉酶基因,得到2.1kb的DNA片段(L)。將得到的2.2kb的DNA片段(L)導入穿梭載體pHY300PLK(Yakult)的限制性內(nèi)切酶的切斷點BamHI-XbaI,從而構建用于堿性淀粉酶生產(chǎn)率評價的質(zhì)粒pHYK38(S237ps)。將構建的質(zhì)粒pHYK38(S237ps),通過轉(zhuǎn)化體細胞感受態(tài)法導入168PHsigA株、168PFsigA株和作為對照的枯草桿菌168株中。將由此得到的菌株按照與實施例3相同的條件,振蕩培養(yǎng)5天。培養(yǎng)后,測定通過離心分離除去細胞體的培養(yǎng)液上清液的堿性淀粉酶活性,從而求得通過培養(yǎng)在細胞體外分泌生產(chǎn)的堿性淀粉酶的量。結果,如表12所示,證明了和對照的168株(野生型)的情況相比較,在使用作為宿主的168PHsigA株和168PFsigA株的情況下,堿性淀粉酶的分泌生產(chǎn)高,上述變異株顯示出在各種蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)中有效。表12序列表<110>花王株式會社(KAOCORPORATION)<120>變異芽孢桿菌<130>CPJPL60799<150>日本2004-062852<151>2004.03.05<160>28<170>PatentInVer.3.1<210>1<211>371<212>PRT<213>枯草桿菌<400>1MetAlaAspLysGlnThrHisGluThrGluLeuThrPheAspGlnVal151015LysGluGlnLeuThrGluSerGlyLysLysArgGlyValLeuThrTyr202530GluGluIleAlaGluArgMetSerSerPheGluIleGluSerAspGln354045MetAspGluTyrTyrGluPheLeuGlyGluGlnGlyValGluLeuIle505560SerGluAsnGluGluThrGluAspProAsnIleGlnGlnLeuAlaLys65707580AlaGluGluGluPheAspLeuAsnAspLeuSerValProProGlyVal859095LysIleAsnAspProValArgMetTyrLeuLysGluIleGlyArgVal100105110AsnLeuLeuSerAlaLysGluGluIleAlaTyrAlaGlnLysIleGlu115120125GluGlyAspGluGluSerLysArgArgLeuAlaGluAlaAsnLeuArg130135140LeuValValSerIleAlaLysArgTyrValGlyArgGlyMetLeuPhe145150155160LeuAspLeuIleHisGluGlyAsnMetGlyLeuMetLysAlaValGlu165170175LysPheAspTyrArgLysGlyTyrLysPheSerThrTyrAlaThrTrp180185190TrpIleArgGlnAlaIleThrArgAlaIleAlaAspGlnAlaArgThr195200205IleArgIleProValHisMetValGluThrIleAsnLysLeuIleArg210215220ValGlnArgGlnLeuLeuGlnAspLeuGlyArgGluProThrProGlu225230235240GluIleAlaGluAspMetAspLeuThrProGluLysValArgGluIle245250255LeuLysIleAlaGlnGluProValSerLeuGluThrProIleGlyGlu260265270GluAspAspSerHisLeuGlyAspPheIleGluAspGlnGluAlaThr275280285SerProSerAspHisAlaAlaTyrGluLeuLeuLysGluGlnLeuGlu290295300AspValLeuAspThrLeuThrAspArgGluGluAsnValLeuArgLeu305310315320ArgPheGlyLeuAspAspGlyArgThrArgThrLeuGluGluValGly325330335LysValPheGlyValThrArgGluArgIleArgGlnIleGluAlaLys340345350AlaLeuArgLysLeuArgHisProSerArgSerLysArgLeuLysAsp355360365PheLeuGlu370<210>2<211>1047<212>DNA<213>枯草桿菌<400>2acagcctttcttcctcattctggacgagcttgaagaccctcataatcttggttccattat60gaggacagcagatgcggtcggcgctcatggcatcgtcattccaaaacggagagctgtcgg120gctgacaacaacagtggcaaaagcttcaacaggagcaattgagcacattcctgtagcaag180agtcaccaatttggcacggacgttagaagagatgaaagagcggggaatctgggttgtcgg240aacggatgcgtccgcgcgtgaggatttccgtaatatggacggcaatatgcctttggctct300agtcatcggaagtgaaggaaaagggatgggccgccttgtgaaggaaaagtgcgattttct360cattaaactcccgatggccggaaaggtaacttcactaaatgcatctgtcgcggctggtct420tttgatgtatgaagtctaccggaaacgaaaccctgtgggagaataaagacccatggatat480cctgttagtagacgggtacaacatgattggagcctggccgcagctgaaggatttaaaagc540gaacagttttgaagaggcgagagacgtactgattcagaaaatggcggaatatcaatcgta600tacaggaaacagggttattgttgtttttgacgcgcatctcgtaaaagggcttgagaaaaa660acagaccaaccatagagttgaagtaatttttacaaaagaaaatgagacggctgatgagcg720gatagaaaagctcgctcaggc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