專利名稱：梭菌毒素netb的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型毒素。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有這種毒素的免疫原組合物以及 對動物，例如家雞接種而使之不易于患上梭菌病的方法。
背景技術(shù)：
梭狀芽孢桿菌屬是由革蘭氏陽性厭氧產(chǎn)芽胞細(xì)菌構(gòu)成的。這些生物的天生棲息地 是人類和其它動物的環(huán)境和腸道。盡管已經(jīng)識別了大約100種梭菌，但是僅僅少數(shù)已經(jīng)被 認(rèn)知為醫(yī)療和獸醫(yī)重要性的病源物(或病原體)。盡管如此，這些物種還是與嚴(yán)重疾病有 關(guān)，包括肉毒梭菌中毒、破傷風(fēng)、厭氧的蜂窩織炎、氣性壞疽、菌血癥、假膜性結(jié)腸炎和梭菌 腸胃炎。產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是在經(jīng)濟(jì)上有價(jià)值的家畜禽中發(fā)現(xiàn)的 各種梭菌病的病源物。壞疽腸炎(NE)就是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的梭菌腸道疾病的一個(gè)實(shí) 例。壞疽腸炎導(dǎo)致在腸壁上產(chǎn)生壞疽病變，而導(dǎo)致家禽發(fā)病和死亡。這也是一種復(fù)雜的多 因子病，具有部分未知的流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)理(Kaldhusdal，1999)。細(xì)菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，通 常在家禽腸道中能夠發(fā)現(xiàn)(Tschirdewahn et al.，1991)，然而，壞疽腸炎的出現(xiàn)是偶發(fā)性 的(Cowen et al.，1987)。盡管如此，被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的進(jìn)食還是間接表明在家雞中壞 疽腸炎的發(fā)作(Kaldhusdal，1999)。研究也表明，健康家雞在其腸道中所具有的產(chǎn)氣莢膜梭 菌數(shù)量相對較低，同時(shí)細(xì)菌濃度的增長能夠?qū)е聣木夷c炎病癥(Craven et al.，1999)。臨床壞疽腸炎被認(rèn)為在小腸中產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖到高數(shù)量并產(chǎn)生毀壞腸道的胞 外毒素時(shí)才發(fā)生。主要的毒素?fù)?jù)信涉及的是α-毒素，但是其在疾病過程中的精確作用還 未完全知曉。α “毒素是一種分泌型的鋅金屬酶，其不但具有磷脂酶C活性，還具有神經(jīng)磷 脂酶(或鞘磷脂酶)活性，是涉及到人類氣性壞疽發(fā)病機(jī)理中的主要毒素(Awad，et al.， 1995 ；Songer, 1997) 0產(chǎn)氣莢膜梭菌的所有五種毒素類型(A至E)承載和表達(dá)α毒素結(jié)構(gòu) 基因，pic。迄今為止，還沒有其它毒素被證實(shí)為壞疽腸炎中的關(guān)鍵毒性因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明已經(jīng)鑒別了一種新型梭菌毒素。本發(fā)明已經(jīng)命名這種多肽為NetB。因此，本發(fā)明提供了一種基本純化的或重組多肽，其中所述多肽含有i)按照SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3提供的氨基酸序列，ii)至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列，或iii) i)或ii)的生物活性片段和/或抗原片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，該多肽具有毒素活性。在另一實(shí)施方式中，該多肽與通過SEQ ID N0:2和/或SEQ IDNO :3編碼的多肽相 比具有降低的毒素活性已經(jīng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該多肽所含的氨基酸序列至少90%相同于SEQ ID NO 2或 SEQ ID NO :3ο在一個(gè)實(shí)施方式中，該多肽能夠從梭狀芽孢桿菌屬的細(xì)菌中純化。優(yōu)選該多肽能 夠從產(chǎn)氣莢膜梭菌中進(jìn)行純化。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，該多肽是類毒素。在還有的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該多肽是含有至少一種其它多肽序列的融合蛋 白。例如，至少一種其它多肽可以是增強(qiáng)本發(fā)明多肽穩(wěn)定性的多肽，或者是輔助該融 合蛋白純化的多肽，或者是增強(qiáng)本發(fā)明多肽的免疫性能的多肽。在還有的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽是合成多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種分離的和/或重組的多核苷酸，包含i)根據(jù)SEQ ID NO 1提供的核苷酸序列，ii)編碼根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列，iii)至少40%相同于SEQ ID NO 1的核苷酸序列，和/或iv)在嚴(yán)格條件下與i)至iii)任意之一雜交的序列或其反相互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離的或重組的多核苷酸含有至少40%相同于SEQ ID NO 1 的核苷酸226至1194的核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了 一種含有本發(fā)明多核苷酸的載體。優(yōu)選地，在該載體中的多核苷酸可操作地連接于啟動子。在一個(gè)實(shí)施方式中，該載體是病毒載體或質(zhì)粒載體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸和/ 或本發(fā)明的載體。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生至少一種本發(fā)明多肽的任何細(xì)胞，并包括動 物、植物、細(xì)菌、真菌(包括酵母)和節(jié)肢動物的細(xì)胞。優(yōu)選該宿主細(xì)胞是細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)菌是大腸桿菌。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)菌是選自 CCEC22, CCEC31 和 CCEC59 的大腸桿菌。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法，該方法包括對根據(jù)本發(fā) 明的宿主細(xì)胞或編碼所述多肽的本發(fā)明載體在容許表達(dá)編碼該多肽的多核苷酸的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括分離所述多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種特異性地結(jié)合于本發(fā)明多肽的基本純化的抗體，或其片 段。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種含有本發(fā)明多肽、本發(fā)明多核苷酸、本發(fā)明載體、本發(fā)明 宿主細(xì)胞和/或本發(fā)明抗體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物是免疫原的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該免疫原的組合物進(jìn)一步含有佐劑和/或藥用載體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有抗原的疫苗，其中抗原含有根據(jù)本發(fā)明的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗含有佐劑和/或藥用載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，該疫苗進(jìn)一步含有一種或多種附加抗原。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的多核苷酸的DNA疫苗，其中一 旦向受試者給藥，多肽就會表達(dá)而對多肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種減毒細(xì)菌，其能夠產(chǎn)生含有至少40%相同于SEQ ID NO 2 和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽，其中該細(xì)菌與野生型細(xì)菌相比產(chǎn)生降低量的多 肽和/或與野生型細(xì)菌相比具有降低的毒素活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，減毒細(xì)菌并不表達(dá)多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，減毒細(xì)菌經(jīng)過了進(jìn)一步改性(或修飾)而表達(dá)異源多肽。該 異源多肽可以例如是生物活性多肽或抗原。生物活性多肽的實(shí)例包括細(xì)胞因子、生長因子 和酶。抗原可以例如來自細(xì)菌、真菌、寄生生物病原體(或病原物)或病毒性病原體(或病 原物)。優(yōu)選地，減毒細(xì)菌屬于梭狀芽孢桿菌屬。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)菌是產(chǎn)氣莢膜 梭菌。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種削弱表達(dá)含有至少40%相同于SEQID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽的細(xì)菌毒性的方法，該方法包括突變多核苷酸序列而降低多 肽的表達(dá)和/或多肽的毒素活性，由此減毒細(xì)菌與未減毒細(xì)菌相比具有降低的毒素活性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種提高受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者 給予本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的組合物、本發(fā)明的疫苗、本 發(fā)明的宿主細(xì)胞和/或本發(fā)明的細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞或細(xì)菌是活的(或活體)。在另一實(shí)施方式中，該多肽、多核苷酸、組合物、載體、宿主細(xì)胞或細(xì)菌是在卵中 (或卵胚中，in ovo)遞送的。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種檢測受試者是否已經(jīng)暴露于表達(dá)含有至少40%相同于 SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽的病原體的方法，其中該方法包括 檢測由該受試者獲得的樣品中存在或不存在這種多肽，其中這種多肽的存在是暴露于病原 體的指征(或指示)。 本發(fā)明進(jìn)一步提供了 一種檢測受試者是否已經(jīng)暴露于表達(dá)含有至少40 %相同于 SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽的病原體的方法，其中該方法包括 檢測由樣品中特異性地結(jié)合于根據(jù)本發(fā)明多肽的抗體存在或不存在，其中這種抗體的存在 是暴露于病原體的指征(或指示)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種檢測受試者是否已經(jīng)暴露于表達(dá)含有至少40%相同于 SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :3的核苷酸序列的多核苷酸的病原體的方法，其中該方法 包括檢測由該受試者獲得的樣品中多核苷酸存在或不存在，其中這種多核苷酸的存在是暴 露于病原體的指征(或指示)。檢測多核苷酸存在或不存在的任何合適技術(shù)都可以使用。例如，多核苷酸的存在 或不存在可以通過雜交，例如通過DNA印跡(或薩慎印跡，Southern blot)，或通過多核苷 酸的擴(kuò)增，例如，通過PCR進(jìn)行檢測。在一個(gè)實(shí)施方式中，病原體來自梭狀芽孢桿菌屬。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，病原體 是產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中，受試者是禽類。
優(yōu)選地，受試者是家禽。例如，受試者可以是家雞、火雞、野雞、鵪鶉、鴨子、鴕鳥或 其它常見的以商業(yè)量飼養(yǎng)的家禽。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試者是家雞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于篩選調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽活性的激動劑或拮抗劑的 方法，該方法包括將本發(fā)明的多肽與候選化合物接觸，并確定所述化合物是否增加或減少 本發(fā)明多肽的毒素活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，該化合物是拮抗劑。優(yōu)選該化合物是抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種測試樣品毒素活性的方法，該方法包括(a)將疑似含有根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的多肽的樣品分成至少第一和第二子 樣品，(b)將所述第一子樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的多肽的拮抗劑接觸，和(c)檢測第一和第二子樣品是否具有毒素活性，其中在所述第一子樣品中缺乏毒素活性和在所述第二樣品中存在毒素活性是至 少40%相同于SEQ ID NO :2禾Π /或SEQ ID NO 3的多肽存在的指征(或指示)。在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(C)包括獨(dú)立地用動物細(xì)胞在各種條件下培養(yǎng)所述第一 和第二子樣品一段時(shí)間而足以使該多肽產(chǎn)生細(xì)胞病理效應(yīng)，并檢測細(xì)胞上是否存在或不存 在細(xì)胞病理效應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，拮抗劑是抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種含有根據(jù)本發(fā)明多肽的拮抗劑的食物和/或飲料。優(yōu)選地，拮抗劑是根據(jù)本發(fā)明的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的食物和/或飲料降低由表達(dá)含有至少40%相同于 SEQ ID Ν0:2和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽的細(xì)菌對動物的感染和/或群集 (或殖民化，colonization)的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的外源性多核苷酸的非人基因 轉(zhuǎn)移生物。優(yōu)選地，非人基因轉(zhuǎn)移生物是植物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有本發(fā)明多肽的食物和/或飲料。優(yōu)選地，當(dāng)非人基因轉(zhuǎn)移生物和/或食物和/或飲料口服給予受試者時(shí)，該多肽提 高對細(xì)菌病原體的免疫應(yīng)答。細(xì)菌病原體可以是梭狀芽孢桿菌屬，例如，產(chǎn)氣莢膜梭菌。優(yōu) 選地，受試者是禽類，例如，家雞、火雞或鴨子。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，本發(fā)明的非人基因轉(zhuǎn)移生物和/或食物和/ 或飲料能夠用于向受試者給予本發(fā)明的多肽，使得在受試者體內(nèi)提高對該多肽的免疫應(yīng)答。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種提高對本發(fā)明多肽的免疫應(yīng)答的方 法，該方法包括向受試者口服給予本發(fā)明的非人基因轉(zhuǎn)移生物和/或本發(fā)明的食物和/或 飲料。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種提供對雌性禽類后代被動免疫的方法，該方法包括在所 述雌性禽類產(chǎn)下含有所述后代的卵之前向該雌性禽類給予本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷 酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的組合物、本發(fā)明的疫苗、本發(fā)明的減毒細(xì) 菌、本發(fā)明的非人基因轉(zhuǎn)移生物、和/或本發(fā)明的食物和/或飲料，由此為所述后代提供對 表達(dá)含有至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽的細(xì)菌
9的被動免疫。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的 組合物、本發(fā)明的疫苗、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的細(xì)菌、本發(fā)明的非人基因轉(zhuǎn)移生物和/ 或本發(fā)明的食物和/或飲料在生產(chǎn)用于提高受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答的醫(yī)藥中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的 組合物、本發(fā)明的疫苗、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的細(xì)菌、本發(fā)明的非人基因轉(zhuǎn)移生物和/ 或本發(fā)明的食物和/或飲料作為提高受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答的醫(yī)藥的用途。這將是很明顯的，本發(fā)明一方面的優(yōu)選特征和特性適用于本發(fā)明的許多其它方在整個(gè)說明書中詞語“包括”，或變體如“含有”或“包含”，應(yīng)該理解為是指所陳述 的元件、整體或步驟的包含，或元件、整體或步驟的分組，并不排除任何其它元件、整體或步 驟，或元件、整體或步驟的分組。本發(fā)明此后將通過以下非限制性實(shí)施例的方式并參照附圖而進(jìn)行描述。


圖1.來自產(chǎn)氣莢膜梭菌的NetB和β -毒素的ClustalW對齊；“*”是指在該列中 殘基或核苷酸在對齊中的所有序列中相同；“”是指已經(jīng)觀察到保守替換Λ ”是指觀察 到半保守替換。圖2. NElS-AnetB染色體區(qū)域的示意圖。netB的突變通過采用含有在基因兩側(cè) 具有約2kb的同源DNA的插入性滅活netB基因的自毀質(zhì)粒進(jìn)行等位交換而構(gòu)建并引入到 EHE-NE18 中。圖3.在LMH細(xì)胞上產(chǎn)氣莢膜梭菌EHE-NE18培養(yǎng)基上清液的細(xì)胞毒性測定。a. TPG 培養(yǎng)基介質(zhì)(純的)；b.產(chǎn)氣莢膜梭菌EHE-NE18培養(yǎng)基上清液(1 16稀釋)；c.產(chǎn)氣莢 膜梭菌JIR325(菌株13-非壞疽腸炎菌株)培養(yǎng)基上清液(1 2稀釋)；d.產(chǎn)氣莢膜梭菌 NE18-Ml(plc突變體)培養(yǎng)基上清液(1 16稀釋)。圖4在LMH細(xì)胞上EHE-NE18培養(yǎng)基上清液netB陰性衍生物的細(xì)胞毒性測定。
a.EHE-NE18培養(yǎng)基上清液(1 16稀釋)；b. NE18-缺失(或消除)的netB培養(yǎng)基上清液 (1 2稀釋)；c. NE18-缺失的netBl+pJIR1457 (穿梭質(zhì)粒)培養(yǎng)基上清液(1 2稀釋)； d. NE18-缺失的netBl+pALK20 (netB互補(bǔ)質(zhì)粒)培養(yǎng)基上清液(1 16稀釋)；e. TPG培養(yǎng) 基介質(zhì)(純凈的)；f.柱純化的重組 NetB (Columnpurified recombinant NetB) (1 8 稀 釋)。圖5.用NetB處理的LMH細(xì)胞的乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性測定。在上清液中釋放的LDH 作為細(xì)胞溶解指示劑用Cyto-TodPromega)試劑盒進(jìn)行測定并以細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)給出。每 次稀釋按照一式三份進(jìn)行而對每次稀釋計(jì)算SEM。圖6.對于netB存在的NE和非NE產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的PCR篩選。a. NE菌株；
b.非NE菌株。圖7.在各種產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株(NE和非-NE)中對于蛋白存在的蛋白印跡觀測 (Western blot survey)。對于NetB表達(dá)的產(chǎn)氣莢膜梭菌篩選的NE菌株和非NE菌株的免 疫印跡分析。產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株在TPG介質(zhì)中生長直至達(dá)到由SDS-PAGE分離的0. 6和培養(yǎng)基上清液0D600nm。將經(jīng)分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜并用兔rNetB抗血清探測。Brackets 指示NE菌株和非NE產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株。圖8用NetB接種的家雞血清的蛋白印跡分析。Lane 1 分子量標(biāo)記 (Invitrogen SeeBlue Plus2 預(yù)染色標(biāo)準(zhǔn))；Lanes 2-14 接種的鳥 #1_#13 的血清。關(guān)鍵序列列表SEQ ID NO 編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素的核苷酸序列。SEQ ID NO :2_產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素成熟氨基酸序列。SEQ ID NO :3_包括信號肽序列的產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素的氨基酸序列。SEQ ID NO :4_產(chǎn)氣莢膜梭菌β -毒素的氨基酸序列。SEQ ID No :5至10-寡核苷酸引物。
具體實(shí)施例方式一般性技術(shù)和定義除非另外明確指出，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都應(yīng)采取本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員所共同理解的相同意義(例如，按照微生物學(xué)，細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)，分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免 疫計(jì)量化學(xué)，蛋白質(zhì)化學(xué)，和生物化學(xué)領(lǐng)域)。除非另外指出，本發(fā)明中所使用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)基、微生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù) 都是標(biāo)準(zhǔn)的方法，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的方法。這種技術(shù)在文獻(xiàn)源的整個(gè)文獻(xiàn) 中進(jìn)行了描述和解釋，例如 J. Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley andSons(1984), J. Sambrook et al. , Molecular Cloning :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989) , T. A. Brown (editor) , Essential Molecular Biology :A Practical Approach, Volumesl and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames(editors), DNA Cloning :A Practical Approach, Volumes 1-4,IRL Press(1995 andl996),and F. M. Ausubel et al. ,(editors),Current Protocols inMolecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane(editors) Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory, (1988), 禾口 J.E.Coligan et al. , (editors)Current Protocolsin Immunology, John Wiley & Sons (including all updates untilpresent)，并)其結(jié)合于本文中作為參考。正如本文中所使用的，術(shù)語“受試者”是指動物，例如鳥類或哺乳動物。在一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方式中，該受試者是禽類，例如家雞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該受試者是人。其它優(yōu)選 的實(shí)施方式包括寵物(或同伴性動物，companion animals)如貓和狗，以及家畜如馬、牛、 綿羊和山羊。如本文中所使用的，術(shù)語“禽類”是指分類學(xué)分類為鳥類的生物的任何種、亞種 或品種，諸如但不限于家雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、野雞、鸚鵡、雀、鷹、烏鴉和包括鴕鳥、鴯鹋 和鶴鴕在內(nèi)的平胸鳥。該術(shù)語包括各種已知的原雞(或紅原雞，Gallus galIus)的品 系(strain)，或家雞，(例如，白來航(White Leghorn)、棕色來航雞(Brown Leghorn)、 橫斑蘆花雞(Barred-Rock)、蘇塞克斯雞(Sussex)、新罕布什爾雞(New Hampshire)、 羅德島紅雞(RhodeIsland)、澳洲黑雞(Australorp)、考尼什雞(Cornish)、米諾卡
11雞(Minorca)、Amrox、加利福尼亞灰雞(California Gray)、意大利鷓鴣色雞(Italian Partidge-co 1 ored))、以及火雞、野雞、鵪鶉、鴨、鴕鳥和其它以商業(yè)規(guī)模飼養(yǎng)的家禽的品 系。如本文中所使用的，“毒素活性”是指多肽或肽(例如，NetB毒素)殺死動物細(xì)胞、 或?qū)е聞游锛?xì)胞中的細(xì)胞病理效應(yīng)的能力。在某些情況下，對于多肽與NetB毒素相比具 有降低的毒素活性或許是合乎需要的。毒素活性的降低優(yōu)選至少50、60、70、80、90、95或 99%。毒素活性方面的降低可以例如作為細(xì)胞病理效應(yīng)的降低而進(jìn)行測定。如本文中所使用的，術(shù)語“細(xì)胞病理效應(yīng)”或“CPE”描述了細(xì)胞結(jié)構(gòu)中由于細(xì)胞毒 素的活性(即，病例效應(yīng))而產(chǎn)生的變化。常見的細(xì)胞病理效應(yīng)包括細(xì)胞破壞、細(xì)胞圓形 化、合胞體(即，融合的大細(xì)胞)形成、細(xì)胞空泡化形成、和內(nèi)含體的形成。CPE產(chǎn)生于毒素 在細(xì)胞上的作用，而負(fù)面地影響細(xì)胞實(shí)施其保持存活體的所需功能的能力。在體外細(xì)胞培 養(yǎng)系統(tǒng)中，當(dāng)細(xì)胞與含有毒素的樣品接觸后，作為部分融合性單層，顯示非融合性的區(qū)域時(shí) CPE是顯而易見的。細(xì)胞病理效應(yīng)易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員辨別和區(qū)分。如本文中所使用的，術(shù)語“類毒素”是指任何至少部分失活的毒素，但并非意指以 任何方式限制產(chǎn)生類毒素的毒素失活的具體方式。這種失活技術(shù)包括(i)改性(或修飾) 完整毒素的化學(xué)方法，例如甲醛或戊二醛處理；(ii)物理方法如加熱；(iii)改變毒性的酶 方法，如將毒素切割成片段的蛋白酶；(iv)重組方法，如移除或改變毒素酶區(qū)域但保留一 個(gè)或多個(gè)抗原決定基(或抗原決定部位)的毒素基因的遺傳工程化。如本文中所使用的，有關(guān)細(xì)菌的術(shù)語“野生型”是指天然存在的細(xì)菌，其產(chǎn)生含有 至少40%相同，更優(yōu)選至少90%相同于具有毒素活性的SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3的氨 基酸序列的多肽。如本文中所使用的，術(shù)語“處理” “治療”或“處治”包括給予治療有效劑量的本發(fā) 明的多肽、多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞、組合物、疫苗和/或減毒細(xì)菌而足以降低或消除由表 達(dá)具有毒素活性的多肽的細(xì)菌感染所導(dǎo)致的疾病的至少一種癥狀。術(shù)語“預(yù)防”是指保護(hù)或許被暴露于細(xì)菌的受試者免于發(fā)展由于細(xì)菌感染和/或 群集(或殖民化，colonization)而導(dǎo)致的至少一種癥狀，或降低被暴露于細(xì)菌的受試者體 內(nèi)感染和/或群集癥狀的嚴(yán)重度。多肽/肽術(shù)語“多肽”和“蛋白” 一般可以互換使用，是指可以或不可以通過添加非氨基酸 基團(tuán)改性的單多肽鏈。應(yīng)該理解到，這種多肽鏈可以與其它多肽或蛋白或其它分子如輔助 因子相關(guān)。如本文中所使用的，術(shù)語“蛋白”和“多肽”包括本文中描述多肽的變體、突變體、 生物活性片段、改性體(或修飾物)、類似物和/或衍生物。對于“基本純化的多肽”或“分離的多肽”，我們意指一般從脂質(zhì)、核酸、其它肽、和 其它與其天然狀態(tài)有關(guān)的污染分子中分離出來的多肽。優(yōu)選地，基本純化的多肽至少60% 游離出，更優(yōu)選至少75%游離出，而更加優(yōu)選至少90%游離出與之天然相關(guān)的其他組分。在多肽的上下文中的術(shù)語“重組”是指當(dāng)由細(xì)胞、或在無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，以變化 的量或以變化的速率產(chǎn)生時(shí)的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，該細(xì)胞是并不會天然產(chǎn)生多肽的 細(xì)胞。然而，該細(xì)胞可以是含有導(dǎo)致該多肽的產(chǎn)生量改變，優(yōu)選提高的非內(nèi)源性基因的細(xì) 胞。本發(fā)明的重組多肽包括還未從轉(zhuǎn)錄(重組)細(xì)胞、或產(chǎn)生該蛋白的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的
12其它組分中分離出的多肽，以及在隨后從至少一些其它組分中純化出的這種細(xì)胞或無細(xì)胞 系統(tǒng)中產(chǎn)生的多肽。多肽的識別％通過GAP (Needleman and Wunsch, 1970)分析(GCG程序)采用間隔 生成罰分=5、和空格延伸罰分=0. 3進(jìn)行測定。在長度上查詢序列為至少15個(gè)氨基酸， 而GAP分析在至少15個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序列在長度上為至 少50個(gè)氨基酸，而GAP分析在至少50個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序 列在長度上為至少100個(gè)氨基酸，而GAP分析在至少100個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)比對兩個(gè)序列。 更加優(yōu)選地，查詢序列在長度上為至少250個(gè)氨基酸，而GAP分析在至少250個(gè)氨基酸的區(qū) 域內(nèi)比對兩個(gè)序列。更加優(yōu)選地，在其整個(gè)長度內(nèi)比對這兩個(gè)序列。關(guān)于定義的多肽，應(yīng)該理解到，比以上提供的識別％圖更高的那些多肽將會涵蓋 優(yōu)選的實(shí)施方式。因此，根據(jù)最低的識別％圖，只要適用，優(yōu)選該多肽含有的氨基酸序列為 至少40 %，更優(yōu)選至少45 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu) 選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少76 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu) 選至少90 %，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92 %，更優(yōu)選至少93 %，更優(yōu)選至少94 %，更優(yōu) 選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %，更優(yōu)選至少99 %，更優(yōu) 選至少99. 1 %，更優(yōu)選至少99. 2 %，更優(yōu)選至少99. 3 %，更優(yōu)選至少99. 4 %，更優(yōu)選至少 99.5%,更優(yōu)選至少99. 6%，更優(yōu)選至少99. 7%，更優(yōu)選至少99. 8%，而甚至更優(yōu)選至少 99. 9%相同于相關(guān)指定的SEQ ID NO。本發(fā)明多肽的氨基酸序列突變能夠通過向本發(fā)明的核酸中引入合適的核苷酸而 變成本發(fā)明的核酸、或通過所需多肽的體外合成而進(jìn)行制備。這種突變例如包括，該氨基酸 序列中的殘基的缺失(或刪除)、插入或替換。缺失(或刪除)、插入或替換的組合能夠使 之達(dá)到最終的構(gòu)建，條件是，最終的肽產(chǎn)品具有所需要的特性。突變(經(jīng)改變的)多肽能夠采用本領(lǐng)域已知的任何合適技術(shù)進(jìn)行制備。例如，本 發(fā)明的多核苷酸能夠進(jìn)行體外誘發(fā)突變。這種體外誘變技術(shù)包括將多核苷酸亞克隆到合適 載體中，將載體變換成“增變”菌株，如大腸桿菌XL-I紅(Stratagene)并繁殖所轉(zhuǎn)化細(xì)菌 達(dá)到合適的繁殖代數(shù)。在另一實(shí)例中，本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行按照Harayama(1998)廣泛描 述的DNA改組技術(shù)。這些DNA改組技術(shù)可以包括與本發(fā)明的那些(多肽)相關(guān)的毒素編碼 基因，如來自細(xì)菌而不是產(chǎn)氣莢膜梭菌的那些。衍生于突變的/經(jīng)改變的DNA的產(chǎn)品采用 本文中描述的技術(shù)能夠易于被篩選而確定它們是否具有毒素活性。在設(shè)計(jì)氨基酸序列的突變體中，突變位點(diǎn)的定位和突變的性質(zhì)將取決于待修飾的 特性。突變位點(diǎn)能夠進(jìn)行個(gè)別或連續(xù)修飾，例如，通過(1)首先用保守氨基酸選項(xiàng)進(jìn)行替換 而后用更激進(jìn)選項(xiàng)替換，這要取決于所實(shí)現(xiàn)的效果，(2)刪除(或缺失)靶殘基，或(3)在 鄰近于定位位點(diǎn)插入其他殘基。氨基酸序列刪除(或缺失)一般在約1至15個(gè)殘基，更優(yōu)選約1至10個(gè)殘基而 典型地約1至5個(gè)毗鄰殘基的范圍內(nèi)。替換突變體在移除的多肽分子中具有至少一個(gè)氨基酸殘基和在其位置處插入不 同的殘基。對于替換突變最感興趣的位點(diǎn)包括驗(yàn)證為活性位點(diǎn)的位點(diǎn)。其它感興趣的位點(diǎn) 是其中由各種菌株或物種獲得的特定殘基相同的位點(diǎn)。這些位置對于生物活性而言或許是 很重要的。這些位點(diǎn)，尤其是落入至少三個(gè)其它同等保守位點(diǎn)的序列中的那些位點(diǎn)，優(yōu)選以相對保守的方式進(jìn)行替換。這種保守替換如下表1中“典型替換”標(biāo)題下所示。表1-典型替換 本發(fā)明的多肽的生物活性片段也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。如本文中所使用的，“生物 活性片段”是本發(fā)明多肽的一部分，其保持了全長多肽的指定活性。生物活性片段能夠是它 們保持所指定活性的長度的任何長度。優(yōu)選地，生物活性片段保持全長蛋白的至少10%的 活性。正如熟練的收閱人(addressee)所知，驗(yàn)證多肽的生物活性片段的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi) 是已知的。例如，本發(fā)明多肽的片段可以用合適的測定(或分析)法，例如通過確定該片段 是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中的細(xì)胞病理效應(yīng)，進(jìn)行測試而確定該片段是否具有毒素活性。在一個(gè) 實(shí)施方式中，生物活性片段在長度上為至少100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選在長度上為至少110個(gè)氨 基酸，更優(yōu)選在長度上為至少120個(gè)氨基酸，更優(yōu)選在長度上為至少130個(gè)氨基酸，更優(yōu)選 在長度上為至少140個(gè)氨基酸，更優(yōu)選在長度上為至少150個(gè)氨基酸，更優(yōu)選在長度上為至 少175個(gè)氨基酸，或更優(yōu)選在長度上為至少200或更多個(gè)氨基酸。術(shù)語“抗原”和“抗原的”在本領(lǐng)域內(nèi)很好理解，是指通過免疫系統(tǒng)的組分特異性 識別的大分子的部分，例如，抗體或T-細(xì)胞抗原受體。術(shù)語“抗原”是指肽、多肽或其它在 宿主中能夠被誘導(dǎo)對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的其它大分子。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明多肽的抗原 片段。優(yōu)選地，抗原片段能夠提高對細(xì)菌病原體例如來自梭狀芽孢桿菌屬包括但不限于產(chǎn) 氣莢膜梭菌的細(xì)菌的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原是本發(fā)明多肽的抗原決定基(或 部位)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原片段在長度上是6個(gè)氨基酸，更優(yōu)選在長度上是7個(gè)氨基 酸，更優(yōu)選在長度上是8個(gè)氨基酸，更優(yōu)選在長度上是9個(gè)氨基酸，更優(yōu)選在長度上是10個(gè) 氨基酸?？商娲?，抗原片段在長度上為至少20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個(gè)氨 基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)向受試者給藥時(shí)抗原能夠誘發(fā)對含有按照SEQID N0:2和/或 SEQ ID NO :3提供的氨基酸序列的多肽的免疫應(yīng)答。而且，如果需要，非天然氨基酸或化學(xué)合成氨基酸類似物能夠作為替換物到或 插入物而引入本發(fā)明的多肽中。這種氨基酸包括但不限于，常見氨基酸的D-異構(gòu)體、2， 4- 二氨基丁酸、α -氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸， 3_氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基 丙氨酸、叔丁基甘氨酸(t-butylglycine)、叔丁基丙氨酸(t-butylalanine)、苯基甘氨酸 (phenylglycine)、環(huán)己基丙氨酸(cyclohexylalanine)、β _丙氨酸、氟-氨基酸、設(shè)計(jì)的 (designer)氨基酸如β _甲基氨基酸、C α -甲基氨基酸、N α -甲基氨基酸和一般的氨基酸 類似物。本發(fā)明的多肽，在合成期間或之后，例如通過生物素化、苯甲酰化、糖基化、乙酰 化、磷酸化、酰胺化、由已知的保護(hù)基/阻斷基衍生化、蛋白水解裂解、連接于抗體分子或其 它細(xì)胞配體等進(jìn)行差異化改性(或修飾)，也都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些改性(或修 飾)可以用于提高本發(fā)明多肽的穩(wěn)定性和/或生物活性。本發(fā)明的多肽能夠以各種方式進(jìn)行生產(chǎn)，包括天然多肽的生產(chǎn)和回收，重組多肽 的生產(chǎn)和回收、以及多肽的化學(xué)合成。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明分離的多肽是通過在有效
15生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)能夠表達(dá)該多肽的細(xì)胞、并回收多肽而進(jìn)行生產(chǎn)的。用以培養(yǎng)的優(yōu) 選細(xì)胞是本發(fā)明的宿主細(xì)胞。有效的培養(yǎng)條件包括但不限于，有效的介質(zhì)、生物反應(yīng)器、溫 度、PH和容許多肽生產(chǎn)的氧條件。有效介質(zhì)是指其中細(xì)胞被培養(yǎng)而生產(chǎn)本發(fā)明多肽的任何 介質(zhì)。這種介質(zhì)典型地包括具有可吸收碳、氮和磷酸鹽(酯)源的含水介質(zhì)，和合適的鹽、 礦物質(zhì)、金屬和其它營養(yǎng)成分，如維生素。本發(fā)明的細(xì)胞能夠在傳統(tǒng)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖 瓶、試管、微孔板盤和培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)能夠在溫度、PH和適用于重組蛋白的氧含量 條件下實(shí)施。這些培養(yǎng)條件都在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的專門知識的范疇之內(nèi)?？贵w如本發(fā)明中所使用的，術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性 抗體、雙抗體(diabodies)、三抗體(triabodies)、異源偶聯(lián)抗體(hetreoconjugate antibodies)、包括完整分子及其片段的嵌合抗體，例如能夠結(jié)合抗原決定基(或部位)決 定子的Fab、F(ab' )2和Fv，以及其它的類抗體分子?？贵w片段保持了與其抗原或受體選擇性結(jié)合的一些能力，而定義如下(l)Fab，含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段，能夠通過用酶木瓜蛋白酶消 化整個(gè)抗體而產(chǎn)生完整輕鏈和一個(gè)重鏈的部分而進(jìn)行生產(chǎn)；(2)Fab'，抗體分子的片段，能夠通過用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體接著還原而產(chǎn)生 完整輕鏈和重鏈的部分而獲得；每分子抗體能夠獲得兩個(gè)Fab'片段；(3) (Fab' ) 2，能夠通過用酶胃蛋白酶處理整個(gè)抗體但隨后并不還原而獲得的抗 體片段；F (ab) 2是通過兩個(gè)二硫鍵固定到一起的兩個(gè)Fab'片段的二聚體；(4) Fv，定義為含有表達(dá)為雙鏈的輕鏈可變區(qū)域和重鏈可變區(qū)域的基因工程片段； 和(5)單鏈抗體(“SCA”)，定義為含有輕鏈可變區(qū)域、重鏈可變區(qū)域、由合適的多肽 連接子連接成為基因融合單鏈分子的基因工程分子。制備這些片段的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。(參見，例如，Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory, New York(1988),結(jié) 合于此作為參考)。(6)單結(jié)構(gòu)域抗體，典型地為無輕鏈的可變重結(jié)構(gòu)域。多克隆抗體本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 是已知的。多克隆抗體能夠在哺乳動物或禽類體內(nèi)，例如通過一次或多次注射表達(dá)該多 肽的細(xì)胞以及如果需要還有佐劑而進(jìn)行提高。典型地，細(xì)胞和/或佐劑在哺乳動物或禽類 體內(nèi)通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射而進(jìn)行注射?？梢圆捎玫淖魟?shí)例包括弗氏完全佐劑和 MPL-TDM佐劑(單磷酰類脂A，人工合成的海藻糖二霉菌酸酯)。免疫方案可以通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員進(jìn)行選擇而無須采取過分(或不當(dāng))實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體可替代地，由本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可以采用雜 交瘤方法進(jìn)行制備，例如，文獻(xiàn)Kohler andMilstein, (1975)描述的那些方法。在雜交瘤方 法中，鼠、倉鼠或其它合適的宿主動物典型地采用表達(dá)衍生于基因轉(zhuǎn)移哺乳動物的第一物 種的多肽的細(xì)胞進(jìn)行免疫而誘發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生將會特異性地結(jié)合于第一物種多肽的抗體的淋巴細(xì)胞。一般而言，如果需要人源細(xì)胞，則要么使用周圍血液淋巴細(xì)胞(“PBL”)，或者如 果需要非人哺乳動物源，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后采用合適的融合劑如聚乙二 醇而使淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合而形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal Antibody Principles and Practice, Academic Press, (1986)pp. 59—103)。永生化細(xì)胞系通常由哺 乳動物細(xì)胞，尤其是嚙齒動物、牛和人源的骨髓瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì) 胞系。雜交瘤細(xì)胞可以在優(yōu)選含有一種或多種抑制不融合的永生化細(xì)胞生長或存活的物質(zhì) 的合適培養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。例如，如果親本細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT 或HPRT)，則雜交瘤的培養(yǎng)介質(zhì)典型地將含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(“HAT介 質(zhì)”)，該物質(zhì)能夠阻止HGPRT-缺乏細(xì)胞的生長。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是通過所選的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞有效融合、維持抗體穩(wěn)定的 高水平表達(dá)、而對介質(zhì)如HAT介質(zhì)敏感的那些。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是鼠科骨髓瘤細(xì) 胞系，其能夠例如從 SalkInstitute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.和 American TypeCulture Collection,Manassas,Va.獲得。人骨髓瘤和鼠-人雜交骨髓瘤細(xì) 胞系對于人單克隆抗體的生產(chǎn)也進(jìn)行了描述(Kozbor, 1985 ；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApp1ications, Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987 pp.51-63)。其中進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)介質(zhì)然后能夠針對第一物種多肽的單克隆抗體 的存在進(jìn)行分析(或測定)。優(yōu)選地，通過雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性由免 疫沉淀法或通過體外結(jié)合測定(或分析)，如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定 (或分析)(ELISA)來確定。這些技術(shù)和分析(或測定)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。例如，單克 隆抗體的結(jié)合親和力能夠通過芒森和波拉德(Munson and Pollard, (1980))的斯卡查德分 析來確定。在識別所需的雜交瘤細(xì)胞之后，該克隆通過限制稀釋步驟就可以進(jìn)行亞克隆而 通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行生長。為此目的的合適培養(yǎng)介質(zhì)，例如，包括Dulbecco，s Modified Eagle' s Medium和RPMI-1640介質(zhì)?？商娲?，雜交瘤細(xì)胞可以在哺乳動物體內(nèi)作為腹 水進(jìn)行體內(nèi)生長。通過亞克隆分泌的單克隆抗體可以從培養(yǎng)介質(zhì)或腹水流體中通過傳統(tǒng)的免疫球 蛋白純化技術(shù)如例如蛋白A-瓊脂糖凝膠(protein A-S印harose)、羥基磷灰石色譜、凝膠 電泳、透析、或親合色譜進(jìn)行分離或純化。單克隆抗體也可以通過重組DNA方法，如描述于美國專利US4，816，567中的那些 方法制備。編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA能夠易于采用傳統(tǒng)方法(例如，通過使用能夠 特異性結(jié)合于編碼鼠科抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)進(jìn)行分離和排序(或定 序)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞能夠作為這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，這種DNA就可以被置 入表達(dá)載體，然后表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞如猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或 其它不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞中，而在重組宿主細(xì)胞中獲得合成的單克隆抗體。DNA 也可以例如通過用編碼序列替換人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域而代替同源鼠科序列(美國專 利US 4，816，567)或通過共價(jià)結(jié)合于免疫球蛋白編碼序列、非免疫球蛋白多肽的所有或部 分編碼序列而進(jìn)行改性(或修飾)。這種非免疫球蛋白多肽能夠替換本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者能夠替換本發(fā)明抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體?？贵w可以是單價(jià)抗體。制備單價(jià)抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。例如，方 法之一涉及免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)修飾(或改性)重鏈的重組表達(dá)。重鏈一般在Fc區(qū)域的 任何點(diǎn)發(fā)生短截以便防止重鏈交聯(lián)?？商娲?，相關(guān)的半胱氨酸殘基用另一氨基酸殘基替 換或缺失(或刪除)而防止交聯(lián)。體外方法也適用于制備單價(jià)抗體。產(chǎn)生其片段，尤其是Fab片段的抗體的消化，能 夠采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)來完成。抗體也可以是采用已知的選擇和/或本領(lǐng)域已知的突變形成方法成熟的親合性。 優(yōu)選的親合力成熟的抗體具有的親合力比成熟抗體制備所用的起始抗體高5倍、更優(yōu)選10 倍。甚至更優(yōu)選20倍或30倍。雙特異件抗體雙特異性抗體是對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。例如，結(jié)合 特異性之一可以是對本發(fā)明的多肽，另一結(jié)合特異性是對于任何其它抗原，而優(yōu)選是對于 細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞單元的結(jié)合特異性。用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域也是已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的 重組生產(chǎn)基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達(dá)，其中兩個(gè)重鏈具有不同的特異 性(Milstein and Cuello，1983)。因?yàn)槊庖咔虻鞍字劓満洼p鏈的隨機(jī)搭配，這些雜交瘤 (quadromas)產(chǎn)生10個(gè)不同抗體分子的潛在混合物，其中僅僅一個(gè)具有正確的雙特異性結(jié) 構(gòu)。該正確分子的純化通常通過親合色譜步驟完成。類似的方法公開于W093/08829和文 獻(xiàn) Traunecker (1991)中。雙特異性抗體能夠作為全長抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab' )2雙特異性抗體)來 制備。由抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)在文獻(xiàn)中已經(jīng)進(jìn)行了描述。例如，雙特異性抗 體能夠采用化學(xué)鍵連來進(jìn)行制備。各種直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)基中制備和分離雙特異性抗體 片段的技術(shù)也已經(jīng)進(jìn)行了描述。Hollinger et al. (1993)提供了一種用于制備雙特異性抗體片段的可替代機(jī)制。 該片段含有通過太短而不容許在同一鏈上的兩域之間配對的連接子連接到輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)。因此，一個(gè)片段的Vh結(jié)構(gòu)域和八結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段的 互補(bǔ)\結(jié)構(gòu)和Vh結(jié)構(gòu)域域配對，由此而形成兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)。通過使用單鏈Fv(sFv) 二聚體用于制備雙特異性抗體片段的另一策略已經(jīng)由文獻(xiàn)Gruber et al. (1994)進(jìn)行了報(bào) 道。具有多于兩價(jià)的抗體也是可設(shè)想的。例如，三特異性抗體也能夠制備，如Tutt et al. (1991)。異源 禺聯(lián)抗體(HetreoconiURate Antibodies)異源偶聯(lián)抗體也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩個(gè)共價(jià)連接的抗體構(gòu) 成。這種抗體，例如，有人提出將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不希望的(或多余)細(xì)胞(美國專利 US 4，676，980)，而用于治療 HIV 感染(W0 91/00360 ；WO 92/200373 ；EP 03089)。可以設(shè) 想，這些抗體可以采用合成蛋白化學(xué)中已知的方法，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法而進(jìn)行體 外制備。例如，免疫毒素可以采用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚堿而進(jìn)行構(gòu)建。為 此目的的合適試劑的實(shí)例包括亞氨基硫醇鹽(iminothiolate)和4-巰基丁酰亞氨甲酯
18(methyl-4-mercaptobutyrimidate)以及例如在美國專利US4, 676，980中公開的那些試 劑。多核苷酸對于“分離的多核苷酸”，我們意指一般從與其有關(guān)的或在其天然狀態(tài)與之連接的 多核苷酸序列中分離出來的多核苷酸。優(yōu)選地，經(jīng)分離的多核苷酸至少60%游離出，更優(yōu)選 至少75%游離出，而更優(yōu)選至少90%游離出天然與之相關(guān)的其它組分。而且，術(shù)語“多核苷 酸”在本文中可以與術(shù)語“核酸分子”、“基因”和“mRNA”互換使用。在多核苷酸的上下文中術(shù)語“重組”是指當(dāng)與其天然狀態(tài)相比，在細(xì)胞中，或在無 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，以變化的量存在時(shí)的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，該細(xì)胞是并不天然含 有該多核苷酸的細(xì)胞。然而，該細(xì)胞可以是含有導(dǎo)致編碼的多肽生產(chǎn)量的改變，優(yōu)選提高的 非內(nèi)源性多核苷酸的細(xì)胞。本發(fā)明的重組多核苷酸包括還未從轉(zhuǎn)錄(重組)細(xì)胞、或者在 其中其存在的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的其它組分中分離出的多核苷酸，以及在隨后從至少一些其 它組分中純化出的這種細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的多核苷酸。“多核苷酸”是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。這可以是染色體組或合成源、 雙鏈或單鏈的DNA或RNA，而與碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白或其它物質(zhì)化合而實(shí)施本文中定義 的特定活性。多核苷酸的識別％通過GAP (Needleman and Wunsch, 1970)分析(GCG程序)采用 間隔生成罰分=5和空格延伸罰分=0. 3而進(jìn)行測定。在長度上查詢序列為至少45個(gè)核 苷酸，而GAP分析在至少45個(gè)核苷酸的區(qū)域內(nèi)比對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序列在長度 上為至少150個(gè)核苷酸，而GAP分析在至少150個(gè)核苷酸的區(qū)域內(nèi)比對兩個(gè)序列。更加優(yōu) 選地，查詢序列在長度上為至少300個(gè)核苷酸，而GAP分析在至少300個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)比 對兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，在其整個(gè)長度內(nèi)比對這兩個(gè)序列。關(guān)于所定義的多核苷酸，應(yīng)該理解到，比以上提供的識別％圖更高的多核苷酸將 會涵蓋優(yōu)選的實(shí)施方式。因此，根據(jù)最低識別％圖，只要適用，優(yōu)選該多核苷酸含有的多核 苷酸序列為至少40 %，更優(yōu)選至少45 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少 60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少76 %，更優(yōu)選至少 80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92 %，更優(yōu)選至少 93 %，更優(yōu)選至少94 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少 98 %，更優(yōu)選至少99 %，更優(yōu)選至少99. 1 %，更優(yōu)選至少99. 2 %，更優(yōu)選至少99. 3 %，更優(yōu) 選至少99. 4 %，更優(yōu)選至少99. 5 %，更優(yōu)選至少99. 6 %，更優(yōu)選至少99. 7 %，更優(yōu)選至少 99. 8%，而更加優(yōu)選至少99. 9%相同于相關(guān)指定的SEQ ID NO。本發(fā)明的多核苷酸，當(dāng)對比于天然存在的分子時(shí)，可以擁有一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘 基的缺失(或刪除)、插入或替換的突變。突變體能夠是天然發(fā)生的(也就是說，從天然來 源中分離出的)或人工合成的(例如通過在以上描述的核酸上實(shí)施定位突變或DNA改組)。 因此，顯而易見本發(fā)明的多核苷酸能夠是天然產(chǎn)生的或重組的。本發(fā)明的多核苷酸包括在對于含有至少40%相同于，優(yōu)選至少90%相同于SEQ ID NO 1的核苷酸序列的多核苷酸的嚴(yán)格條件下雜交的那些。如在本文中所使用的，術(shù)語“嚴(yán) 格的雜交條件”等是指與本領(lǐng)域中所熟悉的那些參數(shù)，包括隨寡核苷酸的長度變化的雜交 溫度。核酸雜交參數(shù)可以在編撰這些方法的文獻(xiàn)Sambr00k，et al. (supra), and Ausubel,
19et al. (supra)中找到。例如，如在本文中所使用的，嚴(yán)格雜交條件能夠是指在65°C下的雜 交緩沖液(3. 5XSSC,0. 02% Ficoll,0. 02%聚乙烯吡咯烷酮，0. 02%牛血清白蛋白，2. 5mM NaH2PO4(pH7) ,0. 5% SDS,2mM EDTA)中的雜交。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括重組載體，其包含本發(fā)明的至少一種分離的多核苷酸 分子，被插入到能夠?qū)⒍嗪塑账岱肿舆f送到宿主細(xì)胞中的任何載體中。這樣的載體含有異 源性多核苷酸序列，這是并非天然發(fā)現(xiàn)的毗鄰本發(fā)明的多核苷酸分子而優(yōu)選衍生于除了多 核苷酸衍生物種之外的物種的多核苷酸序列。該載體能夠是RNA或DNA，原核的或是真核 的，而典型地是轉(zhuǎn)位子(或轉(zhuǎn)座子)(例如描述于美國專利US 5，792，294)，病毒或質(zhì)粒。如本文中所使用的，“可操作地連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸(例如DNA)片段之間的 功能關(guān)系。典型地，這是指轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件對轉(zhuǎn)錄序列的功能關(guān)系。例如，如果啟動子刺激或 調(diào)節(jié)合適細(xì)胞中的編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子可操作地連接于編碼序列，例如本文中所定 義的多核苷酸。一般而言，可操作地連接于轉(zhuǎn)錄序列的啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件對轉(zhuǎn)錄序列是 物理上鄰近的，即它們是順式作用的。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，如增強(qiáng)子，并不需要是物理 上鄰近的或定位于它們增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄的編碼序列的緊鄰。正如本文中所使用的，表達(dá)載體是能夠轉(zhuǎn)變宿主細(xì)胞并實(shí)施指定多核苷酸分子表 達(dá)的DNA或RNA載體。優(yōu)選地，表達(dá)載體也能夠在宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，表達(dá)載體能夠是原 核的或真核的，而典型地是病毒或質(zhì)粒。本發(fā)明的表達(dá)載體包括在本發(fā)明的重組細(xì)胞，包括 在細(xì)菌、真菌、內(nèi)源性寄生生物(或體內(nèi)寄生生物)、節(jié)肢動物、動物、和植物細(xì)胞中發(fā)揮功 能(即，引導(dǎo)基因表達(dá))的任何載體。具體而言，本發(fā)明的表達(dá)載體含有調(diào)節(jié)序列，如轉(zhuǎn)錄控制序列，翻譯控制序列，復(fù) 制起點(diǎn)、和其它與重組細(xì)胞相容并控制本發(fā)明的多核苷酸分子表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。具體地，本 發(fā)明的重組分子包括轉(zhuǎn)錄控制序列。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄開始、延長和終止的序列。特 別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄開始，如啟動子、增強(qiáng)子、操縱基因和阻抑物序列的那些 序列。合適的轉(zhuǎn)錄控制序列包括那些能夠在本發(fā)明至少一種重組細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何轉(zhuǎn) 錄控制序列。各種這樣的轉(zhuǎn)錄控制序列對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的。本發(fā)明的重組分子也可以(a)含有使本發(fā)明所表達(dá)的多肽能夠從產(chǎn)生該多肽的 細(xì)胞中分泌出來的分泌信號(即，信號片段核酸序列)，和/或(b)含有導(dǎo)致本發(fā)明的核酸 分子作為融合蛋白表達(dá)的融合序列。合適的信號片段的實(shí)例包括任何能夠引導(dǎo)本發(fā)明的多 肽分泌的信號片段。重組分子也可以包括圍繞和/或在本發(fā)明的核酸分子的核酸序列內(nèi)的 插入序列(或間插序列)和/或非翻譯序列。本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括含有本發(fā)明的一種或多種重組分子的宿主細(xì)胞。多核 苷酸分子轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中能夠通過多核苷酸分子能夠插入到細(xì)胞中的任何方法來完成。轉(zhuǎn)化 技術(shù)包括但不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、吸附、和原生質(zhì)體融合。重組細(xì) 胞可以保持單細(xì)胞或者可以生長成組織、器官或多細(xì)胞生物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的多核苷酸分 子能夠保持是染色體外的、或者能夠以保留其表達(dá)能力的這種方式結(jié)合到所轉(zhuǎn)化的(即重 組)細(xì)胞的染色體中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。待轉(zhuǎn)化的合適宿主細(xì)胞包括能夠用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞。本發(fā)明的 宿主細(xì)胞能夠內(nèi)源性地(即，天然的)生產(chǎn)本發(fā)明多肽或在用本發(fā)明的至少一種多核苷酸
20分子轉(zhuǎn)化后能夠產(chǎn)生這種多肽。本發(fā)明的宿主細(xì)胞能夠是能夠產(chǎn)生本發(fā)明至少一種蛋白的 任何細(xì)胞，包括動物、植物、細(xì)菌、真菌(包括酵母)、寄生生物、和節(jié)肢動物的細(xì)胞。優(yōu)選地， 該宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞是具有血清型H抗原HlO的 大腸桿菌菌株。合適的大腸桿菌菌株實(shí)例包括在WO 2007/025333中描述的CCEC22、CCEC31 和 CCEC59。重組DNA工藝學(xué)能夠用于通過，例如，可操作控制宿主細(xì)胞中的多核苷酸分子復(fù) 制體的數(shù)目而改進(jìn)所轉(zhuǎn)化多核苷酸分子的表達(dá)、這些多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄效率、所得轉(zhuǎn)錄 物的翻譯效率、和翻譯后修飾的效率。對提高本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)的有用重組技術(shù)包 括但不限于，可操作地將多核苷酸分子連接到高復(fù)制數(shù)質(zhì)粒，將多核苷酸分子結(jié)合到一個(gè) 或多個(gè)宿主細(xì)胞染色體中，將載體穩(wěn)定性序列添加入質(zhì)粒中，替換或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號 (例如，啟動子、操縱基因、增強(qiáng)子)，替換或修飾翻譯控制信號(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)， Shine-Dalgarno序列(或SD序列))，修飾本發(fā)明的多核苷酸分子而對應(yīng)于宿主細(xì)胞的密 碼子使用，以及確實(shí)(或刪除)對轉(zhuǎn)錄去穩(wěn)定化的序列。多核苷酸的檢測任何容許用于檢測本發(fā)明多核苷酸的合適技術(shù)都可以使用，包括那些容許定量評 價(jià)多核苷酸在組織和/或細(xì)胞中的表達(dá)水平的技術(shù)。例如，轉(zhuǎn)錄基因的存在或水平能夠通 過RNA印跡法(或諾慎印跡法，Northernblotting)、和/或多核苷酸的擴(kuò)增，如通過PCR就 能夠檢測。比較可以通過參照標(biāo)準(zhǔn)對照進(jìn)行。例如，轉(zhuǎn)錄基因的水平能夠通過RNA印跡法 和/或RT-PCR就能夠測定。隨著定量(實(shí)時(shí))PCR的出現(xiàn)，基因表達(dá)的定量分析通過采用 對于所感興趣基因的合適引物就能夠?qū)崿F(xiàn)。核酸可以在基因陣列上進(jìn)行標(biāo)記和雜交，在這 種情況下，基因濃度將直接與陣列中產(chǎn)生的放射性或熒光信號的強(qiáng)度成比例?！熬酆衔锩告湻磻?yīng)”(“PCR”)是其中復(fù)制副本采用構(gòu)成“上游”和“下游”引物 的“引物對”或“引物組”、以及聚合催化劑如DNA聚合物酶、和典型的熱穩(wěn)定性聚合物酶 而制成多核苷酸靶的反應(yīng)。用于PCR的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如于"PCR" (Ed. Μ. J. McPherson and S. G Moller (2000)BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford)中所 教導(dǎo)的。PCR能夠在由從生物樣品中分離出的反轉(zhuǎn)錄mRNA獲得的cDNA上實(shí)施。然而，如果 PCR在染色體組的DNA上實(shí)施，則一般這將會更容易些。引物通常是約20個(gè)核苷酸長，最少約15個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其能夠在序列特異 性模式下雜交到靶序列中而在PCR期間擴(kuò)展。擴(kuò)增子或PCR產(chǎn)物或PCR片段或擴(kuò)增產(chǎn)物是 含有引物和靶序列的新近合成的復(fù)制體的擴(kuò)展產(chǎn)物。多重PCR系統(tǒng)含有導(dǎo)致同時(shí)產(chǎn)生多于 一個(gè)擴(kuò)增子的多組引物。引物可以極好地匹配于靶序列或它們可以含有能夠在特異性靶序 列中產(chǎn)生限制內(nèi)切酶或催化性核酸識別/裂解位點(diǎn)誘導(dǎo)的內(nèi)部不匹配堿基。引物也可以含 有其它序列和/或修飾或標(biāo)記的核苷酸而有利于捕獲或檢測擴(kuò)增子。DNA的熱變性、引物 的退火到其互補(bǔ)序列和退火引物用聚合物酶進(jìn)行擴(kuò)展的重復(fù)循環(huán)，導(dǎo)致了靶序列的指數(shù)擴(kuò) 增。術(shù)語“靶”或“靶序列，，或“模板”是指擴(kuò)增的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解到，還有許多可替代的技術(shù)可以用于擴(kuò)增本發(fā)明的多核 苷酸。其它擴(kuò)增技術(shù)的實(shí)例包括反轉(zhuǎn)錄聚合物酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(“LCR”)， 還包括等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如鏈替換擴(kuò)增(SDA)、DNA環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)。可替代地，本發(fā)明的多核苷酸可以在樣品中采用合適的雜交技術(shù)，例如采用合適標(biāo)記探針的DNA印跡雜交，進(jìn)行檢測?！疤结槨笔悄軌驂A基配對到含有互補(bǔ)序列(靶)的第 二 DNA或RNA分子的定義序列的單鏈DNA或RNA分子。所得的雜交分子的穩(wěn)定性取決于所 發(fā)生的堿基配對的程度，并受到參數(shù)如探針和靶分子之間的互補(bǔ)程度、以及雜化條件的嚴(yán) 格程度的影響。對于本文中描述的多核苷酸、或其部分具有特異性的探針，在長度上可以變 化，包括從至少8個(gè)核苷酸到500個(gè)核苷酸之間的任何在內(nèi)的整數(shù)值，這取決于探針?biāo)?用的目的、和在此目的下的條件。例如，探針在長度上可以是至少8、10、15、20或25個(gè)核苷 酸，或者在長度上可以是至少30、40、50或60個(gè)核苷酸，或在長度上可以是100、200、500或 1000個(gè)核苷酸內(nèi)的長度。例如采用比對(Align)程序分析(Myersand Miller，1989)，對 本文中描述的多核苷酸具有特異性的探針一般至少40 %、50 %、55 %或60 %，或至少65 %、 75%、80%、85%、90%或95%，或多達(dá)96%、97%、98%或99%相同于本文中描述的核酸序 列。如本文中所使用的，術(shù)語“雜交”是指兩個(gè)核酸分子相互之間通過氫鍵的關(guān)聯(lián)作 用。影響這種結(jié)合的因素包括溶劑的類型和體積 ’反應(yīng)溫度；雜交時(shí)間；攪拌；阻斷液相分 子非特異性連接于固體載體的試劑(登哈特試劑或BL0TT0)；分子的濃度；用于增加分子關(guān) 聯(lián)比率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；和雜交后的沖洗條件的嚴(yán)格度(參見， Sambrook et al. ,Molecular Cloning ；ALaboratory Manual,Second Edition(1989))。根 據(jù)這些原理，互補(bǔ)分子與靶分子的雜交的抑制作用可以采用雜交試驗(yàn)分析進(jìn)行檢測；具有 更大程度同源性的基本同源的分子，接著就會競爭而在各種嚴(yán)格條件下抑制競爭性同源分 子結(jié)合于靶分子，正如在文獻(xiàn)Wahl et al. , (1987)中所教導(dǎo)的。正如本文中關(guān)于雜交所使用的，“嚴(yán)格條件”是指這樣一些條件(1)采用低離 子強(qiáng)度和高溫沖洗，例如，50°C的0. 015MNaCl/0. 0015 M檸檬酸鈉/0. 1 % NaDodSO4 ； (2) 雜交期間采用變性試劑如甲酰胺，例如，42°C的50% (ν/ν)甲酰胺與0. 牛血清清蛋 白、0. 菲可(聚蔗糖，F(xiàn)icoll)、0. 聚乙烯吡咯烷酮、50mM pH6. 5磷酸鈉緩沖液與 750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉；或(3)采用42°C在0. 2 X SSC和0. 1% SDS中的50%甲酰胺、 5X SSC(0. 75M NaCl, 0. 075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6. 8)、0. 焦磷酸鈉、5X 登哈特 溶液(Denhardt' s solution)、超聲處理的鮭魚精子 DNA (50g/ml)、0. 1% SDS 和 10%硫酸 葡聚糖。減毒細(xì)菌細(xì)菌病原體的減毒方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。典型地，將突變引入到細(xì)菌染色體 組中以阻止或降低毒素或其它毒性基因的表達(dá)而缺失(或刪除)或使該基因失活。在某些 情況下，它們完全敲除這些基因的功能。這可以通過完全從基因中廢止任何多肽的合成、或 通過使之產(chǎn)生突變而導(dǎo)致非功能性多肽的合成而實(shí)現(xiàn)。為了廢止多肽的合成，整個(gè)基因或 其5'-端部可以進(jìn)行刪除(或缺失)。在基因編碼序列中刪除或插入，可以用于產(chǎn)生僅僅 合成非功能性多肽的基因(例如，僅僅含有野生型蛋白的N-端序列的多肽)。在毒素基因 的情況下，突變可以導(dǎo)致該基因產(chǎn)物變成無毒性?！巴蛔儭卑ㄅc親代菌株相比在生物的DNA序列，即染色體組中的任何改變。這種 改變可以通過將生物暴露于誘變刺激物，如誘變化學(xué)品、能量、輻射、重組技術(shù)、交配、或任 何用于改變DNA的其它技術(shù)而產(chǎn)生。突變可以包括在本文中描述的任何核苷酸序列中的改 變，或者可以包括在編碼本文中描述的任何多肽的核苷酸序列中的改變。
作為突變的結(jié)果，當(dāng)與親本菌株相比時(shí)，如果突變細(xì)胞的毒性水平降低至少10%、 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,100 %，則突變可以“弱化毒素毒性”。毒 性的降低也可以通過當(dāng)與親本菌株相比時(shí)降低多肽，例如含有基本相同于序列SEQ IDNO 2 或SEQ ID NO :3、或其片段或變體的氨基酸序列在突變菌株中至少10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%或100%的表達(dá)和/或毒素活性而進(jìn)行測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解到，本發(fā)明的減毒細(xì)菌病原體可以適用于向受試者遞送 一種或多種生物活性多肽。適用于通過本發(fā)明的減毒細(xì)菌遞送的生物活性多肽的實(shí)例包括 能夠局部或系統(tǒng)地發(fā)揮功能的多肽，例如能夠發(fā)揮內(nèi)分泌活性而影響局部或全身代謝的多 肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物活性多肽可以是異源多肽。術(shù)語“異源多肽”在本領(lǐng)域內(nèi) 很好理解，是指非細(xì)胞內(nèi)生的多肽。編碼所感興趣的多肽的核酸分子可以源于能夠產(chǎn)生所 感興趣多肽的任何生物，或者可以是完全人工合成的基因。編碼該多肽的核酸分子能夠例 如通過感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、(高速粒子)噴射技術(shù)(microprojection)等加入到 細(xì)胞中。以舉例的方式，生物活性多肽可以是能夠調(diào)節(jié)免疫造血系統(tǒng)的多肽。可替代地，生 物活性多肽可以是能夠影響體內(nèi)各種正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的生存力、生長和分化的多肽。 可替代地，生物活性多肽可以是能夠影響免疫調(diào)節(jié)或?qū)κ軅透腥镜募毙云诎l(fā)炎應(yīng)答的誘 導(dǎo)的多肽?？商娲?，生物活性多肽可以是能夠增強(qiáng)或誘導(dǎo)對由作用于其靶細(xì)胞受體上的 趨化激素介導(dǎo)的細(xì)胞和組織感染的抗性、或上皮細(xì)胞增殖或傷愈促進(jìn)的多肽。這種多肽的具體實(shí)例包括胰島素，生長激素，催乳素，降鈣素，黃體生成素，甲狀旁 腺激素，促生長素抑制素，促甲狀腺激素，血管活性腸肽，結(jié)構(gòu)組1細(xì)胞因子(structural group 1 cytokine)如 IL-1β 、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-IU IL-12、 IL-13、 IL-15、 IL-16、 IL-17、 IL-18、 IL-19、 IL-20、 IL-21、 IL-23、 IL-24、 IL-25、IL-26、IL-32、cMGF、LT、GM-CSF、M-CSF, SCF、IFN- y、IFN- λ、EPO, G-CSF, LIF、OSM、 CNTF、GH、raL或IFNa/β，結(jié)構(gòu)組2細(xì)胞因子如TNF族的細(xì)胞因子例如TNFa配體、TNF3配 體、⑶40配體、⑶27配體或FAS配體，IL-I族的細(xì)胞因子，成纖維細(xì)胞生長因子族，血小板衍 生的生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子β和神經(jīng)生長因子，結(jié)構(gòu)組3細(xì)胞因子例如上皮生長因子族 的細(xì)胞因子，趨化因子，胰島素相關(guān)的細(xì)胞因子，結(jié)構(gòu)組4細(xì)胞因子如調(diào)蛋白(heregulins) 或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，例如EGF。可替代地，生物活性多肽能夠是對于以上定義的生物活性多肽的受體或拮抗劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，生物活性多肽是抗體，優(yōu)選重組抗體?？商娲?，生物活性多肽能夠是抗微生物肽或其合成變體?？刮⑸镫陌⒕?肽、爪蟾抗菌肽(或蛙皮素，magainin)和防衛(wèi)素(defensin)。殺菌肽是第一族特征化較佳的結(jié)構(gòu)相關(guān)的抗微生物肽，據(jù)發(fā)現(xiàn)廣泛分布于昆蟲體 內(nèi)(Boman，2003)。在脊椎動物中，爪蟾抗菌肽(或蛙皮素)族抗微生物肽已經(jīng)從爪蟾皮 膚和胃腸道的腺體中分離出來，而被認(rèn)為是構(gòu)成兩棲動物粘膜表面抗感染防御體系的基礎(chǔ) (Soravia et al. ，1988)。防衛(wèi)素是在從幾種哺乳動物物種包括人類中分離出的吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的抗微生 物肽，而其特征是序列中的8個(gè)不變殘基(Gabayet al.，1989)。肽，如防衛(wèi)素的抗微生物活性機(jī)理是經(jīng)由選擇性地破壞膜而產(chǎn)生抗生物活性的特征廣譜(Boman，1995)。防衛(wèi)素的抗微 生物譜包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、分枝桿菌、許多真菌和一些包膜病毒。細(xì)菌源的抗微生物肽已知為小菌素、大腸桿菌素和細(xì)菌素(Jacket al. , 1995 ； Ingham et al.，2003)。據(jù)所知，細(xì)菌素活性的序列、結(jié)構(gòu)和機(jī)理是不同的。最豐富的和研 究最透徹的細(xì)菌素包括I類(羊毛硫抗生素)和II類(含非羊毛硫氨酸的小熱穩(wěn)定肽) 細(xì)菌素(Ermahar et al.，2000)。II類細(xì)菌素因?yàn)槠浠钚院蜐撛诘膽?yīng)用構(gòu)成了一重要的 亞群。IIa類細(xì)菌素包括Piscicolin 126、明串珠菌素A(leucocin A)和腸道菌素P (或 促腸活動素，enterocin P)等。IIa類細(xì)菌素具有共同的N-端基序AGNGVXaaCXaa(K/ N) XaaXaaCXaaV (N/D) (ff/K/R) Xaa- (G/A/S) (Α/Ν)，其中具有較高可變性的殘基表示為 Xaa(Bhugaloo-Vial，et al.，1996)。在論證細(xì)菌素抗微生物性質(zhì)的實(shí)例中，Piscicolin 126，當(dāng)其被注入小鼠體內(nèi)時(shí)，已經(jīng)證實(shí)表現(xiàn)出體內(nèi)抗微生物活性，并顯著降低了肝臟和脾 中的李斯特負(fù)載(listerial load) (Ingham et al.，2003)?？商娲?，生物活性肽能夠是酶。酶能夠是任何具有所需活性的酶。例如，遞送在 改善食物消化能力或去除抗?fàn)I養(yǎng)化合物中起作用的酶，是合乎需要的。例如，多糖降解和 纖維蛋白溶解的酶如木聚糖酶(Liu et al.，2005)、葡聚糖酶(Cho et al.，2000)、纖維素 酶(Liuet al.，2005)、淀粉酶、果聚糖蔗糖酶、和菊粉蔗糖酶都可以被遞送而增加食物的消 化能力。蛋白酶、肽酶、和脂肪酶也可以被遞送而增加被消化食物的營養(yǎng)價(jià)值。植酸酶(或 肌醇六磷酸酶)(Vohra andSatyanarayana, 2003 ；Nahashon et al.，1994)和酸性磷酸酶 (Palacioset al. ,2005)也可以被遞送而降低在植物種子中發(fā)現(xiàn)的肌醇六磷酸(鹽/酯) 的抗?fàn)I養(yǎng)效應(yīng)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的減毒細(xì)菌病原體可以表達(dá)抗原體。如果抗原是例 如來自細(xì)菌、真菌、寄生生物或病毒性致病劑(viraldisease agent)，則減毒細(xì)菌菌株 就能夠用于對受試者接種而對抗由這種致病劑導(dǎo)致的疾病。例如，減毒細(xì)菌菌株能夠用 于遞送來自禽類病原微生物的抗原。這種微生物包括但不限于以下這些物種棒狀桿菌 (Corynebacteria),支原體(Mycoplasma)，李斯特氏桿菌(Listeria)，包柔氏螺旋體菌 (Borrelia)，衣原體(Chlamydia)，梭狀芽胞桿菌(Clostridia)，科克斯菌屬(Coxiella)， 丹毒絲狀菌(Eysipelothrix),黃桿菌(Flavobacteria),葡萄球菌(Staphylococcus), 埃希氏菌(Escherichia)，沙門氏菌(Salmonella)，彎曲桿菌(Campylobacter)和鏈球 菌(Streptococcus)。已知感染家禽的真菌和寄生性禽類病原體的實(shí)例有以下物種變 帶緣蟲屬(Amoebotaenia), Aproctella,蟲回蟲屬(Ascaridia),曲霄菌(Aspergillus), 念珠菌(Candida)，毛細(xì)線蟲屬(Capillaria)，隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)，杯 冠木屬(Cyathostroma)，咽飾帶線蟲屬(Dispharynx)，艾美耳球蟲屬(Eimeria)，皺 褶屬(Fimbriaria)，筒線蟲屬(Gongylonemia)，異刺線蟲屬(Heterakis)，組織滴 蟲屬(Histomonas)，尖旋尾屬(Oxyspirura),皰原蟲屬(Plasmodium)，瑞立絳蟲屬 (Raillietina)，類圓線蟲屬(Strongyloides)，錐尾屬(Subulura)，比翼屬(Syngamus)， 四棱屬(Tetrameres)和毛圓線蟲屬(Trichostrongylus)。感染家禽的已知病毒包括腺 病毒(adenoviruses)(例如，出血性腸炎病毒(hemorrhagic enteritisvirus)),星狀病 毒(astroviruses)，冠形病毒(coronaviruses)(例如，傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus)),畐Ij 粘病毒(paramyxoviruses)(例如，新城疫病毒(Newcastledisease virus))、微小核糖核酸病毒(picornaviruses)(例如，禽類腦脊髓炎病毒 (encephalomyelitis virus)),痘病毒(pox viruses),逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)(例如， 禽類白血病/肉瘤病毒(leukosis/sarcomaviruses))，呼吸道腸道孤病毒(reoviruses)和 輪狀病毒(rotaviruses)。具體實(shí)例包括禽流感病毒、馬立克氏病病毒(Marek’ s Disease Virus)和雞貧血病毒(Chicken Anaemia Virus)。用作抗原的優(yōu)選基因產(chǎn)物是多肽和肽， 包括糖蛋白和脂蛋白。來自這些原核和真核生物的抗原編碼的基因能夠進(jìn)行克隆，并采用 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在減毒細(xì)菌中表達(dá)。組合物和給藥“免疫原組合物”是指含有提高所需免疫應(yīng)答的物質(zhì)的組合物，包括“疫苗”。術(shù)語 “疫苗”涵蓋了任何誘導(dǎo)抗靶向病原體的至少部分保護(hù)性免疫應(yīng)答或其有效保護(hù)對抗病原 體的組合物；例如，在給予或注射到動物(例如，禽類如家雞或豬類家畜如豬)體內(nèi)之后，誘 發(fā)對抗靶向病原體的至少部分保護(hù)性免疫應(yīng)答或提供對抗病原體(如產(chǎn)氣莢膜梭菌)的有 效保護(hù)。病原體的子單元例如從病原體分離出的抗原或免疫原或抗原決定基，和子單元組 合物，含有或基本由一種或多種從病原體中分離出的抗原、免疫原或抗原決定基組成。對于 誘發(fā)“至少部分保護(hù)性的”免疫應(yīng)答，意指疫苗降低由表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)菌產(chǎn)生的感染和 /或群集(或殖民化)或者降低由表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)菌感染而產(chǎn)生的至少一種癥狀。免疫原的組合物可以選擇、活化或擴(kuò)展包括記憶B細(xì)胞和T細(xì)胞在內(nèi)的免疫系統(tǒng) 細(xì)胞，而例如使之能夠消除傳染性致病物，如表達(dá)含有SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3氨 基酸序列、或其抗原片段的多肽的細(xì)菌病原體。在一些實(shí)施方式中，免疫原的組合物包括合適的載體，如佐劑，其是這樣的一種試 劑，其以非特異性方式作用而增加對特異性抗原、或抗原組的免疫應(yīng)答，而能夠以既定劑量 降低抗原數(shù)量，或者降低產(chǎn)生所需的免疫應(yīng)答而需要的劑量頻率。例如，在接種動物中所 需的免疫應(yīng)答相對于未接種動物可以包括10%至100%之間的任何值，例如10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%對抗細(xì)菌病原體散發(fā)或群集的保護(hù)。佐劑對于改善免疫應(yīng)答和/或增加疫苗制劑的穩(wěn)定性是有用的。佐劑典型地描 述為免疫系統(tǒng)的非特異性刺激物，而且對于靶向免疫系統(tǒng)的特異性分支也是有用的。一 種或多種具有這種活性的化合物可以加入到疫苗中。因此，本發(fā)明的具體疫苗另外含有一 種佐劑。能夠用作佐劑的化學(xué)化合物的實(shí)例包括但不限于，鋁化合物(例如，氫氧化鋁)， 可代謝的和不可代謝的油，礦物油包括礦物油溶液中的油酸二縮甘露醇酯衍生物(例如， 購自Seppic SA, France的MONTANIDE ISA 70)和輕礦物油如DRAKE0L 6VR、嵌段共聚物、 ISCOM' s (免疫刺激絡(luò)合物)、維生素和礦物質(zhì)(包括但不限于維生素E、維生素A、硒和 維生素 B12)和CARBOPOL 。其它合適的佐劑，有時(shí)候也稱之為免疫刺激劑，包括但不限于細(xì)胞因子、生長因 子、趨化因子、淋巴細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液、單核細(xì)胞、來自淋巴器官的細(xì)胞、來自植 物、細(xì)菌或寄生生物的細(xì)胞制劑和/或提取物(金黃色葡萄球菌或脂多糖制劑)或促細(xì)胞 分裂劑。一般而言，佐劑隨本發(fā)明的抗原同時(shí)給藥。然而，佐劑也能，或可替代地在疫苗給 藥之前2個(gè)星期的時(shí)間內(nèi)給藥、和/或疫苗給藥之后一定時(shí)間內(nèi)給藥，即只要抗原，例如含 有按照SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3提供的氨基酸序列的多肽或其抗原片段，存留于組織
25內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的免疫原的組合物可以包括本文中所描述的多肽和核酸分子、或其免 疫原片段，并且可以采用本領(lǐng)域已知的或本文中描述的任何給藥形式進(jìn)行給藥。在本發(fā)明 一些實(shí)施方式中，免疫原組合物或疫苗可以包括活體細(xì)菌病原體、殺滅的細(xì)菌病原體，或其 組分。活體細(xì)菌病原體可以以口服疫苗的形式給藥，可以進(jìn)行減毒而使之降低細(xì)菌病原體 的毒性，而不是其免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)?；铙w疫苗可以能夠群集于接種動物如禽類的腸內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，本文中描述的多肽和核酸分子，或其抗原片段，或本文中描述 的變異細(xì)菌(例如，減毒細(xì)菌)可以給予家禽，例如家雞、鴨、火雞等，而誘發(fā)家禽內(nèi)的免疫 應(yīng)答，例如，產(chǎn)生抗體。由這種家禽獲得的蛋，或其產(chǎn)品，表現(xiàn)出對抗本文中描述的多肽和 核酸分子、或其免疫原片段的免疫應(yīng)答的，可以給予動物，如人、牛、山羊、綿羊等，而在動物 內(nèi)誘發(fā)對本文中描述的多肽和核酸分子、或其免疫原片段的免疫應(yīng)答。在家禽中產(chǎn)生抗 體的方法，以及給予這種抗體的方法，描述于例如美國專利US 5，750，113和美國專利US 6，730，822 中。根據(jù)本發(fā)明的免疫原組合物和疫苗可以進(jìn)一步通過加入其它的當(dāng)給予動物受試 者時(shí)可以導(dǎo)致產(chǎn)生各種特異性抗體的重組或純化抗原而進(jìn)行補(bǔ)充。并非所有的這些抗體都 需要是保護(hù)性地對抗疾病。在這種類型的具體實(shí)施方式
中，這樣的抗原也來自產(chǎn)氣莢膜梭 菌。因此，本發(fā)明的疫苗可以與本發(fā)明的多肽一起含有各種其它活性的或失活的病原因子。 因此，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的多肽能夠與其它的梭菌和非梭菌細(xì)胞、類毒素和提取物一起組
I=I O其它抗原可以包括病毒抗原體和/或細(xì)菌抗原體和/或寄生生物抗原體。例 如，抗原體可以衍生于微生物，包括但不限于以下物種棒狀桿菌(Corynebacteria)， 支原體(Mycoplasma)，李斯特氏桿菌(Listeria)，包柔氏螺旋體菌(Borrelia)，衣 原體(Chlamydia)，梭狀芽胞桿菌(Clostridia)，科克斯菌屬(Coxiel la)，丹毒絲狀 菌(Eysipelothrix),黃桿菌(Flavobacteria)，葡萄球菌(Staphylococcus),埃希氏 菌(Escherichia)，沙門氏菌(Salmonella),彎曲桿菌(Campylobacter)、和鏈球菌 (Streptococcus) 0已知感染家禽的真菌和寄生性禽類病原體的實(shí)例有以下物種變 帶緣蟲屬(Amoebotaenia), Aproctella,蟲回蟲屬(Ascaridia),曲霄菌(Aspergillus), 念珠菌(Candida)，毛細(xì)線蟲屬(Capillaria)，隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)，杯 冠木屬(Cyathostroma)，咽飾帶線蟲屬(Dispharynx)，艾美耳球蟲屬(Eimeria)，皺 褶屬(Fimbriaria)，筒線蟲屬(Gongylonemia)，異刺線蟲屬(Heterakis)，組織滴 蟲屬(Histomonas)，尖旋尾屬(Oxyspirura),皰原蟲屬(Plasmodium)，瑞立絳蟲屬 (Raillietina)，類圓線蟲屬(Strongyloides)，錐尾屬(Subulura)，比翼屬(Syngamus)，四 棱屬(Tetrameres)和毛圓線蟲屬(Trichostrongylus)。已知的感染家禽的病毒包括腺 病毒(adenoviruses)(例如，出血性腸炎病毒(hemorrhagic enteritisvirus)),星狀病 毒(astroviruses)，冠形病毒(coronaviruses)(例如，傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus)),畐Ij 粘病毒(paramyxoviruses)(例如，新城疫病毒(Newcastle disease virus))、微小核糖核酸病毒(picornaviruses)(例如，禽類腦脊髓炎病毒 (encephalomyelitis virus)),痘病毒(pox viruses),逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)(例如， 禽類白血病/肉瘤病毒(leukosis/sarcomaviruses))，呼吸道腸道孤病毒(reoviruses)和輪狀病毒(rotaviruses)。本發(fā)明的多價(jià)疫苗還能夠含有一種或多種以下抗原體產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素， 產(chǎn)氣莢膜梭菌β 2毒素，產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素，產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素，產(chǎn)氣莢膜梭菌t毒 素，產(chǎn)氣莢膜梭菌κ毒素，產(chǎn)氣莢膜梭菌λ毒素，產(chǎn)氣莢膜梭菌θ毒素，索氏梭菌失血性 (C. sordellii hemorrhagic)毒素，索氏梭菌致命毒素，艱難梭菌(C. difficile)A毒素，艱 難梭菌B毒素，敗毒梭菌(C. septicum) α毒素，諾維梭菌(C. novyi) α毒素和諾維梭菌β本發(fā)明的免疫原組合物和疫苗可以作為液體、乳液、干粉給藥，和/或以霧劑通過 任何腸道外途徑、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)，通過破皮，皮下、肌肉內(nèi)給藥，或通過粘膜途徑，例 如口服、作為氣溶膠鼻吸，通過眼滴，通過卵內(nèi)注射給藥，或作為凍干粉末灌輸給藥。本文中描述的多肽和核酸分子，或其免疫原片段，變異細(xì)菌(例如減毒細(xì)菌)和/ 或本文中描述的免疫原組合物的給藥，可以通過向禽類(例如家禽)的蛋內(nèi)注射和注射到 氣囊中而很方便實(shí)現(xiàn)。盡管氣囊是卵內(nèi)注射給藥的優(yōu)選途徑，但是其它區(qū)域如卵黃囊或絨 毛膜尿囊液也可以通過注射接種。當(dāng)氣囊不是用于給藥的靶標(biāo)時(shí)盡管沒有必要是不可接受 的商業(yè)水平，但是孵化能力比率或許會稍微降低。注射的機(jī)理并不嚴(yán)格限于本發(fā)明的實(shí)施 內(nèi)容，但是優(yōu)選的是針不會導(dǎo)致對蛋或胚胎發(fā)育的組織和器官或胚胎周圍的外胚膜造成不 合宜的損害。一般而言，配備約22號針的皮下注射器是合適的。本發(fā)明的方法尤其適用于 自動注射系統(tǒng)，如描述于美國專利US 4，903，635、US 5，056，464、US 5，136，979和US 20060075973中的那些系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了對雌性動物(例如，懷孕母畜)后代提供被動免疫的方法，包括 在其后代出生之前向該雌性動物(例如，母體)給予本發(fā)明的疫苗。“被動免疫”是指將免 疫性從母體轉(zhuǎn)移到后代并能夠尤其是通過初乳消化來完成，正如在哺乳動物中所發(fā)生的那 樣，或?qū)⒖贵w從蛋卵黃吸收到血流中，正如在家禽中所發(fā)生的那樣。在一個(gè)實(shí)施方式中，雌性動物是禽類，而疫苗在其產(chǎn)下含有后代的蛋之前向禽類 母體給藥。以這種方式，其后代就被提供了被動免疫。在一個(gè)這種實(shí)施方式中，禽類是家禽。 優(yōu)選地，家禽是家雞、火雞或鴨子。本發(fā)明的免疫原組合物和疫苗可以含有藥用載體。藥用載體包括獸醫(yī)藥可接受的 載體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，術(shù)語“藥用的”是指由聯(lián)邦或州政府管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在適 用于動物，而尤其是人類的美國藥典或其它一般認(rèn)知的藥典中所列出的。術(shù)語“載體”是指 治療給藥所用的稀釋劑、賦形劑或媒介物。這種藥物載體能夠是無菌液體，如水和油，包括 石油、動物、植物或合成源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。一般而言，本發(fā)明的制劑成分要么獨(dú)立地要么在單位劑量形式中一起混合供給， 例如，作為凍干粉或無水濃縮物儲存于氣密性密封容器如指示活性劑的量的安瓿瓶或粉囊 中。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體和/或宿 主細(xì)胞的組合物。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解到該組合物可以含有合適的載體或賦形 劑。DNA 疫苗
DNA接種涉及將DNA編碼抗原直接體內(nèi)引入受試者的細(xì)胞和/或組織而由受試者 組織的細(xì)胞表達(dá)抗原。這種疫苗在本文中稱之為“DNA疫苗”或“核酸基疫苗”。DNA疫苗的 實(shí)例描述于美國專利 US 5，939，400，美國專利 US 6, 110, 898, WO 95/20660 和 WO 93/19183 中。直接注射編碼抗原而誘發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的DNA的能力已經(jīng)在各種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中得以證 實(shí)(參見,例如，Conry et al. , 1994 ；Cardosoet al. , 1996 ；Montgomery et al. , 1993 ；Yang et al.，1997)。已知的影響由DNA免疫誘發(fā)的免疫應(yīng)答的因素是DNA遞送的方法，例如，腸道外 途徑能夠產(chǎn)生的基因轉(zhuǎn)移速率低，而產(chǎn)生的基因表達(dá)的可變性很大(Montgomery et al., 1993)。采用基因槍的高速接種質(zhì)粒，能夠增強(qiáng)小鼠的免疫應(yīng)答(Fynan et al.，1993)，大概 是因?yàn)镈NA轉(zhuǎn)染效率更大，而抗原通過樹突細(xì)胞滲透更有效。含有本發(fā)明核酸基疫苗的載 體也可以通過其它本領(lǐng)域已知的方法如轉(zhuǎn)染、電穿孔、微量注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡萄 糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)子而引入到所需宿主中。衍牛于轉(zhuǎn)基因棺物的疫苗術(shù)語“植物”是指整個(gè)植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞等?？?設(shè)想用于本發(fā)明的實(shí)施中的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。典型的雙子葉植物包括玉 米、土豆、西紅柿、菜豆、大豆等。典型的轉(zhuǎn)基因植物常規(guī)上都作為用于農(nóng)場動物，尤其是家 雞的食物(或飼料)來源而進(jìn)行使用。轉(zhuǎn)基因植物，正如在本發(fā)明上下文中所定義的，包括植物(以及所述植物的部分 和細(xì)胞)及其后代，這種后代已采用重組DNA技術(shù)遺傳修飾而在所需植物或植物器官內(nèi)導(dǎo) 致或增強(qiáng)了本發(fā)明的至少一種多肽的生產(chǎn)。現(xiàn)有的幾種技術(shù)能夠?qū)⑼庠催z傳物質(zhì)引入到植物細(xì)胞中，而獲得穩(wěn)定維持和表達(dá) 所引入基因的植物。這樣的技術(shù)包括加速涂覆到微粒上的遺傳物質(zhì)直接進(jìn)入細(xì)胞中(參 見，例如，美國專利US4, 945，050和US 5，141，131)。植物可以采用土壤桿菌技術(shù)(或農(nóng)桿 菌技術(shù)，Agrobacterium technology)進(jìn)行轉(zhuǎn)化(參見，例如，US5, 177，010、US 5，104,310、 US 5,004, 863,US 5，159，135)。電穿孔技術(shù)也用于植物轉(zhuǎn)化(參見，例如，WO 87/06614,US 5, 472, 869, US 5, 384, 253, WO 92/09696 和 WO 93/21335)。除了用于轉(zhuǎn)化植物的各種技術(shù) 外，與外源基因相接觸的組織類型也可以進(jìn)行變化。這種組織可以包括但不限于，胚胎發(fā)生 組織、胼胝體I型和II型、胚軸、分生組織等。幾乎所有的植物組織在發(fā)育和/分化期間采 用本文中描述的合適技術(shù)就可以被轉(zhuǎn)化。適合穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物的建立的許多載體已經(jīng)描述于例如文獻(xiàn) Pouwels et al. ,Cloning Vectors :A LaboratoryManual,1985,supp. 1987 ；Weissbach and ffeissbach, Methods forPlant Molecular Biology, Academic Press, 1989 ；禾口 Gelvin et al. ,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers, 1990 中。典型地， 植物表達(dá)載體包括，例如，一種或多種在5'和3'調(diào)節(jié)序列和顯性選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)染控制下 克隆的植物基因。這種植物表達(dá)載體還能夠含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如，控制可誘導(dǎo)的或組 成型的、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的、或細(xì)胞或組織特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))，轉(zhuǎn)染開始的始發(fā)位點(diǎn)，核 糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA處理信號、轉(zhuǎn)染終止位點(diǎn)，和/或多腺苷酸化信號。植物啟動子的實(shí)例包括但不限于，核酮糖-1，6- 二磷酸羧化酶小子單元、β -伴大 豆球蛋白(conglycinin))啟動子、菜豆蛋白啟動子、ADH啟動子、熱沖擊啟動子和組織特異
28性啟動子。啟動子也可以含有某些可以改善轉(zhuǎn)錄效率的增強(qiáng)子序列元件。典型的增強(qiáng)子包 括但不限于Adh-內(nèi)含子1和Adh-內(nèi)含子6。組成型啟動子引導(dǎo)所有細(xì)胞型中在所有時(shí)間的連續(xù)基因表達(dá)(例如，肌動蛋白、 泛素、CaMV 35S)。組織特異性啟動子負(fù)責(zé)在特異性細(xì)胞和組織類型如葉子或種子(例如， 玉米蛋白、油質(zhì)蛋白、油菜籽蛋白(或種子儲藏蛋白，napin)、ACP、球蛋白等)中的基因表 達(dá)，而這些啟動子也可以使用。啟動子也可以在植物發(fā)育的某些階段是活性的，以及在植物 組織和器官中也是活性的。這種啟動子的實(shí)例包括但不限于，花粉特異性的、胚胎特異性 的、玉米穗絲特異性的、棉纖維特異性的、根特異性的、種子胚乳特異性的啟動子等。在某些情況下，采用可誘導(dǎo)的啟動子或許是合乎需要的?？烧T導(dǎo)的啟動子負(fù)責(zé)響 應(yīng)特異性信號如物理刺激(熱沖擊基因)；光(RUBP羧化酶)；激素(Em)；代謝物；和應(yīng)力， 而用于進(jìn)行基因表達(dá)。其它在植物中發(fā)揮功能的所需的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件也可以使用。除了植物啟動子之外，各種來源的啟動子都能在植物細(xì)胞中有效使用而表達(dá)外源 基因。例如，細(xì)菌源的啟動子，如章魚堿合酶(或真蛸堿合成酶，octopine synthase)啟動 子、胭脂氨酸合成酶啟動子、甘露堿合酶啟動子；病毒源的啟動子，如花椰菜花葉病毒(35S 和19S)等，都可以使用。許多植物衍生的可食用疫苗目前已經(jīng)發(fā)展為用于動物和人的病原體(Hood and Jilka,1999)。免疫應(yīng)答也已經(jīng)用以下物質(zhì)口服免疫化而產(chǎn)生產(chǎn)生類病毒粒子(VLP)的轉(zhuǎn) 基因植物、或顯示抗原決定基的嵌合植物病毒(Modelska et al.，1998 ；Kapustra et al.， 1999)。由之啟示如下這些VLP或嵌合病毒的粒子形式可以導(dǎo)致抗原在胃中更大的穩(wěn)定 性，有效地提高了在內(nèi)臟中吸收的可利用的抗原的量(Modelska et al. 1998)。食物在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物是食物或食料。為本發(fā)明之目的，“食物”或 “食料”包括人或動物(如，牛、馬、山羊和綿羊)消耗的任何食物或制劑(包括腸或腸胃外 的消耗)，當(dāng)吸收到身體內(nèi)之后，(a)起到供給營養(yǎng)或構(gòu)建組織或供給能量；和/或(b)維 持、儲存或支持足夠的營養(yǎng)狀態(tài)或代謝功能。食物包括對于具體用途所需的用量的營養(yǎng)物質(zhì)如可食用常量營養(yǎng)物、維生素，和/ 或礦物質(zhì)。這些成分的量將會根據(jù)組合物是否打算用于正常個(gè)體還是具有專用需求的個(gè)體 所用，如患有代謝障礙等的個(gè)體，而進(jìn)行變化。具有營養(yǎng)價(jià)值的物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于，常量營養(yǎng)物如可食用脂肪、碳水化合 物和蛋白質(zhì)。這樣的可食用脂肪的實(shí)例包括但不限于，椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑加倫 油、豆油、和酸-和二酸-甘油酯。這樣的碳水化合物的實(shí)例包括(但不限于)葡萄糖、可 食用乳糖、和水解淀粉。另外，在本發(fā)明的營養(yǎng)組合物中可以使用的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括(但 不限于)大豆蛋白、電滲析乳清、電滲析脫脂乳、乳清、或這些蛋白的水解產(chǎn)物。關(guān)于維生素和礦物質(zhì)，以下可以添加到本發(fā)明的食物組合物中鈣、磷、鉀、鈉、氯、 鎂、錳、鐵、銅、鋅、硒、碘，以及維生素A、E、D、C、和B族復(fù)合物。也可以添加其它的這樣的維 生素和礦物質(zhì)。在本發(fā)明的食物組合物中可以利用的組分能夠是半純化的或純化的來源。對于半 純化或純化的物質(zhì)，意指通過營養(yǎng)物質(zhì)的純化或通過從頭合成(novo synthesis)制備的物 質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽用于食物的生產(chǎn)中。例如含有本發(fā)明多肽的食 物能夠用于動物接種而通過細(xì)菌病原體表達(dá)具有毒素活性的多肽以提供對感染和/或群 集的至少部分的保護(hù)作用。優(yōu)選地，細(xì)菌病原體表達(dá)的多肽含有至少40%相同于SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)菌病原體來自于梭狀芽孢 桿菌屬，例如，細(xì)菌病原體是產(chǎn)氣莢膜梭菌。在另一實(shí)施方式中，食物含有本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，和/或所述植物的部分，和/ 或所述植物的提取物。激動劑和拮抗劑_試驗(yàn)分析(或測定)和分子本發(fā)明的多肽可以應(yīng)用于該多肽的毒素活性的活化(激動劑)或抑制(拮抗劑) 的化合物的篩選過程中。潛在的拮抗劑的實(shí)例包括抗體、寡糖及其衍生物。潛在的拮抗劑包括結(jié)合于本發(fā) 明的多肽使之無法接近該多肽的底物的小分子。小分子的實(shí)例包括但不限于，小肽或類肽 分子。小分子可以模擬根據(jù)本發(fā)明多肽的底物的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還包括識別與具有毒素活性的多肽相互作用或抑制其生物活性(即，影響 酶活性)的化合物的高通量篩選(HTS)分析法。HTS分析法容許以有效的方式篩選大量化 合物。HTS分析法經(jīng)設(shè)計(jì)而識別具有所需性能的“命中化合物”或“先導(dǎo)化合物”，這種先導(dǎo) 化合物能夠經(jīng)過設(shè)計(jì)而改善所需的性能。對于“命中化合物”或“先導(dǎo)化合物”的化學(xué)改性 (或修飾)經(jīng)常基于“命中化合物”和毒素多肽之間的可識別結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系。本發(fā)明多肽的拮抗劑通過將其添加到動物食物或飲料中可以用于保護(hù)動物免于 生病。這種處理能夠降低該動物暴露的活性環(huán)境衍生生物的負(fù)載。因此，本發(fā)明提供的食 物和/或飲料含有本發(fā)明多肽的拮抗劑。拮抗劑可以是例如，結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體。本 發(fā)明還提供了含有這樣的拮抗劑的食物和/或飲料用于降低動物被表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì) 菌感染和/或群集的用途。實(shí)施例實(shí)施例1.產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素編碼NetB基因的測序?qū)?0 μ g從產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株EHE-NE18分離出來的染色體組DNA用于獲得序列 讀取、重疊群和序列質(zhì)量得分。氨基酸序列由核苷酸序列推斷。信號肽的預(yù)測采用SignalP ν 3.0程序?qū)嵤?Bendtsen et al.，2004)。與所推斷的氨基酸序列同源的序列采用gapped BLAST 程序搜索(Altschul et al.，1997)。編碼NetB的基因的核苷酸序列按照SEQ ID NO :1提供，而包括信號序列的NetB 的氨基酸序列按照SEQ ID NO :3提供。信號肽序列從成熟分泌的蛋白(SEQ ID NO 2)中切 取。當(dāng)與NetB共享同一性低于39%時(shí)，BLAST搜索識別產(chǎn)氣莢膜梭菌β _毒素(圖1)。重組NetB的純化和兔抗-rNetB抗血清的產(chǎn)生將netB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并克隆入pENTR/SD/D-T0P0，并從框架中亞克隆入表達(dá) 載體pDest41BA。蛋白在鎳親合柱上接著通過凝膠過濾(S200)而進(jìn)行純化。將峰組分匯集 并進(jìn)行TEV裂解，而重新載入到鎳柱上以除去未裂解的蛋白和TEV。將重組蛋白( 1. 3mg) 送入Chemicon而進(jìn)行抗體生產(chǎn)(Chemicon-Millipore，CA, USA)。將抗-rNetB抗血清用于 產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的免疫印跡分析(或蛋白質(zhì)印跡分析)和中和研究中。
天然NetB純化產(chǎn)氣莢膜梭菌EHE-NE18在TPG湯內(nèi)生長直至0D600nm為0. 6。通過以18000g的 轉(zhuǎn)速在4°C下離心15min而獲取培養(yǎng)基上清液(3L)。采用超濾(Amicon 8400)通過IOkDa 膜(DIAFLO YM10-76mm，Amicon)將上清液濃縮X 5倍，接著在4°C下用40% (w/v)的 (NH4)2SO4沉淀過夜，并通過以ISOOOg轉(zhuǎn)速在4°C下離心2h來分離。將含有毒素的沉淀物 濃縮20倍(總共100倍)并在48h內(nèi)于4°C下用pH 7. 2的IOmM Tris-HCl透析。將蛋白 在瓊脂糖S印harose Q FF(GE)陰離子交換樹脂中用Tris緩沖液(pH8. 5)進(jìn)行色譜分離， 并流過收集。實(shí)施例2.缺乏毒素的產(chǎn)氣莢膜梭菌突變菌株的產(chǎn)生根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施DNA操作。在自殺質(zhì)粒的構(gòu)建中所使用的寡核苷酸是 AKP60 (SEQ ID NO :7)、AKP61 (SEQ ID NO :8)、AKP58 (SEQ ID NO 9)和 AKP59 (SEQ ID NO 1 0)。將所有的擴(kuò)增產(chǎn)物都克隆入克隆載體pGEM -T Easy載體系統(tǒng)(Promega)，隨后按 需進(jìn)行亞克隆。標(biāo)記的、部分刪除(或缺失)、自殺質(zhì)粒，PALK16，通過在pALKl內(nèi)catP盒的 任意一側(cè)上克隆netB基因區(qū)域的片段進(jìn)行構(gòu)建。首先，將采用AKP60和AKP61擴(kuò)增的1490 bp MfeI-SpeI片段定向克隆入pALKl的EcoRI-SpeI位點(diǎn)，接著，將采用AKP58和AKP59擴(kuò) 增的1937 bp BamHI-NheI片段克隆入所得質(zhì)粒的BamHI-NheI位點(diǎn)。最后，將由pJIR1457 擴(kuò)增的ermB和oriT鈍端(blunt end)克隆入SmaI位點(diǎn)。將最終的自殺質(zhì)粒pALK16如先 前所描述地引入到產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株EHE-NE18中(Scott and Rood, (1989))。在37°C下 于用甲砜霉素補(bǔ)充的TSC上生長后，將菌落交叉貼到用紅霉素補(bǔ)充的TSC上而證實(shí)雙交叉 事件已經(jīng)發(fā)生。在合適抗生素上生長的菌落經(jīng)過選擇而用于進(jìn)一步分析。制備染色體DNA 后，采用PCR和DNA印跡分析而證實(shí)突變體衍生于netB基因區(qū)域中的雙交叉事件。將互補(bǔ) 質(zhì)粒，PALK20，通過將全長netB基因克隆入產(chǎn)氣莢膜梭菌穿梭載體pJIR1457而引入到兩個(gè) 突變體中。采用細(xì)胞毒性分析(或測定)中的紅霉素選擇和試驗(yàn)來證實(shí)互補(bǔ)。NElS-AnetB 染色體區(qū)域的示意圖如圖2所示。實(shí)施例3. NetB活性分析細(xì)胞毒性分析在產(chǎn)氣莢膜梭菌EHE-NE18培養(yǎng)基上清液上實(shí)施。將LMH細(xì)胞培養(yǎng) 直至在0. 2%白明膠涂覆并在37°C下于EMEM介質(zhì)中生長的24孔板中達(dá)到70%匯合。將培 養(yǎng)基上清液加入到整個(gè)孔板用2倍稀釋的介質(zhì)中高達(dá)1 32，并在37°C下孵育達(dá)16h。將 LMH細(xì)胞在純的TPG培養(yǎng)介質(zhì)(圖3a)；產(chǎn)氣莢膜梭菌EHE-NE18培養(yǎng)基上清液，1 16稀釋 (圖3b)；產(chǎn)氣莢膜梭菌JIR325非-壞疽腸炎菌株13培養(yǎng)基上清液，1 2稀釋(圖3c)； 或產(chǎn)氣莢膜梭菌NE18-M1 (pic突變體不表達(dá)α-毒素)培養(yǎng)基上清液，1 16稀釋(圖3d) 存在下培養(yǎng)。在100Χ放大倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞變性效應(yīng)(CPE)。正常細(xì)胞(圖3a)看起來是健康的，然而，添加產(chǎn)生NetB的菌株的培養(yǎng)基上清液 導(dǎo)致細(xì)胞圓形收攏(round-up)而死亡(圖3b)。并不表達(dá)NetB的菌株的上清液不感染細(xì) 胞(圖3c)。刪除(或缺失)α -毒素基因并未影響培養(yǎng)基上清液殺死細(xì)胞的能力(圖3d)。實(shí)施例4.產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素突變體的互補(bǔ)NE18-缺失(或刪除)的netBl菌株(netB陰性菌株)用pALK20netB互補(bǔ)質(zhì)粒 補(bǔ)充。然后對互補(bǔ)的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株測試毒素活性。對于細(xì)胞毒性分析，將LMH細(xì)胞培 養(yǎng)直至在以0. 2%白明膠涂覆并在37°C下于EMEM介質(zhì)中生長的24孔板中達(dá)到70%匯合。將培養(yǎng)基上清液加入到整個(gè)孔板用2倍稀釋的介質(zhì)中高達(dá)1 32，并在37°C下孵育達(dá)16h。 將LMH細(xì)胞用以下培養(yǎng)液的任一種孵育EHE-NE18培養(yǎng)基上清液，1 16稀釋(圖4a)； NE18-缺失的netBl培養(yǎng)基上清液，1 2稀釋(圖4b) ；NE18-缺失的netBl+pJIR1457 (穿 梭質(zhì)粒)培養(yǎng)基上清液，1 2稀釋(圖4c) ；NE18-缺失netBl+pALK20 (netB互補(bǔ)質(zhì)粒)培 養(yǎng)基上清液，1 16稀釋(圖4d)；純TPG培養(yǎng)基介質(zhì)(圖4e)；或柱純化重組NetB，1 8 稀釋(圖4d)。netB基因的缺失(或刪除)消除了在細(xì)胞培養(yǎng)基分析中的殺滅活性。具有克隆到 質(zhì)粒上的基因的突變體的互補(bǔ)作用恢復(fù)了殺滅活性。重組NetB蛋白殺死了培養(yǎng)的細(xì)胞。實(shí)施例5.由毒素蛋白殺死的細(xì)胞的定量分析為了測定NetB殺死細(xì)胞的能力，在用NetB處理的LMH細(xì)胞上實(shí)施乳酸脫氫酶細(xì) 胞毒性分析。將LMH細(xì)胞培養(yǎng)直至在以0. 2%白明膠涂覆并在37°C下于EMEM介質(zhì)中生長 的96孔板中達(dá)到70%匯合。將來自NE18-M1的半純化NetB加入到整個(gè)孔板用2倍稀釋的 介質(zhì)中高達(dá)1 128，并在37°C下孵育4h。將在上清液中釋放的LDH作為細(xì)胞溶解的指示 劑(或指征)采用Cyto-ToHPromega)試劑盒進(jìn)行測定，而以細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)給出。每次 稀釋按一式三份完成，對每次稀釋計(jì)算SEM (圖5)。實(shí)施例6.在家雞疾病模型中的netB突變菌株將20和2 1天齡的11只鳥組用產(chǎn)氣莢膜梭菌(NE18)野生型菌株或netB缺失的 菌株的突變體(NE18-NetB-Ml和NE18-NetB-M2)進(jìn)行免疫性試驗(yàn)(challenge)。在24天齡， 將鳥尸體解剖而對腸道中的壞疽病變打分。將測定的約2 4cm的回腸或空腸的片段收集 到10%中性磷酸鈉緩沖的福爾馬林中。將小腸樣品以4mm的間隔截取(cross-sectioned)， 并將片段加工處理成石蠟嵌埋塊用于常規(guī)組織學(xué)分析，并以4 5 μ m切割并用蘇木精和署 紅(HE)染色。將組織學(xué)載玻片通過光學(xué)顯微鏡檢測。對腸道根據(jù)壞疽病變的數(shù)目進(jìn)行評 分0_沒有病變，1-薄壁化和易碎腸，2-病灶性壞死或潰瘍(1 5個(gè)病灶)，3-病灶性壞 死或潰瘍(6 15個(gè)病灶)，4-病灶性壞死或潰瘍(16或更多個(gè)病灶)，5-壞疽塊2 3cm 長，6-彌漫性壞死典型現(xiàn)場病例。野生型菌株顯示出顯著的致病水平，而獨(dú)立地分離突變體 二者都未顯示出任何致病跡象。我們推斷，NetB是疾病發(fā)病機(jī)理中必要的關(guān)鍵毒性因子。表2 NetB突變體菌株在家雞疾病模型中具有下降的毒性 實(shí)施例7.產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中毒素的觀測X仔一氣ι·草纏纖PCR MHI通過PCR研究了 netB基因在產(chǎn)氣莢膜梭菌的NE和非-NE菌株中的存在。對于試 驗(yàn)的每一產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，將單菌落懸浮于0. ImL蒸餾水中并煮沸l(wèi)Omin，然后以IOOOOg 離心lOmin。收集上清液并用作PCR中的模板DNA。PCR在含有以下物質(zhì)的總量為25 μ L反 應(yīng)混合物中實(shí)施1 XPCR緩沖液(無Mg2+) ；2. 5mM MgCl2 ；0. 2mM dNTP混合物；2. 5單位的 Go Taq DNA聚合物酶(Promega) ；50Pm的引物AKP78和AKP79 ；以及5 μ L模板溶液。以下 條件用于PCR中在94°C下變性2min ；在94°C下變性30s的35個(gè)循環(huán)；在55°C下退火30s ； 和在72°C下延伸Imin ；在72°C下最后延伸12min。將PCR產(chǎn)物通過在如圖6所示的1.5% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離而進(jìn)行分析a. NE菌株；b. Non-NE菌株。在從壞疽腸炎病家雞 中分離出來的大多數(shù)產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中都看到了 384bpnetB片段。在任何其它菌株中都 沒有觀察到netB特異性PCR片段。這表明netB基因的存在是家雞中產(chǎn)氣莢膜梭菌毒性的 良好指示劑(或指征)，而這種分析法能夠用于檢測潛在的毒性菌株。X寸輔一氣ι·草纏纖跡刪產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株在預(yù)煮沸的TPG湯內(nèi)生長直至0D600nm為 0. 6。培養(yǎng)基上清液 通過以18000g離心IOmin后獲得。將上清液通過SDS-PAGE ( NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel, Invitrogen)在 MES SDS 工作緩沖液(NuPAGE MES SDS Running Buffer, Invitrogen)中分離。將蛋白轉(zhuǎn)移到PDVF(Millipore)膜上并用兔多克隆抗-rNetB 抗體(Chemicon，USA)探測。將印跡用ECL蛋白質(zhì)印跡試劑盒(Amersham Biosciences,NJ, USA)顯影，如圖7所示將結(jié)果記錄于自體放射照相膠片上。括號表示NE和非-NE產(chǎn)氣莢膜 梭菌菌株。蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)結(jié)果證明了 PCR觀測結(jié)果-基因和蛋白出現(xiàn)在大多數(shù)NE衍生 菌株而不是非-NE菌株中。這種基于抗體的檢測方法是檢測潛在毒性菌株的另一途徑。實(shí)施例8.重組NetB子單元疫苗的保護(hù)效能
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重組NetB蛋白(SEQ ID NO 2)的效能當(dāng)作為子單元疫苗遞送時(shí)在接種試驗(yàn)中進(jìn) 行測試。接種試驗(yàn)1193-4將Ross 308肉雞(Aviagen)用50 μ g作為每劑量抗原的重組NetB/以0. 5mL氫 氧化鋁作為佐劑進(jìn)行接種。這種家禽以7天和14天接種，而以20天和21天用1. 5mL 口服 劑量的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株EHE-NE18進(jìn)行免疫性試驗(yàn)。為了提高這種家禽對壞疽腸炎的易 感性，在免疫性試驗(yàn)期間對其喂食含有魚肉的高蛋白飲食。在第25天這些家禽進(jìn)行安樂死 并尸檢以對壞疽腸炎腸道病變打分。病變根據(jù)以下方案打分0 沒有病變1薄壁化易碎腸2病灶性壞死或潰瘍(1 5個(gè)病灶)3病灶性壞死或潰瘍(6 15個(gè)病灶)4病灶性壞死或潰瘍(16或更多個(gè)病灶)5 壞疽塊2 3cm長6彌漫性壞死的典型現(xiàn)場病例MM用NetB重組抗原接種的家雞和佐劑對照家雞的平均病變得分提供于表3中。表3.用NetB重組抗原接種的家雞的平均病變得分 采用Marm-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行病變得分的統(tǒng)計(jì)分析，表明NetB接種分組和佐劑對 照分組之間的差異在大于95%的置信度下是統(tǒng)計(jì)顯著性的。實(shí)施例9.來自接種家禽血清的蛋白質(zhì)印跡分析來自接種家雞的血清通過蛋白質(zhì)印跡法分析而確定家雞是否對NetB蛋白產(chǎn)生了 血清抗體。在每孔聚丙烯酰胺凝膠中上樣4yg的重組NetB抗原并進(jìn)行SDS-PAGE。將蛋白 通過蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜中。將來自接種家禽的血清在5 %脫脂奶于TBS/0. 5 %吐溫 20中稀釋1 1000，并用膜在室溫下孵育lh。將膜用TBS/0. 5% Tween 20沖洗3次，并隨 后用在5%脫脂奶于TBS/0. 5%吐溫20中稀釋1 10，000的山羊抗家雞HRP抗體(KPL ； Cat#14-24-06 ；Lot#050860)室溫下孵育lh。隨后，將孵育的膜用TBS/0. 5%吐溫20沖洗3次。用GE Healthcare ECL蛋白質(zhì)印跡試劑(Cat#RPN2106)根據(jù)廠商說明書檢測HRP-標(biāo) 記的二抗。用重組NetB接種的大多數(shù)家禽都對NetB蛋白產(chǎn)生了血清抗體(圖8)，這表明 所使用的疫苗能夠誘發(fā)對NetB抗原的顯著免疫應(yīng)答。實(shí)施例10.接種和免疫性試驗(yàn)程序的重復(fù)接種試驗(yàn)1219-1對在試驗(yàn)1193-4中產(chǎn)生的結(jié)果通過采用單獨(dú)制備的各批重組NetB蛋白重復(fù)接種 和免疫性試驗(yàn)程序而測試再現(xiàn)性。將重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果提供于表4中。表4. NetB接種組對佐劑對照 采用Marm-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行病變得分的統(tǒng)計(jì)分析，表明NetB接種分組和佐劑對 照分組之間的差異在大于95%的置信度下是統(tǒng)計(jì)顯著性的。接種試驗(yàn)1250-1按照前述試驗(yàn)采用相同的接種和免疫性試驗(yàn)方案，在尸檢時(shí)測定家禽的活體體 重。將每一陰性對照、陽性對照和NetB接種家禽的平均重量提供于表5中。表5. NetB接種家禽的活體體重對陽性對照分組的活體體重
(NE18免 疫性試驗(yàn))2291485. 7采用家禽重量的未配對t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明NetB接種分組和陽性對照分 組在大于99%的置信度(P = 0. 0004685)下重量差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的。接種家禽受到保 護(hù)而免于在未受保護(hù)、陽性對照免疫性試驗(yàn)家禽中所見的體重增益的限制。
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實(shí)施例11.可替代NetB基疫苗的保護(hù)效能在接種試驗(yàn)1250-1中，對許多可替代疫苗進(jìn)行了試驗(yàn)?？商娲呙缬芯?+NetB ；表達(dá)NetB的大腸桿菌活體載體；和活體產(chǎn)氣莢膜梭菌(netB缺失體)。以下描述可 替代疫苗，而接種家禽的活體體重對陽性對照組的活體體重提供于表6中。菌苗 +NetB制備產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株EHE_NE18(400ml TPG)的過夜培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基離心，并 保留細(xì)胞顆粒和上清液部分。將細(xì)胞顆粒再懸浮于20M1的磷酸鹽緩沖的鹽水中，超聲破 碎細(xì)胞，然后用0. 3%的甲醛處理。將上清液通過超濾濃縮至20mL，然后用0. 3%的甲醛處 理。將所處理的細(xì)胞顆粒、上清液和佐劑溶液等體積混合并加入重組NetB蛋白至最終濃度 為100 μ g/mL。采用每只家禽每次接種為皮下接種0. 5mL如此配制的疫苗。表汰NetB的大腸桿菌活體載體將大腸桿菌菌株CCEC31rn (如WO 2007/025333中所描述的)采用表達(dá)來自其天 然啟動子的netB的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化。NetB由該質(zhì)粒組成性地表達(dá)。在第2天使每只家禽口服 劑量為0. 5mL的過夜培養(yǎng)基(Luria湯)?；铙w產(chǎn)氣莢膜梭菌(netB缺失體)將產(chǎn)氣莢膜梭菌EHE-NE18的netB缺失突變體衍生物在液體巰基醋酸鹽 (thoiglylate)湯中生長，并對2天齡家禽口服接種0. 5mL。表6.接種家禽的活體體重對陽性對照分組的活體體重 采用家禽重量的未配對t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明菌苗+NetB接種分組和陽性對 照分組在大于99%的置信度(P = 0. 003879)下重量差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的，表達(dá)NetB的 大腸桿菌活體載體接種分組和陽性對照分組在大于95%的置信度(P = 0. 0217605)下重量 差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的，而用缺失netB基因接種的活體產(chǎn)氣莢膜梭菌接種分組和陽性對 照分組在大于99%的置信度(P = 0. 0003855)下重量差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的。這些結(jié)果表 明不同的疫苗都能保護(hù)家禽免于在未接種的免疫性試驗(yàn)家禽中所見的體重增益的限制。在本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解到，對本發(fā)明可以作出如具體實(shí)施方式
所示的各種 變化和/或修改，而不偏離廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)施方式應(yīng)該 被當(dāng)作各個(gè)方面的舉例說明，而不是限制性的。本文中所討論的和/或參考的所有出版物都以其全文結(jié)合于此。
本申請要求享有美國專利US 60/942，858的優(yōu)先權(quán)，將其全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。任何已經(jīng)包含于本說明書中的文檔、行為、物質(zhì)、設(shè)備、制品等的討論都是作為單 獨(dú)目的提供于本發(fā)明的上下文。這不能以此為允諾，因?yàn)檫@在本申請的每一權(quán)利要求的優(yōu) 先權(quán)日之前都業(yè)已存在，任何或所有這些物質(zhì)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或在關(guān)于本發(fā)明 的領(lǐng)域內(nèi)是常用的一般性知識。參考文獻(xiàn)Altschul, et al. (1997)Nucleic Acids Res，25 :3389_3402·Awad, et al. (1995)Mol Microbiol, 15 191-202.Bendtsen, et al. (2004)J Mol Biol, 340 :783_795·Bhugaloo-Vial，et al. (1996)Appl Environ Microbiol,62 4410-4416.Boman, (1995)Annu Rev Immunol,13 61-92.Boman, (2003) J Intern Med, 254 :197_215·Cardoso, et al. (1996). Virology, 225 :293_9.Cho, et al. (2000)Curr Microbiol,40 :257_263.Conry, et al. (1994). Cancer Research, 54 1164-68.Cowen, et al. (1987)Avian Dis，31 :904_906.Craven, et al. (1999)Avian Dis，43 484-490.Ennahar et al. (2000)FEMS Microbiol Rev,24 :85-106.Fynan, et al. (1993)Proc Natl Acad Sci USA, 90 11478-82.Gabay, et al (1989)Proc Natl Acad Sci USA, 86 10183.Gruber et al. (1994) J Immunol 152:5368.Harayama, (1998)Trends Biotechnol，16 :76_82.Hollinger et al. (1993)Proc Natl Acad Sci USA 90 :6444_6448.Hood and Jilka(1999)Current Opinions in Biotechnology, 10 :382-6.Ingham, et al. (2003)J Antimicrob Chemother,51 :1365—1371.Jack, et al. (1995)Microbiol Rev,59 171-200.Kaldhusdal, (1999) FEMS Immunol Med Microbiol, 24 :337-343.Kapustra, et al. (1999)FASEB Journal, 13 :1796-99.Kozbor et al. (1985)J Immunol Methods,81 :31-42.Liu, et al. (2005)Appl Environ Microbiol,71 :6769_6775.Milstein and Cuello, (1983)Nature,305 :537-539.Modelska, et al. (1998). Proc Natl Acad Sci USA,95 :2481-85.Montgomery, et al. (1993)DNA and Cell Biology, 12 :777_83.Morrison(1994)Nature 368:812-13.Munson and Pollard, (1980)Anal Biochem, 107 -.220.Myers and Miller(1989)CABI0S，4 :11_17.Nahashon，et al. (1994)Poult Sci，73 :1552—1562.Needleman，and Wunsch, (1970) J Mol Biol,48:443—453.
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權(quán)利要求
一種基本純化的和/或重組的多肽，其中所述多肽含有i)按照SEQ ID NO2或SEQ ID NO3提供的氨基酸序列；ii)至少40％相同于SEQ ID NO2和/或SEQ ID NO3的氨基酸序列，和/或iii)i)或ii)的生物活性片段和/或抗原片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有毒素活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽與由SEQID NO :2和/或SEQ ID NO 3 編碼的多肽相比具有降低的毒素活性。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽含有至少90%相同于SEQID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽能夠由所述梭狀芽孢桿菌屬的 細(xì)菌進(jìn)行純化。
6.權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述多肽能夠由產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行純化。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽是類毒素。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的多肽，其是含有至少一種其它多肽序列的融合蛋白ο
9.一種分離的和/或重組的多核苷酸，含有i)根據(jù)SEQID NO 1提供的核苷酸序列，ii)編碼根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列，iii)至少40%相同于SEQID NO=I的核苷酸序列，和/或iv)在嚴(yán)格條件下與i)至iii)任意之一雜交的序列或其反相互補(bǔ)序列。
10.一種載體，含有根據(jù)權(quán)利要求9所述的多核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體，其中所述多核苷酸可操作地連接于啟動子。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的載體，其是一種病毒載體或質(zhì)粒載體。
13.一種宿主細(xì)胞，含有根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求9的多 核苷酸和/或根據(jù)權(quán)利要求10至12任一項(xiàng)所述的載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其是一種細(xì)菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌。
16.一種用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽的方法，所述方法包括對根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或編碼所述多肽的根據(jù) 權(quán)利要求10至12任一項(xiàng)所述的載體在容許表達(dá)編碼所述多肽的所述多核苷酸的條件下進(jìn) 行培養(yǎng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，進(jìn)一步包括分離所述多肽。
18.—種基本純化的抗體，所述抗體特異性地結(jié)合于根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽。
19.一種組合物，含有根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求10至12 任一項(xiàng)所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、和/或根據(jù)權(quán)利要求18 所述的抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其是一種免疫原的組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的免疫原的組合物，進(jìn)一步含有佐劑和/或藥用載體。
22.—種含有抗原的疫苗，其中所述抗原含有根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，進(jìn)一步含有佐劑和/或藥用載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求24所述的疫苗，進(jìn)一步含有一種或多種附加抗原。
25.—種DNA疫苗，含有編碼根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸。
26.—種生產(chǎn)含有至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ IDNO :3的氨基酸序列的 減毒細(xì)菌，其中與野生型細(xì)菌相比所述細(xì)菌生產(chǎn)降低量的所述多肽和/或與野生型細(xì)菌中 的所述多肽相比具有降低的毒素活性。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的減毒細(xì)菌，其并不表達(dá)所述多肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27任一項(xiàng)所述的減毒細(xì)菌，其進(jìn)一步經(jīng)過改性而表達(dá)異源多肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的減毒細(xì)菌，其中所述異源蛋白是生物活性多肽或抗原。
30.一種削弱表達(dá)含有至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ IDNO 3的氨基酸序 列的多肽的細(xì)菌毒性的方法，所述方法包括突變多核苷酸序列而降低所述多肽的所述表達(dá) 和/或毒素活性，由此所述減毒細(xì)菌與未減毒的細(xì)菌相比具有降低的毒素活性。
31.一種提高受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者給予根據(jù)權(quán)利 要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求9所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求10至12任 一項(xiàng)所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求19至21任 一項(xiàng)所述的組合物、根據(jù)權(quán)利要求22至25任一項(xiàng)所述的疫苗和/或根據(jù)權(quán)利要求26至29 任一項(xiàng)所述的細(xì)菌。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞或細(xì)菌是活的。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或權(quán)利要求32所述的方法，其中所述多肽、多核苷酸、組合物、載 體、宿主細(xì)胞或細(xì)菌是在卵內(nèi)遞送的。
34.一種確定受試者是否已經(jīng)被暴露于表達(dá)含有至少40%相同于SEQ ID N0:2和/或 SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多核苷酸的病原體的方法，其中所述方法包括檢測從所述受 試者獲取的樣品中存在或不存在所述多肽，其中所述多肽的所述存在是暴露于所述病原體 的指征。
35.一種檢測受試者是否已經(jīng)被暴露于表達(dá)含有至少40%相同于SEQ ID N0:2和/或 SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽的病原體的方法，其中所述方法包括檢測樣品中特異性 結(jié)合于根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽的抗體存在或不存在，其中所述抗體的所述 存在是暴露于所述病原體的指征。
36.一種檢測受試者是否已經(jīng)被暴露于表達(dá)含有至少40%相同于SEQ ID N0:1的核苷 酸序列的多核苷酸的病原體的方法，其中所述方法包括檢測由所述受試者獲得的樣品中存 在不存在所述多核苷酸，其中所述多核苷酸的所述存在是暴露于所述病原體的指征。
37.根據(jù)權(quán)利要求31至36所述的方法，其中所述受試者是禽類。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述受試者是家禽。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述受試者是家雞。
40.一種篩選用于調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求2的多肽的所述活性的激動劑或拮抗劑的方法， 所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽與候選化合物接觸，并確定所述化 合物是否增加或減少根據(jù)權(quán)利要求2所述多肽的毒素活性。
41.一種測試樣品毒素活性的方法，所述方法包括(a)將疑似含有根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽的樣品分成至少第一和第二子樣品，(b)將所述第一子樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽的拮抗劑接觸，以及(c)檢測所述第一和第二子樣品是否具有毒素活性，其中在所述第一子樣品中缺乏毒 素活性和在所述第二樣品中存在毒素活性是至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQID NO 3的多肽存在的指征。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中步驟(c)包括獨(dú)立地用動物細(xì)胞在各種條件下 孵育所述第一和第二子樣品一段時(shí)間而足以使所述多肽產(chǎn)生細(xì)胞病理效應(yīng)，并檢測在所述 細(xì)胞上是否存在或不存在細(xì)胞病理效應(yīng)。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的方法，其中所述拮抗劑是一種抗體。
44.含有根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述多肽的拮抗劑的食物和/或飲料。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的食物和/或飲料，其中所述拮抗劑是一種根據(jù)權(quán)利要求18 所述的抗體。
46.根據(jù)權(quán)利要求44或權(quán)利要求45所述的食物和/或飲料降低由表達(dá)含有至少40% 相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽的細(xì)菌對動物發(fā)生感染和/ 或群集的用途。
47.一種含有編碼根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述多肽的外源性多核苷酸的非人基因 轉(zhuǎn)移生物。
48.根據(jù)權(quán)利要求17所述的非人基因轉(zhuǎn)移生物，其是一種植物。
49.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽的食物和/或飲料。
50.一種提高受試者體內(nèi)對抗根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述多肽的免疫應(yīng)答的方法， 所述方法包括向所述受試者口服給予根據(jù)權(quán)利要求47或權(quán)利要求48的所述非人基因轉(zhuǎn)移 生物和/或根據(jù)權(quán)利要求49的所述食物或飲料。
51.一種提供雌禽的后代被動免疫的方法，所述方法包括在所述雌禽產(chǎn)下含有所述后 代的卵之前向所述雌禽給予根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求9所述 的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求10至12任一項(xiàng)所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)所述 的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求19至21任一項(xiàng)所述的組合物、根據(jù)權(quán)利要求22至25任一項(xiàng)所 述的疫苗、根據(jù)權(quán)利要求26至30任一項(xiàng)所述的減毒細(xì)菌、根據(jù)權(quán)利要求47或權(quán)利要求48 所述的非人基因轉(zhuǎn)移生物和/或根據(jù)權(quán)利要求49所述的食物和/或飲料，由此為所述后代 提供對表達(dá)含有至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽 的細(xì)菌產(chǎn)生被動免疫。
52.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求9所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán) 利要求10至12任一項(xiàng)所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán) 利要求19至21任一項(xiàng)所述的組合物、根據(jù)權(quán)利要求22至25任一項(xiàng)所述的疫苗、根據(jù)權(quán)利 要求26至30任一項(xiàng)所述的減毒細(xì)菌、根據(jù)權(quán)利要求47或權(quán)利要求48所述的非人基因轉(zhuǎn) 移生物和/或根據(jù)權(quán)利要求49所述的食物和/或飲料在生產(chǎn)用于提高受試者體內(nèi)免疫應(yīng) 答的醫(yī)藥中的用途。
53.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求9所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求10至12任一項(xiàng)所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán) 利要求19至21任一項(xiàng)所述的組合物、根據(jù)權(quán)利要求22至25任一項(xiàng)所述的疫苗、根據(jù)權(quán)利 要求26至30任一項(xiàng)所述的減毒細(xì)菌、根據(jù)權(quán)利要求47或權(quán)利要求48所述的非人基因轉(zhuǎn) 移動物和/或根據(jù)權(quán)利要求49所述的食物和/或飲料作為用于提高受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答 的醫(yī)藥中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于源于產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有這種毒素的免疫原組合物以及對動物如家雞進(jìn)行接種的方法，使得它們不易于患上梭菌病。本發(fā)明還公開了用以檢測動物是否被暴露于毒素、編碼毒素的多核苷酸以及表達(dá)毒素活性降低或毒性更少形式的減毒細(xì)菌的方法。
文檔編號A61K38/16GK101903399SQ200880019023
公開日2010年12月1日 申請日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者安東尼·萊斯利·凱伯恩, 朱利安·艾安·魯?shù)? 羅伯特·約翰·穆爾 申請人:澳大利亞家禽Crc私人有限公司