專利名稱：一種高產(chǎn)過氧化氫酶的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株可用于生產(chǎn)過氧化氫酶的枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，尤其是一種過量表達過氧化氫酶而高產(chǎn)過氧化氫酶的枯草芽孢桿菌，屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
過氧化氫酶(CAT)是一種酶類清除劑，它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2A的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。一個過氧化氫酶分子每秒鐘可以分解數(shù)百萬個過氧化氫分子。大多數(shù)過氧化氫酶由4個相同的亞單位組成，分子量在240kDa左右。所有的好氧生物在進行氧代謝時均會產(chǎn)生包括H2O2在內(nèi)的氧自由基，在活性氧代謝過程中過氧化氫酶可催化分解細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的或由胞外進入細(xì)胞的 H2O2，避免了 H2A通過!^enton和Harber-weiss反應(yīng)產(chǎn)生· 0H，從而保護機體；并對血紅蛋白及其它的含巰基蛋白質(zhì)起到保護作用，使它們不被氧化，對減輕活性氧損傷有一定意義， 因此，過氧化氫酶是一種重要的生物抗氧化酶。過氧化氫酶在紡織、食品、醫(yī)藥、臨床等行業(yè)都有著廣泛的用途。隨著過氧化氫酶在紡織、造紙、制漿等行業(yè)的普遍應(yīng)用，市場對過氧化氫酶的需求大幅增長。近年來嗜熱子囊菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，蘋果炭疽菌、芽孢桿菌等微生物菌種均有用于過氧化氫酶的生產(chǎn)研究。但利用野生菌株生產(chǎn)過氧化氫酶，資源消耗大、原料利用率低、 產(chǎn)量較低，難以滿足日益增長的市場需求；通過傳統(tǒng)方法育種，工作量大、盲目性大、回復(fù)突變率高，難以篩選得到理想的突變菌株。有通過重組大腸桿菌生產(chǎn)過氧化氫酶，但由于內(nèi)毒素、包涵體以及大分子蛋白分泌困難等限制因素，大腸桿菌并非表達CAT的理想宿主，產(chǎn)品后續(xù)處理復(fù)雜，很難在產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis WSHDZ-01)是一株已用于過氧化氫酶(CAT) 工業(yè)化生產(chǎn)的野生菌株。雖然該菌株易于培養(yǎng)，產(chǎn)生的CAT耐熱耐堿性強，但CAT產(chǎn)量不穩(wěn)定且酶活較低，無法滿足市場對CAT的需求量。實驗室從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis WSHDZ-01)中擴增出過氧化氫酶基因katA并用pET20b在大腸桿菌中表達，CAT活性大幅提高，但該菌株需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘氨酸促進其產(chǎn)物的分泌才能獲得較高活性的過氧化氫酶。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前CAT發(fā)酵產(chǎn)量及應(yīng)用中存在的問題，本發(fā)明提供一種高產(chǎn)過氧化氫酶的重組枯草芽孢桿菌，含有克隆有過氧化氫酶基因的質(zhì)粒pST0P1622-katA，所述過氧化氫酶基因克隆與PST0P1622質(zhì)粒木糖啟動子下游。所述枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)購買于CCTCC，保藏編號為CCTCC NO M206062(該菌株是本課題組專利申請中保藏的菌株，ZL200610040898. 0)。
所述過氧化氫酶基因含有編碼自身信號肽和啟動子的序列。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建所述重組枯草芽孢桿菌的方法，首先構(gòu)建木糖誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒的構(gòu)建pST0P1622-katA;然后，將其轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌 (B.subtilis WSHDZ-O1)。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種利用所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的方法，其發(fā)酵條件為溫度設(shè)為30 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速為300 500rpm，通氣量為0.5 2.(^雅，發(fā)酵時間為36 7211;發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖10 20，NaNO3 5 10，MgSO4 · 7H20 0. 5，Na2HPO4 9. 52，KH2PO4 0. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 0025，麥芽汁 2. 0%~ 3.0% (w/w)，pH自然；木糖誘導(dǎo)濃度為0. 1 1.0% (w/w)，其中優(yōu)選發(fā)酵條件為溫度設(shè)為 37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，通氣量為1. Ovvm，發(fā)酵時間為48 56h，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/ L)葡萄糖 20，NaNO3 10，MgSO4 · 7Η20 0. 5，Na2HPO4 9. 52，KH2PO4 0. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 0025， 麥芽汁2. 0% (w/w)，pH自然；木糖誘導(dǎo)濃度為0. 1% (w/w)。運用基因工程手段改造野生菌株，使其自身片段自克隆，過量表達所需產(chǎn)品；加之雙啟動子表達體系以及芽孢桿菌作為野生酶類較適合的表達系統(tǒng)，獲得的轉(zhuǎn)化株的CAT產(chǎn)量顯著提高，搖瓶中產(chǎn)量可達7532U/mL，是原始菌株枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01) 的4倍。在3L攪拌式反應(yīng)器(STR)中培養(yǎng)，重組枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ_01)CAT 活性可以提高4. 19倍，達到39117U/m，這是文獻報道中產(chǎn)CAT芽孢桿菌的活性最高。


圖1木糖誘導(dǎo)型質(zhì)粒pST0P1622-katA物理圖譜。圖2重組枯草芽孢桿菌250mL搖瓶中發(fā)酵結(jié)果。圖3重組枯草芽孢桿菌3L攪拌式反應(yīng)器中發(fā)酵結(jié)果。
具體實施例方式實施例1、木糖誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒的構(gòu)建及重組枯草芽孢桿菌的獲得1.枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)基因組的提取根據(jù)細(xì)菌基因組提取試劑盒說明提取枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)的基因組，并通過瓊脂糖電泳檢測。瓊脂糖濃度為質(zhì)量百分比0. 8%。2.katA片斷克隆的克隆根據(jù)GenBank上公布枯草芽孢桿菌(Bacillus sp. TE124)的基因組序列，設(shè)計引物katA primerl 5' -GGACTAGTAAAAGCTGTTACAACAAGTT-3‘katA primer2 5' -TCCCCCCGGGGATGAGAAGCATACGCAATG-3‘以枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)的基因組為模板，利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴增katA片段。PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為20 μ mol/L)IOX 緩沖液5. OyL,25mmol/L MgCl24. 0 μ L ；10mmol/L 四種 dNTP 混合液 l.OyL;
上下游引物各l.OyL;TaqDNA 聚合酶0. 5 μ L ；基因組DNAl.OyL,加水補至50 μ L ；PCR 反應(yīng)條件95 V 預(yù)變性 5min，95 V 變性 30s，48 V 退火 30s，72 V 延伸 120s，30 個循環(huán)后72°C延伸5min，4°C保存。電泳檢測片段的大小。瓊脂糖濃度為0.8%。引物中下劃線部分為相應(yīng)的酶切位點，前引物中為SpeI酶切位點，后者為SmaI酶切位點。3.木糖誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒的構(gòu)建及重組菌的獲得(1)酶切反應(yīng)將環(huán)境誘導(dǎo)型片斷與pST0P1622利用SpeI和SmaI核酸內(nèi)切酶進行雙酶切消化。 SpeI酶切反應(yīng)溫度為37°C，SmaI酶切反應(yīng)溫度為30°C。然后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(購自TakaRa公司)回收純化酶切的片段。(2)連接反應(yīng)利用Ligation Mix連接液(購買于TakaRa公司)連接，反應(yīng)組成體系為katA 片斷4. OyLpST0P1622LOyLLigation Mix 5. 0 μ L連接反應(yīng)在16°C下進行，反應(yīng)時間為4h，反應(yīng)體系為10 μ L0經(jīng)連接后得到重組木糖誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒pST0P1622-katA。(3)感受態(tài)細(xì)胞的制備挑枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)單菌落至2mL SPI培養(yǎng)基中，37 °C， 200rpm培養(yǎng)過夜。次日上午取100 μ L培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至5mL SPI培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長末期(約4 釙)，取0. 2mL培養(yǎng)液至2mL SPII培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng) 90min,加入 20 μ L lOmmol/LEGTA,再于 37°C，200rpm 培養(yǎng) IOmin0(4)重組木糖誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒pST0P1622-katA的驗證擴增將含有重組木糖誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒pST0P1622的連接液加入500 μ L的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻；于37°C，100rpm培養(yǎng)90min，取菌液涂布篩選平板。將轉(zhuǎn)化液涂布于含有質(zhì)量百分比為2. 0%的瓊脂并加有終濃度為20 μ g/mL的四環(huán)素的固體LB培養(yǎng)基平板上，37 °C條件下，靜置培養(yǎng)1 ，挑取單菌落篩選轉(zhuǎn)化子。將單菌落挑取轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中，370C，200rpm下培養(yǎng)過夜(培養(yǎng)基中添加四環(huán)素至終濃度為20 μ g/mL)。離心菌體，利用質(zhì)粒提取試劑盒(購買于TakaRa公司)提取重組質(zhì)粒PST0P1622，并驗證質(zhì)粒的正確性。重組質(zhì)粒圖譜見圖1。實施例2、重組菌CAT產(chǎn)量檢測活化培養(yǎng)基6% (w/w)麥芽汁，pH 7. 0 7. 5重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為30 40°C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150 250rpm，發(fā)酵時間36h 72h ；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖10 20，NaNO3 5 10，MgSO4 · 7H20 0. 5，Na2HP049. 52，KH2PO4 0. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 0025，pH 自然；木糖誘導(dǎo)濃度為0. 1 1. 0% (w/w)。挑取LB平板中篩選后的產(chǎn)CAT重組枯草芽孢桿菌，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于20 50mL并加有終濃度為10 50 μ g/mL的四環(huán)素的活化培養(yǎng)基中(只含有質(zhì)量百分比為6%的麥芽汁)，30 40°C條件下，150 250rpm搖床振蕩培養(yǎng)8 16h，制得種子液；以1 % 5 %的接種量轉(zhuǎn)接入裝有20 50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中。發(fā)酵條件為30 40°C，150 250rpm。發(fā)酵36 72h，每間隔4h取樣。進一步的優(yōu)選方式，發(fā)酵重組大腸桿菌的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為37°C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為200rpm，發(fā)酵時間48h 56h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖10，NaNO3 5， MgSO4 · 7H20 0. 5，Na2HPO4 9. 52，KH2PO4 0. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 0025，pH 自然;木糖誘導(dǎo)濃度為0.5% (w/w)挑取LB平板中篩選后的產(chǎn)CAT重組枯草芽孢桿菌，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于25mL并加有終濃度為20 μ g/mL的四環(huán)素的活化培養(yǎng)基中，37°C條件下，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)16h，制得種子液；以5%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中。發(fā)酵條件為37°C，200rpm。發(fā)酵56h，每間隔4h取樣，原菌株枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)作為對照。CAT發(fā)酵檢測取ImL發(fā)酵液于5mL離心管中，10000rpm、4°C下離心lOmin，取上清液為胞外CAT 測定樣品，沉淀以50mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH70)洗滌2次，以ImL緩沖液重懸后置冰浴預(yù)冷；超聲波間歇破碎9min ； IOOOOrpm離心15min，上清液作為胞內(nèi)CAT測定樣品。過氧化氫酶總酶活=胞內(nèi)酶活-胞外酶活，總酶活用紫外分光光度計在MOnm下測定。檢測結(jié)果見圖2。katA基因在枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)中過量表達， 獲得的轉(zhuǎn)化株的CAT產(chǎn)量顯著提高，搖瓶中產(chǎn)量可達7532U/mL (圖幻，是原始菌株枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)的 4 倍。實施例3、3L攪拌式反應(yīng)器中重細(xì)菌CAT產(chǎn)量檢驗活化培養(yǎng)基6% (w/w)麥芽汁，pH 7. O 7. 5重組枯草芽孢桿菌3L攪拌式反應(yīng)器的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為30 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速為300 500rpm，通氣量為0. 5 2. Ovvm，發(fā)酵時間為36 72h ；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖10 20，NaNO3 5 10，MgSO4 · 7Η20 0. 5， Na2HP049. 52，KH2PO4 0. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 0025，麥芽汁 2· 0% 3· 0% (w/w)，pH 自然；木糖誘導(dǎo)濃度為0. 1 1. 0% (w/w)。挑取LB平板中篩選后的產(chǎn)CAT重組枯草芽孢桿菌，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于20 50mL并加有終濃度為10 50 μ g/mL的四環(huán)素的活化培養(yǎng)基中(只含有質(zhì)量百分比為6%的麥芽汁)，30 40°C條件下，150 250rpm搖床振蕩培養(yǎng)8 16h，制得種子液；以1 % 5 %的接種量轉(zhuǎn)接入裝有1. O 1. 6L發(fā)酵培養(yǎng)基的3L攪拌式反應(yīng)器中。發(fā)酵條件為溫度設(shè)為30 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速為300 500rpm，通氣量為0. 5 2. Ovvm，發(fā)酵時間為36 72h，每間隔4h取樣。進一步的優(yōu)選方式，發(fā)酵重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，通氣量為l.Ovvm，發(fā)酵時間為48 56h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖 20，NaNO3 10，MgSO4 · 7H20 0. 5，Na2HPO4 9. 52，KH2PO4 0. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 0025，麥芽汁 2.0% (w/w), pH 自然；木糖誘導(dǎo)濃度為0. 1 % (w/w)。挑取LB平板中篩選后的產(chǎn)CAT重組枯草芽孢桿菌，在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)于25mL并加有終濃度為20 μ g/mL的四環(huán)素的活化培養(yǎng)基中，37°C條件下，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)16h，制得種子液；以5%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有1. 6L發(fā)酵培養(yǎng)基的3L攪拌式反應(yīng)器中。發(fā)酵條件為溫度設(shè)為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，通氣量為1. Ovvm，發(fā)酵時間為56h， 每間隔4h取樣，原菌株枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)作為對照。CAT發(fā)酵檢測與實施例2中相同。檢測結(jié)果見圖3。在3L攪拌式反應(yīng)器(STR)中培養(yǎng)，重組枯草芽孢桿菌(B. subtilis WSHDZ-01)CAT 活性可以提高4. 19倍，達到39117U/mL(圖3)，這是文獻報道中產(chǎn)CAT芽孢桿菌的活性最高。研究結(jié)果表明，自我克隆原始菌株的完整表達框的是一個合理的過量表達策略，可明顯改善野生型酶的產(chǎn)量。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)過氧化氫酶的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于含有克隆有過氧化氫酶基因的質(zhì)粒pST0P1622-katA，所述過氧化氫酶基因克隆于pST0P1622質(zhì)粒木糖啟動子下游。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征是所述過氧化氫酶基因含有編碼自身信號肽和啟動子的序列。
3.權(quán)利要求1所述重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟(1)構(gòu)建木糖誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒的構(gòu)建pST0P1622-katA；(2)將步驟1)獲得的木糖誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征是所述pST0P1622-katA由katA片段插入到質(zhì)粒PST0P1622中的SpeI與SmaI限制性酶切位點之間構(gòu)建而成。
5.權(quán)利要求2所述重組菌株應(yīng)用于過氧化氫酶的生產(chǎn)，其特征在于所述重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為30 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速為300 500rpm，通氣量為0. 5 2. Ovvm，發(fā)酵時間為36 72h ；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖10 20，NaNO3 5 10， MgSO4 ·7Η20 0. 5, Na2HPO4 9. 52, KH2PO4 0. 6，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0. 0025，麥芽汁 2. 0% 3. 0% (w/ w)，pH自然；木糖誘導(dǎo)濃度為0. 1 1. 0% (w/w)。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，通氣量為1. Ovvm,發(fā)酵時間為48 56h，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)葡萄糖 20，NaNO3 10，MgSO4 · 7Η20 0. 5，Na2HPO4 9. 52，KH2PO4 0. 6，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 0025，麥芽汁2. 0% (w/w)，pH自然木糖誘導(dǎo)濃度為0. 1% (w/w)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)過氧化氫酶的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次將CAT基因在野生型宿主菌中表達。出發(fā)菌株為野生型枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis WSHDZ-01)，由武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM206062。將其CAT基因katA利用表達載體pSTOP1622在野生菌株中進行表達，大幅度提高了CAT的產(chǎn)量，是原始菌株的4倍。在3L攪拌式反應(yīng)器中培養(yǎng)，CAT活性可以提高4.19倍，達到39117U/mL。本發(fā)明為CAT的過量表達提供了方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/08GK102382790SQ20111032875
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者周景文, 堵國成, 康振, 郭婭瓊, 陳堅 申請人:江南大學(xué)