專利名稱：非活性型Ca²⁺/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα敲入動物以及同樣的敲入細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非活性型Ca"/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II a (CaMKIIa)敲入動物和非活性型Caa/釣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶 IIa ( CaMKIIa)敲入細(xì)胞。
背景技術(shù)：
Ca"/4丐調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶n (CaMKII)豐富地存在于 中樞神經(jīng)系統(tǒng)，作為通過將各種各樣的蛋白質(zhì)進行磷酸化而對該 蛋白質(zhì)的功能進行修飾的蛋白激酶(蛋白磷酸化酶)，與神經(jīng)活動 的調(diào)控和突觸可塑性密切相關(guān)。另外，被認(rèn)為對以學(xué)習(xí).記憶為首 的高級腦功能、抑制癲癇發(fā)作出現(xiàn)、抑制腦缺血時的腦損傷起著 重要的作用(參照下面的非專利文獻l )。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CaMKII形成由a亞基(CaMKIIa)和(3亞 基(CaMKIip)構(gòu)成的多聚體結(jié)構(gòu)。這兩個亞基同源性高，各自 兼有蛋白激酶活性、Ca"/鈣調(diào)蛋白結(jié)合能力、亞基之間的締合能 力。由于a亞基大多出現(xiàn)在前腦，P亞基大多出現(xiàn)在小腦，所以認(rèn) 為上述CaMKII的功能主要是由a亞基承擔(dān)的。
非專利文獻1:《蛋白質(zhì)核酸酶》VoL47 No.l( 2002 ) 51-57
頁
非專利文獻2: Science, Vol.257( 1992 )201-206頁、206-211
頁
非專利文獻3: Proc.Natl.Acad.Sci.USA， Vol.92 ( 1995 ) 6852-6855頁
非專利文獻4: J.Cereb.Blood Flow Metab.， Vol.16 ( 1996)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題
到目前為止，已報道了制作將CaMKIIoc蛋白本身去除的單純 敲除小鼠，看到與記憶.學(xué)習(xí)有關(guān)的行動異常和電生理異常，此外 也報道了對易痙攣性、腦缺血的脆弱性現(xiàn)象(參照上述非專利文 獻2、 3、 4)。然而，在單純敲除小鼠中，(1)作為將其它蛋白質(zhì) 進行磷酸化的蛋白激酶的功能、(2)與作為Ca"結(jié)合蛋白的鈣調(diào) 蛋白結(jié)合的功能、(3) CaMKII亞基之間結(jié)合、或與其它蛋白質(zhì) 結(jié)合而作為結(jié)構(gòu)蛋白起作用的功能，這些所有功能都喪失了，通 過敲除小鼠看到的各種異常是由(1) ~ (3)中哪一種功能喪失 引起的并不清楚。另一方面，使用培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞或腦切片的實驗 表明，(1)的作為蛋白激酶的功能更重要。
因此，為了對CaMKII的上述(1) ~ (3)的功能進行區(qū)別 研究，制作只有(1)的功能被特異地阻礙了的特異性高的功能阻 礙動物(所謂的"功能性敲除動物")并進行解析，這對闡明腦功 能的分子機制和精神神經(jīng)疾病的病理學(xué)很有必要。
本發(fā)明正是著眼于上述的問題而進行的，其課題是提供一種 將CaMK II a基因置換為非活性型、只有CaMK II a的蛋白激酶活性 被特異地?fù)p傷了的非活性型CaMKII a敲入動物和非活性型 CaMKII a敲入細(xì)胞。
用于解決課題的手段
鑒于上述課題，本發(fā)明人使用基因工程和發(fā)育工程上的手法， 新制作了將CaMKII在前腦的主要亞基a置換為非活性型的敲入 型基因改變的小鼠，并進行了解析，結(jié)果完成了本發(fā)明。
即，作為產(chǎn)業(yè)上和醫(yī)療 醫(yī)學(xué)研究上有用的發(fā)明，本發(fā)明包括
以下A) ~1)的發(fā)明。
A) —種非活性型CaMKIIa敲入非人動物，其特征在于，通 過將同源染色體的 一 方或雙方的Ca2+/^調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶 II a ( CaMKII a )基因置換為非活性型，改變?yōu)楸磉_(dá)非活性型 CaMKIIoc。其中，所謂"非活性型CaMKIIa"是指CaMKIIa 作為蛋白被表達(dá)、并保持鈣調(diào)蛋白結(jié)合能力等，但其蛋白激酶(蛋 白磷酸化酶)活性被特異地?fù)p傷(消失或顯著降低)?？梢允峭?染色體的一方被非活性型CaMKIIa置換的雜合體動物，也可以是 雙方被置換的純合體動物。
B) —種上述A)所述的非活性型CaMKIIa敲入非人動物，其 特征在于，由通過基因打靶法制作的。如后述那樣，在該基因打 耙法中，為了置換為非活性型CaMKIIa，包括通過同源重組將基 因組中的CaMKII a基因的編碼區(qū)域中的一部分置換為其它堿基 序列的工序。
C) 一種上述A)或B)中所述的非活性型CaMKIIa敲入非人 動物，其特征在于，改變了CaMKIIa的催化結(jié)構(gòu)域中的l個或多 個氨基酸殘基。所謂"催化結(jié)構(gòu)域"是指CaMKIIoc的N末端一側(cè) 的具有蛋白激酶活性的區(qū)域，包括ATP結(jié)合部位。另外，所謂"改 變氨基酸殘基"主要指置換為其它的氨基酸殘基，但是，包括缺 失、插入等廣泛人工改變的意思。
D) —種上述C)所述的非活性型CaMKIIa敲入非人動物， 其特征在于，改變了與ATP結(jié)合所必需的1個或多個氨基酸殘基。 通過改變與ATP結(jié)合所必需的氨基酸殘基，可以使催化活性消失、 有效地變換為非活性型。
E) —種上述D)所述的非活性型CaMKIIa敲入非人動物， 其特征在于，改變了與ATP結(jié)合所必需的賴氨酸殘基。大鼠和小 鼠CaMKIIa的情況下，該賴氨酸殘基相當(dāng)于第42位(在其它動物
中，該賴氨酸位置有時會前后稍有移動)。在下述非活性型
CaMKIIoc敲入小鼠的制作中，通過將該第42位的賴氨酸置換為精 氨酸而將CaMKIIoc變換為非活性型。該氨基酸置換可通過在 CaMKII oc基因的外顯子2中的 一個堿基導(dǎo)入點突變來實現(xiàn)。
F) —種上述A) ~E)中任一項所述的非活性型CaMKIIoc敲 入非人動物，其特征在于該動物是嚙齒目動物。
G) —種上述F)中所述的非活性型CaMKIIa敲入非人動物， 其特征在于該動物是小鼠。
H) —種上述A)中所述的非活性型CaMKIIot敲入非人動物， 其特征在于，與野生型相比，在腦內(nèi)伏核的神經(jīng)活動相對底下。
I) 一種非活性型CaMKIIot敲入細(xì)胞，其特征在于，將同源 染色體的 一 方或雙方的Ca^/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II oc
(CaMKII a )基因置換為非活性型，改變?yōu)楸磉_(dá)非活性型 CaMKIIa。對于這樣的非活性型CaMKII a敲入細(xì)胞，也可以通過 后述的基因打靶法制作。另外，也可以由本發(fā)明的動物個體制作。 非活性型CaMKII ot敲入細(xì)胞也可以由來自人的細(xì)胞制作。 發(fā)明的效果
本發(fā)明的非活性型CaMKII a敲入動物和非活性型CaMKII a 敲入細(xì)胞，為了保持作為CaMKIIa的蛋白的表達(dá)， 一方面要保持 上述(1) ~ ( 3)諸功能中的(2)的鈣調(diào)蛋白結(jié)合能力、(3)的 亞基之間的多聚體形成能力或與其它蛋白(以后述的NMDA型谷 氨酸受體為首的突觸相關(guān)蛋白)的結(jié)合能力，另一方面只有(1) 的蛋白激酶活性被特異地?fù)p傷。
因此，作為僅集中到(1 )的功能阻礙的特異性高的功能阻礙 動物(或細(xì)胞)，本發(fā)明可以廣泛用于包括學(xué)習(xí)'記憶的損傷、癲 癇發(fā)作、腦損傷等研究的所有腦研究。例如，本發(fā)明的非活性型 CaMKIIoc敲入動物可用作學(xué)習(xí)'記憶的損傷、癲癇發(fā)作、腦損傷
的才莫型動物，預(yù)期有助于其分子^L制的闡明，可以對腦研究的進 展做出貢獻。
另外如下面所述那樣，本發(fā)明的非活性型CaMKIIoc敲入動物 與野生型相比，具有在伏核等大腦邊緣系的神經(jīng)活動相對降低的 特征。已知該腦區(qū)域控制情感行為，表明還與兒童中以注意力缺 陷-多動性障礙(ADHD)或統(tǒng)合失調(diào)癥為首的精神疾病的癥狀的
的病理學(xué)、研究治療法的模型動物是有用的。
另外，本發(fā)明還對CaMKII的底物蛋白的篩選等有用。 本發(fā)明的進一步的特征和優(yōu)點通過以下所示的記載可充分了
解。另外本發(fā)明的益處通過以下參照附圖的說明會更清楚。


是說明本發(fā)明的實施例涉及到的用于制作非活性型 CaMKII a敲入小鼠的基因打靶法的圖。是表示通過置換l個堿基而產(chǎn)生新的BstNI限制酶酶切 位點的圖。( a)( b)是表示基因組DNA的DNA印跡(Southern blot) 解析結(jié)果的圖。 (a) (b)是表示基因組DNA的PCR解析結(jié)果的圖。 [圖5]是表示通過測序直接確認(rèn)點突變導(dǎo)入的有無的結(jié)果的圖。是表示通過蛋白印跡(Western blot)法解析CaMKII 蛋白的表達(dá)的結(jié)果的圖。是表示使用來自前腦的勻漿液的CaMKII活性測定結(jié)果 的圖表。是表示使用來自小腦的勻漿液的CaMKII活性測定結(jié)果
的圖表。表示小鼠腦的細(xì)胞色素氧化酶活性染色的結(jié)果。左邊是 野生型(wild )的腦切片，右邊是作為本實施例的非活性型 CaMKIIoc敲入小鼠的純合體小鼠(homo)的腦切片。
具體實施例方式
如下述實施例所示，本發(fā)明人使用基因打靶法(gene targeting method )制作了將CaMK II oc基因置換為非活性型的敲 入動物。下面，對該使用基因打靶法制作非活性型CaMKIIoc敲入 動物的方法進行簡單說明(詳細(xì)說明在后述的實施例中參照附圖 進行說明)。革巴向載體的制作
首先為了制作靶向載體(打靶設(shè)計物)，將作為對象的動物的 CaMKIIa基因的一部分進行隔離。例如，制作敲入小鼠時，可以 從小鼠的基因組DNA文庫中篩選CaMKIIa基因。篩選的條件、方 法沒有特別限制，篩選中使用的探針也可以從來自其它動物的 cDNA等制備。在下面的實施例中，使用從大鼠CaMKIIa的cDNA 制備的探針來篩選小鼠的基因組DNA文庫，當(dāng)然也可以從小鼠的 CaMKIIa的cDNA制備探針。或者不使用探針，由cDNA信息或基 因組信息設(shè)計PCR引物，使用該引物從小鼠BAC ( bacterial artificial chromosome, 細(xì)菌人工染色體)文庫等進行篩選，也 可以克隆CaMKII a基因的一部分。
使用通過上述篩選得到的基因組DNA克隆，構(gòu)建用于同源重 組的靶向載體。基因組DNA克隆當(dāng)然不需要基因全長，只克隆置 換成非活性型所必需的區(qū)域就可以。在下面的實施例(小鼠)中， 對含有外顯子2的區(qū)域進行亞克隆，然后在對應(yīng)于ATP結(jié)合所必需 的第42位賴氨酸(Lys-42)的核酸序列(AAG )中導(dǎo)入一個堿
基突變(AGG),作成精氨酸(Arg-42 ),從而置換為非活性型。 靶向載體可以通過公知的方法進行制作，大體上是通過將用
上述方法置換為非活性型的基因組DNA克隆、市售的質(zhì)粒、正選 擇用的標(biāo)記(PGKneo盒等)和負(fù)選擇用的標(biāo)記(DT - A基因、 HSV-tk基因等)等各個片段適當(dāng)連接而制作。此時，將靶向載 體設(shè)計成在合適位置配置各個限制酶酶切位點就可以。另外，由 于打靶效率依賴于同源區(qū)域的長度，所以優(yōu)選同源區(qū)域盡可能長。 另外，由于直鏈狀的靶向載體比環(huán)狀的好，所以為了直鏈化，可 以預(yù)先在同源區(qū)域以外的部分設(shè)置一處適當(dāng)?shù)南拗泼该盖形稽c。 [2]非活性型CaMK II a敲入動物的制作
來自對象動物的全能性細(xì)胞，然后挑選發(fā)生了目標(biāo)同源重組的細(xì) 胞。挑選可以通過正-負(fù)雙向選擇法使用藥劑來有效地篩選。挑 選后，將發(fā)生了目標(biāo)同源重組的細(xì)胞通過DNA印跡或PCR法等進 行確認(rèn)。在下面的實施例中，再利用Cre重組酶除去正選擇用的新 霉素抗性基因(PGKneo)區(qū)域。
最后將已確認(rèn)為所希望的同源重組的全能性細(xì)胞導(dǎo)入從妊娠 中的輸卵管或子宮采集的8細(xì)胞期胚或胚盤胞(胚嚢)。向8細(xì)胞期 胚或胚盤胞導(dǎo)入細(xì)胞可以通過微注射法等進行，但不限定于該方 法。
將上述8細(xì)胞期胚或胚盤胞按照常規(guī)方法移植入代孕父母。通 過由代孕父母生育的生殖系嵌合動物(最好是雄的)與具有純合 體野生型CaMKIIa基因的野生型動物(最好是雌的)交配，作成 第l世代(Fl)，可以得到同源染色體上的一方的CaMKIIa基因通 過同源重組被置換為非活性型的雜合體。再通過使這些雜合體之 間交配，做成第2世代(F2)，可以得到同源染色體上的雙方的 CaMKIIa基因被置換為非活性型的純合體。雜合體、純合體的鑒 定可以通過將身體的一部分(例如尾巴)切斷，才是取DNA進行DNA 印跡或PCR法等來研究基因型。另外，作為第2世代(F2)可以得 到與雜合體、純合體同窩的野生型動物(純合體具有野生型基因)， 但該野生型動物適合用于對照實驗中。
作為非活性型CaMKII a敲入動物對象的動物沒有特別限定， 例如牛、豬、綿羊、山羊、兔、狗、貓、土撥鼠、倉鼠、小鼠、 大鼠等哺乳動物。其中，優(yōu)選作為實驗動物使用的是兔、狗、貓、 土撥鼠、倉鼠、小鼠和大鼠，其中更優(yōu)選嚙齒目。特別優(yōu)選可制 作出大量近交系、受精卵的培養(yǎng)、體外受精等技術(shù)齊備的小鼠。 此外，作為全能性細(xì)胞，除了受精卵、初期胚之外，還可以將具 有多分化能力的ES細(xì)胞、體干細(xì)胞這樣的培養(yǎng)細(xì)胞作為對象。
以上說明的基因打耙法只是給出了其中的一例，可進行公知 的各種改變是不言而喻的。此外，還可以使用在本發(fā)明以后新開 發(fā)的方法。
例如，制作非活性型CaMKIIa敲入小鼠時，在保持其它的功 能結(jié)構(gòu)域(鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、締合結(jié)構(gòu)域)的功能的同時只 是使激酶活性喪失的小鼠的意義上，除了在下面的實施例中采用 的ATP結(jié)合所必需的Lys - 42的點突變以外還可以采用各種各樣 的手法。
根據(jù)有關(guān)各種絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶的激酶結(jié) 構(gòu)域的研究可知，其酶催化活性所必需的部位由(1) ATP結(jié)合部 位、(2)催化部位、(3)肽結(jié)合部位這3個功能部位構(gòu)成。對這3 個功能部位中的任 一 個進行突變，都可以使蛋白激酶活性消失， 做成非活性型，通過以含有各個對應(yīng)的氨基酸殘基的外顯子作為 靶對核酸進行突變，進行置換氨基酸的操作，由此可以制作本發(fā) 明的非活性型敲入小鼠。
其中，通過對緊靠近上述(1 )的ATP結(jié)合部位的賴氨酸殘基
(Lys)進行化學(xué)修飾或置換為丙氨酸(Ala)、組氨酸(His)、甲 疏氨酸(Met)、精氨酸(Arg)等其它氨基酸殘基來變換為非活 性型的方法，已使用各種蛋白激酶進行了嘗試，是在對新的蛋白 激酶的激酶活性的功能性的重要性進行確認(rèn)時也被采用的方法。 實際上，關(guān)于CaMKIIa，從對培養(yǎng)細(xì)胞的cDNA的表達(dá)實驗可以 確認(rèn)將Lys - 42置換為Met或Arg、 Ala就會變?yōu)榉腔钚孕?參照 Neuron,Vol.12 ( 1994 ) 943 - 956頁)，因此當(dāng)制作下面的非活性 型敲入小鼠時，作為可靠的方法，采用將Lys-42置換的方法、從 而將外顯子2作為靶的方法。
而本發(fā)明的非活性型CaMKIIot敲入細(xì)胞也可以通過上述的 基因打靶法進行制作。本發(fā)明的非活性型CaMKII a敲入動物以及非活性型 CaMKIIa敲入細(xì)胞的利用方法(有用性)
本發(fā)明的非活性型CaMKII a敲入動物以及非活性型 CaMKIIa敲入細(xì)胞，其CaMK II a的蛋白激酶活性被特異地?fù)p傷， 可以廣泛用于CaMKII oc整個功能的解析是當(dāng)然的，不止用于 CaMK II a的功能解析，還具有以下給出的各種各樣的產(chǎn)業(yè)上的利 用性(有用性)。
(A )包括基礎(chǔ)研究以及應(yīng)用研究在內(nèi)的全般腦研究中的利用
如上所述，本發(fā)明的非活性型CaMKIIa敲入動物是作為 CaMKII a的蛋白的表達(dá)被維持、而只有蛋白激酶活性選擇性地消 失了的"功能性敲除動物"?？紤]到CaMKIIa與學(xué)習(xí).記憶的高級 腦功能有關(guān)、另外抑制由癲癇發(fā)作或缺血引起的腦損傷，所以本 發(fā)明的非活性CaMKIIa敲入動物可以廣泛用于包括學(xué)習(xí)'記憶的 損傷、癲癇發(fā)作、腦損傷等的分子機制的闡明在內(nèi)的全般腦研究 中。例如，可用于(1 )有關(guān)學(xué)習(xí).記憶的行為學(xué) 電生理學(xué)的解析、 (2)腦波解析以及研究由于給藥或腦內(nèi)電刺激引起的易痙攣性的
實驗、(3)調(diào)查對腦缺血的脆弱性的實驗等。另外，預(yù)期作為各 種腦疾病的模型動物用在腦功能的分子機制的進一 步闡明以及各 種精神神經(jīng)疾病的病理學(xué)和治療法的研究中。
(B) CaMKIIa的底物蛋白的篩選中的應(yīng)用 使用本發(fā)明的非活性型CaMKIIa敲入動物(例如小鼠)制備
初代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、或腦切片等，通過來自外部的藥理學(xué)的刺激 使細(xì)胞內(nèi)的CaMKIIa活化，進行磷酸化蛋白質(zhì)組解析，通過野生 型小鼠、純合體小鼠之間的比較等，可以對CaMKIIa的底物進行 全面且有效的鑒定。
在如使主要的腦內(nèi)蛋白之一CaMKIIoc蛋白本身缺失了的敲 除小鼠中，在其它蛋白質(zhì)的表達(dá)圖中會發(fā)生各種各樣變化的可能 性大，不適合底物蛋白的研究。另外，如果使用作為CaMKIIa的 蛋白的表達(dá)被保持而只有其激酶活性喪失了的非活性型敲入小 鼠，預(yù)期可以有效地進行腦內(nèi)原有的主要而且重要的底物蛋白的 研究。
(C) CaMKIIa的激酶活性對突觸蛋白的動態(tài)帶來的影響的
解析
同樣使用初代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞等，通過在野生型、純合體小鼠 之間對突觸前、突觸后的突觸相關(guān)蛋白的動態(tài)進行對比觀察，可 以解析CaMKIIa導(dǎo)致的突觸相關(guān)蛋白的磷酸化對其動態(tài)和突觸 傳遞帶來的影響。
已知突觸相關(guān)蛋白伴隨著神經(jīng)活動表現(xiàn)出動力學(xué)的動態(tài)變 化。CaMKIIa在突觸前，作為與突觸小胞結(jié)合蛋白之一 ，參與突 觸蛋白I等蛋白對突觸小胞的結(jié)合，而在突觸后，作為突觸后肥厚 部的主要構(gòu)成成分，與神經(jīng)遞質(zhì)受體或通道蛋白相互作用。再通 過將突觸相關(guān)蛋白進行磷酸化，進行神經(jīng)遞質(zhì)的釋放調(diào)節(jié)或受體-通道活性的修飾。因此與敲除小鼠不同，如果使用只使CaMKIIa
的活性消失的非活性型敲入小鼠，對蛋白之間的相互作用沒有影 響，可以有效地驗證該激酶活性對突觸相關(guān)蛋白的動態(tài)和突觸傳
遞的影響。
另外如上所述，在本發(fā)明的非活性型CaMKIIa敲入動物(細(xì) 胞)中，由于作為CaMKIIa的蛋白的表達(dá)被保持，所以CaMKIIa 與其它蛋白質(zhì)的結(jié)合能力被保持。此處所謂"其它蛋白質(zhì)"是指 突觸相關(guān)蛋白，具體來說，指的是在突觸前端存在的突觸小胞結(jié) 合蛋白、突觸蛋白I、在突觸后存在的突觸后肥厚部膜蛋白NMDA 型谷氨酸受體、密蛋白-180等。
(D)在CaMKIIa的活性調(diào)節(jié)中起著重要作用的自磷酸化部 位的磷酸化調(diào)節(jié)^L制的解析
通過使用野生型小鼠、純合體小鼠的腦勻漿液對腦內(nèi)的 CaMKII的自磷酸化狀態(tài)進行比較、解析，可以闡明生物體內(nèi)的自 磷酸化的調(diào)節(jié)機制。
CaMK II作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)Ca"信號的主要的責(zé)任 承擔(dān)者，被認(rèn)為在依賴于神經(jīng)活動的腦功能的修飾中起著重要的 作用。C a M KII通過結(jié)合由細(xì)胞內(nèi)C a2 +的增加而被活化的鈣調(diào)蛋白 (Ca"結(jié)合型鈣調(diào)蛋白、Ca^/鈣調(diào)蛋白)而被活化，使得各種各 樣的底物蛋白磷酸化。在該活化時，引起處于調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中的第 286位(大鼠和小鼠的情況)的氨基酸、蘇氨酸(Thr - 286 )的 自磷酸化。該Thr - 286的自磷酸化只要在細(xì)胞內(nèi)Ca2"々濃度降低 后不會因磷酸酶(去磷酸化酶)而被去磷酸化，就可以使CaMKII 維持在活化狀態(tài)、即保持蛋白質(zhì)磷酸化活性的狀態(tài)，因此可以認(rèn) 為該Thr - 286的自磷酸化作為將暫時性的細(xì)胞內(nèi)Ca"的增加變 換為持續(xù)性的信號的開關(guān)機制，對成為記憶.學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)的突觸可 塑性起著重要的作用。
CaMKII形成10 12個同源亞基(腦為oc和P)所構(gòu)成的多聚
體結(jié)構(gòu)(全酶)，到目前為止，根據(jù)在試管內(nèi)使用純化的CaMKII 的各種實驗一直認(rèn)為活化所必需的Thr - 286的自磷酸化是在全 酶內(nèi)相鄰的亞基之間發(fā)生的。在作為CaMKIIoc的蛋白的表達(dá)被保 持而只是其激酶活性失活了的非活性型敲入小鼠中，CaMK II ot單 獨、或與CaMKII(3—起形成多聚體的功能得以保持，而且作為底 物的Thr - 286也被保持，因此，在其激酶活性喪失時，通過對全 酶內(nèi)的CaMKIIoc的Thr- 286 ( CaMKII p的情形中是Thr - 287 ) 的自磷酸化發(fā)生到什么程度進行解析，可以驗證"自磷酸化發(fā)生 在相鄰的亞基之間"的上述假說，而且可成為用于研究有無新的 調(diào)節(jié)機制的最佳模型。而在CaMKIIa的蛋白本身被去除了的敲除 小鼠中，這樣的解析是不可能的。
(E)作為注意缺陷'多動性障礙(ADHD)等神經(jīng)疾病的病 理學(xué)闡明和治療法研究的模型動物的利用
使用下述實施例中制作的本發(fā)明的非活性型CaMKIIoc敲入 純合體小鼠的腦進行組織學(xué)研究的結(jié)果，沒有看到在光學(xué)顯微鏡 水平的結(jié)構(gòu)上的異常，但通過可反映神經(jīng)細(xì)胞的活動性的細(xì)胞色 素氧化酶活性染色，可知以伏核、扁桃體為首的大腦邊緣系的神 經(jīng)活動與野生型相比明顯降低(參照圖9)。
已知這些伏核等部位借助5-羥色胺系、多巴胺系來控制動物 個體的情感行為，也表明與兒童中的以注意力缺陷 多動性障礙
(ADHD)或統(tǒng)合失調(diào)為首的精神疾病的出現(xiàn)有關(guān)聯(lián)。實際上， 在上述敲入小鼠中可觀察到行為學(xué)上的多動癥狀，強烈啟示與伴 隨這些注意力障礙的功能性精神疾病有關(guān)。因此可認(rèn)為，本發(fā)明 的敲入動物作為用于闡明這些疾病的病理學(xué)或研究治療法、篩選 藥物的模型動物是有用的。
本發(fā)明的非活性型CaMKIIa敲入細(xì)胞也具有與上述(A) ~
(E)同樣的有用性。
實施例
以下，作為本發(fā)明的非活性型CaMKIIoc敲入動物，對制作非 活性型C a M KII oc敲入小鼠的實施例進行說明，但本發(fā)明并不受這 些實施例的任何限定。
圖l是說明本實施例的非活性型CaMKII a敲入小鼠的制作方 法中所使用的基因打靶法的圖。圖中，由上到下依次分別示意地 表示用于制作非活性型CaMKII a敲入小鼠的打靶設(shè)計物 (targeting construct )、正常的CaMK II oc基因(wild type allele ， 野生型等位基因)、發(fā)生了同源重組的CaMKII ot突變基因 (mutated allele,突變等位基因)、通過Cre重組酶的作用削除 了新霉素抗性基因的CaMKII a突變基因(mutated allele after Cre recombination, Cre重組之后的突變等位基因)的結(jié)構(gòu)。N、 K、 X、 EV、 A、 H分別表示NotI、 Kpnl、 Xbal、 EcoRV、 Apal、 HindIII的限制酶酶切位點。
在本打靶法中，首先使用與小鼠同源性高的大鼠CaMKII a的 cDNA,篩選小鼠TT2細(xì)胞系(胚胎干細(xì)胞、ES細(xì)胞)的基因組 DNA文庫，得到包含小鼠CaMKIIa的外顯子2 ( exon2 )的基因 片段。外顯子2是含有相當(dāng)于CaMKIIa的活性中心第42位的氨基 酸殘基賴氨酸(Lys - 42)的核酸序列的外顯子。將該基因片段插 入到質(zhì)粒載體后，制作限制性酶譜圖(參照圖l的野生型等位基 因)，再進行亞克隆。
通過使用突變寡核苷酸的PCR法，在對應(yīng)于外顯子2內(nèi)的Lys -42的核酸序列(AAG)中導(dǎo)入一個堿基突變(AGG),引起點 突變以變成精氨酸(Arg-42 )(參照圖l的打靶設(shè)計物。圖中，★ 表示導(dǎo)入了點突變)。該點突變導(dǎo)入的確i人可以通過核酸序列的確 定進行。通過這一 點突變可以生成新的BstNI限制酶的酶切位點
(參照圖2)。
再將夾loxP序列的新霉素抗性基因(PGKneo)插入到外顯子 2的3'側(cè)的內(nèi)含子內(nèi)的Ap a I限制酶酶切位點，另外將白喉毒素A基 因(MCI-DT-A)插入到非同源區(qū)域，從而完成打耙設(shè)計物(參 照圖l的打靶設(shè)計物)。
將上述打耙設(shè)計物大量純化后，經(jīng)限制酶處理成線性，用于 對ES細(xì)胞(TT2細(xì)胞)的電穿孔。通過使用抗生素G418的篩選， 將新霉素抗性ES克隆挑出，對于其基因組DNA使用PCR法和DNA 印跡法進行解析，從總數(shù)524個克隆中確認(rèn)4個同源重組體。發(fā)生 同源重組的等位基因的結(jié)構(gòu)示于圖l的野生型等位基因。
由上述方法得到的陽性克隆通過夾有點突變的部分的PCR產(chǎn) 物(圖2所示的0.29kb的片段)的核酸序列的決定，確認(rèn)實際上導(dǎo) 入了目標(biāo)突變。對于其中2個陽性克隆，使用表達(dá)載體并通過電穿 孔導(dǎo)入Cre重組酶和噤呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(puromycin N-acetyltransferase ( Pac))，通過使用抗生素嘌呤霉素的篩選， 挑出導(dǎo)入了 Cre重組酶的ES克隆。這些基因組DNA通過PCR法和 DNA印跡法進行解析，再通過Cre重組酶的作用除去新霉素抗性 基因，得到只剩下loxP序列的陽性克隆(參照圖l的Cre重組之后 的突變等位基因)。對于這些陽性克隆，再通過夾有點突變的部分 的PCR產(chǎn)物的核酸序列的決定來確認(rèn)實際上導(dǎo)入了目標(biāo)點突變。
按照常規(guī)方法，將發(fā)生了同源重組而且新霉素抗性基因被削 除了的上述ES細(xì)胞的陽性克隆微注入到小鼠8細(xì)胞期胚中，從而 得到嵌合小鼠。然后使該嵌合小鼠與野生型小鼠交配，結(jié)果可以 得到帶有來自ES細(xì)胞的基因的小鼠"非活性型CaMKIIa敲入小 氛 。 [實施例4:非活性型CaMKII oc敲入小鼠的解析-DNA水平的 解析-]
對于通過上述方法做出的非活性型CaMKIIa敲入小鼠，通過 DNA印跡解析確認(rèn)經(jīng)同源重組導(dǎo)入了突變基因。該實驗結(jié)果如圖3 所示。
詳細(xì)地講，從野生型小鼠(+/+ )、同源染色體的一方導(dǎo)入 非活性型CaMKIIa基因的雜合體小鼠(+/-)、同源染色體的雙方 導(dǎo)入了非活性型CaMKIIa基因的純合體小鼠(-/-)的尾部組織 分別提取基因組DNA,進行DNA印跡解析。所使用的探針是打靶 設(shè)計物的3，下游、對應(yīng)于非同源區(qū)域的3，探針(3'probe)，以及打 靶設(shè)計物內(nèi)部、對應(yīng)于同源區(qū)域的內(nèi)部探針(internal probe )兩 種探針(參照圖l)。將各個基因組DNA經(jīng)限制酶ApaI處理后，用 3'探針檢測的檢測結(jié)果如圖3 ( a )所示，而用限制酶EcoRV處理 后，用內(nèi)部探針檢測的檢測結(jié)果如圖3 (b)所示。
在野生型(+ /+ )中，檢測到(a)經(jīng)Apal消化得到的4.5kb 帶、(b)經(jīng)EcoRV消化得到的3.86kb帶，相對于此，在非活性型 CaMKIIa敲入純合體小鼠(-/-)中，檢測到表現(xiàn)出基因的同源 重組的突變帶的(a)經(jīng)Apal消化得到的5.5kb帶、(b)經(jīng)EcoRV 消化得到的2.15kb帶。在雜合體小鼠(+/-)中，檢測到在野生 型和純合體小鼠中被證實的兩方的帶。根據(jù)圖3給出的結(jié)果可以確 認(rèn)通過同源重組導(dǎo)入了突變基因。
另外，通過基因組DNA的PCR解析進行了各個小鼠的基因型 的決定(genotyping,基因分型)。其結(jié)果如圖4所示。圖中，(a) 是通過使用插入了在外顯子2的3'下游的內(nèi)含子內(nèi)殘存的loxP序 列插入部分的引物進行PCR解析(loxP-PCR)來檢測loxP序列的 有無，由此決定各個小鼠的基因型的結(jié)果。如圖4所示，野生型小 鼠(+ /+ )的loxP-PCR產(chǎn)物是220bp,相對于此，純合體小鼠中 由于loxP序列的插入而增長到287bp。
圖4( b)是通過對插入了外顯子2內(nèi)的點突變導(dǎo)入部分的PCR 產(chǎn)物用BstNI進行限制酶處理(PCR—BstNI消化)，確認(rèn)突變小 鼠中出現(xiàn)了新的酶切位點，即發(fā)生了堿基序列的置換(點突變) 的結(jié)果。如圖2所示的那樣，通過使存在于CaMKIIa基因的外顯 子2內(nèi)的核酸序列AAG (相當(dāng)于Lys-42 )發(fā)生一個堿基突變變成 AGG (相當(dāng)于Arg-42 ),可出現(xiàn)新的BstNI限制酶酶切位點。因此 如圖4 (b)所示，在野生型小鼠(+/+ )中出現(xiàn)了 194bp和97bp 兩條帶，而在純合體小鼠(-/-)中由于可形成新的BstNI限制 酶酶切位點，所以出現(xiàn)了131bp、 97bp、 63bp的3條帶。在雜合體 小鼠(+/—)中可4全觀'J到194bp、 131bp、 97bp、 63bp的4條帶。
另外，通過直接決定插入了外顯子2內(nèi)的點突變導(dǎo)入部分的 PCR產(chǎn)物的核酸序列，可進行點突變導(dǎo)入的確認(rèn)。其結(jié)果如圖5所 示。可以直接確i人在野生型(wild type)中混有相當(dāng)于Lys-42的 堿基序列(AAG)、在純合體小鼠(homozygote)中混有相當(dāng)于 Arg-42的堿基序列(AGG)、而在雜合體小鼠(hete雨ygote ) 中混合存在AAG和AGG序列。
接下來，使用小鼠腦的勻漿液，通過蛋白印跡進行蛋白水平 的解析。其結(jié)果如圖6所示。在使用與CaMKIIa特異反應(yīng)的抗體 的沖全測中，在前月S (forebrain)和小腦(cerebellum)中，野生 型(+/+ )和純合體小鼠(-/-)之間在CaMKIIoc蛋白水平上 都沒有看到明顯差別(圖6上圖)。由此可知，通過一個氨基酸置 換的基因操作，顯然對于CaMKIIa蛋白的表達(dá)水平幾乎沒有什么 影響。另外，對于CaMKII的另一個亞基p也使用特異抗體進行研 究的結(jié)果，在前腦和小腦中，野生型和純合體小鼠之間都沒有看
到其表達(dá)上有差別(圖6下圖)。
然后，使用小鼠腦的勻漿液，使用特異的肽底物測定CaMKII 的活性。結(jié)果如圖7所示那樣，在CaMKIIa比(3占優(yōu)勢的前腦，在 雜合體小鼠(hetero)、純合體小鼠(homo)中與野生型(wild) 相比分別只看到71.5% (約7成)、38.8%(約4成)的活性。在純 合體小鼠中的殘存活性認(rèn)為是CaMKIIp引起的。
另外，在CaMKIip比a占優(yōu)勢的小腦，如圖8所示那樣，在野 生型、雜合體小鼠、純合體小鼠之間活性上幾乎看不到有差別。 因此可以認(rèn)為，在基因中導(dǎo)入了突變的CaMKIIa是不具有蛋白激 酶活性的非活性型。
由以上結(jié)果可知，在非活性型CaMKII a敲入小鼠中， CaMKIIa的蛋白水平的表達(dá)幾乎可正常保持，而只是蛋白激酶活 性選擇性地消失了 。
雜合體小鼠之間交配產(chǎn)下的93只小鼠的基因型和性別比例的 解析是在出生后4周齡進行的。其結(jié)果如下面表l所示。
表l
純合體 雜合體 野生型總計
雄性 雌性9(20.5%)26 ( 59.1%) 9(20.5%) 10(20.4%) 24 ( 49.0%) 15(30.6%)44 ( 47.3% ) 49 ( 52.7%)
總計19(20.4%) 50 ( 53.8%) 24 ( 25.8%)93 ( 100% )
如表l所示那樣，判明是按照孟德爾法則出生的，即雜合體小
鼠約半數(shù)、野生型、純合體小鼠分別占約4分之一。即，可知導(dǎo)入 到小鼠基因組的基因突變本身對動物的出生、存活沒有直接影響。 而且雄性、雌性的比例也幾乎相同。在敲除小鼠中常常看到繁殖 能力顯著下降，相反在本發(fā)明的非活性型CaMKIIa敲入小鼠中看 不到那樣的繁殖能力的下降，根據(jù)這一點也可以認(rèn)為是有用性高
的小鼠。
通過反映神經(jīng)細(xì)胞的活動性的細(xì)胞色素氧化酶活性染色，研 究野生型和非活性型CaMK II a敲入小鼠之間在神經(jīng)活動上是否 產(chǎn)生差異。圖9是表示該結(jié)果的腦切片，左圖是野生型(wild), 右圖是作為本實施例的非活性型CaMKII a敲入小鼠的純合體小 鼠(homo)的腦切片。
如該圖9所示的那樣，在大腦皮質(zhì)(Cx)、紋狀體(CPu)的 活性是在野生型、純合體小鼠之間沒有看到大的差別，但在伏核 (Acc)的活性是純合體小鼠與野生型相比有降低。為了進行定量 比較，在各個切片中測定四方形包圍部分的平均濃度，以伏核中 的值比上大腦皮質(zhì)中的值的比例(Acc/Cx)進行比較，野生型為 120.1%,相對于此，純合體小鼠為99.8%，在純合體小鼠中，伏 核中的細(xì)胞色素氧化酶活性相對較低。該結(jié)果表明純合體小鼠的 伏核中的神經(jīng)細(xì)胞的活動性降低。
使用長成成體的小鼠，當(dāng)將痙攣誘發(fā)劑戊四唑注射到腹腔內(nèi) (50mg/kg)時，在野生型小鼠中出現(xiàn)全身性的陣攣，沒有進一 步發(fā)展到痙攣，相反在作為本發(fā)明的非活性型CaMKII oc敲入小鼠 的純合體小鼠中，持續(xù)全身性陣攣，出現(xiàn)陣攣性'強直性痙攣，一 部分小鼠甚至死亡等，確認(rèn)了痙攣的重癥化。因此，非活性型 CaMKIIa敲入小鼠與正常動物比較，痙攣的閾值降低了 。
另外，當(dāng)調(diào)查出生后4周齡至半年期間的小鼠的死亡數(shù)時，野 生型小鼠是53只中死亡數(shù)為0，而雜合體小鼠是95只中有5只(5%) 死亡、純合體小鼠是48只中有12只(25%)死亡，在非活性型 CaMKIIa敲入小鼠中死亡率顯著升高。認(rèn)為該結(jié)果反映了非活性
型CaMK II ot敲入小鼠對于外部.內(nèi)部的侵襲是脆弱的。
以上結(jié)果具體表明本發(fā)明的非活性型CaMKIIa敲入動物作
為癲癇發(fā)作、腦障礙的模型動物是有用的。 產(chǎn)業(yè)上可利用性
本發(fā)明的非活性型CaMK II ot敲入動物以及非活性型CaMK IIa敲入細(xì)胞中，僅CaMKIIot的蛋白激酶活性被特異地?fù)p傷，因 此如上述那樣，作為特異性更高的功能阻礙動物(或細(xì)胞)，除了 可
權(quán)利要求
1.一種非活性型CaMK IIα敲入非人動物，其特征在于，通過將同源染色體的一方或雙方的Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IIα(CaMK IIα)基因置換為非活性型、改變?yōu)楸磉_(dá)非活性型CaMK IIα，CaMK IIα的蛋白激酶活性被特異地?fù)p傷，并保持CaMK IIα的鈣調(diào)蛋白結(jié)合能力和亞基之間的多聚體形成能力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的非活性型CaMKIIa敲入非人動物， 其特征在于，是通過基因打靶法制作的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的非活性型CaMK II a敲入非人動 物，其特征在于，改變了CaMKIIa的催化結(jié)構(gòu)域中的l個或多個 氨基酸殘基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的非活性型CaMKIIot敲入非人動物， 其特征在于，改變了與ATP結(jié)合所必需的1個或多個氨基酸殘基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的非活性型CaMKIIa敲入非人動物， 其特征在于，改變了與ATP結(jié)合所必需的賴氨酸殘基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l ~ 5任一項所述的非活性型CaMKIIa敲入 非人動物，其特征在于，該動物是嚙齒目動物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的非活性型CaMKIIa敲入非人動物， 其特征在于，該動物是小鼠。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的非活性型CaMKIIa敲入非人動物， 其特征在于，與野生型相比，在腦內(nèi)伏核的神經(jīng)活動相對降低。
9. 一種非活性型CaMKIIa敲入細(xì)胞，其特征在于，通過將 同源染色體的 一 方或雙方的Ca"/4丐調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II a(CaMKII a )基因置換為非活性型，改變?yōu)楸磉_(dá)非活性型 CaMKIIa, CaMK II a的蛋白激酶活性被特異地?fù)p傷，并保持 CaMKIIa的4丐調(diào)蛋白結(jié)合能力和亞基之間的多聚體形成能力。
全文摘要
本發(fā)明提供只有Ca²⁺/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IIα(CaMKIIα)的蛋白激酶活性被特異地?fù)p傷了的非活性型CaMKIIα敲入動物。考慮到CaMKIIα與所謂學(xué)習(xí)·記憶的高級腦功能有關(guān)、還抑制由癲癇發(fā)作或缺血引起的腦損傷，從以上出發(fā)，本發(fā)明的非活性CaMKIIα敲入動物可以廣泛用于學(xué)習(xí)·記憶的損傷、癲癇發(fā)作、腦損傷等機制的闡明等、腦·神經(jīng)科學(xué)的諸方面的研究。
文檔編號C12N15/85GK101098961SQ200580010479
公開日2008年1月2日 申請日期2005年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月29日
發(fā)明者山肩葉子, 柳川右千夫 申請人:獨立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu)