專利名稱：來自角膜緣的未分化干細胞組織系統(tǒng)的制作方法
有關(guān)聯(lián)邦資助研究或發(fā)展的聲明不可應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明的領(lǐng)域 本發(fā)明涉及包括哺乳動物未分化干細胞的組織系統(tǒng)系統(tǒng)，優(yōu)選人未分化干細胞，其來自角膜緣組織角膜緣組織并且適合修復(fù)眼表的損傷或病患。
2.相應(yīng)領(lǐng)域的描述 在有機體的一生中，干細胞負責(zé)細胞的更替和組織的再生。干細胞是有強大增殖潛能的細胞，并且依賴干細胞分化成幾種細胞系，和/或經(jīng)過移植使組織重新生成。胚胎干(ES)細胞是典型的干細胞，有無限的自我更新和多能性的潛力。ES細胞是來自胚泡期胚胎的內(nèi)層細胞團。在有機體中，成體干細胞也是特異的未分化干細胞，其在出生后和整個成體期保留了細胞更換和組織再生的能力。一般認為成體干細胞與ES細胞相比，具有較弱的自我更新能力，并且雖然它們可以分化成為多個系，但一般不認為是多能的。在成熟機體的不同的組織中發(fā)現(xiàn)成體干細胞(又叫″組織特異干細胞″)數(shù)目很少，包括骨髓(Weissman，(2000)Science 2871442-1446)、神經(jīng)組織(Gage，(2000)Science 2871433-1438)、胃腸組織(Potten，(1998)Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.353821-830)、表皮組織(Watt，(1997)Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.353831)、肝組織(Alison和Sarraf，(1998)J.Hepatol.29678-683)和間葉細胞組織(Pittenger et al.，(1999)Science 284143-147)。尤其是在哺乳動物眼角膜鞏膜緣發(fā)現(xiàn)的成體干細胞對維持健康眼表面是十分重要的，并且參與健康眼和角膜表面的動態(tài)平衡。
眼表面由角膜上皮細胞、結(jié)膜上皮細胞和前角膜淚膜組成。在健康眼中，角膜上皮細胞不斷脫落進入淚池并由角膜鞏膜緣干細胞補充。由角膜邊緣產(chǎn)生的新細胞從邊緣向心移動和從上皮的基底層向前移動補充角膜上皮細胞完成更新(Cotsarelis et al.，(1989)細胞57201-209)。如果缺乏適當(dāng)?shù)难a充，會導(dǎo)致一個不健康或不正常的眼表面產(chǎn)生諸如視物不清或眼部不適的癥狀。角膜緣干細胞的缺乏和損耗會形成不正常的角膜表面，例如結(jié)膜成分內(nèi)生到角膜表面導(dǎo)致角膜失明、疼痛、畏光等(Anderson et al.，(2001)Br.J.Opthalmol.85567-575)。即使眼睛的其它部位健康，但由于不正常角膜表面導(dǎo)致視力障礙。
一級角膜緣干細胞缺乏可以由遺傳條件引起，諸如先天性無虹膜癥、多發(fā)性內(nèi)分泌缺乏相關(guān)的角膜炎、limbitis和原發(fā)癥。先天性無虹膜癥是一種遺傳決定的由于角膜鞏膜邊緣的未完全分化引起的眼異常，特征是眼表面異常以及虹膜缺失。次級角膜緣干細胞缺失也可以在獲得性條件下發(fā)生，諸如Steven-Johnson綜合癥、感染(如嚴重的細菌性角膜炎)、眼表腫瘤、由化學(xué)或熱損傷或暴露于紫外線照射引起的角膜緣干細胞的創(chuàng)傷性破壞、多次外科手術(shù)或冷凍療法、角膜內(nèi)上皮腫瘤、外圍潰瘍和炎癥性角膜炎、缺血性角膜炎、角膜病、隱型眼鏡或鏡片清洗液引起的毒性作用、免疫條件、眼睛斑痕類天皰瘡、翼狀胬肉、假翼狀胬肉，等等。
因此具有高增殖能力的角膜緣干細胞對維持具有活力和健康的眼表面非常重要，因為它們連續(xù)不斷地提供為維持角膜表面平衡所需角膜上皮細胞(Tseng，(1996)Mol.Biol.Rep.2347-58)。角膜緣干細胞在有損傷或病患眼中的角膜緣干細胞缺乏，如果沒有角膜緣干細胞源的再引入，就不能被正?；?Holland et al.，(1996)Trans.Am.Ophthalmol.Soc.94677-743；Tan et al.，(1996)Ophthalmol.10329-36)。因此沒有對眼角膜緣干細胞源的再引入，就不能修復(fù)角膜緣干細胞缺失帶來的損害(Tseng et al.，(1996)；Tsai et al.，(2000)N.Engl.J.Med.34386-93；Henderson et al.，(2001)Br.J.Ophthalmol.85604-609)。
已經(jīng)使用了幾種方法來試圖恢復(fù)角膜表面損傷后的正常視力，但是這些方法不足以修復(fù)涉及或由于角膜緣干細胞缺失造成的損傷。一個常規(guī)的修復(fù)由于角膜緣干細胞缺失造成角膜表面損傷的方法是將羊膜直接移植到治療對象治療對象的眼表面(Anderson et al.，(2001)Br J.Opthalmol.85567-575)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羊膜移植促進上皮形成、保持正常上皮形態(tài)、降低炎癥、減少疤痕、降低組織的粘連和降低眼睛脈管的形成。但是羊膜移植并不都能成功，最后的結(jié)果經(jīng)常是與病人的初始情況沒有太大的差別(Prabhasawat etal.，(1997)Arch.Ophthalmol 1151360-67)。這項技術(shù)在恢復(fù)角膜角膜緣干細胞正常數(shù)量上所取得的成功也是有限的(Shimazaki et al.，(1997)Ophthalmology 1042068-2076；Tseng et al.，(1997)Am.J.Ophthalmol.124765-774)。另外，羊膜移植僅應(yīng)用在部分角膜緣干細胞缺乏的病人例子中，因為病人眼中相當(dāng)數(shù)量的角膜緣干細胞的存在角膜緣干細胞，可以提高成功的可能性。諸如Hu等(WO00/73421)所公開的分離人羊膜上皮細胞并將其分化為角膜表面上皮細胞的方法，具有費力和角膜緣干細胞產(chǎn)率低的缺點。
另一種治療角膜緣干細胞缺乏的方法涉及角膜移植，其治療慢性眼表疾患也存在問題，因為最后治療的成功依賴于供者角膜上皮細胞被受者角膜上皮細胞的逐漸更替，由于受者眼中缺乏角膜緣干細胞，會出現(xiàn)不良預(yù)后(Lindstrom，(1986)N.Engl.J.Med.3 1557-59。另一治療角膜緣干細胞缺乏的方法是將供者眼邊緣移植物移植到受者眼。該技術(shù)包括移植兩個大的來自健康眼的分離的結(jié)膜邊緣移植物，優(yōu)選來自同一病人，每一個邊緣跨度弧長大約為6-7mm，。該方法已經(jīng)顯示在兔模型中，比結(jié)膜移植修復(fù)角膜表面的效果好得多(Tsai et al.，(1990)Ophthalmology 97446-455)，并已經(jīng)用于解除很多病人經(jīng)歷的眼睛不適，以及修復(fù)角膜表面和視力。但是與該方法相關(guān)的一個主要問題是，它需要從病人健康眼中移出大量角膜緣干細胞，其有將健康眼睛置于角膜緣干細胞缺乏的危險以及由嚴重的角膜緣干細胞缺損導(dǎo)致健康眼的其它并發(fā)癥。
在了解了從活體供者中移出大量角膜緣活檢組織的缺點后，角膜緣干細胞一些只采用健康眼少量邊緣上皮細胞活檢組織來治療角膜緣干細胞缺乏的方法已被開發(fā)了出來(Pellegrini et al.，(1997)Lancet 349990-993)。這些方法包括在塑料培養(yǎng)皿里角膜緣活檢組織進行2-3星期的培養(yǎng)。一旦邊緣細胞融合，用胰蛋白酶處理收集細胞培養(yǎng)物并移植到病人損傷眼睛。有的方法是將角膜緣活檢組織放在羊膜上進行生長角膜緣活檢組織(Koizumi et al.，(2000)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.412506-2513；Koizumi etal.，(2000)Comea 1965-71；Dua et al.，(2000)Surv.Ophthalmol.44415-425)，但是從這些培養(yǎng)物分離并移植的邊緣細胞時間一長就不穩(wěn)定，難以產(chǎn)生令人滿意的眼表面修復(fù)，尤其是對嚴重角膜緣干細胞缺乏的病人(Jun Shimazaki et al.，(2002)Opthalmol.1091285-1290)。在公布號為20030208266的美國專利中公開的利用羊膜的另一方法是，移植用的上皮干細胞是在經(jīng)過特殊處理的羊膜上進行體外培養(yǎng)所獲得的。這個外科移植物產(chǎn)生的方法不使用任何一種對角膜緣干細胞進行唯一篩選角膜緣干細胞的分離步驟，并且干細胞層在整個移植物上的分布是不均勻的。移植物的這些特點可以導(dǎo)致移植的上皮細胞缺乏穩(wěn)定性，尤其是對角膜緣干細胞缺乏的病人。
產(chǎn)生移植物的另一方法是在專利號為0572364的歐洲專利中提出的。它公開了體外培養(yǎng)人眼表面上皮細胞活檢組織的方法，活檢組織來自眼睛邊緣和/或前緣區(qū)域，或眼的forrinx和/或結(jié)膜區(qū)域。細胞培養(yǎng)后，用合適的器具，諸如滅菌的紗布或半剛性的鏡片將其移植到眼睛中。但是因為在移植分化的上皮細胞中角膜緣干細胞是有限的，該方法不能矯正嚴重的角膜緣干細胞缺乏病人的損傷。另外對嚴重的眼或角膜表面損傷的病人，插入角膜接觸鏡是不必要的，因為在一個已經(jīng)有損傷的眼表面上置放角膜接觸鏡可以引起發(fā)炎和不適，使眼的狀態(tài)進一步惡化，導(dǎo)致其它的并發(fā)癥。在另一個為WO03/030959的專利申請中，公開了一種使用表面修飾的角膜接觸鏡進行角膜緣干細胞的培養(yǎng)，治療角膜損害的角膜修復(fù)裝置，角膜緣干細胞。該方法有幾種缺點，包括角膜緣干細胞在接種到鏡片上后是否可以持續(xù)性地釋放出來幫助治療損傷眼睛的不確定性，和接種到角膜接觸鏡的細胞群落可能只有少量的10％的角膜緣干細胞，不足以對嚴重的角膜緣干細胞缺乏病人進行成功的角膜修復(fù)。
申請?zhí)枮?0020039788的美國專利公開了一種類似的治療角膜上皮表面損傷或病變的生物工程合成的移植物，其中合成的移植物包括分化了的上皮細胞構(gòu)成的復(fù)層上皮細胞。同樣的，這些分化了的上皮細胞移植物具有有限的未分化的角膜緣干細胞數(shù)目，其對嚴重缺乏角膜緣干細胞的病人進行成功的眼修復(fù)是必要的。申請?zhí)枮?,610,538的美國專利公開了利用角膜緣干細胞培養(yǎng)物作為移植物進行體外重建人角膜上皮治療眼損傷病人的方法角膜緣干細胞。用克隆分析和應(yīng)用標記，如K19、K12、K3和p63，對該角膜緣干細胞進行選擇。然而這些標記眾所周知是用來說明對表明角膜細胞的特性對分離的細胞是否未分化卻沒有特異性。另外，公開的專利中提出的克隆分析來選擇的細胞是全克隆細胞，其屬于基底邊緣層，對選擇富集角膜緣干細胞細胞的細胞群落是不必要的。因此這些移植物對于嚴重的角膜緣干細胞缺乏病人修復(fù)眼損傷是不適合的。
WO 03/093457也公開了一種通過選擇表達膜蛋白標記CD34或CD133的干細胞來鑒定和分離角膜組織干細胞的方法，這兩個標記都屬于分化叢(CD)。但是這些標記特意用于分離人造血系而不是角膜緣干細胞。因此該方法優(yōu)選用來選擇污染角膜組織活檢組織的血細胞，對用該方法分離的細胞的未分化狀態(tài)，則沒有評價。
任何邊緣細胞移植的穩(wěn)定性和成功依賴于其持續(xù)再生用于修復(fù)眼表面的有活性的角膜緣干細胞的能力。目前使用的治療角膜緣干細胞缺乏的移植物或被移植物一般含有高比例的分化了的角膜上皮細胞，而不是含量有限的角膜緣干細胞。由于提供的角膜緣干細胞有限，該移植物或被移植物中的供者上皮細胞一般只能存活很短時間。換句話說，移植物可以產(chǎn)生明顯的角膜上皮，但是缺少足夠的角膜緣干細胞造成不正常的上皮表面和不良的療效，導(dǎo)致不能修復(fù)眼表面和改善視力。所以，可能由于在移植物或被移植物中具有自我再生能力的未分化角膜緣干細胞的供給有限，這些試圖為缺乏角膜緣干細胞的眼提供角膜緣干細胞的方法存在嚴重的局限性。因此，通過提供充足的具有再生和為眼持續(xù)提供角膜緣干細胞的能力的角膜緣干細胞數(shù)目來提供能更加成功地修復(fù)和重建眼表損傷的移植物或被移植物是必要的。角膜緣干細胞角膜緣干細胞。
發(fā)明概述 本發(fā)明公開了一種組織系統(tǒng)，其中組織系統(tǒng)包括角膜緣干細胞，其中在組織系統(tǒng)中至少大約30-90％的細胞是未分化干細胞(USCs)。優(yōu)選地，在組織系統(tǒng)中USCs包括至少大約30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的角膜緣干細胞。在不同的實施例中，USCs表達選自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex1、Sox2、Tra-1-60、Tra-1-81和干細胞因子組成的組中的一個或多個干細胞標記基因。在一個優(yōu)選的實施例中，USCs對胚胎階段特異性抗原標記4(SSEA-4)呈現(xiàn)陽性。在優(yōu)選的實施例中，在組織系統(tǒng)中至少大約50％、60％、70％、80％、90％或95％的USCs呈現(xiàn)SSEA-4陽性。在其它優(yōu)選的實施例中，組織系統(tǒng)中的細胞表達選自K3/K12、K19和p63組成的組中的一個或多個細胞表面標記。在其它優(yōu)選的實施例中，組織系統(tǒng)來自角膜鞏膜角膜緣組織。而角膜鞏膜角膜緣組織可以來自任意一個合適的哺乳動物，人組織尤其是優(yōu)選的來源。優(yōu)選的組織系統(tǒng)是復(fù)層組織系統(tǒng)。
本發(fā)明也提供產(chǎn)生組織系統(tǒng)的方法，其中組織系統(tǒng)包括未分化干細胞，該方法包括以下步驟(a)分離供者角膜緣組織角膜緣組織；(b)培養(yǎng)角膜緣組織角膜緣組織來增加培養(yǎng)的的角膜邊緣細胞的數(shù)量；(c)通過分選角膜緣細胞將角膜緣干細胞群落從培養(yǎng)的角膜緣細胞中分離出來，從而選擇一個或多個干細胞特異表面標記，其中干細胞特異表面標記是由未分化干細胞(USCs)表達的；(d)培養(yǎng)分離的USCs群落以產(chǎn)生組織系統(tǒng)。
在優(yōu)選實施例中，組織系統(tǒng)的角膜緣干細胞至少包括大約40-50％的細胞，在組織系統(tǒng)中更優(yōu)選至少大約60-70％的細胞，在組織系統(tǒng)中最優(yōu)選至少大約80-90％的細胞。在其它的優(yōu)選的實施例中，角膜緣干細胞包括USCs，最優(yōu)選的是人USCs。優(yōu)選的是，在組織系統(tǒng)中，USCs至少包括大約30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的角膜緣干細胞。在優(yōu)選的實施例中，USCs表達選自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex1、Sox2、Tra-1-60、Tra-1-81和干細胞因子組成的組中的一個或多個干細胞標記基因。在其它的優(yōu)選實施例中，組織系統(tǒng)中的細胞表達選自K3/K12、K19和p63組成的組中的一個或多個細胞表面標記。用于產(chǎn)生組織系統(tǒng)的角膜緣組織角膜緣組織可以從任何合適的哺乳動物中分離，人組織尤其是優(yōu)選的來源。優(yōu)選地，根據(jù)上述的方法產(chǎn)生的組織系統(tǒng)適合對受者進行移植、植入或被移植，尤其是對單只眼或雙眼患有角膜緣干細胞缺乏癥的受者。在其它的優(yōu)選實施例中，受者和供者是相同的。
在有關(guān)上述產(chǎn)生組織系統(tǒng)的方法的其它優(yōu)選的實施例中，優(yōu)選在支持所需角膜緣干細胞和USCs生長的培養(yǎng)基基中進行角膜緣組織角膜緣組織的培養(yǎng)，例如DMEM或F12的培養(yǎng)基基，進一步添加營養(yǎng)血清和選自以下可溶性因子組成的組中的一個或多個可溶性因子二甲基亞砜(DMSO)、重組人表皮生長因子(rhEGF)、胰島素、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵因子、氫化可的松、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)。優(yōu)選地，將角膜緣組織角膜緣組織的培養(yǎng)到培養(yǎng)中的角膜邊緣細胞幾乎完全融合為止，例如80％的融合。
在優(yōu)選的實施例中，角膜緣組織在合適的支持物如細胞外基質(zhì)或生物包被表面進行培養(yǎng)，例如，在細胞外基質(zhì)載體或生物包被的培養(yǎng)皿上進行培養(yǎng)。角膜緣組織角膜緣組織優(yōu)選地，細胞外基質(zhì)是人羊膜。支持物可以是生物包被了一個或多個附著因子，諸如纖維蛋白原、層粘蛋白、膠原質(zhì)膠原蛋白IV、固生蛋白、纖維連接蛋白、膠原蛋白膠原質(zhì)、牛垂體提取物、EGF、肝細胞生長因子、角化細胞生長因子、氫化可的松，或它們的組合物。在細胞外基質(zhì)載體上培養(yǎng)的角膜邊緣細胞優(yōu)選地在分離USCs前，先從支持物上脫離。在優(yōu)選的實施例中，用對本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法分選角膜邊緣細胞，例如用磁力親和細胞分選法(MACS)或熒光激活細胞分選法(FACS)分離USCs群落。在其它的實施例中，選擇一個或多個的干細胞特異表面標記來分離USCs，包括但不局限于SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex1、Sox2、Tra-1-60、Tra-1-81、干細胞因子、CD73、CD105、CD31、CD54和CD117。在一個特別優(yōu)選的實施例中，用來選擇USCs的干細胞特異表面標記是SSEA-4。USCs可以表達一個或多個這些標記，因此可以使用這些標記將USCs從角膜邊緣細胞群落中優(yōu)選出來。在特定的實施例中，分選出的USCs包括至少大約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％SSEA-4陽性的細胞。
在優(yōu)選的實施例中，分離出的USCs群落在組織基底上進行培養(yǎng)產(chǎn)生組織系統(tǒng)。在優(yōu)選的實施例中，所述組織基底是哺乳動物羊膜、MatrigelTM、層粘蛋白、膠原蛋白膠原質(zhì)IV或膠原蛋白膠原質(zhì)IV片、固生蛋白、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、纖維蛋白原和凝血酶片(纖維蛋白膠、RelisealTM)或它們的任何組合物。組織基底也可以用支持物進行生物包被，包括但不局限于人羊膜、層粘蛋白、膠原蛋白膠原質(zhì)IV、固生蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、纖維連接蛋白或它們的組合物。在特定的優(yōu)選實施例中，組織基底是人羊膜，更優(yōu)選的是用一種支持物進行生物包被的人羊膜。將分離出的USCs群落優(yōu)選培養(yǎng)在可以增加細胞數(shù)量但并不充分分化細胞的培養(yǎng)基中，例如添加了來自未活化的人胚胎纖維原細胞的調(diào)整培養(yǎng)基的培養(yǎng)基，添加了人白血病抑制因子的培養(yǎng)基，或添加了一種或多種可溶性因子的培養(yǎng)基，該可溶性因子選自二甲基亞砜、重組人表皮生長因子、胰島素、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵因子、氫化可的松和堿性成纖維細胞生長因子組成的組中。


以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分并用于進一步說明本發(fā)明的特定內(nèi)容。通過參考一個或多個附圖并結(jié)合對特定的實施例的具體描述，會對本發(fā)明有更好的了解。
圖1.培養(yǎng)終止時，羊膜復(fù)層組織系統(tǒng)的H&E染色。
圖2.對培養(yǎng)的角膜緣活檢組織樣品進行的流式細胞分析。圖2A表示未標記的對照細胞。圖2B表示用抗小鼠異硫氰酸熒光素(FITC)抗體處理的細胞，即一種次級抗體，作為FITC標記對照。圖2C表示用胚胎階段性特異抗原標記物-4(SSEA-4)抗體(初級抗體)和抗小鼠FITC(次級抗體)標記的細胞。在角膜緣活檢組織樣品中，大約30％的細胞為SSEA-4標記物陽性。
圖3.為培養(yǎng)的組織系統(tǒng)樣品的流式細胞分析。圖3A表示未標記的對照細胞。圖3B表示用抗小鼠FITC抗體處理的細胞，作為次級抗體標記的對照。圖3C表示用SSEA-4抗體(初級抗體)和抗小鼠FITC(次級抗體)標記的細胞。在角膜緣活檢組織樣品中，大約74％的細胞為SSEA-4標記物陽性。
圖4.對復(fù)層組織系統(tǒng)的免疫熒光顯微照相顯示對SSEA-4的陽性免疫熒光。
圖5.對復(fù)層組織系統(tǒng)的免疫熒光顯微照相顯示對干細胞因子(SCF)的陽性免疫熒光。
圖6.對復(fù)層組織系統(tǒng)的免疫熒光顯微照相顯示對Tra-1-60的陽性免疫熒光。
圖7.對復(fù)層組織系統(tǒng)的免疫熒光顯微照相顯示對Oct-4的陽性免疫熒光。
圖8.對復(fù)層組織系統(tǒng)的免疫組化顯微照相顯示對p63陽性免疫熒光。用Vector Elite試劑盒進行免疫過氧化物酶分析。p63是一種核抗原并且棕色點是細胞在組織系統(tǒng)中的陽性核。
圖9.對復(fù)層組織系統(tǒng)的免疫熒光顯微照相顯示在組織系統(tǒng)的表層中聚集K3/K13陽性細胞。
圖10.對復(fù)層組織系統(tǒng)的免疫熒光顯微照相顯示組織系統(tǒng)中K19的基底層表達。
圖11.對復(fù)層組織系統(tǒng)的免疫熒光顯微照相表示使用Vector Elite試劑盒，在組織系統(tǒng)中不存在Connexin43表達。在邊緣基底上皮細胞中不存在Connexin43的表達。
圖12.為用未分化干細胞標記Oct-4、Nanog、Rex1和BMP2和BMP5的RT-PCR法得到的復(fù)層組織系統(tǒng)的細胞群落的基因表達譜。GAPDH表達作為陽性對照也進行了分析。發(fā)現(xiàn)所有測試的細胞標記都有表達。
圖13.直方圖表示本發(fā)明外科采集的在運送培養(yǎng)基中經(jīng)歷12、24、48和72小時的角膜緣活檢組織的活性。用角膜緣活檢組織發(fā)育形成的復(fù)層組織系統(tǒng)的成功百分率來測定活性。
圖14.直方圖表示復(fù)層組織系統(tǒng)在6、12、24和48小時后期培養(yǎng)后的活性。在4℃或室溫下轉(zhuǎn)移組織系統(tǒng)，在稍長的時間內(nèi)會影響組織系統(tǒng)的活性。用細胞在組織系統(tǒng)中的成功百分率(存活)測定活性。
本發(fā)明描述一種組織系統(tǒng)，包括具有自我再生能力并且來自角膜緣組織的未分化干細胞(USCs)，角膜緣組織角膜緣組織，以及產(chǎn)生該組織系統(tǒng)的方法和用途。在此，″組織系統(tǒng)″是指包括USCs的細胞群落，優(yōu)選的是指適合的組織基底，適于對接受治療的哺乳動物對象進行移植、植入或被移植給治療對象。優(yōu)選地，該組織系統(tǒng)是移植物、植入物或被移植物，例如外科移植物或具有多層細胞集合物的合成移植物。在此，術(shù)語″未分化干細胞″或″USCs″是指未分化或本質(zhì)上未分化細胞或未定向祖細胞，它們表達一個或多個的干細胞特異標記物，優(yōu)選是胚胎干細胞特異標記物。本發(fā)明的USCs表現(xiàn)出ES樣細胞的特性和特點，例如ES特異標記物的表達，例如SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex1、Sox、Tra-1-60，和/或在培養(yǎng)物中長期增殖。另外，本發(fā)明的USCs在不同環(huán)境條件下可以增殖和產(chǎn)生未分化或分化的細胞后代。例如，本發(fā)明的USCs具有分化成為角膜上皮細胞的潛能，這對于眼表面的健康功能非常重要。在此，術(shù)語″分化″是指未分化干細胞或前體細胞特異化的過程。
在優(yōu)選實施例中，具有USCs的組織系統(tǒng)取自人供者的角膜鞏膜或角膜緣組織角膜緣組織。具體是，本發(fā)明的組織系統(tǒng)具有自我再生能力的USCs，優(yōu)選是包括大量的USCs，例如至少大約70％，至少大約80％或至少大約90％的USCs。大量或高比例的USCs存在于組織系統(tǒng)中，可以極大地促進組織系統(tǒng)在移植、植入或被移植到哺乳動物治療對象后，恢復(fù)損傷或眼表病患的能力治療對象。另外，組織系統(tǒng)中高比例的USCs允許系統(tǒng)在長時間內(nèi)穩(wěn)定持續(xù)地將有活性的角膜緣干細胞對眼表面進行再增殖，這對眼睛表面的健康功能十分重要。在某些實施例中，組織系統(tǒng)是包括細胞外基質(zhì)載體的復(fù)合移植物，例如含有大量USCs的羊膜，其中，大量USCs在細胞外基質(zhì)載體上進行體外培養(yǎng)。
優(yōu)選是，組織系統(tǒng)是移植、植入或被移植到損傷或病患的眼睛并且能夠修復(fù)眼表面損傷，尤其是對嚴重角膜緣干細胞缺乏的治療對象的損傷或病患眼睛。在此，損傷或病患的眼睛嚴重的角膜緣干細胞缺乏的治療對象，可能在損傷或病患的眼睛中完全缺乏角膜緣干細胞。在優(yōu)選實施例中，用于角膜緣活檢組織產(chǎn)生USCs組織系統(tǒng)的角膜緣活檢組織的供者也是組織系統(tǒng)進行移植、植入或被移植(即同源組織系統(tǒng))的受者。或者，當(dāng)角膜緣活檢組織的供者不是受者時，供者最好是生物相容性的供者，例如接受移植或被移植的受者的近親，或可以是生物相容(例如組織相容)的尸體(即異源組織系統(tǒng))。一般要求移植細胞或組織與接受移植物的受者相同，以避免組織排斥。
如本發(fā)明所述，利用角膜緣組織角膜緣組織作為獲得組織系統(tǒng)來源的一個顯著優(yōu)勢是從供者獲得角膜緣組織角膜緣組織相對容易。該方法僅需要小手術(shù)，安全、簡便、有效，并且只需要很少角膜角膜緣活檢組織。角膜緣組織角膜緣組織是在角膜中發(fā)現(xiàn)的，是位于前房外表面的透明、無血管的組織。它保護眼睛不受環(huán)境的損害，使光線有效地進入眼睛。角膜主要由兩部分組成(1)前部非角質(zhì)層鱗狀上皮層和(2)下部固有質(zhì)。人角膜包含三種眾所周知的細胞類型角膜上皮細胞；基底角膜細胞(角膜纖維原細胞)；與基質(zhì)相關(guān)的角膜內(nèi)皮細胞的基底層。角膜上皮細胞是五至七層細胞厚的多細胞層，覆蓋在角膜前表面。通常會發(fā)生角膜上皮細胞的自然翻轉(zhuǎn)，其中表面上皮細胞會從上皮表面脫落并被下面的表皮細胞替代?；咨掀ぜ毎麖耐庵芟騼?nèi)遷移，以補充深層角膜上皮細胞。
角膜邊緣(又叫角膜鞏膜邊緣)是在角膜和球根結(jié)膜和鞏膜之間大約1mm寬的一個環(huán)形過渡帶。它位于眼球的外表面，象一個小溝，將角膜和鞏膜區(qū)別開來。它含有很多血管并且參與角膜的新陳代謝。邊緣和結(jié)膜上皮細胞，與穩(wěn)定的前眼淚膜一起保持角膜的完整性。雖然已知再補充角膜上皮細胞的來源是成體干細胞，但是這些細胞的確切位置和特性仍是未知數(shù)。直到在本發(fā)明中分離和鑒定前，還不清楚ES樣細胞特性的UCSs群落的存在。本發(fā)明描述了一種具有來自角膜鞏膜邊緣的高比例的UCSs組織系統(tǒng)，可用來恢復(fù)損傷或疾患的眼表面。
典型的分離角膜緣組織角膜緣組織的方法是從供者眼角膜表面上顳象限手術(shù)移取0.8-3mm2的一小塊角膜緣組織的活檢組織。從角膜邊緣這樣獲得活檢組織的方法，例如層狀角膜切除術(shù)，是本領(lǐng)域人員所熟知的。一旦活檢組織從供者移取出來活檢組織，必須將它轉(zhuǎn)移到一個設(shè)備中，以使角膜緣活檢組織能在本發(fā)明的組織系統(tǒng)中進行培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)移過程中具有足量角膜緣活檢組織保持活性以便于從中得到組織系統(tǒng)非常重要。優(yōu)選地，角膜緣活檢組織轉(zhuǎn)移并保存在能夠支持活檢組織活性的培養(yǎng)基中。優(yōu)選的轉(zhuǎn)移活檢組織的培養(yǎng)基包括Dulbecco’s Modified Eagles培養(yǎng)基(DMEM)和Ham’s F-12(比例為1∶1)，添加人臍帶血清(3-5％)、DMSO(0.1-0.5％)、rhEGF(0.5-2ng/ml)、胰島素(0.5-5μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵因子(0.5-5μg/ml)、亞硒酸鈉(0.5-5μg/ml)、氫化可的松(0.1-5μg/ml)、霍亂毒素A(0.01-0.1nmol/ml)、慶大霉素(10-50μg/ml)和兩性霉素B(0.5-1.25μg/ml)。優(yōu)選地，邊緣細胞活檢組織在從供者手術(shù)移取48小時內(nèi)進行培養(yǎng)。
在供者的角膜緣組織活檢后，將它置放在培養(yǎng)基中用培養(yǎng)介質(zhì)進行培養(yǎng)，優(yōu)選的介質(zhì)是適合的支持物，如細胞外基質(zhì)或生物包被的表面，例如細胞外基質(zhì)載體或生物包被培養(yǎng)皿。邊緣細胞活檢組織可以作為完整的外植體進行培養(yǎng)，或在培養(yǎng)前分散成單個細胞懸液。在優(yōu)選實施例中，支持物的存在有利于活檢組織中的角膜緣干細胞與細胞培養(yǎng)板結(jié)合，從而促進角膜緣干細胞的生長。優(yōu)選是，在培養(yǎng)外植體前，將外植體切成小片。用來培養(yǎng)角膜緣組織支持物的實施例包括但不局限于MatrigelTM和其等同物、哺乳動物羊膜，優(yōu)選人羊膜、層粘蛋白、固生蛋白、巢蛋白、透明質(zhì)酸、纖維蛋白原、膠原-IV、多聚-L-賴氨酸、明膠、多聚L-鳥氨酸、纖維連接蛋白、血小板來源生長因子(PDGF)及類似物，單獨或與其它支持物組合物使用。支持物可以用一個或多個的添加生長因子或附著因子處理，例如，纖維蛋白原、層粘蛋白、膠原-IV、固生蛋白、纖維連接蛋白、膠原、牛垂體提取物、EGF、肝生長因子、角化細胞生長因子、氫化可的松或它們的組合物。
優(yōu)選人羊膜培養(yǎng)活檢邊緣組織，并且用本領(lǐng)域人員熟知的方法進行制備(參見，例如專利號為6,152,142的美國專利和Tang et al，(1997)Am.J.Ophthalmol.124765-774，每一份在此都作為參考)。例如，為促進邊緣細胞的生長，羊膜可這樣制備，用凍融法、酶分解和機械刮擦去除內(nèi)源性羊膜上皮細胞，之后用生長因子、細胞外基質(zhì)化合物和/或粘附-增強分子進行表面處理角膜緣干細胞。羊膜是產(chǎn)生組織系統(tǒng)的優(yōu)選基質(zhì)，因為它是促進USCs活性和生長的天然物質(zhì)。在一個實施例中，將帶有基膜或基質(zhì)面的羊膜平滑地附著在培養(yǎng)板上進行USCs培養(yǎng)。通過以下實施例描述，使用細胞外基質(zhì)材料或生物包被表面的優(yōu)選方法。
一個優(yōu)選的培養(yǎng)角膜緣活檢組織的方法是在將外植體放在細胞外基質(zhì)或生物包被的細胞培養(yǎng)板之前或之后，將外植體干培養(yǎng)培育幾種分鐘。然后將少量培養(yǎng)基加到外植體，以便粘附到細胞外基質(zhì)或生物包被的組織培養(yǎng)表面。經(jīng)過幾小時至1天，輕輕加入另外的培養(yǎng)基，將外植體在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)幾天，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。優(yōu)選地，當(dāng)干細胞在培養(yǎng)基中開始增殖之后，將原來的角膜緣活檢組織的小片從培養(yǎng)基中移出。在其它的實施例中，可以用角膜緣活檢組織產(chǎn)生單細胞懸液，然后培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明的組織系統(tǒng)。例如沖洗角膜緣活檢組織然后進行酶處理，如用胰酶-EDTA(如0.25％處理20-30分鐘)或裂解酶(例如4℃過夜)產(chǎn)生包括USCs的單細胞懸液。酶處理使上皮細胞分散，因此在單細胞懸液中，基質(zhì)或間質(zhì)細胞中減少或不存在。
培養(yǎng)角膜緣組織的培養(yǎng)基優(yōu)選是DMEM或DMEM∶F-12(1∶1)培養(yǎng)基，優(yōu)選添加營養(yǎng)血清，例如血清或血清為基礎(chǔ)的溶液，提供有效保持細胞生長和活性的營養(yǎng)(例如，Knock-out血清、熱滅活人血清或人臍帶血血清)。培養(yǎng)基中也可以添加生長因子。在此，術(shù)語″生長因子″是指結(jié)合到細胞表面受體的蛋白質(zhì)，主要作用是促進細胞增殖和分化。用于培養(yǎng)角膜緣組織的優(yōu)選生長因子選自表皮生長因子(EGF)、堿性生長因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、胰島素、亞硒酸鈉、人轉(zhuǎn)鐵因子或人白血病抑制因子(hLIF)以及它們的組合物。但是對于本領(lǐng)域研究人員所熟知的任何合適的培養(yǎng)基都可以使用。在某些實施例中，邊緣細胞經(jīng)過可以使USCs在培養(yǎng)基中增殖的細胞因子或其它的生長因子處理。
角膜緣組織在培養(yǎng)幾天后，例如直到細胞融合時，USCs就可以從培養(yǎng)基中分離。優(yōu)選地，優(yōu)選地，允許角膜緣組織培養(yǎng)達到至少大約50％、60％、70％、80％、90％或95％的融合。在優(yōu)選實施例中，邊緣細胞首先與細胞外基質(zhì)或生物包被的細胞培養(yǎng)板解離，優(yōu)選是通過酶消化，例如用胰酶-EDTA或裂解酶溶液來解離?？梢杂枚喾N本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將USCs與培養(yǎng)基中其它的邊緣細胞分離，諸如免疫標記和熒光分選法，例如固相吸附、熒光-激活細胞分選(FACS)、磁力親和細胞分選(MACS)法等。在優(yōu)選實施例中，USCs通過分選，例如某些細胞表面標記的免疫熒光分選來分離的。兩種對本領(lǐng)域研究人員熟知的優(yōu)選方法是MACS和FACS。
分選技術(shù)如免疫熒光染色技術(shù)包括利用合適的干細胞標記，將USCs與培養(yǎng)基中的其它的細胞分離。用于將USCs與培養(yǎng)的邊緣細胞分離的合適的干細胞特異表面標記包括但不局限于SSEA-4、SSEA-3、CD73、CD105、CD31、CD54和CD117。在優(yōu)選實施例中，USCs是通過MACS利用細胞表面標記諸如SSEA-4得到分離的。用該方法，增加的細胞表面陽性標記USCs群落是來自角膜緣活檢組織細胞培養(yǎng)的混合群落?；蛘?，通過選擇不具有細胞表面標記的USCs，將細胞分類去除不需要的細胞。在將USCs與角膜緣組織分離的實施例中，USCs對以下細胞表面標記呈現(xiàn)陰性CD34、CD45、CD14、CD133、CD106、CD11c、CD123和HLA-DR。
經(jīng)過分選而增加的的邊緣細胞培養(yǎng)物含有至少有大約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的USCs。在優(yōu)選實施例中，分離的細胞至少大約有50％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的SSEA-4陽性USCs。在其它實施例中，通過篩選某些基因標記的表達，在包含邊緣細胞的混合細胞培養(yǎng)物中篩選USCs。在混合邊緣細胞培養(yǎng)物的實例中，可以通過基因標記的表達確認USCs群落，諸如SSEA-4、SSEA-3、OCT-4、Nanog、TDGF、UTX-1、FGF-4、Tra-1-60、Tra-1-81、干細胞因子(SCF)、Sox2、Rex1和其它的未分化細胞的基因標記以及它們的組合物。
當(dāng)含有豐富USCs的邊緣細胞群落用上述之一的方法被分離后，分離的細胞優(yōu)選地在支持USCs生長和用于移植、植入或被移植給損傷或病患眼睛的組織系統(tǒng)發(fā)育的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在這些條件下培養(yǎng)的組織系統(tǒng)優(yōu)選是包括至少大約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的USCs。在一個優(yōu)選實施例中，分離的USCs是在用于培養(yǎng)含有USCs的組織系統(tǒng)的加富培養(yǎng)基的存在下的組織基底上進行培養(yǎng)。優(yōu)選地，組織基底與天然眼表面有相似的特性，例如清晰、薄、有彈性、生物相容、無血管和無抗原性，并且能夠支持USCs的生長和在移植、植入或被移植后的正常分化。
在優(yōu)選實施例中，組織基底選自哺乳動物的羊膜，MatrigelTM和其等同物、層粘蛋白、固生蛋白、巢蛋白、透明質(zhì)酸、纖維蛋白原、凝血酶、膠原質(zhì)-IV、膠原質(zhì)-IV片、多聚-L-賴氨酸、明膠、多聚-L-鳥氨酸、纖維連接蛋白、血小板源性生長因子(PDGF)、凝血酶片(纖維蛋白Sealant、RelisealTM，Reliance Life Sciences)等或它們的組合物。在其它的實施例中，組織基底是膠原質(zhì)或纖維蛋白膠，膠質(zhì)可以進一步包括產(chǎn)生組織系統(tǒng)所需的其它細胞類型，包括但不局限于纖維原細胞，諸如角膜間質(zhì)纖維原細胞、間葉細胞組織的衍生物，以及上皮細胞，如角膜上皮細胞。又在其它實施例中，組織基底是一種水凝膠，例如一種合成的水凝膠，一種軟性水凝膠接觸鏡片或多聚HEMA基質(zhì)。在優(yōu)選實施例中，組織基底在組織系統(tǒng)移植、植入或被移植后，將被逐漸體內(nèi)重吸收。另外，組織基底優(yōu)選是非抗原性并且促進上皮化而沒有明顯纖維血管生長。
本發(fā)明用于產(chǎn)生組織系統(tǒng)的組織基底優(yōu)選是人羊膜，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行制備。人羊膜可以帶有上皮層完整使用，或?qū)⑸掀ぜ毎麆內(nèi)ナ褂?。以下實施例公開了制備人羊膜的優(yōu)選方法。在其它的優(yōu)選實施例中，用添加的支持物對組織基底進行生物包被，例如促進USCs結(jié)合到組織基底的物質(zhì)。所使用的添加支持物優(yōu)選自纖維蛋白原、層粘蛋白、膠原質(zhì)IV、固生蛋白、纖維連接蛋白、膠原質(zhì)、牛垂體提取物、EGF、肝細胞生長因子、角化細胞生長因子、氫化可的松或它們的組合物。
用于培養(yǎng)邊緣細胞產(chǎn)生組織系統(tǒng)的優(yōu)選加富培養(yǎng)基是DMEM或DMEM∶F-12(1∶1)培養(yǎng)基，優(yōu)選添加營養(yǎng)血清，例如血清或血清為基礎(chǔ)的溶液，提供有效保持USCs生長和活性的營養(yǎng)(例如，knock-out血清、熱滅活人血清或人臍帶血血清)。培養(yǎng)基中也可以添加生長因子。該培養(yǎng)基也可以由來自滅活人胚胎纖維原細胞培養(yǎng)基(例如30-50％)或添加hLIF(例如4-12ng/ml)或其它促進USCs生長的生長因子的培養(yǎng)基的調(diào)整培養(yǎng)基進行加富。用于培養(yǎng)邊緣細胞的其它因子優(yōu)選自DMSO、氫化可的松、EGF、bFGF、LIF、胰島素、亞硒酸鈉、人轉(zhuǎn)鐵因子、層粘蛋白、纖維連接蛋白和類似物及其組合物。優(yōu)選地，用于培養(yǎng)任一階段邊緣細胞的生長促進劑是人重組體來源的。在移植、植入或被移植前，加富培養(yǎng)基也可以用于組織系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。
在其它的優(yōu)選實施例中，用于制備組織系統(tǒng)的培養(yǎng)基包括用于轉(zhuǎn)移角膜緣活檢組織的培養(yǎng)基、用于培養(yǎng)活檢組織的培養(yǎng)基、用于培養(yǎng)角膜緣干細胞的加富培養(yǎng)基和用于轉(zhuǎn)移組織系統(tǒng)的培養(yǎng)基，不包括動物源的任何血清或其它因子，有利于幫助組織系統(tǒng)污染異種成分的風(fēng)險降到最小，從而人在使用該組織系統(tǒng)時是安全的。
對于那些可應(yīng)用于培養(yǎng)USCs的涉及細胞培養(yǎng)和ES細胞培養(yǎng)的一般技術(shù)，，操作者可以參考標準教科書和綜述，例如E.J.Robertson，″畸胎癌和胚胎干細胞一種實用的方法″，ed.，IRL Press Ltd.1987；Hu和Aunins(1997)，Curr.Opin.Biotechnol.8148-153；Kitano(1991)，Biotechnology1773-106；Spier(1991)，Curr.Opin.Biotechnol.2375-79；Birch和Arathoon(1990)，Bioprocess Technol.10251-70；Xu et al.(2001)，Nat.Biotechnol.19(10)971-4；和Lebkowski et al.(2001)Cancer J.7 Suppl.2S83-93，每一篇在此都可作為參考。
包含USCs的邊緣細胞在合適的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)或傳代使USCs保持本質(zhì)上的未分化狀態(tài)。雖然群落中USCs群體會與鄰近分化的細胞相鄰，然而USCs培養(yǎng)物在群落是在合適的條件下培養(yǎng)或傳代時，可以保持本質(zhì)上未分化，并且每一個USCs構(gòu)成細胞群主要的比例。本質(zhì)上未分化的未分化干細胞培養(yǎng)物包含至少大約20％的未分化USCs，和包含至少大約40％、60％、80％或90％的USCs。例如當(dāng)經(jīng)常更換培養(yǎng)基時，培養(yǎng)物中的USCs必須保持合適的細胞密度和亞培養(yǎng)，防止它們分化。在長期培養(yǎng)時，當(dāng)細胞傳代時，它們會分散成小的xibaotuan或單細胞懸液。典型地，當(dāng)細胞的單細胞懸液獲得后將它們接種到另一個細胞培養(yǎng)級別的培養(yǎng)皿中。
培養(yǎng)物可以被系列傳代，至少為20、40、60、80、100或更多代，而USCs沒有本質(zhì)上的分化。包含USCs的邊緣細胞培養(yǎng)物可以被冷凍保存，在不同的時間點被進一步使用而不丟失分化潛能，優(yōu)選在包括來自人臍帶血的10-90％熱滅活血清和5-10％的DMSO的的冷凍培養(yǎng)基中保存。包含USCs的邊緣細胞培養(yǎng)物優(yōu)選地在每次傳代后被保存，例如通過冷凍保存，以便從一個單一角膜緣活檢組織產(chǎn)生更多或加倍的組織系統(tǒng)。這些冷凍保存的培養(yǎng)物也可以作為未分化、具有自我再生能力和具有活性的角膜緣干細胞的來源，用于在將來任何一個給定的時間點進行使用。角膜緣干細胞例如這些冷凍保存培養(yǎng)物可以用于產(chǎn)生額外的組織系統(tǒng)，以防由于免疫抑制、之前的手術(shù)并發(fā)癥、感染等等，導(dǎo)致受者的組織系統(tǒng)失敗進行自體使用。這些冷凍保存培養(yǎng)物還可以為生物相容病人產(chǎn)生額外的組織系統(tǒng)。這些冷凍保存培養(yǎng)物還能避免在組織系統(tǒng)失敗時，從供者要移走更多的組織系統(tǒng)的需要，從而防止將來自體角膜緣干細胞來源枯竭的風(fēng)險。
在此公開的組織系統(tǒng)中的細胞可以通過篩選某些干細胞特異標記物的表達篩選到USCs，諸如SSEA-4、SSEA-3、OCT-4、Nanog、TDGF、UTX-1、FGF-4、Tra-1-60、Tra-1-81、干細胞因子(SCF)、Sox2、Rex1和未分化細胞的其它基因標記或它們的組合物。這些干細胞特異標記物的陽性表達，尤其是ES細胞特異標記的表達，表明組織系統(tǒng)含有USCs，并出ES樣細胞的特性和特點。組織系統(tǒng)的細胞也有角化細胞的特點，例如篩選到顯示組織系統(tǒng)的細胞具有角膜特性的特異標記的表達，諸如p63、K3、K12、K19等等，或它們的組合物。可以分析組織系統(tǒng)的形態(tài)和表現(xiàn)型，例如用免疫熒光或免疫過氧化物酶分析。從本發(fā)明的組織系統(tǒng)還可以篩選到其它的標記來確定分化水平，如有的話，對于利用組織系統(tǒng)修復(fù)眼損傷而進行成功的移植、植入或被移植的是必要的。
本發(fā)明的組織系統(tǒng)在產(chǎn)生后，必須轉(zhuǎn)移到受者部位進行移植、植入或被移植。優(yōu)選地，用于轉(zhuǎn)移組織系統(tǒng)的方法能夠保持組織系統(tǒng)足夠的活性使其在轉(zhuǎn)移后仍然可以被用作移植物、植入物或被移植物。在一個優(yōu)選實施例中，組織系統(tǒng)是在含有轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的特殊設(shè)計的容器中進行轉(zhuǎn)移的，優(yōu)選培養(yǎng)基是用于培養(yǎng)包含USCs的組織系統(tǒng)的加富培養(yǎng)基。特殊設(shè)計的轉(zhuǎn)移容器優(yōu)選地包括一個便攜式的、圓柱狀的箱體，上端開口接受組織系統(tǒng)，下端封閉。在箱體的上端安裝有平行結(jié)構(gòu)，使組織系統(tǒng)固定在培養(yǎng)基插入物上，有一個蓋子用于關(guān)閉箱體的開口端?？梢杂锰厥饧毎囵B(yǎng)級塑料-1、醫(yī)用級的不銹鋼，例如SS 316 L或其它任何合適的級別、醫(yī)用級別的硅樹脂或其它任何合適的細胞培養(yǎng)級別的材料制作轉(zhuǎn)移容器。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移容器以一個安全的方式容納組織系統(tǒng)，從而使組織系統(tǒng)在轉(zhuǎn)移中受到的損害的機會最小。
本發(fā)明的包含USCs的組織系統(tǒng)可應(yīng)用于治療中，例如作為移植物、植入物或被移植物用于單眼或雙眼角膜緣干細胞缺乏癥的治療對象。本發(fā)明的組織系統(tǒng)可以用于任何需要治療的治療對象，包括但不局限于人、靈長類和家庭的、農(nóng)場、寵物或體育用動物，諸如狗、馬、貓、羊、豬、牛、大鼠、小鼠等等。在此，術(shù)語″可治療″、″治療″、″處理″、″去處理″或″醫(yī)治″是指治療處理措施和預(yù)防性或預(yù)防方法。治療包括但不局限于減輕或去除特殊疾病、疾患、損傷或紊亂的癥狀，或減慢或削弱病情惡化，或治愈已有的疾病或紊亂。對需要這樣治療的治療對象，要用有效治療用量的組織系統(tǒng)來恢復(fù)或重新產(chǎn)生功能。在此，組織系統(tǒng)的″有效治療用量″是指足以用來獲得或改善角膜緣干細胞缺失、損傷、障礙或惡化的治療對象角膜緣干細胞生理效果的用量。所使用的細胞或組織的有效治療用量依賴于治療對象的需要、年齡、生理條件和健康狀況，以及所需要的治療效果、所要治療的組織面積的大小、植入部位、病狀程度、選擇的遞送途徑和治療策略。這些組織系統(tǒng)優(yōu)選地以使它們被移植到所需部位并且重組或再生功能缺失區(qū)域的方式，施用給病人。
在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的組織系統(tǒng)用于治療眼損傷或眼疾病尤其是眼表受損的對象?；蛘撸_的組織系統(tǒng)可以用于治療其它的將受益于來自角膜緣組織的未分化干細胞的疾病或損傷，角膜緣組織例如修復(fù)皮膚的燒傷部位。所公開的組織系統(tǒng)尤其適合治療主要是角膜緣干細胞缺乏的對象，此癥狀可能由遺傳因素引起，諸如先天性無虹膜癥、多發(fā)性內(nèi)分泌缺乏相關(guān)性角膜炎、limbitis、原發(fā)癥，或次級角膜緣干細胞缺失，可由獲得性條件引起角膜緣干細胞，諸如Steven-Johnson綜合癥、感染(如嚴重的細菌角膜炎)、眼表腫瘤、化學(xué)藥品或熱損傷或暴露于紫外線照射、多次外科手術(shù)或冷凍療法引起的角膜緣干細胞的創(chuàng)傷性破壞、角膜內(nèi)上皮腫瘤，外圍潰瘍或炎癥性角膜炎、缺血性角膜炎、角膜病變、角膜接觸鏡或鏡片清洗液引起的毒性效果、免疫病癥、眼斑痕類天皰瘡、翼狀胬肉、假翼狀胬肉，等等。優(yōu)選地，組織系統(tǒng)是移植、植入或被移植給治療對象，并且能夠修復(fù)治療對象眼損傷或眼疾病，優(yōu)選地，給治療對象的損傷或患眼提供穩(wěn)定的角膜緣干細胞群落。在優(yōu)選實施例中，組織系統(tǒng)的移植、植入或被移植促進上皮形成，保持正常上皮形態(tài)、減少炎癥、減少疤痕、減少組織粘連、減少脈管形成和提高眼睛視力。
例如，可以移植、植入或被移植組織系統(tǒng)來修復(fù)損傷的角膜。許多這樣的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。其中有一種方法為角膜緣環(huán)狀切開術(shù)，隨后去除裸露鞏膜的周邊結(jié)膜下疤痕和發(fā)炎的組織。角膜的纖維血管組織可以用板層角膜切除術(shù)去除。組織系統(tǒng)可以根據(jù)受者眼睛大小按比例調(diào)整，然后移植或被移植給相應(yīng)受者角膜緣區(qū)域?；蛘撸M織系統(tǒng)全部作為板層角膜組織來使用，作為板層角膜移植來移植或被移植而覆蓋整個區(qū)域。然后用縫合或任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法，將移植、植入或被移植的組織系統(tǒng)施用到損傷部位。
以下舉例為本發(fā)明的優(yōu)選實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識到，在按照發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的技術(shù)實施的實例中公開的技術(shù)，在本發(fā)明的實際應(yīng)用中有很好的功能，因此可以作為實際應(yīng)用中的優(yōu)選模式。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白在不脫離本發(fā)明的實質(zhì)精神和范圍的情況下，在本發(fā)明的啟發(fā)下，可以改變一些本發(fā)明中的特異實施例，取得相同或相似的結(jié)果。
實施例1 1)收集角膜緣活檢組織 在開始收集病人的角膜緣活檢組織前，首先要征得審查委員會的同意。并要獲得每位病人和供者的同意，根據(jù)Helsinki協(xié)定對所有的人治療對象進行治療。用板層角膜切除術(shù)從供者眼角膜表面上顳象限手術(shù)移取0.8mm2至2mm2的角膜緣組織的活檢組織。這些區(qū)域尤其富含角膜緣干細胞。切除后的活檢組織立即放進2ml的裝滿轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移小瓶中。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基由Dulbecco′s Modified Eagles培養(yǎng)基(DMEM)和Ham′s F-12培養(yǎng)基(DMEM∶F-12；1∶1)組成，添加了5％的胎牛血清(FBS)或5％的人臍帶血血清、0.5％二甲基亞砜(DMSO)、2ng/ml重組人表皮生長因子(rhEGF)、5μg/ml胰島素、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵因子、5μg/ml亞硒酸鈉、0.5μg/ml氫化可的松、0.1nmol/L霍亂毒素A、50μg/ml慶大霉素和1.25μg/ml兩性霉素B。血樣也從每個供者收集血樣并與每個角膜緣活檢組織一起轉(zhuǎn)移到中心cGMP設(shè)施中。血樣立即用于傳染性疾病的檢測，包括乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、梅毒和CMV。
2)培養(yǎng)角膜緣活檢組織產(chǎn)生角膜緣干細胞培養(yǎng)物 來自角膜緣活檢組織的角膜緣組織先用榮格(ringer)溶液(含青霉素、鏈霉素和慶大霉素的PBS)洗幾次然后切成小片。將這些角膜緣組織的小片進行干培養(yǎng)2-5分鐘然后以圓形方式放在插入物中的生物包被的羊膜上。將少量含10％knock-out血清(150-200μl)的DMEM培養(yǎng)基加到每個培養(yǎng)皿中，促使活檢組織小片粘附到生物包被的細胞培養(yǎng)物上。第二天，將2ml同樣的培養(yǎng)基加到培養(yǎng)皿中，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)4-5天。4-5天后，培養(yǎng)的角膜緣干細胞開始增殖。此時，用無菌鑷子輕輕、仔細地將活檢組織從培養(yǎng)基中移出，使培養(yǎng)基中剩余的角膜緣干細胞繼續(xù)增殖。該方法避免培養(yǎng)過程中，間葉細胞或纖維原細胞的生長。允許角膜緣干細胞長到大約80％融合，典型的是在培養(yǎng)后7至21天。
3)從培養(yǎng)的角膜緣干細胞中分離未分化干細胞以及組織系統(tǒng)的產(chǎn)生 當(dāng)角膜緣細胞培養(yǎng)達到需要的融合水平后，用磁親和細胞分選(MACS)方法對培養(yǎng)細胞分選，將未分化的多能角膜緣干細胞分離出來。先用0.05％胰酶-EDTA分散培養(yǎng)細胞。加入等量含有胰酶抑制劑或胎牛血清的培養(yǎng)基來中和胰酶。隨之用移液管將細胞制成單細胞懸液，并用血球計計數(shù)。然后，離心細胞，重懸為每200μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中含有107個細胞的濃度。細胞在4℃下，與1μl初級抗體SSEA-4(1∶60，Chemicon)培養(yǎng)一同培養(yǎng)30分鐘。在與SSEA-4初級抗體一同培養(yǎng)后，細胞用PBS清洗兩次去除未結(jié)合抗體。向200μl的細胞懸液中加入20μl與SSEA-4初級抗體結(jié)合的山羊抗小鼠異硫酸酯熒光素(FITC)-結(jié)合的次級抗體的珠子懸液(1∶10，Miltenyi Biotec)，充分混合，在4℃培養(yǎng)培養(yǎng)20分鐘。細胞用PBS清洗3遍去除任何未結(jié)合的次級抗體。
根據(jù)廠商(Miltenyi Biotec)的使用說明，將細胞懸液通過MACS磁選柱分離SSEA-4陽性細胞。先收集陰性產(chǎn)物，柱用PBS洗兩遍。然后從磁力架上取下柱，就可收集含有SSEA-4SSEA-4陽性細胞的陽性產(chǎn)物。
4)用羊膜制備組織系統(tǒng)的組織基底 雖然有幾種合適的細胞外基質(zhì)載體可以作為培養(yǎng)角膜緣干細胞的組織基底，諸如MatrigelTM、纖維蛋白原、PDGF、層粘蛋白、EGF或膠原質(zhì)V，但是用人羊膜來培養(yǎng)角膜緣干細胞。羊膜培養(yǎng)物制備先從收集人胎盤膜開始。任意從剖腹產(chǎn)手術(shù)收集胎盤膜并在轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移到實驗室，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基由添加50單位/ml青霉素、50單位/ml鏈霉素、100μg/ml新霉素和2.5μg/ml兩性霉素B的Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(DPBS)組成。胎盤膜在手術(shù)后3小時內(nèi)轉(zhuǎn)移到實驗室。血樣也從每個供者收集并用上面描述的方法進行傳染性疾病診斷試驗。
一旦得到胎盤，用洗滌培養(yǎng)基洗去上面的粘液和血凝塊。洗滌培養(yǎng)基由DPBS組成，添加了50單位/ml青霉素、50單位/ml鏈霉素、100μg/ml新霉素和2.5μg/ml兩性霉素B。用無菌剪刀將胎盤組織從羊膜上除掉，將羊膜至少徹底洗7次去除所有血凝塊。然后，用鈍性鑷子剝除羊膜的漿膜，羊膜上皮一側(cè)用洗滌培養(yǎng)基洗5次。然后將羊膜上皮一側(cè)朝上地放在無菌的硝化纖維膜上。將羊膜切成5cm×5cm面積的小片，每個小片放進裝滿冷凍培養(yǎng)基的冷凍小瓶中，冷凍培養(yǎng)基由含50％甘油的DMEM組成。在使用前，每一批次加工的羊膜進行無菌、無支原體或內(nèi)毒素污染的檢查。每個批次的羊膜小片在-80℃保存。
在用這些羊膜小片制備用于培養(yǎng)角膜緣干細胞的羊膜培養(yǎng)物時，先將它們在室溫下融化20分鐘。然后用鈍性鑷子從硝化纖維膜上將每個羊膜移出，優(yōu)選地，不要撕壞表面，放在100mm培養(yǎng)皿中的無菌玻璃載片上。然后加入少量0.25％胰酶(1.0-1.5ml)覆蓋羊膜，并在37℃培養(yǎng)培養(yǎng)30分鐘。在培養(yǎng)培養(yǎng)后，用細胞刮刀在無菌條件下刮下羊膜的上皮層。用洗滌溶液沖洗羊膜3次。經(jīng)過加工處理的羊膜，行使培養(yǎng)物細胞外載體基質(zhì)或組織基底的功能，被放在含有0.4μM徑跡蝕刻對苯二酸聚乙烯(PET)膜插入物(Millipore)的培養(yǎng)板上。用10號Ethilon非吸收縫合或用醫(yī)用級硅O形環(huán)將羊膜被固定在PET插入物上。
不論何種方法，羊膜應(yīng)該平展在膜插入物上，將羊膜裸露的上皮側(cè)對著插入膜的內(nèi)側(cè)而基質(zhì)側(cè)背向膜插入物地插入在將羊膜固定到插入物之前，現(xiàn)將羊膜均一地展開，例如將硅O形環(huán)插到羊膜的底部，或?qū)⒀蚰たp合到插入物的基底膜上。整個結(jié)構(gòu)在裝滿培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)培養(yǎng)至少2小時。之后，去除培養(yǎng)基，將羊膜單獨用層粘蛋白、纖維蛋白原或膠原質(zhì)IV一起預(yù)培養(yǎng)包被或用它們的組合物預(yù)包被。羊膜用培養(yǎng)基清洗兩次，并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)又培養(yǎng)30分鐘，然后羊膜作培養(yǎng)角膜緣干細胞備用。
5)培養(yǎng)分離的包含USCs的角膜緣干細胞和產(chǎn)生組織系統(tǒng)。
包含USCs的SSEA-4陽性細胞洗兩次后，接種到培養(yǎng)基中的人羊膜的組織基底上。在加富培養(yǎng)基中，用層粘蛋白生物包被羊膜促進USCs粘附到羊膜。優(yōu)選地，培養(yǎng)基是DMEM和F-12(DMEM∶F-12；1∶1)，用來自2天的滅活人胚胎纖維原細胞的30％調(diào)整培養(yǎng)基進行加富。進一步優(yōu)選地，培養(yǎng)基添加10％knock-out血清或10％熱滅活人臍帶血的血清、DMSO(0.5％)、rhEGF(2ng/ml)、胰島素(5μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵因子(5μg/ml)、亞硒酸鈉(5μg/ml)、氫化可的松(0.5μg/ml)、慶大霉素(50μg/ml)和兩性霉素B(1.25μg/ml)。在37℃的CO2培養(yǎng)箱中，在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)USCs10-15天，直到獲得帶有大量USCs群落的復(fù)層組織系統(tǒng)。圖1顯示在中止培養(yǎng)時，用蘇木精和曙紅(H&E)染色的人羊膜上的復(fù)層組織系統(tǒng)。蘇木精將帶負電的核酸諸如細胞核和核糖體染成藍色，而曙紅將蛋白質(zhì)染成粉色。10-15天后，培養(yǎng)的組織系統(tǒng)作移植備用。
或者，細胞懸液按以前所述通過MACS磁選柱分離SSEA-4陽性細胞后，將細胞接種到含有培養(yǎng)基的MatrigelTM-包被的培養(yǎng)皿中。該培養(yǎng)基是DMEM和F-12(DMEM∶F-12；1∶1)，添加了10％knock-out血清或10％熱滅活人臍帶血的血清、DMSO(0.5％)、rhEGF(2ng/ml)、胰島素(5μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵因子(5μg/ml)、亞硒酸鈉(5μg/ml)、氫化可的松(0.5μg/ml)、bFGF(4ηg/ml)、hLIF(10ηg/ml)、慶大霉素(50μg/ml)和兩性霉素B(1.25μg/ml)。分離的細胞在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-10天或直到獲得含有大量USCs群落的復(fù)層組織系統(tǒng)。組織系統(tǒng)作移植備用。
當(dāng)分選和分離的細胞在培養(yǎng)基中融合后，一些USCs培養(yǎng)物解離并且按1∶3的比例重新接種到新鮮生物包被的細胞培養(yǎng)皿中。然后USCs生長并連續(xù)傳代，經(jīng)過至少40群體倍增次數(shù)或大約13代。
實施例2 包含未分化干細胞的組織系統(tǒng)的分析和特性 如實施例1所總結(jié)，包含USCs的組織系統(tǒng)來自角膜緣活檢組織。為更好地了解來自角膜緣組織的組織系統(tǒng)的細胞群落，用流式細胞術(shù)、免疫熒光和免疫過氧化物酶分析，和確定未分化細胞各種細胞標記的存在與否的分子分析方法，分析組織系統(tǒng)中的細胞。
1)流式細胞術(shù)分析 用流式細胞術(shù)將角膜緣活檢組織培養(yǎng)物的細胞群落和在組織系統(tǒng)中的細胞群落進行比較分析以檢測SSEA-4標記物。首先，在用前述的MACS分選方法選擇細胞后，收集半融合期角膜緣活檢組織培養(yǎng)物的細胞和生長在羊膜組織基底的組織系統(tǒng)的細胞。對兩個細胞群落分別進行分析。收集的細胞群落置于無菌的PBS中并且重懸成細胞懸液。然后，100μl等分試樣的細胞用0.2％Triton X-100滲透測定核抗原。將細胞分成三組。第一組細胞作為對照不用抗體標記。第二組細胞在4℃與SSEA-4初級抗體(Chemicon，1∶60)一起培養(yǎng)培養(yǎng)20分鐘。第三組不與SSEA-4初級抗體培養(yǎng)一起培養(yǎng)。然后第二組和第三組細胞用PBS清洗并且與抗小鼠FITC-結(jié)合次級抗體(Sigma，1∶500)一起在黑暗條件下培養(yǎng)培養(yǎng)20分鐘。
在與次級抗體培養(yǎng)一起培養(yǎng)后，所有三個組的細胞用PBS清洗，并重懸于400-500μI的PBS中，放進FACS Calibur流式細胞儀(Becton-Dickinson)中。用光散射鑒定細胞，基于10,000道，以用于調(diào)節(jié)背景熒光的對照樣品作對照，確定對數(shù)熒光的數(shù)值。使用CELL QUEST軟件(Becton Dickinson)進行分析。流式細胞分析角膜緣活檢組織細胞的結(jié)果如圖2所示，而圖3表示對組織系統(tǒng)中包含USCs的細胞進行相同的分析。圖2表示只有大約30％的培養(yǎng)的角膜緣活檢組織細胞是SSEA-4陽性細胞。相反，圖3顯示的組織系統(tǒng)中的SSEA-4陽性細胞群落增加到74％，表明組織系統(tǒng)中存在高百分比的USCs。
2)免疫熒光和免疫過氧化物酶分析 用免疫熒光和免疫過氧化物酶分析對組織系統(tǒng)的形態(tài)和表現(xiàn)型進行分析。首先，用PBS沖洗去石蠟部分的組織系統(tǒng)，用PBS中的0.2％ triton X-100滲透，用1％的牛血清白蛋白/PBS封閉，在室溫下用以下初級抗體(用1％BSA/PBS稀釋抗體)培養(yǎng)2小時SSEA-4(1∶60，Chemicon)、干細胞因子(1∶250，Santacruz)、Tra-1-60(1∶40，Chemicon)、Oct-4(1∶100，Chemicon)、Connexin43(1∶200，Chemicon)、p63(1∶150，USBiologicals)、K3/K12(1∶200，ICN)和K19(1∶100，Cymbus Biotechnology)培養(yǎng)。然后該部分用FITC-標記的次級抗體在室溫下培養(yǎng)1小時(Sigma)。之后，將該部分置放在免疫熒光固定培養(yǎng)基中，用熒光顯微鏡(Nikon)照相。按照Vector Elite試劑盒的廠商的實驗方案進行免疫過氧化物酶分析。用于免疫過氧化物酶分析的染料是二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽。
復(fù)層組織系統(tǒng)中該部分的免疫熒光和免疫過氧化物酶分析表明，有大約30-70％的SSEA-4陽性細胞(圖4)、大約25-45％的SCF陽性細胞(圖5)、大約30-40％的Tra-1-60陽性細胞(圖6)、大約45-55％的Oct-4陽性細胞(圖7)和大約50-70％的p63陽性細胞(圖8)。在組織系統(tǒng)中也檢測到K3/K12陽性(圖9)，和K19的基底層表達(圖10)。該組織系統(tǒng)部分的分析也表明不存在connexin43(圖11)。該組織系統(tǒng)部分中干細胞特異表面標記的存在確定了組織系統(tǒng)中具有自我再生能力USCs的存在。其它的標記，如K3/K12、K19和p63，表明了組織系統(tǒng)中角膜緣干細胞的角膜特征，對于成功使用組織系統(tǒng)進行眼修復(fù)是十分重要的。
3)分子分析 為進一步表明組織系統(tǒng)中USCs的特征，用RT-PCR對細胞表達以下未分化干細胞標記基因進行分析Oct-4、Nanog、Rex1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白5(BMP5)。分化時，Oct-4、Nanog和Rex1的表達被下調(diào)。BMPs的表達表明了細胞是外胚層起源。在所有細胞中無處不在的″看家″基因GAPDH的表達，也被作為陽性對照被分析。用測序確認RT-PCR產(chǎn)物。
簡要地說，用TRIzol方法(Gibco-BRL)對從實施例1產(chǎn)生的組織系統(tǒng)中分離的細胞總RNA進行分離。用RNase-OUT核糖核酸酶抑制劑(InvitrogenInc，USA)處理的1μg總RNA使用小鼠莫洛尼氏白血病毒Superscript II和oligo dT(Invitrogen Inc，USA)的引導(dǎo)反應(yīng)，通過反轉(zhuǎn)錄進行cDNA合成。在每個聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)中，使用Abgene 2X PCR master mix和合適的引物，通過PCR將20μl的cDNA擴增。用對不同外顯子特異的單個引物，選擇能夠區(qū)分cDNA和基因組DNA的PCR。用于擴增Oct-4、Nanog、Rex1、BMP2、BMP5和GAPDH cDNAs(Genosys)的引物列在下面表1中。用于熱循環(huán)(ABIBiosystems 9700)擴增PCR產(chǎn)物的擴增條件是94℃ 30秒；退火溫度Tm℃(52-65℃)1分鐘和72℃ 1分鐘，進行30-35循環(huán)。
表1
該實驗結(jié)果如圖12所示，所有檢測的基因都表達了。Oct-4、Nanog和Rex1標記物的表達表明了組織系統(tǒng)中的USCs是未分化的。
實施例3 含未分化干細胞組織系統(tǒng)的活性研究 在對含有USCs、具有活性的組織系統(tǒng)進行體外培養(yǎng)之前，對角膜緣活檢組織進行評估，確定活檢組織在轉(zhuǎn)移中保持多長時間。手術(shù)后在4℃下，角膜緣活檢組織在以下培養(yǎng)基中被轉(zhuǎn)移或保存12、24、48和72小時DMEM和Ham′s F-12(比例1∶1)，添加了人臍帶血血清(3-5％)、DMSO(0.5％)、rhEGF(2ng/ml)、胰島素(5μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵因子(5μg/ml)、亞硒酸鈉(5μg/ml)、氫化可的松(0.5μg/ml)、霍亂毒素A(0.1nmol/l)、慶大霉素(50μg/ml)和兩性霉素B(1.25μg/ml)。在這段時間后，培養(yǎng)活檢組織產(chǎn)生如實施例1描述的含有USCs的組織系統(tǒng)。圖13表示，在從治療對象手術(shù)收集活檢組織并開始培養(yǎng)組織系統(tǒng)起大約12、24、48和72小時成功的百分比。如圖13所示，外植體優(yōu)選地在收集活檢組織大約24小時內(nèi)進行培養(yǎng)，用活檢組織產(chǎn)生組織系統(tǒng)取得最大成功大約在12小時之內(nèi)。但是活檢組在手術(shù)收集后直到大約72小時仍然保持有顯著的產(chǎn)生組織系統(tǒng)的能力。
對實施例1中產(chǎn)生的組織系統(tǒng)在轉(zhuǎn)移過程中的活力進行評價，確定培養(yǎng)的組織系統(tǒng)作為組織移植物在從培養(yǎng)物中取出后多長時間內(nèi)保持活性。將組織系統(tǒng)放在包含轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的特殊設(shè)計的容器中，在室溫或4℃下進行轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基由DMEM和F-12(DMEM∶F-12；1∶1)組成，用30％的來自2天滅活人胚胎纖維原細胞的調(diào)整培養(yǎng)基加富，進一步添加10％knock-out血清或10％熱滅活人臍帶血的血清、DMSO(0.5％)、rhEGF(2ng/ml)、胰島素(5μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵因子(5μg/ml)、亞硒酸鈉(5μg/ml)、氫化可的松(0.5μg/ml)、慶大霉素(50μg/ml)和兩性霉素B(1.25μg/ml)。間隔6、12、24和48小時測定組織系統(tǒng)的活性。用以下參數(shù)分析轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中組織系統(tǒng)的活性，諸如培養(yǎng)基的pH、細胞活性、死細胞的百分比和組織系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的完整性(例如通過平片估算)。
圖14表示在不同時期后培養(yǎng)組織系統(tǒng)的活性由轉(zhuǎn)移組織系統(tǒng)時的溫度而定。在4℃下轉(zhuǎn)移組織系統(tǒng)的結(jié)果比在室溫下轉(zhuǎn)移的結(jié)果稍好，在頭12小時轉(zhuǎn)移保持出色的活性，48小時后仍保持良好的活性。
本發(fā)明公開的和主張的所有組合物和方法，按照本發(fā)明，都可以實施，沒有不適當(dāng)?shù)膶嶒?。根?jù)優(yōu)選實施例，本發(fā)明的內(nèi)容和方法已經(jīng)公開，很明顯，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，對本發(fā)明的內(nèi)容和/或方法和方法中的步驟或步驟順序所做的更動都不脫離本發(fā)明的實質(zhì)精神和范圍的情況。尤其是，某些化學(xué)或生理相關(guān)的試劑可以代替公開的試劑并取得相同或相似的結(jié)果是顯而易見的。而本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚所有這樣相似的替代物和更動都在本發(fā)明的實質(zhì)精神和范圍內(nèi)，如所附權(quán)利要求所限定。
序列表<110>Totey，Satish M.
Kashyap，subhadra D.
<120>來自角膜緣的未分化干細胞組織系統(tǒng)<130>REL494/4-005US/71000<140>TO BE ASSIGNED<141>2005-01-25<150>74/MUM/04<151>2004-01-27<160>12<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt 26<210>2<211>24<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2catgtgggcc atgaggtcca ccac 24<210>3<211>25<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3
cgrgaagctg gagaaggaga agctg25<210>4<211>25<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4caagggccgc agcttacaca tgttc25<210>5<211>25<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5cctcctccat ggatctgctt attca25<210>6<211>26<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6caggtcttca cctgtttgta gctgag 26<210>7<211>23<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23<210>8<211>25
<212>DNA<213>Homo sapiens<400>8cagcatccta aacagctcgc agaat25<210>9<211>21<212>DNA<213>Homo sapiens<400>9ggaagaacta ccagaaacgc g21<210>10<211>21<212>DNA<213>Homo sapiens<400>10agatgatcag ccagaggaaa a21<210>11<211>26<212>DNA<213>Homo sapiens<400>11aagaggacaa gaaggactaa aaatat 26<210>12<211>25<212>DNA<213>Homo sapiens<400>12gtagagatcc agcataaaga gaggt2權(quán)利要求
1.一種包含角膜緣干細胞的組織系統(tǒng)，其中在組織系統(tǒng)中至少大約30-90％的角膜緣干細胞是未分化干細胞。
2.權(quán)利要求1的組織系統(tǒng)，其中未分化干細胞表達選自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex-1、干細胞因子、Tra-1-60、CD73、CD105、CD31、CD54和CD117組成的組中的一個或多個干細胞特異標記。
3.權(quán)利要求1的組織系統(tǒng)，其中未分化干細胞表達SSEA-4。
4.權(quán)利要求3的組織系統(tǒng)，其中表達SSEA-4的未分化干細胞在組織系統(tǒng)中至少包含大約50-90％的角膜緣干細胞。
5.權(quán)利要求1的組織系統(tǒng)，其中角膜緣干細胞表達選自K3/K12、K19和p63組成的組中的一個或多個細胞表面標記。
6.權(quán)利要求1的組織系統(tǒng)，其中組織系統(tǒng)是來自角膜鞏膜緣組織。
7.權(quán)利要求6的組織系統(tǒng)，其中角膜鞏膜緣組織是人組織。
8.權(quán)利要求1的組織系統(tǒng)，其中組織系統(tǒng)是復(fù)層組織系統(tǒng)。
9.權(quán)利要求1的組織系統(tǒng)，其中組織系統(tǒng)適合移植、植入或被移植給受者。
10.一種產(chǎn)生組織系統(tǒng)的方法，其中組織系統(tǒng)包含角膜緣干細胞，該方法包括以下步驟(a)從供者分離角膜緣組織；(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)角膜緣組織使之?dāng)U增為角膜緣細胞；(c)通過分選角膜緣細胞將角膜緣干細胞群落從培養(yǎng)的角膜緣細胞中分離出來，從而選擇一個或多個干細胞特異表面標記，其中干細胞特異表面標記是由未分化干細胞表達的；(d)培養(yǎng)分離的角膜緣干細胞群落產(chǎn)生組織系統(tǒng)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中角膜緣干細胞包括未分化干細胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中未分化干細胞在組織系統(tǒng)中至少包含大約70％的角膜緣干細胞。
13.權(quán)利要求11的方法，其中未分化干細胞表達選自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex-1、干細胞因子、Tra-1-60、CD73、CD105、CD31、CD54、CD117組成的組中的一個或多個干細胞特異標記。
14.權(quán)利要求13的方法，其中未分化干細胞表達SSEA-4。
15.權(quán)利要求14的方法，其中表達SSEA-4的未分化干細胞在組織系統(tǒng)中至少包含大約50-90％的角膜緣干細胞。
16.權(quán)利要求10的方法，其中未分化干細胞表達選自K3/K12、K19和p63組成的組中的一個或多個細胞表面標記。
17.權(quán)利要求10的方法，其中角膜緣組織是從人供者分離的。
18.權(quán)利要求10的方法，其中組織系統(tǒng)適合移植、植入或被移植給受者。
19.權(quán)利要求18的方法，其中受者的單眼或雙眼缺乏角膜緣干細胞。
20.權(quán)利要求18的方法，其中供者和受者為相同個體。
21.權(quán)利要求18的方法，其中供者與受者是生物相容的。
22.權(quán)利要求10的方法，其中角膜緣組織在生物包被的表面或細胞外基質(zhì)載體上進行培養(yǎng)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中生物包被的表面是生物包被的培養(yǎng)皿。
24.權(quán)利要求23的方法，其中培養(yǎng)皿是用一個或多個附著因子進行生物包被，該附著因子選自纖維蛋白原、層粘蛋白、膠原質(zhì)IV、固生蛋白、纖維連接蛋白、膠原質(zhì)、牛垂體提取物、EGF、肝細胞生長因子、角化細胞生長因子和氫化可的松組成的組。
25.權(quán)利要求22的方法，其中細胞外基質(zhì)選自MatrigelTM、哺乳動物羊膜、層粘蛋白、RelisealTM、凝血酶、固生蛋白、巢蛋白、透明質(zhì)酸、纖維蛋白原、膠原質(zhì)-IV、多聚-L-賴氨酸、明膠、多聚-L-鳥氨酸、纖維連接蛋白和血小板源性生長因子(PDGF)組成的組。
26.權(quán)利要求22的方法，其中細胞外基質(zhì)是人羊膜。
27.權(quán)利要求22的方法，其進一步包括在分離角膜緣干細胞之前分離培養(yǎng)的角膜緣細胞的步驟。
28.權(quán)利要求10的方法，其中角膜緣組織是在添加了選自二甲基亞砜、重組人表皮生長因子、胰島素、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵因子、氫化可的松、堿性成纖維細胞生長因子和白血病抑制因子組成的組中的一種或多種可溶性因子的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
29.權(quán)利要求10的方法，其中角膜緣細胞用磁親和細胞分選(MACS)法進行分選。
30.權(quán)利要求10的方法，其中角膜緣細胞是用熒光激活細胞分選法(FACS)進行分選。
31.權(quán)利要求10的方法，其中用于分離角膜緣細胞的一個或多個干細胞特異表面標記選自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex-1、干細胞因子、Tra-1-60、CD73、CD105、CD31、CD54和CD117組成的組。
32.權(quán)利要求10的方法，其中用于分離角膜緣細胞的干細胞特異表面標記是SSEA-4。
33.權(quán)利要求10的方法，其中分離的角膜緣干細胞群落在組織基底上進行培養(yǎng)產(chǎn)生組織系統(tǒng)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中組織基底包括生物包被的支持物。
35.權(quán)利要求34的方法，其中生物包被的支持物是選自纖維蛋白原、層粘蛋白、膠原質(zhì)IV、固生蛋白、纖維連接蛋白、膠原質(zhì)、牛垂體提取物、EGF、肝細胞生長因子、角化細胞生長因子和氫化可的松組成的組中的一個或多個附著因子。
36.權(quán)利要求33的方法，其中組織基底選自人羊膜、層粘蛋白、膠原質(zhì)IV、固生蛋白、纖維蛋白原、巢蛋白、透明質(zhì)酸、RelisealTM、凝血酶、MatrigelTM和纖維連接蛋白組成的組。
37.權(quán)利要求33的方法，其中組織基底是人羊膜。
38.權(quán)利要求35的方法，其中人羊膜是由選自層粘蛋白、膠原質(zhì)IV、固生蛋白、纖維蛋白原、巢蛋白、透明質(zhì)酸、RelisealTM、凝血酶、MatrigelTM和纖維連接蛋白組成的組中的一個或多個附著因子進行生物包被。
39.權(quán)利要求10的方法，其中分離的角膜緣干細胞群落在用來自滅活人胚胎纖維原細胞的調(diào)整培養(yǎng)基加富的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
40.權(quán)利要求10的方法，其中分離的角膜緣干細胞群落在用人白血病抑制因子加富的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
41.權(quán)利要求10的方法，其中分離的角膜緣干細胞群落是在添加選自二甲基亞砜、重組人表皮生長因子、胰島素、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵因子和氫化可的松所組成的組中的一種或多種可溶性因子的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
42.權(quán)利要求10的方法，其進一步包括分離的角膜緣干細胞群落的連續(xù)傳代，至少有10、15或20次傳代。
43.權(quán)利要求10的方法，其進一步包括在冷凍培養(yǎng)基中對角膜緣干細胞群落進行冷凍保存。
44.權(quán)利要求43的方法，其中冷凍培養(yǎng)基包含10-90％熱滅活人臍帶血血清和5-10％DMSO的培養(yǎng)基。
45.權(quán)利要求42的方法，其中角膜緣干細胞群落優(yōu)選在每次傳代后進行冷凍保存。
46.權(quán)利要求18的方法，其進一步包括將組織系統(tǒng)在包含轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移容器中轉(zhuǎn)移給受者。
47.權(quán)利要求46的方法，其中轉(zhuǎn)移容器包括一個便攜式的、圓柱狀的箱體，上端開口接受組織系統(tǒng)，下端封閉，在箱體的上端安裝有平行結(jié)構(gòu)用于支撐組織系統(tǒng)，以及一個用于關(guān)閉箱體上端開口的蓋子。
48.權(quán)利要求47的方法，其中轉(zhuǎn)移容器是用特殊組織培養(yǎng)級塑料-1或醫(yī)用級不銹鋼制備的。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種具有自我再生能力的角膜緣干細胞的組織系統(tǒng)，其中角膜緣干細胞主要是未分化干細胞(USCs)。該組織系統(tǒng)來自分離的角膜緣組織，適合修復(fù)眼表損傷，尤其適合角膜緣干細胞缺乏的損傷。組織系統(tǒng)形成是通過選擇性擴增針對USCs的組織系統(tǒng)，例如通過選擇和分選表達干細胞特異表面標記的細胞，如階段性特異胚胎抗原標記物4(SSEA－4)。經(jīng)過分離，將USCs在加富培養(yǎng)基中的組織基底上培養(yǎng)，形成適合于移植、植入或被移植的組織系統(tǒng)。
文檔編號C12N5/02GK101052299SQ200580009947
公開日2007年10月10日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月27日
發(fā)明者薩蒂什·馬哈德奧羅·托泰, 蘇達德勒·德維·卡夏普 申請人:利萊恩斯生命科學(xué)有限公司