專利名稱：：由wrn介導(dǎo)端粒引發(fā)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)的制作方法發(fā)明
背景技術(shù)：
：領(lǐng)域本發(fā)明涉及信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。更具體地說，本發(fā)明涉及端粒引發(fā)的衰老、凋亡、皮膚曬黑(tanning)及其他DNA損傷應(yīng)答的調(diào)節(jié)。相關(guān)技術(shù)描述隨著人口老齡化，發(fā)達(dá)世界中的人類癌癥患病率隨之增高。盡管進(jìn)行了廣泛的研究，近年來對于一些就診時的癌癥類型和疾病期，發(fā)病率和死亡率仍然沒有得到顯著改善。在癌癥進(jìn)展期間，腫瘤細(xì)胞越來越不受負(fù)調(diào)控的控制，包括對于衰老和凋亡的抗性，而衰老和凋亡是如何調(diào)節(jié)正常細(xì)胞與它們的組織特異性環(huán)境的相互作用的重要方面。細(xì)胞衰老已經(jīng)被認(rèn)為是抗癌的一種重要防御手段。廣泛的證據(jù)暗示在衰老過程中端粒漸進(jìn)縮短(由不能復(fù)制染色體3′末端引起)或其它形式的端粒機(jī)能障礙。在生殖系細(xì)胞和大部分癌細(xì)胞中，永生化與由端粒酶作用產(chǎn)生的保持端粒長度相關(guān)，該端粒酶復(fù)合物能夠把TTAGGG重復(fù)片段添加到染色體的3′末端。端粒，即TTAGGG的串聯(lián)重復(fù)序列，其末端是具有大約150-300堿基的3′單鏈突出端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其隱藏在近端端粒雙鏈DNA內(nèi)并由端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(telomericrepeatbindingfactor，TRF)尤其是TRF2所穩(wěn)定。TRF2的顯性-陰性形式(TRF2DN)的異位表達(dá)破壞端粒環(huán)狀結(jié)構(gòu)，暴露3′突出端，引起DNA損傷應(yīng)答，在原代成纖維細(xì)胞、纖維肉瘤細(xì)胞和其它幾種惡性細(xì)胞類型中引起衰老。衰老還可能被廣泛的DNA損傷或某些癌基因的過表達(dá)所劇烈加速。能酶促維持或構(gòu)建端粒長度的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(telomerasereversetranscriptasecatalyticsubunit，TERT)的異位表達(dá)能繞過衰老過程隨后導(dǎo)致一些人類細(xì)胞類型的永生化，強(qiáng)烈提示復(fù)制型衰老的端粒依賴機(jī)制。此外，盡管惡性細(xì)胞經(jīng)常具有比正常衰老細(xì)胞更短的端粒，但通常惡性細(xì)胞表達(dá)TERT和/或含有允許細(xì)胞繞過衰老應(yīng)答并無限增殖的突變。然而，一些腫瘤細(xì)胞應(yīng)答于多種抗癌劑而經(jīng)歷衰老，表明獲得永生化并不必然意味著喪失對于DNA損傷的基本細(xì)胞應(yīng)答。人類細(xì)胞的衰老主要取決于p53和pRb途徑。腫瘤抑制因子p53在細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答機(jī)制中扮演一個重要角色，它能把多種不同刺激例如DNA損傷、轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的失控、癌基因轉(zhuǎn)化和一些化療藥物引起的微管異常轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生長抑制或凋亡。當(dāng)被激活時，p53引起細(xì)胞生長抑制或程序性自殺性細(xì)胞死亡(凋亡)，其依次作為基因組穩(wěn)定性的重要控制機(jī)制。特別地，p53通過從細(xì)胞群體中除去遺傳損傷細(xì)胞來控制基因組穩(wěn)定性，因而它的一個主要功能就是防止腫瘤形成。完整的腫瘤抑制因子pRb途徑也有助于防止腫瘤發(fā)生。在不含有野生型p53的pRb-/-腫瘤細(xì)胞中，導(dǎo)入pRb能誘發(fā)衰老。雖然宮頸癌細(xì)胞常常保留有野生型p53和pRb基因，但是HPVE6和E7蛋白分別干擾了p53和pRb途徑。在宮頸癌細(xì)胞系中病毒E2蛋白的異位表達(dá)能抑制HPVE6和E7的基因轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)迅速顯著的衰老應(yīng)答，再次證實了p53和pRb在癌細(xì)胞衰老中的重要作用。僅僅抑制p53或pRb途徑是不足以讓成纖維細(xì)胞繞過復(fù)制型衰老的。實際上，不論轉(zhuǎn)染了SV40T抗原還是轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒E1A+E1B或者HPVE6+E7組合的人類成纖維細(xì)胞，都能同時抑制p53和pRb途徑，具有延長的生存期并能逃避復(fù)制型衰老。DNA雙鏈斷裂對哺乳動物細(xì)胞是極端的細(xì)胞毒性。在真核生物中高度保守的MRN復(fù)合物參與雙鏈斷裂的修復(fù)。MRN復(fù)合物形成后能立即粘附于雙鏈斷裂位點。在細(xì)胞周期中的S期，MRN復(fù)合物也遷移到端粒處與端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF)結(jié)合。MRN復(fù)合物由Mre11、Rad50和NBS(p95)組成。作為Mre11/p95/Rad50復(fù)合物的一部分，Mre11與細(xì)胞周期S期的端粒結(jié)合。Mre11是一種偏好DNA鏈3′末端的核酸外切酶。人們認(rèn)為Mre11的活性依賴于與Rad50的相互作用，Rad50是一種ATP酶。Nbsl被認(rèn)為參與MRN復(fù)合物的核定位以及其在雙鏈斷裂位點處的裝配。已知在維爾納氏綜合征(Werner’sSyndrome)中的突變蛋白，WRN蛋白，與MRN復(fù)合物相互作用(Chengetal.，2004，vol.2004)。維爾納氏綜合征是一種常染色體隱性疾病，其特征為過早老化、增大的惡性度和基因組不穩(wěn)定性。WRN是一種既含有解旋酶又含有3′到5′核酸外切酶結(jié)構(gòu)域的核蛋白(Oshima，J.，2002，Bioessays22，894-901)。迄今為止，在維爾納氏綜合征中已鑒定出的全部突變都是WRN截短，其能從蛋白的COOH末端除去核定位信號(Oshima，J.，2002)。因此，人們認(rèn)為在維爾納氏綜合征中的WRN突變通過阻止蛋白到達(dá)它的細(xì)胞核作用位點而產(chǎn)生無功能的表型。來自維爾納氏綜合征病人的細(xì)胞無論是在基線水平還是在DNA損傷之后均顯示出缺失和易位水平提高，提示W(wǎng)RN蛋白參與DNA修復(fù)、復(fù)制和重組(Opreskoetal.，2003，Carcinogenesis24，791-802)。比起與其年齡匹配相當(dāng)?shù)膶φ?，維爾納氏綜合征細(xì)胞也過早地衰老(Martinetal.，1970，LabInvest23，86-92)，還表明其加速了端?？s短(Schulzetal.，1996，HumGenet97，750-4)。除了與MRN復(fù)合物相互作用之外，還知道WRN與其它參與DNA損傷應(yīng)答和DNA修復(fù)/復(fù)制的蛋白相互作用，如DNA-PK/Ku(Karmakaretal.，2002，NucleicAcidsRes30，3583-91)、p53(Broshetal.，2001，JBiolChem276，35093-102)和在早衰老化綜合癥(prematureagingsyndrome)、布盧姆綜合征(Bloom’sSyndrome)中突變的解旋酶、BLM(vonKobbeetal.，2002，JBiolChem277，22035-44)。此外，WRN與端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2(TRF2)相互作用，該相互作用改變了對促進(jìn)3′到5′消化端粒DNA的WRN核酸外切酶活性的特異性(Machweetal.，2004，Oncogene23，149-56；Opreskoetal.，2002，JBiolChem277，41110-9)。這些數(shù)據(jù)共同表明了WRN在DNA新陳代謝和端粒保持中的關(guān)鍵作用。然而WRN在這些途徑中的明確作用尚未理解。癌癥典型用高毒性療法進(jìn)行治療，例如化療和放療，這些療法對全部增殖細(xì)胞不論其正常還是惡性都造成同樣的損傷。這些治療的副作用包括了對淋巴系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和腸上皮的嚴(yán)重破壞以及毛發(fā)脫落。一直尋求更安全和更有效的癌癥療法，尤其是那些通過相比于正常增殖細(xì)胞能優(yōu)先靶向于惡性細(xì)胞從而避免某些或全部這種副作用的替代療法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種基于細(xì)胞的篩選WRN調(diào)節(jié)劑的方法，其包含在調(diào)節(jié)劑被細(xì)胞攝取的條件下把候選調(diào)節(jié)劑與表達(dá)WRN的細(xì)胞接觸，以及測定與DNA損傷應(yīng)答途徑激活相關(guān)的細(xì)胞性質(zhì)，該性質(zhì)包括但不限于細(xì)胞增殖、細(xì)胞生存力、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、SA-β-Gal活性及p53或p95的磷酸化、ATM的磷酸化、H2AX的磷酸化、S期停滯誘導(dǎo)或凋亡的誘導(dǎo)。調(diào)節(jié)劑可以通過與對照比較改變的性質(zhì)而鑒定。候選調(diào)節(jié)劑可以是特異結(jié)合WRN的物質(zhì)。WRN可指具有核酸外切酶活性的WRN的片段、同系物、類似物或變體。本發(fā)明還涉及一種篩選特異結(jié)合于WRN的物質(zhì)的體外方法，其包含把候選物與WRN接觸，并測定候選物是否特異結(jié)合于WRN。WRN可以附著于一種固相支持物上?；蛘撸蜻x物可以附著于一固相支持物。本發(fā)明還涉及一種篩選WRN調(diào)節(jié)劑的體外方法，其包含在體外在有WRN核酸底物存在的情況下把候選調(diào)節(jié)劑與WRN接觸，并測定底物的水解。調(diào)節(jié)劑可以通過與對照比較底物核酸的水解變化而鑒定。核酸底物可以是與(TTAGGG)n有至少33％核苷酸序列相同性的寡核苷酸，其中n＝1-20?；蛘?，核酸底物可以是與(TTAGGG)n有至少50％核苷酸序列相同性的寡核苷酸，其中n＝1-20。底物核酸的水解可以通過UV吸收、標(biāo)記寡核苷酸凝膠分析、或回收非可沉淀的核苷酸堿基(recoveryofnon-precipitatablenucleotidebases)進(jìn)行測定。本發(fā)明還涉及一種基于細(xì)胞篩選DNA損傷途徑調(diào)節(jié)劑的方法，其包含在調(diào)節(jié)劑被細(xì)胞攝取的條件下并有寡核苷酸存在的情況下把候選調(diào)節(jié)劑與表達(dá)WRN的細(xì)胞接觸，以及測定與DNA損傷應(yīng)答途徑激活相關(guān)的細(xì)胞性質(zhì)，該性質(zhì)包括但不限于細(xì)胞增殖、細(xì)胞生存力、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性以及p53或p95的磷酸化；ATM的磷酸化、H2AX的磷酸化、S期停滯的誘導(dǎo)或凋亡的誘導(dǎo)。調(diào)節(jié)劑可以通過與對照比較性質(zhì)的改變而鑒定。寡核苷酸可與(TTAGGG)n有至少33％核苷酸序列相同性，其中n＝1-20。寡核苷酸可與(TTAGGG)n有至少50％核苷酸序列相同性，其中n＝1-20。WRN可以WRN的片段、同系物、類似物或變體的形式表達(dá)，且其具有核酸外切酶活性。如上所述用于基于細(xì)胞的篩選方法中的細(xì)胞可以是癌細(xì)胞。所述用于所述基于細(xì)胞的篩選方法中的細(xì)胞可以通過端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶或ALT途徑保持端粒。在上述體外及基于細(xì)胞的篩選方法中所述的候選調(diào)節(jié)劑和物質(zhì)可以是碳水化合物、單糖、寡糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、脂質(zhì)、類維生素A、類固醇、糖肽、糖蛋白、蛋白聚糖、或有機(jī)小分子。本發(fā)明還涉及包含WRN激活劑的組合物的用途。激活劑可以用來治療癌癥、誘導(dǎo)凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞衰老、抑制促進(jìn)皮膚曬黑、促進(jìn)細(xì)胞分化或促進(jìn)免疫抑制。激活劑可以是WRN的寡核苷酸激活劑，其可與(TTAGGG)n有至少33％核苷酸序列相同性，其中n＝1-20。激活劑可以是WRN的寡核苷酸激活劑，其可與(TTAGGG)n有至少50％核苷酸序列相同性，其中n＝1-20。大約一個到大約十個最前端的3′-核苷酸鍵可被3′-5′核酸酶水解。本發(fā)明還涉及包含WRN抑制劑的組合物的用途。該抑制劑可以用于抑制凋亡、抑制細(xì)胞衰老、促進(jìn)生長、抑制皮膚曬黑、抑制細(xì)胞分化、或減少癌癥治療副作用。該組合物可以與化療或電離輻射組合給與。該抑制劑可以是WRN的寡核苷酸抑制劑，其可與(TTAGGG)n有至少33％核苷酸序列相同性，其中n＝1-20。該抑制劑可以是WRN的寡核苷酸抑制劑，其可與(TTAGGG)n有至少50％核苷酸序列相同性，其中n＝1-20。大約0個到大約10個最前端的3′-核苷酸鍵可被3′-5′核酸酶水解。本發(fā)明還涉及一種包含寡核苷酸的組合物，該寡核苷酸與(TTAGGG)n有至少33％核苷酸序列相同性以及有至少一個不可水解的核苷酸間鍵，其中n＝1-20。大約一個到大約十個最前端的3′-核苷酸鍵可被3′-5′核酸酶如WRN水解。所述寡核苷酸可以與TTAGGG有至少33％的核苷酸序列相同性。所述寡核苷酸也可以與TTAGGG有至少50％的核苷酸序列相同性。所述寡核苷酸還可以具有序列GTTAGGGTTAG。所述不可水解的鍵可以是硫代磷酸酯。所述寡核苷酸可以是PNA。圖1A-1H示出碘化丙錠染色的Jurkat細(xì)胞(永生化T淋巴細(xì)胞)經(jīng)稀釋劑處理(圖1A和1E)；40μM11mer-1pGTTAGGGTTAG(SEQIDNO2)處理(圖1B和1F)；40μM11mer-2pCTAACCCTAAC(SEQIDNO3)處理(圖1C和11G)；40μM11mer-3pGATCGATCGAT(SEQIDNO4)處理(圖1D和1H)的FACS分析。Jurkat細(xì)胞在分析前用上述試劑處理48小時(圖1A-1D)或72小時(圖1E-1H)。圖2A-2F為細(xì)胞添加以下物質(zhì)后熒光激活細(xì)胞分選結(jié)果圖圖2A，稀釋劑；圖2B，0.4μM11mer-1；圖2C，0.4μM11mer-1-S；圖2D，稀釋劑；圖2E，40μM11mer-1；圖2F，40μM11mer-1-S。圖3A-3G為細(xì)胞添加以下物質(zhì)后熒光激活細(xì)胞分選結(jié)果圖圖3A，稀釋劑；圖3B，10μM11mer-1；圖3C，10μM11mer-1及1μM11mer-1-S；圖3D，10μM11mer-1及5μM11mer-1-S；圖3E，10μM11mer-1及10μM11mer-1-S；圖3F，20μM11mer-1-S；圖3G，10μM11mer-1-S。圖4所示柱形圖為用稀釋劑、pTpT或pTspT處理后的細(xì)胞黑色素含量(pg/細(xì)胞)。圖5所示柱形圖為經(jīng)稀釋劑、11mer-1或11mer-1-S處理后的細(xì)胞黑色素含量(pg/細(xì)胞)。圖6所示柱形圖為經(jīng)如下處理后的細(xì)胞黑色素含量(pg/細(xì)胞)空白處理(無照射，無寡核苷酸)，或紫外線(UV)照射，或無照射但給予pTspT，或UV照射并給予pTspT。圖7所示為核苷酸序列SEQIDNO2的寡核苷酸圖，其由硫代磷酸酯鍵合成。圖8所示柱形圖為在正常新生人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)時圖7所述的硫代磷酸寡核苷酸1、2、3及4在導(dǎo)致衰老中的作用的檢測結(jié)果，由β-半乳糖苷酶活性陽性染色細(xì)胞指示。寡核苷酸″11-1″表示用完全使用硫代磷酸酯鍵合成的SEQIDNO2處理的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物?！錎il″表示經(jīng)不含寡核苷酸的稀釋劑處理的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物。圖9示出T-oligo誘導(dǎo)p53及H2AX磷酸化的能力由于WRN敲低(knockdown)而降低。在T-oligo處理當(dāng)天，WRN蛋白水平設(shè)定為在“0Hrs”。加入T-oligo(40μM，T)或稀釋劑(D)，24小時或48小時后收集細(xì)胞進(jìn)行Western分析。對照成纖維細(xì)胞是空白(IR，-)或經(jīng)10GyIR(IR，+)照射并且1小時后收集。western印跡用識別WRN、p53磷酸絲氨酸15或磷酸H2AX的抗體探查。圖10示出T-oligo可導(dǎo)致ATM相關(guān)的DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)催化亞基(DNA-PKCS)的磷酸化。ATM與DNA-PKCS的位置已標(biāo)示出。經(jīng)空白處理與經(jīng)照射處理(10GyIR)的成纖維細(xì)胞作為對照。圖11示出響應(yīng)于T-oligo處理的p53的絲氨酸37被磷酸化。圖12示出WRN蛋白″感知″暴露的端粒突出端及T-oligo、導(dǎo)致激活A(yù)TM與DNA-PK并導(dǎo)致與p53以及其它底物的磷酸化的可能機(jī)制。發(fā)明詳述本發(fā)明基于這樣一個發(fā)現(xiàn)WRN參與DNA損傷樣信號傳導(dǎo)，該信號傳導(dǎo)是由端粒3′突出序列的水解引發(fā)的。端粒序列的水解引發(fā)對于應(yīng)答DNA損傷的保護(hù)性細(xì)胞應(yīng)答中起重要作用的信號級聯(lián)，DNA損傷包括但不限于包括細(xì)胞衰老、皮膚曬黑及凋亡。如本申請及以其全文并入?yún)⒖嫉墓餐礇Q國際專利申請No.PCT/US2004/000819所述，3’末端核酸酶消化被阻斷的T-oligo喪失了激發(fā)DNA損傷應(yīng)答的能力。鑒于WRN在參與DNA復(fù)制和修復(fù)及端粒維持中作為3′-5′核酸酶，所以WRN可以成為T-oligo的核″傳感器″。不局限在理論上，我們相信如UV照射、DNA氧化損傷或DNA加合物致癌的形成或年齡相關(guān)端?？s短的DNA損傷都將降低端粒環(huán)的穩(wěn)定性，使包含TTAGGG重復(fù)序列的3′突出序列暴露出來。隨后，端粒相關(guān)蛋白將以序列依賴方式附著在突出端，單獨或以復(fù)合體一部分的形式作為WRN的“錨”。接著，WRN開始由3′端水解端粒突出序列，引起進(jìn)一步的信號級聯(lián)放大，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、基因誘導(dǎo)、凋亡與/或衰老的生物學(xué)終點。此處所列數(shù)據(jù)提示不論單獨還是作為復(fù)合體如Mre11/Rad50/p95(Nbsl)復(fù)合物的一部分，WRN蛋白可以“感知”并降解T-oligo，使ATM與DNA-PK激酶活化，隨后導(dǎo)致下游底物的磷酸化(圖12)。根據(jù)WRN在所述的信號傳導(dǎo)途徑中的作用，預(yù)期WRN激活劑可以激活DNA損傷應(yīng)答途徑，而不論是否存在DNA損傷或端粒環(huán)破壞。類似地，預(yù)期即使在存在DNA損傷或端粒環(huán)破壞的情況下，WRN抑制劑也可以抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在揭示和描述本產(chǎn)品、組合物和方法之前，應(yīng)理解本文所用術(shù)語僅僅為了表述具體的實施方案，而非意圖限制。必須注意的是，除非本文另有明確說明，說明書及其權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式″一″、″所述″同時也包括了復(fù)數(shù)情況。本申請通篇引用了專利及公開文獻(xiàn)，這些出版物的公開內(nèi)容以其全文并入本申請作為參考，是為了更加充分的描述本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的狀況。1.定義如本文所用，術(shù)語″激活劑″是指任何可激活蛋白或使蛋白活性提高的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語″給予″用來描述調(diào)節(jié)劑的量時，是指該藥物的單一或多次劑量。如本文所用，術(shù)語″類似物″在用于肽或多肽時，指一種肽或多肽，其與常規(guī)氨基酸組相比包含一或多個非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸或其他結(jié)構(gòu)變化，并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性；當(dāng)用于寡核苷酸時，指一種寡核苷酸，其包含一或多個除核苷酸間的磷酸二酯鍵外的核苷酸間鍵，并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性。如本文所用，術(shù)語″抗體″指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE類抗體或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab′)2、Fd和單鏈抗體，雙抗體(diabody)、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物。所述抗體可為單克隆抗體、多克隆抗體、親和性純化抗體或其混合物，其對所需表位或衍生于其的序列顯示出充分的結(jié)合特異性。所述抗體亦可為嵌合抗體。所述抗體可為本領(lǐng)域公知的一或多個化學(xué)物、肽或多肽部分附著所衍生化。所述抗體可與化學(xué)部分綴合。如本文所用，術(shù)語″凋亡″指細(xì)胞的一種死亡形式，包括但不限于細(xì)胞體積進(jìn)行性萎縮并保持胞質(zhì)細(xì)胞器的完整性；光鏡或電鏡下可見的染色質(zhì)固縮(即核固縮)；和/或DNA斷裂為可通過離心沉降法檢測到的核小體大小的片段。當(dāng)細(xì)胞失去膜完整性時(例如質(zhì)膜出泡)并伴有吞噬細(xì)胞對完整細(xì)胞碎片(凋亡小體)的吞食時，細(xì)胞死亡。如本文所用，術(shù)語″生物學(xué)活性″在用于肽或多肽的類似物、衍生物、片段、同源物或變體時，指所述類似物、衍生物、片段、同源物或變體保留了所述肽或多肽的至少一種活性，包括但不限于被特異性抗體結(jié)合的能力；在用于WRN時，包括但不限于解旋酶活性、3′-5′核酸外切酶活性及與MRN復(fù)合物相互作用的能力；在用于寡核苷酸的類似物、衍生物、片段、同源物或變體時，指所述類似物、衍生物、片段、同源物或變體如Maniatisetal.，在MolecularCloning(ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratory，1982(其內(nèi)容引入本申請作為參考)所述在嚴(yán)格雜交條件下與所述寡核苷酸進(jìn)行雜交。如本文所用，術(shù)語″癌癥治療″指本領(lǐng)域公知的任何治療癌癥的方法，包括但不限于化療與放射療法。如本文所用，術(shù)語″組合″用來描述給予一種調(diào)節(jié)劑及另外的治療時，指所述調(diào)節(jié)劑可在另外的治療之前、之后或同時或其組合時給予。如本文所用，術(shù)語″衍生物″在文中用于肽或多肽時，指其存在除一級結(jié)構(gòu)(氨基酸與氨基酸類似物)外的差別并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性的肽或多肽；在文中用于寡核苷酸時，指其存在除核苷酸序列外的差別并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性的寡核苷酸。值得注釋的是，肽或多肽的衍生物可通過糖基化，即一種翻譯后修飾來區(qū)別。例如，由于在異源系統(tǒng)中表達(dá)，肽或多肽可能具有糖基化形式。如果保留了至少一種生物學(xué)活性，那么這些肽或多肽是本發(fā)明的衍生物。其他衍生物包括但不限于具有共價修飾的N-或C-端的融合肽或融合多肽、PEG化的肽或多肽、與脂質(zhì)部分結(jié)合的肽或多肽、烷基化的肽或多肽、通過氨基酸側(cè)鏈功能基團(tuán)與其他肽、多肽或化學(xué)物連接的肽或多肽以及本領(lǐng)域所理解的其它修飾形式。如本文所用，術(shù)語″片段″在文中用于肽或多肽時，指任何肽或多肽片段，優(yōu)選約5-300個氨基酸長，更優(yōu)選約8-50個氨基酸長，并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性；在文中用于寡核苷酸時，指任何寡核苷酸片段，優(yōu)選是約2-250個核苷酸，更優(yōu)選約2-20個核苷酸長，并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性。典型的肽或多肽片段的例子為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個氨基酸長。典型的寡核苷酸片段的例子為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸長。如本文所用，術(shù)語″同源物″在文中用于肽或多肽時，指具有共同進(jìn)化祖先或具有至少50％的同源性并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性的肽或多肽；在文中用于寡核苷酸時，指具有共同進(jìn)化祖先或具有至少50％的同源性并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性的寡核苷酸。如本文所用，術(shù)語″抑制″在用于蛋白活性時指防止、遏制、阻止或消除酶活性。如本文所用，術(shù)語″治療″在用于保護(hù)哺乳動物防止發(fā)生疾病時指防止、遏制、阻止或消除所述疾病。防止所述疾病包括在該疾病發(fā)生前給予哺乳動物本發(fā)明的組合物。遏制所述疾病包括在該疾病發(fā)生之后但在其臨床癥狀之前給予哺乳動物本發(fā)明的組合物。阻止所述疾病包括在該疾病的臨床癥狀發(fā)生后給予哺乳動物本發(fā)明的組合物使所述疾病減輕或防止惡化。消除所述疾病包括在該疾病的臨床癥狀發(fā)生后給予哺乳動物本發(fā)明的組合物使該哺乳動物不再患有所述疾病。如本文所用，術(shù)語″變體″在文中用于肽或多肽時，指由于氨基酸的插入、缺失或保守置換造成氨基酸序列差異并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性的肽或多肽；在文中用于寡核苷酸時，指由于核苷酸的插入、缺失或置換造成核苷酸序列差異并優(yōu)選保持了至少一種生物學(xué)活性的寡核苷酸。2.調(diào)節(jié)劑a.WRN調(diào)節(jié)劑本發(fā)明涉及WRN活性調(diào)節(jié)劑。該調(diào)節(jié)劑可以誘導(dǎo)或增強(qiáng)WRN活性。該調(diào)節(jié)劑也可以抑制或降低WRN活性。該調(diào)節(jié)劑可以是人工合成的化合物或是自然存在的化合物。該調(diào)節(jié)劑可以是低分子量化合物、寡核苷酸、多肽或肽、或其片段、類似物、同源物、變體或衍生物。寡核苷酸調(diào)節(jié)劑可以是與(TTAGGG)n具有至少大約33％到100％或至少50％到大約100％核苷酸序列相同性的寡核苷酸，n為大約1到20。如本文所用，″(TTAGGG)n″在文中用于對比核酸序列時，作為參考核酸。序列相同性通過將寡核苷酸與參考核酸進(jìn)行比對并用(a)比對相同的核苷酸數(shù)目除以(b)總的寡核苷酸堿基對數(shù)目來計算。例如，11bp的寡核苷酸序列GTTAGGGTTAG與(TTAGGG)2具有＞91％的序列相同性。所述寡核苷酸可以是包括但不限于單鏈、雙鏈或其組合的形式。所述寡核苷酸優(yōu)選包含大約2至大約2000個核苷酸、更優(yōu)選為大約2至大約200個核苷酸單鏈3′末端。所述寡核苷酸也可以是EST。可特別預(yù)期的還可以是所述寡核苷酸的類似物、衍生物、片段、同源物或變體。如實施例所示，本發(fā)明中的某些寡核苷酸在細(xì)胞中抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡，而本發(fā)明的其它寡核苷酸抑制生長停滯及抑制凋亡。寡核苷酸活性的不同依賴于3′可水解核苷酸間鍵的數(shù)目。改變3′可水解核苷酸間鍵的數(shù)目，則該寡核苷酸的作用也改變。不局限在理論上，我們認(rèn)為寡核苷酸被WRN識別并作為3′外切酶WRN的底物。其推論是，包含3′不可水解核苷酸間鍵的底物寡核苷酸作為WRN的拮抗劑或抑制劑。決定WRN活性水平的其它因素包括但不限于3′可水解核苷酸間鍵的總濃度、堿基序列和G含量。如果(i)一個核苷酸間鍵是在生理條件下可被WRN水解的磷酸二酯鍵或其類似物，及(ii)所有位于其3′方向的核苷酸間鍵也都是可水解的，則根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為該核苷酸間鍵是可水解的。如果核苷酸間鍵在生理條件下不被WRN水解，則根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為其是不可水解的，無論3′端可水解的核苷酸間鍵的數(shù)目為何。不可水解的核苷酸間鍵的代表性例子包括但不限于硫代磷酸酯鍵和肽核酸鍵(PNA)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述寡核苷酸包含可水解核苷酸間鍵。該寡核苷酸可以包含約1至約200個可水解核苷酸間鍵。所述寡核苷酸也包含不可水解核苷酸間鍵。該寡核苷酸可包含約0至約199個不可水解核苷酸間鍵。在另一實施方案中，寡核苷酸包含不可水解鍵。該寡核苷酸可包含約1至約200個不可水解核苷酸間鍵。寡核苷酸也可以包含可水解核苷酸間鍵。該寡核苷酸包含約0-5個可水解核苷酸間鍵。優(yōu)選的寡核苷酸是本申請所述和如并入本文參考的2002年4月12日提交的共同未決美國專利申請No.10/122,630所述的T-oligo。b.DNA損傷途徑調(diào)節(jié)劑本發(fā)明還涉及DNA損傷途徑的調(diào)節(jié)劑。該調(diào)節(jié)劑可以誘導(dǎo)DNA損傷途徑。該調(diào)節(jié)劑也可以抑制DNA損傷途徑。所述調(diào)節(jié)劑可以是人工合成化合物或天然存在的化合物。該調(diào)節(jié)劑可以是低分子量化合物、多肽或肽、或其片段、類似物、同源物、變體或衍生物。3.組合物本發(fā)明還涉及包含上述調(diào)節(jié)劑的組合物。該組合物可以包含WRN激活劑。該組合物也可以包含WRN抑制劑。該組合物還可以包含超過一種的本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑。該組合物亦可以包含一或多種調(diào)節(jié)劑以及其它治療劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，該組合物包含了本發(fā)明的寡核苷酸。該寡核苷酸可以包含可水解核苷酸間鍵或不可水解核苷酸間鍵或其組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，該寡核苷酸是WRN激活劑。在另一個優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸是WRN抑制劑。如上所述，基于可水解核苷酸間鍵的總濃度，可以調(diào)節(jié)寡核苷酸的活性以誘導(dǎo)或者抑制WRN。a.制劑本發(fā)明的組合物可按常規(guī)方式制成片劑或錠劑。例如，口服片劑和膠囊可含有常規(guī)賦形劑，包括但不限于粘合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑和增濕劑。粘合劑包括但不限于糖漿、阿拉伯樹膠、明膠、山梨醇、黃蓍膠、淀粉膠和聚乙烯吡咯烷酮。填充劑包括但不限于乳糖、蔗糖、微晶纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣和山梨醇。潤滑劑包括但不限于硬脂酸鎂鹽、硬脂酸、滑石、聚乙二醇和二氧化硅。崩解劑包括但不限于馬鈴薯淀粉和淀粉乙醇酸鈉。增濕劑包括但不限于月桂硫酸酯鈉。片劑可按本領(lǐng)域熟知方法包衣。本發(fā)明的組合物亦可為液體制劑，包括但不限于含水或含油懸液、溶劑、乳狀液、糖漿和酏劑。該組合物也可制成干產(chǎn)物，使用前用水或其他合適的載體建立(constitution)。這些液體制劑可含有添加劑，包括但不限于懸浮劑、乳化劑、非水載體及防腐劑。懸浮劑包括但不限于山梨醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/蔗糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠和氫化食用脂肪。乳化劑包括但不限于卵磷脂、脫水山梨糖醇單油酸酯和阿拉伯樹膠。非水載體包括但不限于食用油類、杏仁油、分餾椰子油、油酯、丙二醇和乙醇。防腐劑包括但不限于對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯和山梨酸。本發(fā)明的組合物亦可制為栓劑，其可以含有栓劑基質(zhì)，包括但不限于可可脂或甘油酯。本發(fā)明的組合物亦可制為吸入劑，其可以為包括但不限于以干粉給予的溶液、懸液或乳濁液的形式或以使用噴射劑(如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷)的氣霧劑的形式。本發(fā)明的組合物亦可制成包含水或非水載體的經(jīng)皮制劑，包括但不限于乳膏、軟膏、洗液、漿糊(paste)、藥膏(medicatedplaster)、藥膏(patch)或膜。本發(fā)明的組合物亦可制為胃腸外給予，包括但不限于通過注射或連續(xù)輸液。注射制劑可為含油或含水載體的懸液、溶液或乳狀液，并可含配制劑包括但不限于懸浮劑、穩(wěn)定劑和分散劑。該組合物亦可以干粉形式提供，用合適的載體包括但不限于無菌、無熱源水重建(reconstitution)。本發(fā)明的組合物還可制為貯存制品(depotpreparation)，其可通過植入或肌內(nèi)注射給予。該組合物可以用合適的聚合物或疏水材料(例如，可接受油的乳濁液)、離子交換樹脂或略溶性衍生物(例如略溶性鹽)來配制。本發(fā)明的組合物還可制為脂質(zhì)體制品。脂質(zhì)體制品可含有可以穿透感興趣細(xì)胞或角質(zhì)層并能夠與細(xì)胞膜融合的脂質(zhì)體，最終將脂質(zhì)體內(nèi)涵物傳送入細(xì)胞。例如，可使用以下專利所描述的脂質(zhì)體Yarosh的美國專利5,077,211、Redziniaketal.的美國專利4,621,023或Redziniaketal.的美國專利4,508,703。用于靶向皮膚病的本發(fā)明組合物可以在哺乳動物皮膚暴露于紫外線或引起氧化損害的因素之前、之中或之后給予。其他合適的制劑還應(yīng)用niosome。Niosome是與脂質(zhì)體類似的脂質(zhì)載體，其具有主要由非離子脂質(zhì)組成的膜，其一些形式可以有效的攜帶化合物穿過角質(zhì)層。4.治療方法a.WRN激活劑本發(fā)明誘導(dǎo)或增強(qiáng)WRN活性的調(diào)節(jié)劑可單獨或與其他治療方式組合用于治療與生長停滯、凋亡或增殖性衰老的機(jī)制喪失相關(guān)的疾病。這些病癥的代表性例子包括但不限于過度增生性疾病，如癌癥和超過正常范圍的細(xì)胞的良性生長，例如在牛皮癬、成纖維細(xì)胞肥厚性瘢痕與瘢痕疙瘩中的角質(zhì)細(xì)胞的良性生長；或在某種自身免疫紊亂中的某些淋巴細(xì)胞亞群的良性生長。這些方法治療的癌癥具有多樣化的表現(xiàn)形式且產(chǎn)生自機(jī)體的不同細(xì)胞類型及器官中，例如宮頸癌、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤及其他皮膚癌和白血病。所述療法指向的癌細(xì)胞的類型包括乳腺、肺、肝、前列腺、胰、卵巢、膀胱、子宮、結(jié)腸、腦、食道、胃和甲狀腺。所述調(diào)節(jié)劑也可用來抑制促進(jìn)皮膚曬黑、促進(jìn)細(xì)胞分化和免疫抑制。在本發(fā)明的一個實施方案中，包含可水解核苷酸間鍵的本發(fā)明寡核苷酸用于通過給予有需要這種治療的患者所述寡核苷酸來治療與生長停滯、凋亡或增殖性衰老的機(jī)制喪失相關(guān)的疾病。該寡核苷酸也可包含不可水解核苷酸間鍵。如上所述，寡核苷酸的活性可以基于可水解核苷酸間鍵的總濃度來調(diào)節(jié)以誘導(dǎo)生長停滯或凋亡。該寡核苷酸可與本發(fā)明中的調(diào)節(jié)劑或其他治療方式組合給予。在一個優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸用來治療癌癥，所述癌癥選白宮頸癌、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、皮膚癌、白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宮癌、結(jié)腸癌、腦癌、食道癌、胃癌和甲狀腺癌。T-oligo在小鼠模型中可如UV照射一樣有效地阻斷過敏性接觸性超敏反應(yīng)的誘導(dǎo)與引發(fā)，其通過上調(diào)已知免疫抑制介質(zhì)TNF-α與IL10實現(xiàn)。因此，局部或全身性的WRN激活劑可以代替類固醇治療，例如牛皮癬、濕疹的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚疾病以及淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的系統(tǒng)性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、紅斑狼瘡和許多其他的疾病的治療。b.WRN抑制劑本發(fā)明的可抑制或降低WRN活性的調(diào)節(jié)劑可單獨或與其他療法組合用來治療與生長停滯、凋亡或增殖性衰老相關(guān)的疾病。這種疾病的代表性例子包括但不限于暴露于UV照射和如化療和放療的癌癥治療對正常組織的副作用或促進(jìn)抑制暴露于日光引起的正常皮膚曬黑的應(yīng)答。該調(diào)節(jié)劑也可以用來抑制細(xì)胞分化。在另一個實施方案中，含不可水解核苷酸間鍵的本發(fā)明寡核苷酸用于通過給予有需要這種治療的患者所述寡核苷酸來治療與生長停滯或凋亡相關(guān)的疾病。該寡核苷酸也可包含可水解核苷酸間鍵。如上所述，寡核苷酸的活性可以基于可水解核苷酸間鍵的總濃度來調(diào)節(jié)以抑制生長停滯或抑制凋亡。該寡核苷酸可與本發(fā)明調(diào)節(jié)劑或其他治療方式組合給予。在一個優(yōu)選的實施方案中，該寡核苷酸被用來治療的疾病選自UV輻射暴露和如化療和放療癌癥治療方法的副作用。c.給予本發(fā)明的組合物可以任何方式給予，包括但不限于口服、胃腸外、舌下、經(jīng)皮、直腸、跨粘膜、局部、吸入、口腔給予或其組合。胃腸外給予包括但不限于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)及關(guān)節(jié)內(nèi)給予。d.劑量用于治療所需的組合物的治療有效量根據(jù)要治療疾病的性質(zhì)、所需活性的時間長短以及病人的年齡和狀況變化，并最后由主治醫(yī)師作出決定。通常，用于成人治療的典型劑量范圍是0.001mg/kg到大約200mg/kg/天。劑量可以是約1μg/kg到約100μg/kg/天。所需劑量應(yīng)方便單劑量給予或以合適的間隔多劑量給予，例如每天二次、三次、四次或更多次亞劑量。通常多劑量給藥是需要或必需的。調(diào)節(jié)劑的劑量可是任何劑量，包括但是不限于約1μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、550μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、650μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、750μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、850μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg或1mg/kg。5.篩選方法本發(fā)明還涉及鑒定WRN活性調(diào)節(jié)劑的篩選方法。此外，本發(fā)明涉及鑒定DNA損傷途徑調(diào)節(jié)劑的篩選方法。篩選方法可以多種方式進(jìn)行，包括但不限于體外檢測、基于細(xì)胞的檢測、遺傳學(xué)檢測和體內(nèi)檢測。WRN調(diào)節(jié)劑可通過篩選與WRN特異性結(jié)合的底物而鑒定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體外鑒定特異結(jié)合底物，所述技術(shù)包括但不限于免疫沉淀和親和層析。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可通過使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)應(yīng)用遺傳篩選來鑒定特異結(jié)合底物，所述技術(shù)包括但不限于酵母雙雜交與噬菌體展示。特異結(jié)合底物還可通過使用高通量篩選方法包括但不限于將WRN附著到固體基質(zhì)如芯片上(例如玻璃、塑料或硅)來進(jìn)行鑒定。WRN調(diào)節(jié)劑也可通過體外篩選調(diào)節(jié)WRN活性的底物來鑒定。通過將WRN與疑似調(diào)節(jié)劑接觸、確定疑似調(diào)節(jié)劑是否可以改變WRN的活性從而鑒定調(diào)節(jié)劑。WRN的活性可通過測定WRN的核酸底物的水解而測定。測定核酸底物水解的方法包括但不限于測量UV吸收以及優(yōu)選標(biāo)記的寡核苷酸的凝膠分析或非沉淀核苷酸堿基的回收。WRN調(diào)節(jié)劑可通過篩選在基于細(xì)胞的分析中調(diào)節(jié)WRN活性的底物而鑒定。類似地，DNA損傷途徑的調(diào)節(jié)劑也可得到鑒定。使疑似調(diào)節(jié)劑與細(xì)胞接觸并測定疑似調(diào)節(jié)劑是否可以改變凋亡、衰老、或p53、p95、ATM、H2AX的磷酸化、S期停滯的誘導(dǎo)或凋亡誘導(dǎo)的水平從而鑒定調(diào)節(jié)劑。如上所述，候選調(diào)節(jié)劑可以是特異性結(jié)合WRN的底物。測定凋亡調(diào)節(jié)的方法包括但不限于在FACS分析中測定sub-G0/G1峰的大小、TUNEL分析、DNAladder分析、膜聯(lián)蛋白分析或ELISA分析。衰老的調(diào)節(jié)可以通過檢測衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性或細(xì)胞產(chǎn)量增加的失敗或磷酸化pRb的失敗或促有絲分裂刺激后的3H-胸腺嘧啶摻入的失敗來確定。p53活性的調(diào)節(jié)可以通過凝膠遷移分析測定p53絲氨酸15或絲氨酸37的磷酸化來進(jìn)行檢測，可通過p53啟動子驅(qū)動的CAT或熒光素酶構(gòu)建體的讀取(read-out)進(jìn)行測定，或通過p53調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物如p21的誘導(dǎo)進(jìn)行測定。p95活性的調(diào)節(jié)可以通過在western印跡分析中p95條帶的遷移從而檢測p95的絲氨酸343的磷酸化或由FACS分析檢測S期停滯來進(jìn)行測定。WRN調(diào)節(jié)劑還可通過篩選在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的底物來鑒定。任何細(xì)胞都可用于基于細(xì)胞的分析。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選的是人類細(xì)胞與非人靈長類細(xì)胞。合適細(xì)胞的代表性例子包括但不限于原代(正常)人類皮膚成纖維細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和相應(yīng)的永生化或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系；以及原代、永生化的或轉(zhuǎn)化的鼠細(xì)胞系。蛋白磷酸化的量可通過使用本領(lǐng)域技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)來測定，包括但不限于比色法、發(fā)光法、熒光測定法和western印跡。將疑似調(diào)節(jié)劑通過如混合的方式加入細(xì)胞中的條件是這樣的條件，其中在基本上沒有其他可干擾凋亡或信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)化合物存在的情況下，該細(xì)胞會發(fā)生凋亡或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。有效的條件包括但不限于允許細(xì)胞生長的合適的培養(yǎng)基、溫度、pH和氧條件。合適的培養(yǎng)基典型是固體或液體培養(yǎng)基，其包含生長因子及可同化的碳、氮和磷源，以及合適的鹽、礦物質(zhì)、金屬及其他營養(yǎng)物如維生素，還包括細(xì)胞可以在其中進(jìn)行培養(yǎng)以展示凋亡或信號傳導(dǎo)的有效的培養(yǎng)基。例如，對于哺乳動物細(xì)胞來說，所述培養(yǎng)基可為含10％胎牛血清的DulbeccomodifiedEagle′s培養(yǎng)基。細(xì)胞可在多種容器中培養(yǎng)，所述容器包括但不限于組織培養(yǎng)瓶、試管、微孔板和培養(yǎng)板(petriplate)。培養(yǎng)應(yīng)在具有對細(xì)胞適宜的溫度、pH和二氧化碳含量的條件下進(jìn)行。這些培養(yǎng)條件也是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。將疑似調(diào)節(jié)劑加入細(xì)胞的方法包括電穿孔、顯微注射、細(xì)胞表達(dá)(即使用一個表達(dá)系統(tǒng)，包括裸核酸分子、重組病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體和腺病毒表達(dá))、在培養(yǎng)基中加入試劑、使用金屬配對試劑以及使用用于細(xì)胞通化的表面活性劑。候選調(diào)節(jié)劑可以是天然分子，如碳水化合物、單糖、寡糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸，包括DNA及DNA片段、RNA及RNA片段等、脂質(zhì)、類視黃醇(retinoid)、類固醇、糖肽、糖蛋白、蛋白聚糖等；或天然分子的類似物及衍生物，如肽模擬物(peptidomimetics)等；以及非天然分子，如″小分子″有機(jī)化合物。術(shù)語″小分子有機(jī)化合物″通常指分子量小于大約1000、優(yōu)選小于大約500的有機(jī)化合物。候選調(diào)節(jié)劑可能存在于文庫(即化合物的集合)中，該文庫可以任何方法制備或獲得，包括但不限于組合化學(xué)技術(shù)、發(fā)酵方法、植物與細(xì)胞提取等。制備組合文庫的方法為本領(lǐng)域所熟知。參見例如E.R.Felder，Chimia1994，48，512-541；Gallopetal.，J.Med.Chem.1994，37，1233-1251；R.A.Houghten，TrendsGenet.1993，9，235-239；Houghtenetal.，Nature1991，354，84-86；Lametal.，Nature1991，354，82-84；Carelletal.，Chem.Biol.1995，3，171-183；Maddenetal.，PerspectivesinDrugDiscoveryandDesign2，269-282；Cwirlaetal.，Biochemistry1990，87，6378-6382；Brenneretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1992，89，5381-5383；Gordonetal.，J.Med.Chem.1994，37，1385-1401；Lebletal.，Biopolymers1995，37177-198及本文引用的參考文獻(xiàn)。以下非限制性實施例舉例說明了本發(fā)明的多個方面。實施例實施例1寡核苷酸可誘導(dǎo)凋亡將與端粒突出端重復(fù)序列(TTAGGG；SEQIDNO1)同源的寡核苷酸、序列(11mer-1pGTTAGGGTTAG；SEQIDNO2)、與這個序列互補(bǔ)(11mer-2pCTAACCCTAAC；SEQIDNO3)以及端粒序列不相關(guān)的(11mer-3pGATCGATCGAT；SEQIDNO4)加入Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)物中，Jurkat細(xì)胞是一種人類T細(xì)胞系，據(jù)報導(dǎo)其可由于應(yīng)答端粒破壞而發(fā)生凋亡。在48小時內(nèi)，用40μM的SEQIDNO2處理的細(xì)胞有50％積聚在S期，而對照細(xì)胞相比只有25-30％(p＜0.0003，非配對t-檢驗；見圖1A-1D)；72小時，通過sub-G0/G1DNA含量確定13％的這些細(xì)胞凋亡，對照組相比為2-3％(p＜0.007，非配對t-檢驗；見圖1E-1H)。96小時，11mer-1處理的細(xì)胞有20±3％凋亡，對照組為3-5％(p＜0.0001，非配對t-檢驗)。為排除11mer-1所獨有的效應(yīng)是由于其被優(yōu)先攝取所引起的，使用3′端以亞磷酰胺熒光素標(biāo)記的寡核苷酸處理Jurkat細(xì)胞，然后進(jìn)行共聚焦顯微鏡與FACS分析。細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在所有處理后4小時和24小時相同。Western分析顯示在加入11mer-124小時后p53增加以及轉(zhuǎn)錄因子E2F1水平伴隨增加，但在11mer-2或11mer-3中未見，已知E2F1在誘導(dǎo)凋亡過程中與p53協(xié)同作用并可以p53依賴方式誘導(dǎo)人類成纖維細(xì)胞衰老表型以及調(diào)節(jié)S期關(guān)卡(checkpoint)。實施例2端粒突出端同源物11mer-1的硫代磷酸物不誘導(dǎo)凋亡將Jurkat人類T細(xì)胞培養(yǎng)物用稀釋劑、11mer-1(SEQIDNO1)或硫代磷酸11mer-1(11mer-1-S)處理96小時，然后收集進(jìn)行FACS分析。檢測兩種寡核苷酸濃度，0.4μM(圖2A-2C)與40μM(圖2D-2F)。在0.4μM，兩種寡核苷酸都不能影響預(yù)期的Jurkat細(xì)胞的對數(shù)生長細(xì)胞周期圖。在40μM，sub-G0/G1峰顯示11-mer-1誘導(dǎo)了廣泛的凋亡，而11mer-1-S沒有作用。實施例311mer-1的硫代磷酸物阻斷了磷酸骨架11mer-1誘導(dǎo)的S期停滯僅用11mer-1(SEQIDNO2)或在11mer-1-S濃度提高的情況下用11mer-1處理角質(zhì)細(xì)胞系(SSC12F，100,000細(xì)胞/38cm2)培養(yǎng)物48小時。如前述實施例1所示，通過FACS(Becton-DickinsonFacScan)證明11mer-1誘導(dǎo)了S期停滯。43％的細(xì)胞處于S期，在經(jīng)稀釋劑處理的對照細(xì)胞中為26％。然而，在提高濃度的硫代磷酸11mer-1加入這些培養(yǎng)物中時，幾乎沒有細(xì)胞被停滯(圖3A-3G)。當(dāng)11mer-1∶11mer-1-S的比率為2∶1時可見這種停滯被完全抑制。11mer-1-S自身不誘導(dǎo)S期停滯。實施例4硫代磷酸形式的端粒寡核苷酸減弱了組成性和UV誘導(dǎo)的色素沉積且不刺激黑素原生成用100μM的pTpT或硫代磷酸pTpT(pTspT)(圖4)或40μM的11mer-1或硫代磷酸11mer-1(11mer-1-S)(圖5)處理S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞(100,000細(xì)胞/38cm2)培養(yǎng)物6天，然后收集，計數(shù)，并檢測黑色素含量。pTpT和11mer-1(分別見圖4和圖5)刺激了這些細(xì)胞中的黑素原生成，而pTspT和11mer-1-S則沒有(分別見圖4和圖5)。此外，pTspT(圖4)和11mer-1-S(圖5)都減少了這些細(xì)胞中的組成性色素沉積，提示在端粒修復(fù)/復(fù)制時這個序列的慢性暴露可提供持續(xù)的、低水平的黑素原生成信號而且這個信號被pTspT與11mer-1-S阻斷。實施例5硫代磷酸pTspT抑制UV誘導(dǎo)的黑素原生成對雙份S91細(xì)胞培養(yǎng)物(100,000細(xì)胞/39cm2)進(jìn)行假照射或以來自1kW氙弧太陽模擬器(XMN1000-21，OpticalRadiation，Azuza，CA)的5mJ/cm2太陽模擬光進(jìn)行照射，使用研究性輻射計(型號IL1700A，InternationalLight，Newburyport，MA)將該模擬器設(shè)定在285.5nm處。兩個空白照射板隨后補(bǔ)加100μM的pTspT，兩個照射培養(yǎng)物也用pTspT類似處理。一周后，收集細(xì)胞，計數(shù)，使用1NNaOH溶解細(xì)胞沉淀并在475nm處測量光密度來分析黑色素含量。UV照射使這些細(xì)胞中的黑色素含量加倍。然而，加入pTspT可以阻斷這種應(yīng)答(圖6)。另外，pTspT在空白照射培養(yǎng)物中減少了組成性色素沉積，與圖4及圖5所示數(shù)據(jù)類似。實施例6水解T-oligo對于活性是必需的合成基于SEQIDNO2的寡核苷酸。寡核苷酸1完全以硫代磷酸骨架合成。寡核苷酸2在每個末端都具有兩個硫代磷酸酯鍵，其他中間部分的鍵均為磷酸二酯鍵。寡核苷酸3在5′末端具有二個硫代磷酸酯鍵(5′端阻斷)，其余鍵均為磷酸二酯鍵。寡核苷酸4在3′末端具有二個硫代磷酸酯鍵(3′端阻斷)，其余鍵均為磷酸二酯鍵。參見圖7。將這些寡核苷酸加入正常的新生成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中。48小時后收集細(xì)胞并通過western印跡分析p53絲氨酸15磷酸化以及p95/Nbsl磷酸化。其它培養(yǎng)物在寡核苷酸存在的情況下繼續(xù)培養(yǎng)一周，然后對衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性(SA-β-Gal)進(jìn)行細(xì)胞染色，β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞被記分，并計算占細(xì)胞總數(shù)的百分比(圖8)。具有核酸酶可接近3′末端的寡核苷酸在刺激″早期″應(yīng)答如p53和p95/Nbsl磷酸化時是最有效的。而具有核酸酶可接近5′末端的寡核苷酸也能夠在一周后誘導(dǎo)衰老表型，但是在48小時不引起磷酸化反應(yīng)，提示3′-5′核酸酶的敏感性對于誘導(dǎo)衰老的活性是優(yōu)選的。實施例7下調(diào)WRN蛋白水平阻斷T-oligo應(yīng)答用50ρmol的WRNsiRNA或50ρmol針對對照綠色熒光蛋白(GFP)的siRNA處理正常新生成纖維細(xì)胞連續(xù)兩天。第二次siRNA處理后一天，收集代表性的培養(yǎng)物做wester印跡分析以評估WRNsiRNA去除所述蛋白的效力。同時，雙份WRNsiRNA處理和GFPsiRNA處理的培養(yǎng)物給予40μMT-oligo(11mer-1；SEQIDNO2)或等量的稀釋劑。在加入T-oligo或稀釋劑后1或2天收集所有條件的細(xì)胞并通過western印跡分析檢測p53絲氨酸15的磷酸化及組蛋白H2AX的磷酸化，這兩種現(xiàn)象均能很好的記錄DNA損傷應(yīng)答(Lambertetal.，1998，JBiolChem273，33048-53；Burmaetal.，2001，JBiolChem276，42462-7)。作為對照，包括來自空白照射細(xì)胞和用10Gy電離輻射(IR)照射的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物。印跡用特異于WRN、p53磷酸絲氨酸15和磷酸H2AX的抗體探查。圖9所示數(shù)據(jù)表明WRN的“敲低”顯著降低了第0天(加入T-oligo當(dāng)天)的WRN水平以及T-oligo誘導(dǎo)p53和H2AX磷酸化的能力。實施例8DNA-PK介導(dǎo)T-oligo作用用40μM的T-oligo或等體積的稀釋劑處理正常的新生兒成纖維細(xì)胞4、6、8、16、24或48小時，然后收集并用抗ATM磷酸絲氨酸1981的抗體通過western印跡分析。圖10顯示T-oligo處理在成纖維細(xì)胞中導(dǎo)致表觀分子量為450kDa的蛋白質(zhì)磷酸化，該蛋白質(zhì)遷移至ATM(370kDa)的分子標(biāo)準(zhǔn)的上方。在后續(xù)實驗中，此磷酸化蛋白質(zhì)示出與ATM相關(guān)的DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PKcs)的催化亞基共遷移，有理由預(yù)期其結(jié)合抗高度同源的ATM蛋白的抗體。正如T-oligo處理后的情形(圖10)所示，由于DNA-PKcs在激活時自身磷酸化(Dingetal.，2003，MolCellBiol23，5836-48)并且通過異源二聚體Ku蛋白(DNA-PK復(fù)合物的一部分)與WRN相關(guān)，所以分析成纖維細(xì)胞的p53絲氨酸37的磷酸化，該位點顯示被DNA-PK磷酸化(Leesetal.，1992，MolCellBiol12，5041-9)。新生兒成纖維細(xì)胞如上述處理并類似地用抗絲氨酸37磷酸化的p53抗體進(jìn)行分析。Western分析顯示p53絲氨酸37在應(yīng)答T-oligo處理時被磷酸化(圖11)。權(quán)利要求1.一種篩選WRN調(diào)節(jié)劑的方法，包括(a)提供一種表達(dá)WRN的細(xì)胞；(b)在調(diào)節(jié)劑被該細(xì)胞攝取的條件下將候選調(diào)節(jié)劑與所述細(xì)胞接觸；及(c)測定該細(xì)胞與DNA損傷應(yīng)答途徑激活相關(guān)的性質(zhì)，其中與對照相比，所述性質(zhì)的變化指示所述候選調(diào)節(jié)劑是WRN調(diào)節(jié)劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述候選調(diào)節(jié)劑特異結(jié)合WRN。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞的性質(zhì)選自細(xì)胞增殖；細(xì)胞生存力；細(xì)胞形態(tài)學(xué)；SA-β-Gal活性；p53磷酸化、p95磷酸化、ATM磷酸化、H2AX磷酸化、誘導(dǎo)S期停滯和誘導(dǎo)凋亡。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的候選調(diào)節(jié)劑選自碳水化合物、單糖、寡糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、脂質(zhì)、類維生素A、類固醇、糖肽、糖蛋白、蛋白聚糖和有機(jī)小分子。6.一種篩選特異結(jié)合WRN的物質(zhì)的方法，包括(a)將候選物質(zhì)與WRN接觸；以及(b)確定候選物質(zhì)是否特異結(jié)合WRN。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中WRN附著于固相支持物。8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中候選物質(zhì)附著于固相支持物。9.一種篩選WRN調(diào)節(jié)劑的方法，包括(a)在體外在存在WRN的核酸底物的情況下將WRN與候選調(diào)節(jié)劑接觸，以及(b)測定所述底物的水解，其中通過與對照比較所述底物的水解的改變來鑒定調(diào)節(jié)劑。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述核酸底物是與(TTAGGG)n有至少33％核苷酸序列相同性的寡核苷酸，其中n＝1-20。11.一種治療癌癥的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN激活劑的組合物。12.一種誘導(dǎo)凋亡的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN激活劑的組合物。13.一種誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN激活劑的組合物。14.一種促進(jìn)皮膚曬黑的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN激活劑的組合物。15.一種促進(jìn)細(xì)胞分化的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN激活劑的組合物。16.一種促進(jìn)免疫抑制的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN激活劑的組合物。17.根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項的方法，其中激活劑是一種與(TTAGGG)n有至少33％核苷酸序列相同性的WRN寡核苷酸激活劑，并且至少前x個3′-核苷酸鍵是可被3′-5′核酸酶水解的，其中n＝1-20，x為大約1至大約10。18.一種抑制凋亡的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN抑制劑的組合物。19.一種抑制細(xì)胞衰老的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN抑制劑的組合物。20.一種促進(jìn)生長的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN抑制劑的組合物。21.一種抑制皮膚曬黑的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN抑制劑的組合物。22.一種抑制細(xì)胞分化的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN抑制劑的組合物。23.一種減少癌癥治療的副作用的方法，包括給予需要此治療的對象一種包含WRN抑制劑的組合物。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中該組合物與化療或電離輻射組合給予。25.根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項的方法，其中抑制劑是一種與(TTAGGG)n有至少33％核苷酸序列相同性的WRN寡核苷酸抑制劑，并且至少前x個3′-核苷酸鍵是可被3′-5′核酸酶水解的，其中n＝1-20，x為大約0至大約10。26.一種組合物，其包含與(TTAGGG)n有至少33％核苷酸序列相同性且具有至少一個不可水解的核苷酸間鍵的寡核苷酸，其中該寡核苷酸的至少前x個3′-核苷酸鍵是可被3′-5′核酸酶水解的，其中n＝1-20，x為大約0至大約10。27.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中3′-5′核酸酶是WRN。全文摘要本發(fā)明描述了WRN調(diào)節(jié)劑的用途。WRN激活劑可以用來誘導(dǎo)生長抑制、細(xì)胞凋亡或增殖性衰老，而WRN抑制劑可以用來減少生長抑制、細(xì)胞凋亡或增殖性衰老。本發(fā)明還描述了鑒別WRN調(diào)節(jié)劑的方法。文檔編號G01N33/50GK1965076SQ200580015751公開日2007年5月16日申請日期2005年5月19日優(yōu)先權(quán)日2004年5月19日發(fā)明者巴巴拉·A.·吉爾克萊斯特,馬克·S.·埃勒申請人:波士頓大學(xué)理事會