專利名稱：抗胃泌素激素單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及針對胃泌素激素的特定部位的抗體以及動物(尤其是人)體內不同形式胃泌素激素。本發(fā)明還進一步涉及這些單克隆抗體(MAb)在檢測、診斷和監(jiān)測胃泌素介導的疾病和狀況方面的應用，以及使用本發(fā)明中的MAb對胃泌素介導的疾病和狀況進行預防和治療的方法。
背景技術：
盡管胃泌素激素在100年前就被首次發(fā)現(xiàn)，并在20世紀60年代進行了提純，但它對不同正常和患病組織的作用仍未能被完全了解。難以對各種不同形式的胃泌素激素分別進行檢測和定量測定一直是造成人們對胃泌素系統(tǒng)認知缺乏的一個主要原因。
哺乳動物體內的多肽類激素胃泌素以幾種形式存在，根據其肽鏈上氨基酸殘基的數(shù)量，主要可歸為兩大類“小”胃泌素和“大”胃泌素?！靶　蔽该谒匕ǔ墒煳该谒?17(G17)和甘氨酸延伸型胃泌素G17(G17-Gly)；而“大”胃泌素包括胃泌素-34(G34)和甘氨酸延伸型G34(G34-Gly)。成熟形式的G17是胃酸分泌的一個主要效應物，其作用估計比G34強6倍多。不同形式的胃泌素在體內由前體肽、前胃泌素經過斷裂，或者，在有的情況下，由斷裂物修飾而生成。人G34在其C-末端具有G17完整的17個氨基酸的序列，并且，可預見地，與G17發(fā)生交叉免疫反應。
成熟G17的氨基端和羧基端殘基均經過修飾N-末端(氨基末端)的谷氨酸被環(huán)化形成焦谷氨酸(pGlu)，而C-末端(羧基末端)苯丙氨酸殘基的游離羧基被肽基α-酰胺化單氧化酶(PAM)酰胺化形成C-末端苯丙氨酸-NH2。成熟G34的C-末端被同樣酰胺化形成C-末端苯丙氨酸-NH2(見Dockray et al.，Ann.Rev.Physiol.(2001)63119-139)。
人類“小”胃泌素的主要形式--成熟G17的氨基酸序列為pEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO1)。在健康人體中發(fā)現(xiàn)的次要形式的“小”胃泌素G17-Gly是一種未加工完全的胃泌素，其氨基酸序列為pegpwlEeeeeaygwmdfg(seq id no2)。
人類“大”胃泌素的主要形式--胃泌素-34的氨基酸序列為pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO3)，而甘氨酸延伸型胃泌素34(G34-Gly)具有額外的C-末端甘氨酸殘基，氨基酸序列為pELGPQGPPHLVADPSKKEGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO4)。
胃泌素由胃幽門竇-G細胞在胃泌素釋放肽(GRP)的作用下分泌，受胃酸和幾種多肽類激素(最主要的是生長激素抑制素)的旁分泌作用的抑制。人們很早已發(fā)現(xiàn)胃泌素肽能刺激健康人體胃的胃酸分泌，但是，直到最近才發(fā)現(xiàn)這些肽還控制著胃腸(GI)系統(tǒng)不同類型細胞的增殖、分化和成熟。
除在胃腸(GI)系統(tǒng)的局部作用外，G17、G17-Gly(更少些)，還被釋放入血液中，并被發(fā)現(xiàn)在罹患胃腸道疾病(如胃癌、結腸直腸癌和胰腺癌)的患者的血清中有所增加。最近還發(fā)現(xiàn)這幾種類型的胃泌素與其它與胃腸道無關的疾病相關，包括小細胞肺癌(SCLC)和肝轉移瘤。例子參見″Gastrin and Colon Cancera unifying hypothesis″S.N.Joshi etal.，DigestiveDiseases(1996)14334-344；和″Gastrin and Colorectal Cancer″Smith，A.M.and Watson，S.A.Alimentary Pharmacology and Therapeutics(2000)14(10)1231-1247。
抗體是醫(yī)學、獸醫(yī)學和其它領域所用的許多測定技術中的關鍵試劑。這類測試包括許多常規(guī)使用的免疫測定技術，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、免疫組織化學(IHC)和免疫熒光(IF)測定法。
單克隆抗體(MAb)具有獨特的特性，使得它們在被用于多種這類測定時，在許多方面均優(yōu)于多克隆抗血清和多克隆抗血清提純所得抗體。這些特性包括對靶抗原的單抗原決定簇特異性(即，對單一表位的特異性)、在多種抗體制備中不變的特異性、以及長時間不變的親和力和化學組成。而且，MAb可通過體外方法無限期地并不受數(shù)量限制地進行生產。這些特性與多克隆抗體的特性形成了鮮明對比，后者需要用到體內免疫法，不可避免地具有生物變異性和免疫動物壽命所決定的有限的抗體生產能力。
盡管有這些優(yōu)點，即使是對同一表位具特異性的各個單克隆抗體之間也存在差異。例如由單一抗原表位部位免疫誘導的單克隆抗體可能因為以下一種或所有特性而出現(xiàn)差異1)對表位分子組成和三級結構的精確特異性；2)抗體個體基因型；3)抗體親和力；4)抗體同種異型；和5)抗體同種型。這些特性上的差異能影響單克隆抗體在特定免疫測定中的表現(xiàn)，使得針對同一抗原部位的不同單克隆抗體分離物在一給定的測定中具有不同的表現(xiàn)。作為結果，在被作為試劑用于特定的免疫測定中時，一些單克隆抗體將優(yōu)于其它與同樣表位結合的抗體。
免疫測定法可以是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、免疫擴散測定或免疫檢測測定，如酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)、槽印跡(slot-blot)、或蛋白質斑跡法。作為這些技術的一個總的指導，參見例如Ausubel et al.(eds)(1987)in″Current Protocols in MolecularBiology″John Wiley and Sons，New York，N.Y。或者，免疫測定法也可以是為使組織樣品中的某種胃泌素激素顯像所用的免疫組織化學(IHC)染色法或免疫熒光(IF)操作。例子參見″Principles and Practice ofImmunoassay″(1991)Christopher P.Price and David J.Neoman(eds)，Stockton Press，New York，N.Y。
對G17的N末端部位和C-末端部位具選擇性的單克隆抗體已進行了描述。例子參見Azuma et al.，Gastroenterologica Japonica(1986)21(4)319-324；Ohning et al.，Peptides(1994)15(3)417-423；Fuerle et al.，Pancreas(1995)10(3)281-286；Kovacs et al.，Peptides(1996)17(4)583-587；Ohning et al.，Am.J.Physiol.(1996)271(3 Pt 1)G470-476；Sipponen et al.，(2002)Scand.J.Gastroenterol.37(7)785-791。但是，不論這些抗體的單獨形式或組合，都未被發(fā)現(xiàn)能對正常和病變生物學液體中的一種以上的不同形式胃泌素激素進行識別和定量分析。
抗胃泌素多克隆抗體已被證明可抑制胃泌素的活性(″Inhibition ofgastrin activity by incubation with antibodies to the C-terminal tetrapeptide ofgastrin″Jaffe et al.，Surgery(1969)65(4)633-639)；而且非人類抗胃泌素多克隆抗體已被用于治療罹患Zollinger-Ellison綜合征(在無進食刺激的情況下胃泌素過度分泌)的患者。見Hughes et al.，″Therapy with GastrinAntibody in the Zollinger-Ellison Syndrome″Hughes et al.，DigestiveDiseases(1976)21(3)201-204。但是，這些兔抗胃泌素抗體“最多能對患者起到短期治療作用?！?Hughes at p.204)。美國專利5,886,128和5,785,970揭示了一種通過使用胃泌素肽綴合物免疫對生長依賴于或受胃泌素激素刺激的潰瘍或腫瘤進行治療的方法。
最近，血清中的酰胺化胃泌素激素與非酰胺化胃泌素激素的比率被建議作為衡量個體發(fā)生十二指腸潰瘍或胃萎縮風險的指標。見已公開的T.C.Wang的美國專利申請2003/0049689，名為″Diagwlosis and Treatmentof Gastrointestinal Disease″。另一組使用的方法包括測量禁食G17水平，將禁食G17的陽性判別值與胃蛋白酶原I/II和幽門螺旋桿菌標志物水平相比較，作為評估胃酸相關疾病風險的基礎。見WO0423148，
公開日2004年3月18日。
直到現(xiàn)在，還未能獲得能對G17、G17-Gly、G34和G34-Gly進行靈敏檢測和準確分辨的單克隆抗體(MAb)。而且，直至本發(fā)明為止，還無法準確測量生物學液體樣品中每種形式的胃泌素激素的含量。使用本發(fā)明中的單克隆抗體(MAb)進行臨床檢驗測定能更準確地說明正常和患病情況下的胃泌素激素生物學。使用本發(fā)明中的單克隆抗體還能提供藥學單克隆抗體成分以及預防和治療胃泌素相關疾病和狀況的方法。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了選擇性與胃泌素-17(G17)或甘氨酸延伸型G17(G17-Gly)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(對應G17的氨基酸1-6，SEQ ID NO5)中的表位結合的單克隆抗體(MAb)。還提供了產生這些選擇性與胃泌素-17(G17)或G17-Gly的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(SEQ ID NO5)中的表位結合的單克隆抗體的雜交瘤。
本發(fā)明還提供了選擇性與胃泌素-17(G17)或胃泌素-34的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO6)中的表位結合的單克隆抗體(MAb)。本發(fā)明還提供了產生這些選擇性與胃泌素-17(G17)或胃泌素-34(G34)的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO6)中的表位結合的單克隆抗體的雜交瘤。
本發(fā)明進一步提供了選擇性與人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO7)中的表位結合的單克隆抗體(MAb)。本發(fā)明還提供了產生這些選擇性與胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO7)中的表位結合的單克隆抗體的雜交瘤。
本發(fā)明還進一步提供了選擇性與甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列ygwmdfg(SEQ ID NO8)中的表位結合的單克隆抗體(MAb)。本發(fā)明還提供了產生這些選擇性與甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列ygwmdfg(SEQ ID NO8)中的表位結合的單克隆抗體(MAb)的雜交瘤。
本發(fā)明中兩種或兩種以上抗體的組合可被用于選擇性與胃泌素激素的G17、G17-Gly、G34和G34-Gly等各種形式的N-末端或C-末端相結合的單克隆抗體組中。
另外本發(fā)明還提供了選擇性與以下之一相結合的單克隆抗體的藥物組合物(1)胃泌素-17(G17)或甘氨酸延伸型G17(G17-Gly)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(對應G17的氨基酸1-6，SEQ ID NO5)中的表位(2)胃泌素-17(G17)或胃泌素-34(G34)的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO6)中的表位；(3)人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO7)中的表位；或(4)甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列YGWMDFG(SEQ ID NO8)中的表位；以及藥用可接受的載體。
患者的胃泌素介導的疾病或狀況可通過測定患者生物學液體樣品中一種形式的胃泌素激素水平，并將樣品中的胃泌素激素水平與健康人生物學液體樣品中的胃泌素激素正常水平相比較來進行診斷。
這類胃泌素介導的疾病或狀況可通過給予患者含有選擇性與以下之一相結合的單克隆抗體(MAb)的藥物組合物進行預防或治療(1)胃泌素-17(G17)或甘氨酸延伸型G17(G17-Gly)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(對應G17的氨基酸1-6，SEQ ID NO5)中的表位；(2)胃泌素-17(G17)或胃泌素-34(G34)的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO6)中的表位；(3)人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO7)中的表位；或(4)甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列YGWMDFG(SEQ ID NO8)中的表位。
本發(fā)明還提供了一種對患者胃泌素介導的疾病或狀況的過程進行監(jiān)測的方法。該方法包括在初始時間點測定患有胃泌素介導的疾病或狀況或存在患胃泌素介導的疾病或狀況的風險的患者的生物學液體樣品中的胃泌素激素水平；在不同時間點測定患者的一個或多個生物學液體樣品中的胃泌素激素水平；并以此監(jiān)測胃泌素介導的疾病或狀況的過程。
本發(fā)明還提供了一種對患胃泌素介導的疾病或狀況的患者的胃泌素激素阻斷治療進行評估的方法。該方法包括步驟(a)-(j)a)在治療前或在治療早期獲取患者的第一個生物學液體樣品；b)通過免疫測定法測定第一個樣品中的胃泌素激素水平；c)在待治療疾病或狀況以及第一個樣品中的胃泌素激素水平的基礎上進行診斷；d)給予患者藥物治療，包括施用能與胃泌素激素相結合以調整其與體內靶受體的結合的第一藥劑或能產生該第一藥劑的物質；e)在治療起效所需的合適時間后獲取患者的第二個生物學液體樣品；f)通過免疫測定法測定第二個樣品第一部分中的總胃泌素激素(包括結合和游離胃泌素激素)水平，其中第二個樣品的第一部分與以下物質孵育(i)置換任何與第一藥劑的胃泌素激素結合的第二藥劑，和(ii)固定化抗胃泌素激素抗體，其中固定化抗體未與第二藥劑結合；洗滌除去第二藥劑并加入一種可檢測的抗體，所述抗體與胃泌素激素相結合且不與固定化抗體相競爭，形成免疫復合物，其含有與胃泌素激素相結合的固定化抗體，而同時胃泌素激素也與可檢測的抗體相結合；g)檢測免疫復合物中可檢測的抗體的量并由此確定第二個樣品中總胃泌素激素的量；h)以第二種樣品第二部分重復步驟f)和g)測定其中的游離胃泌素激素水平，其中步驟f)中的孵育過程未加入第二藥劑；及j)比較第一個樣品中測得的游離胃泌素激素的量和第二個樣品中游離胃泌素激素和總胃泌素激素的量，以確定對患者進行胃泌素激素阻斷治療的效果。
本發(fā)明進一步提供了一種進行免疫測定用的試劑盒，包括一種抗胃泌素激素單克隆抗體(MAb)和一種適當?shù)娜萜?。抗胃泌素單克隆抗體(MAb)優(yōu)選以下單克隆抗體組中的抗體400-1、400-2、400-3、400-4、401-2、445-1、445-2和458-1。
圖形簡述

圖1使用人G17-BSA包被板進行的ELISA測定。以405nm的吸光度(A405)對下列血清滴度作圖方塊代表測試樣品血清。菱形代表免疫前采血血清(pre-bleed)。三角形代表參考標準血清。確定陽性標準血清在滴度2×105(1)處的吸光度值(2)。測試樣品曲線與該吸光度值的交叉點即為測試樣品的滴定度(3)。在本例子中，測試樣品的滴度為2.8×104。
圖2一條代表性總胃泌素-17校準曲線，顯示了與450nm的吸光度(A450)相對應的胃泌素濃度(以皮摩爾標繪)，并使用四甲基聯(lián)苯胺(TMBS)發(fā)色團來顯示酶的變化。
圖3一條代表性游離胃泌素-17校準曲線，顯示了如上所述的與450nm的吸光度(A450)相對應的胃泌素濃度(以皮摩爾標繪)。
發(fā)明詳述以下提供了本說明書中使用的術語和短語的定義此處交替使用的“胃泌素激素”或“胃泌素激素形式”指的是任何具有生物活性和/或交叉免疫反應的胃泌素肽。胃泌素激素的主要形式包括但不局限于胃泌素-17(G17)，無論其帶有酰胺化羧基端或帶有游離羧基端；甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)；胃泌素-34(G34)，包括羧基端酰胺化形式和帶游離羧基端的形式；甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)，和前胃泌素。
此處使用的樣品中的胃泌素激素“總量”指的是游離(非結合)胃泌素激素的量與復合(結合)胃泌素激素的量之和。復合胃泌素激素可能是與樣品中的抗體或其它結合部分相結合而成。
此處使用的“生物學液體”指的是任何含有生物起源物質的液體。用于本發(fā)明的優(yōu)選生物學液體包括動物(尤其是哺乳動物，優(yōu)選人)的體液。體液可以是任何體液，包括但不局限于血液、血漿、血清、淋巴液、腦脊液(CSF)等等。
此處使用的“防腐劑”指的是任何可減少生物學液體樣品或含有生物成分的液體樣品中的胃泌素隨時間的降解的藥劑、補充物或添加劑。能用于本發(fā)明實踐的防腐劑包括任何工藝上已熟知的防腐劑，包括但不局限于普通化學防腐劑，如疊氮化鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)；蛋白酶抑制劑，如苯甲基磺酰氟化物(PMSF)和胰蛋白酶抑制劑(如特斯樂(Trasylol))；或生物防腐劑，如肝素。
新的抗-胃泌素單克隆抗體優(yōu)選通過評估每種候選單克隆抗體在最終應用中的表現(xiàn)來進行最適用于某特定應用的單克隆抗體(MAb)的選擇?；诖嗽颍瑢蜻x單克隆抗體在預期最終應用中的最佳功能性的測試是生成最適用于預期應用的單克隆抗體的選擇步驟的一部分。除了通常所用的生成單克隆抗體的選擇步驟(包括與靶抗原結合，對產生單克隆抗體的雜交瘤進行系列克隆以保證雜交瘤細胞株基本特性的穩(wěn)定(包括持續(xù)的細胞生長和分裂，以及無限期地不受限制地產生抗體))外，還要進行這項選擇步驟。
此處使用的術語，對某特定形式的胃泌素激素的“選擇性”指的是抗體由于對某特定形式的胃泌素激素的特定靶表位具特異性，而可與每種含有這種靶表位的胃泌素激素相結合。例如成熟G17和G34均具有成熟(酰胺化)G17的C-末端，因此，對在成熟G17的C-末端發(fā)現(xiàn)的靶C-末端表位具特異性的單克隆抗體對G17(以及G34)具有選擇性。
本發(fā)明還具體說明了一種鑒別對各種生物活性形式的胃泌素激素、酰胺化胃泌素-17(G17)、酰胺化胃泌素-34(G34)、甘氨酸延伸型胃泌素17(G17-Gly)、甘氨酸延伸型胃泌素34(G34 Gly)和前胃泌素的N-末端和C-末端具選擇性的單克隆抗體(單克隆抗體具有更好的特性)的方法。這些單克隆抗體尤其適合被用于測量生物學液體中特定形式胃泌素激素所用的免疫酶分析(通常稱為“ELISA”或酶聯(lián)免疫吸附分析)中。本發(fā)明中的單克隆抗體也適合被用于免疫檢測(如酶聯(lián)免疫斑點/ELISPOT、放射性免疫測定、抗體三明治捕捉試驗、點印跡法、槽印跡法和蛋白質斑跡法)中對胃泌素激素進行檢測和/或定量測定。
一方面，本發(fā)明提供了選擇性與胃泌素-17(G17)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(SEQ ID NO5)中的表位結合的單克隆抗體。這些對胃泌素-17(G17)的N-末端具有選擇性的單克隆抗體與肽pEGPWLEEEE(SEQ ID NO11)的BSA-綴合物的結合受人G17、馬G17或人G17-Gly的抑制。
另一方面，本發(fā)明還提供了選擇性與胃泌素-17(G17)或胃泌素-34(G34)的C-末端的氨基酸序列EEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO6)中的表位結合的單克隆抗體。
另一方面，本發(fā)明還提供了選擇性與人胃泌素-34(hG34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO7)中的表位結合的單克隆抗體。
在又一方面，本發(fā)明還提供了選擇性與甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列ygwmdfg(SEQ ID NO8)中的表位結合的單克隆抗體。
在又一方面，本發(fā)明還提供了選擇性與前胃泌素相結合的單克隆抗體。這些單克隆抗體與前胃泌素相結合，但不與加工后的胃泌素激素形式(G17、G17、G17-Gly或G34-Gly)結合。本發(fā)明中對前胃泌素具選擇性的單克隆抗體包括與人前胃泌素的C-末端相結合的單克隆抗體。這些單克隆抗體也將與含有101氨基酸肽鏈(隨后被加工生成前胃泌素和胃泌素)的前胃泌素原相結合。但是，對前胃泌素原的加工很快并且發(fā)生在合成其的內質網(ER)中。本發(fā)明中與前胃泌素相結合的單克隆抗體可用于此處所述的測定中，對樣品中的前胃泌素進行檢測和定量測定。
對于本發(fā)明中的單克隆抗體優(yōu)選結合的胃泌素形式，所述抗體對其具有選擇結合性，結合常數(shù)(Ka)為106至約107LM-1，優(yōu)選約107至約108LM-1，更優(yōu)選約108至109LM-1，更優(yōu)選約109至約1010LM-1，更優(yōu)選約1010至約1011LM-1，最優(yōu)選1011至1012LM-1。
抗胃泌素單克隆抗體組本發(fā)明首次提供了能對G17，G17-Gly，G34和G34-Gly胃泌素激素形式進行明確鑒定和定量測定的抗胃泌素激素單克隆抗體組。例如，含有對G34的N-末端具選擇性的單克隆抗體和對G17/G34(G34的C-末端與G17的C-末端完全相同)的C-末端具選擇性的單克隆抗體的單克隆抗體組，可通過眾多常規(guī)免疫分析測定法中的任何一種對樣品中的G34進行特異性鑒定和定量測定?？赡苡玫奖景l(fā)明中的單克隆抗體的常規(guī)免疫測定包括但不局限于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)、放射性免疫測定(RIAs)、免疫熒光測定(IFs)、免疫組織化學測定(IHCs)、免疫擴散測定等等。這類常規(guī)診斷測定方法的例子參見美國專利5,932,412，名為″Syntheticpeptides in human papilloma virus 1，5，6，8，11，16，18，31，33 and 56 usefulin immunoassay for diagnostic purposes″，Dillner et al。
往單克隆抗體組中補加一種或多種額外的本發(fā)明中的單克隆抗體可對樣品中更多的胃泌素激素種類進行鑒定和定量測定。例如往上述抗體組中加入對G17的N-末端具選擇性的單克隆抗體可進一步實現(xiàn)通過以下所述的本發(fā)明中的方法對樣品中的游離和總(結合+游離)G17激素進行特異性鑒定和定量測定。
類似地，含有對G34的N-末端具選擇性的單克隆抗體和對甘氨酸延伸型G34的C-末端(與甘氨酸延伸型胃泌素G17的C-末端相同)具選擇性的單克隆抗體的單克隆抗體組可實現(xiàn)對樣品中的甘氨酸延伸型G34的鑒定和定量測定。另外，按此處所描述的，往單克隆抗體組中補加對G17的N-末端具選擇性的單克隆抗體可實現(xiàn)對樣品中的游離和總(結合+游離)甘氨酸延伸型胃泌素G17的鑒定和定量測定。
選自本發(fā)明的單克隆抗體中的，用于鑒定、定量測定和監(jiān)測其它形式胃泌素激素的單克隆抗體組中的成對單克隆抗體的組合對本領域人員來說也就顯而易見了。本發(fā)明包括了所有這類本發(fā)明中的單克隆抗體對以及本發(fā)明中單克隆抗體對的組合以及本發(fā)明中的單克隆抗體對的任何其它集合。
本發(fā)明中的單克隆抗體提供了準確測定胃泌素激素形式的量及比率的方法，用于對胃泌素介導的疾病和狀況的易感性進行評估，以及對患者的這類疾病和狀況進行檢測和診斷。例如，本發(fā)明中的抗胃泌素單克隆抗體可被用于ELISA測定中，對患者血清或其它生物學液體中的任何或全部G17、G34、G17-Gly和G34-Gly胃泌素激素形式進行大范圍篩選。
本發(fā)明中的單克隆抗體、選自本發(fā)明中的單克隆抗體的單克隆抗體對的組合以及本發(fā)明中的單克隆抗體組在高流通量方法中尤其有用。這類方法包括胃泌素激素抗原檢測用微芯片和微點陣方法，即可在一微量培養(yǎng)板或載玻片或其它測定基層(如具有有效孔的平板，如Garyantes etal的美國專利6,565,813所描述那樣)上對多個樣品進行檢查。對結合的檢測可通過任何一種現(xiàn)有的形式化檢測系統(tǒng)進行。對結合的檢測可通過，例如，特定生物分子反應(如抗原-抗體結合)引起的表面細胞質基因組抵抗力變化來進行。這種技術在酶測定中的應用的例子參見Taremi et al的美國專利5,981,167。這種技術可被應用于持續(xù)恒流模式，也可用于對抗體與表面固定化肽或蛋白質(如胃泌素激素)的結合進行檢測，或被用于胃泌素抗體復合物的檢測。后一種復合物可通過與對不受復合物抗體立體阻礙的胃泌素激素(G17，G34，G17-Gly或G34-Gly)的表位具特異性的表面固定化抗體的結合進行檢測。另外，這項技術還具有高處理能力和高靈敏性的優(yōu)點，不需用到放射標記。
本發(fā)明中的單克隆抗體還可用于組織樣品(例如，活檢材料)的免疫組織化學(IHC)和免疫熒光(IF)測定。這類測定可被用于檢測個體胃泌素激素形式的異常水平，并由此對胃泌素介導的疾病和狀況進行診斷。
本發(fā)明中的單克隆抗體可根據已有的熟知技術進行人源化。例子參見Waldman et al的美國專利6,689,869，名為″Labeled humanizedanti-CD-18 antibodies and fragments and kits″及Carter et al的美國專利6,639,055，名為“Method for making humanized antibodies″。人源化抗體可被調整為與原始小鼠單克隆抗體的親和力更加吻合。例子參見，Ono et al的美國專利6,699,974，名為″Re-shaped human anti-HM1.24 antibody″。
本發(fā)明中的單克隆抗體還可被用于預防和治療胃泌素介導的疾病和狀況。本發(fā)明中的抗胃泌素單克隆抗體可被制成藥劑用于對特定胃泌素激素形式的被動免疫。例子參見Blackburn et al的美國專利6,391,299(下文稱′299專利)，名為″Anti-factor IX/IXa antibodies″。本發(fā)明中的單克隆抗體的功能片段，例如，F(xiàn)ab片段(抗原結合片段)、F(ab′)2片段和任何具有與對應的胃泌素激素形式相結合的能力的片段(對片段的描寫見′299專利)，也可被用于藥劑中用于治療。(有用的藥物組合物參見′299專利。)本發(fā)明中的優(yōu)選給藥途徑包括胃腸道外給藥途徑，如皮下、肌內和靜脈內途徑?；蛘?，也可通過鼻內途徑給藥。這類藥劑在有效量給予的情況下對預防或治療存在高此類疾病風險的患者的胃泌素介導的疾病或狀況，或治療已患有此類疾病或狀況的患者尤其有用。
含有抗胃泌素單克隆抗體，尤其是本發(fā)明中用于治療胃泌素介導的疾病或狀況的人源化抗胃泌素單克隆抗體的完整或功能片段的藥物的有效量被定義為能預防疾病發(fā)作或減緩疾病或狀況發(fā)展的量；更優(yōu)選的有效量為能穩(wěn)定疾病或狀況的量；更優(yōu)選的有效量為能使疾病或狀況消退的量；最優(yōu)選的有效量為能完全治愈疾病或狀況的量。
另外，本發(fā)明中的單克隆抗體還可被應用于監(jiān)測胃泌素介導的疾病和狀況進展的免疫測定中，其中特定胃泌素激素形式(或游離、結合或總胃泌素形式)的水平或量可對治療的成功，或胃泌素介導的疾病或狀況的進展提供指示。
另外，本發(fā)明中的單克隆抗體可被用于對患胃泌素介導的疾病或狀況的患者的胃泌素激素阻斷治療進行評估的方法中。該方法包括以下步驟a)在治療前或治療早期自患者取得第一個生物學液體樣品；b)通過免疫測定法測定第一個樣品中的胃泌素激素水平；c)基于待治療疾病或狀況和第一個樣品中的胃泌素激素水平進行診斷；d)對患者進行治療，包括施用與胃泌素激素結合以調整其與體內靶受體的結合的第一藥劑或能生成該第一藥劑的物質；e)在治療起效所需的適當時間之后，自患者取得第二個生物學液體樣品；
f)通過免疫測定法測定第二個樣品的第一部分中的總胃泌素激素水平，所述總胃泌素激素包括結合胃泌素激素和游離胃泌素激素，其中將第二個樣品的第一部分與以下物質孵育(i)置換任何與第一藥劑相結合的胃泌素激素的第二藥劑，和(ii)固定化的抗胃泌素激素抗體，其中所述固定化抗體不與第二藥劑結合；洗滌除去第二藥劑并加入一種可檢測的抗體，所述可檢測的抗體與胃泌素激素結合且不與所述固定化抗體相競爭，由此形成一種免疫復合物，所述免疫復合物包含與胃泌素激素相結合的固定化抗體，而該胃泌素激素同時與所述可檢測的抗體相結合；g)檢測免疫復合物中可檢測的抗體的量并由此確定所述第二個樣品中總胃泌素激素的量；h)使用第二個樣品的第二部分重復步驟f)和g)以測定游離胃泌素激素水平，其中進行步驟f)中的孵育過程時未加入所述第二藥劑；和j)比較在第一個樣品中測得的游離胃泌素激素的量和第二個樣品中的游離胃泌素激素和總胃泌素激素的量，以確定對患者進行胃泌素激素阻斷治療的效果。
上述用于對患者胃泌素激素阻斷治療進行評估的方法在臨床實踐中尤其具有價值，其中對開始一種或另一種治療方案時機的確定對患者的治療效果很關鍵。本發(fā)明中的方法提供了為這些重要決定作基礎的信息。這種方法提供了治療前或治療早期的胃泌素激素測量數(shù)據(例如，在使用胃泌素肽結合疫苗進行免疫后不久，如美國專利5,622,702)所描述那樣)，還提供了在估計治療開始生效后的一個或多個總和/或游離胃泌素激素測量數(shù)據。
胃泌素激素阻斷治療可以是自動免疫，其中生成對抗胃泌素抗體的免疫原是按照上述方法給入患者體內的?；蛘撸该谒丶に刈钄辔镔|也可以是被動給予患者的。胃泌素激素阻斷物質可以是任何以下胃泌素激素阻斷物質，包括但不局限于抗胃泌素激素抗體，尤其是人源化單克隆抗胃泌素激素抗體；或者胃泌素激素阻斷物質也可以是胃泌素激素受體或胃泌素激素受體模擬物。胃泌素激素受體模擬物可以是任何仿與胃泌素激素相結合的胃泌素激素受體的分子，例如，可溶胃泌素激素受體或可溶胃泌素激素受體片段，或任何其它具有與胃泌素激素相結合能力的分子。
本發(fā)明還提供了對懷疑含有胃泌素激素的樣品進行篩選的藥物、方法和試劑盒。這種篩選可在患者樣品或懷疑含有或產生這種多肽的實驗室樣品中進行。試劑盒可含有本發(fā)明中的一種抗體。試劑盒可含有檢測樣品與本發(fā)明中的抗體之間的相互作用的試劑。提供的試劑可以是放射性的、熒光的、或酶示蹤的。試劑盒可含有一種已知的，能與本發(fā)明中的抗體結合或反應的放射示蹤試劑。
試劑盒中的試劑可以液體溶液、附于固體載體或以干燥粉末的形式提供。當試劑以液體溶液形式提供時，優(yōu)選水溶液。當試劑附于固體載體提供時，固體載體優(yōu)選層析介質，如帶有多孔的測試板，或載玻片。當試劑以干粉形式提供時，粉末可通過加入合適的溶劑(可能提供)進行重新配制。
本發(fā)明中的試劑盒置于容器中提供，通常包括放置抗體、抗原或檢測試劑的藥瓶(優(yōu)選分裝為合適的量)。本發(fā)明中的典型試劑盒還包括一種放置抗體、抗原和試劑的用于商業(yè)銷售的容器。這些容器可以是放置所需藥瓶和一種或多種必需化學品(如色譜材料、溶劑和洗脫劑、試管、去污劑、抗體和檢測反應用的化學物質)的塑料容器。
在進一步實施例中，本發(fā)明還涉及免疫檢測法及相關試劑盒。建議可采用此處的胃泌素激素或肽片段來檢測具有活性的抗體；或者，可采用根據本發(fā)明所制備的抗體來檢測胃泌素激素或含胃泌素激素介導表位的肽?？偟膩碚f，這些方法將包括首先獲取懷疑含有這類激素、肽或抗體的樣品，在適于免疫復合物形成的環(huán)境下，將樣品與符合本發(fā)明的抗體或肽相接觸，然后檢測生成的免疫復合物。
一般來說，對免疫復合物結構的檢測在技術上已熟知，并可通過無數(shù)的方法實現(xiàn)。例如，本發(fā)明考慮的是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、免疫印跡(如點印跡法、槽印跡法、蛋白質斑跡法等)，間接免疫熒光技術等等。通常，免疫復合物的結構將通過使用標記(如放射性標記或酶標記(如堿性磷酸(酯)酶、辣根過氧化物酶等))進行檢測。根據熟知的方法，使用第二結合配體(如第二抗體或者生物素/抗生物素蛋白的配體結合)，還能產生更多的收益。
實施例1.制備抗人G17C-末端的單克隆抗體通過標準固相肽合成法，商業(yè)化合成肽CSSEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO10)，其含有接頭(-Cys-Ser-Ser-)序列以及包括人G17和G34C-末端表位(-EEAYGWMDF-NH2，SEQ ID NO6)氨基酸序列。
將肽按以下步驟結合入免疫原中以誘導產生針對G17/G34C-末端的抗體首先將肽與白喉類毒素(“DT”)進行共價連接生成肽-載體綴合物。每個DT載體上的肽單位數(shù)量為確定值，最終綴合物被制成免疫原。使用的技術在美國專利5,622,702中進行了描述。
簡單地說，肽與載體的化學結合通過異基雙功能交聯(lián)劑epsilon-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide(ε-MCS)進行。綴合物通過在0.1M pH7.3的磷酸鈉緩沖溶液(PBS)中透析進行純化，并通過Lowry測定法測定蛋白質濃度。DT上的肽置換水平取決于綴合物氨基酸分析的摩爾組成。通過將綴合物溶液與Montanide ISA703油(SEPPIC，F(xiàn)rance)按30/70的比率(綴合物佐劑質量比)混合，將溶解后的綴合物制成以Montanide ISA703作佐劑的免疫原。吸取適當體積的每種液體到注射器中，然后通過一個連接中心將溶液在兩個注射器間快速來回推動，完成混合。
首先通過腹腔注射0.1mL 0.1mg肽-DT綴合物免疫原/Montanide ISA703對小鼠進行免疫。首次注射3個星期后進行相同劑量的二次注射。
為制備產生對G17/G34的C-末端具選擇性的單克隆抗體的雜交瘤，使用熟知的標準技術將免疫小鼠的脾細胞與標準小鼠骨髓瘤融合配體細胞株進行融合。這些方法在許多綜述和實驗室手冊中均進行了描述，例子參見美國專利4,196,265，Method of producing antibodies to Kaprowski etal；″Selected Methods in Cellular Immunology″(Chapter 17ImmunoglobulinProducing Hybrid Cell Lines，B.Mishell and S.Shiigi，W.H.Freeman andCo.，San Francisco，1980)；Harlowe and Lane，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；Zola，MonoclonalAntibodiesA Manual of Techniques，CRC Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L，1987。在收集用于細胞融合的小鼠脾細胞的四天前，通過腹腔注射對免疫小鼠追加0.1mg溶于PBS的上述肽-DT綴合物。按Mishell和Shiig所描述那樣，使用次黃嘌呤-氨喋呤-脫氧胸腺嘧啶核苷補充培養(yǎng)基進行雜交細胞的初次篩選。這種融合體被命名為F458。
分離產生針對G17C-末端的單克隆抗體的雜交瘤的初次篩選包括篩選能產生針對靶肽抗體，并能保持雜交細胞系穩(wěn)定性的細胞。通過對含有能產生針對G17/34C-末端抗體的單一克隆細胞的組織培養(yǎng)皿細胞培養(yǎng)基進行篩查，以篩選出能產生抗體的細胞。這種篩選通過使用含有酰胺化合成肽(G34的氨基酸序列16-34-NH2)綴合物的ELISA方法進行實現(xiàn)，該合成肽靠16-賴氨酸以一個半胱氨酸與免疫載體牛血清白蛋白(BSA)連接。專業(yè)人員都知道合適的ELISA技術，以下對幾個例子進行了特別描述。通過對每種能產生在ELISA試驗中與人G34(16-34)NH2-BSA綴合物相結合的抗體的雜交細胞進行兩次克隆以獲取穩(wěn)定的細胞株。通過這些方法，獲得了15種能產生抗G17和G34C-末端的單克隆抗體的雜交細胞系。
實施例2.選擇在總(結合及游離)G17免疫酶測定中表現(xiàn)優(yōu)秀的單克隆抗體測量生物學液體(如可能含有抗胃泌素抗體的人血漿)樣品中G17總量的方法已被發(fā)現(xiàn)并在2004年3月29日歸檔的美國專利10/813,336中進行了描述。簡單說，這種方法包括往生物學液體測試樣品中加入過量的含人G17中1-8位氨基酸(人G17(1-8)置換肽)的肽，以置換任何可能存在的胃泌素激素而通過其N-末端表位與可能存在于測試樣品中的對G17N-末端表位特異的抗體結合。在孵育期后，將含有置換肽的樣品混合物加入包被有針對G17C-末端的捕獲抗體的96孔ELISA板。孵育后，洗滌ELISA板除去置換肽，隨后加入與G17N-末端結合的酶聯(lián)抗體，檢測并定量測定結合的G17。再進行洗滌步驟除去未結合的酶聯(lián)抗體，加入能通過與抗體相連的酶的作用產生可檢測產物的顯色或其他底物，產生可檢測到的信號。例如，當酶為辣根過氧化酶(HRP)時，底物為四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMBS)。當檢測用的酶為堿性磷酸酶時，對硝基苯酚磷酸鹽可被用來作為產生有色復合對硝基苯酚的顯色底物。顏色的程度，讀作吸收單位(AU，對硝基苯酚在405nm處，三硝基苯磺酸在450nm處讀取)指示了試驗樣品中的G17的量，而實際濃度由以所讀取的試驗樣品的吸收度參照不同已知濃度G17制成的標準曲線而確定。
采用這種測定方法進行了預試驗，使用加入了預定濃度的G17的患者血漿樣品，并使用抗G17的C-末端表位的多克隆兔抗體作為捕獲抗體包被在檢測板孔上進行免疫測定。從這些測定中得到的結果和數(shù)據不具一致性，不能提供可接受的敏感度水平。因此，具C-末端選擇性的單克隆抗體被用于包被檢測板并作為測定中的捕獲抗體。
為在總G17測定中檢測融合體458中對G17的C-末端具選擇性的各種單克隆抗體，首先通過G蛋白親和色譜法對15種單獨的抗G17的C-末端的單克隆抗體進行純化。這通過使用一種商業(yè)化試劑盒(HiTrapProtein G HP，1mL，Amersham Biosciences)按照生產商的說明完成。每種單克隆抗體的濃度通過波長280nm處的吸光度(A280)測定。A280除以濃度系數(shù)1.4mL/mg得到濃度值。調整濃度降至0.1-1.0mg/mL范圍內。然后使用ELISA測定法對每種溶液(未稀釋)進行再次測定，準確確定單克隆抗體與G17C-末端的結合。
然后按以上所述，使用人G17(1-8)置換肽對這15種單克隆抗體、1種陰性對照單克隆抗體和3種純化單克隆抗體的混合物在總G17免疫酶測定中的表現(xiàn)進行測試。每種測定包被緩沖液中的單克隆抗體濃度被稀釋至10μg/mL(1瓶Convol pH8.0濃縮緩沖液(BDH product 18052 1U)，加入2.5L水；加入2.5g疊氮化鈉并溶解)，然后如上述測定總G17的方法所述，移至96孔ELISA檢測板的包被孔里。
將一部分已知濃度的G17加入除去了天然G17(通過在室溫下培養(yǎng)過夜，使得內源性血清蛋白酶消化掉任何存在的G17)的血清樣品中。對這種″G17-spiked″血清進行稀釋以制備已知G17濃度的標準溶液。標準G17的濃度為0、4.1、64和800pM。往樣品中加入含有G17N-末端的人G17(1-8)置換肽，將其作為測定中的測試樣品使用。然后將每種G17溶液加到包被有G17C-末端選擇性單克隆抗體的檢測板孔中，按上述步驟進行總G17的測定。
表1列出了這些測定的結果，即使用包被在檢測板孔上的15種單克隆抗體作為捕獲抗體所測得每個G17濃度下的A280吸光度值。
表1.測試每種抗G17C-末端單克隆抗體在總G17 ELISA測定中的表現(xiàn)
在對每種單克隆抗體在測定中的表現(xiàn)的測試的結果的基礎上篩選出最合適的單克隆抗體。比較單克隆抗體所使用的標準如下1)加入0.0pM G17時的吸光值低(基線值，優(yōu)選≤0.1AU)；2)4.1pM G17時吸光值為基線值的兩倍；3)從4.1pM到64pM G17(測定的主要工作范圍)的吸光值出現(xiàn)最高增長(傾斜)；以及4)G17濃度為800pM時吸光值(AU)最高。
根據這些標準，表現(xiàn)最好的單克隆抗體是F458-3-8G 1H 3C。這種抗體被重命名為MAb 458-1，并作為最合適的選擇性與G17的C-末端相結合的單克隆抗體用于隨后的測定中。這些標準和類似測定也同樣被用于篩選針對以下例證的G17，G34，G17-Gly及G34-Gly的末端表位的單克隆抗體。
使用具有合適的氨基酸序列的置換肽以置換結合激素，可被結合入其它形式胃泌素肽的測定中以測定樣品中的游離和總(結合+游離)胃泌素激素的量。如果能得到肽結合區(qū)域的氨基酸序列，置換肽的使用也可被應用于任何肽激素總量的測定中。
實施例3抗人G34 N-末端的單克隆抗體的分離及特征描述除對脾細胞供體小鼠進行抗G34N-末端表位免疫和篩選對G34N-末端表位具特異性的單克隆抗體所用的肽組分以外，按實施例1中關于制備抗G17和G34C-末端的單克隆抗體的描述制備產生抗G34氨基端的單克隆抗體的雜交瘤。為誘發(fā)對G34的N-末端表位的抗體反應，將肽pELGPQGRPPPPC(SEQ ID NO12)與DT相結合形成免疫原。將這種肽與BSA進行類似連接形成ELISA中用的靶抗原，以識別抗G34N-末端表位的單克隆抗體。這種融合體被命名為F401。
F401產生單克隆抗體401-2。抑制ELISA測定證實了G34的特異性，如表2所示，只有G34肽抑制了單克隆抗體401-2與G34 N-末端仿免疫肽(SEQ ID NO12)的結合。
其它形式的胃泌素，包括G17，G17-Gly和馬G17，以及CCK8(未硫酸化)和陰性對照品GnRH，均不能抑制單克隆抗體401-2的結合(如表2所示)。
實施例4.抗G17N-末端的單克隆抗體的分離及特征描述除對脾細胞供體小鼠進行G17N-末端表位免疫和篩選對G17N-末端表位具特異性的單克隆抗體所用的肽組成以外，按實施例1中關于制備抗G17和G34C-末端的單克隆抗體的描述，制備產生抗G17氨基端的單克隆抗體的雜交瘤。為誘發(fā)對G17N-末端表位的抗體應答，將肽pEGPWLERPPPPC(SEQ ID NO5)與DT相結合制成免疫原。將這種肽與BSA進行類似連接制成靶抗原，用于ELISA中對抗G17N-末端表位的單克隆抗體進行確定。另外，肽pEGPWLEEEEAAPPC(SEQ ID NO16)還被與BSA相連制成制成針對G17N-末端表位的ELISA靶抗原。這種融合體被命名為F400。F400產生4種抗G17N-末端表位的單克隆抗體。這些抗體被命名為單克隆抗體400-1至-4。
單克隆抗體通過標準技術在小鼠體內以腹水的形式生成。每種F400單克隆抗體腹水以同等量混和制成試驗用的上述抗體庫?？贵w庫的抗-G17單克隆抗體滴定度通過ELISA確定，如表3所示。
采用技術人員熟知的標準放射免疫測定技術，通過抑制放射性免疫測定的Scatchard分析法測量四種單克隆抗體的親和力，其中每種單克隆抗體與放射性碘化G17的結合受升高未標記的G17濃度抑制。表4顯示了單克隆抗體400-1至4的親和力(Ka)。抑制ELISA測定證明了對G17N-末端表位的特異性，據顯示，僅G17、G17-Gly和馬G17肽抑制了單克隆抗體400-1至-4與G17N-末端仿免疫肽(SEQ ID NO11)的結合；而G34，和CCK8(為硫酸化)以及陰性對照品GnRH均為對400-1至-4單克隆抗體的結合造成抑制(如表5所示)。
抗G17單克隆抗體特征描述
實施例5.抗甘氨酸延伸型G17/G34C-末端的單克隆抗體的分離及特征描述除對脾細胞供體小鼠進行G17-Gly羧基末端表位進行免疫和篩選對G17-Gly羧末端表位具特異性的單克隆抗體所用的肽組成外，按實施例1中關于制備抗G17和G34C-末端的單克隆抗體的描述，制備產生抗G17-Gly羧基末端表位的單克隆抗體的雜交瘤。為誘發(fā)對G17-Gly羧末端表位的抗體應答，將肽CPPPPSSYGWMDFG(SEQ ID NO14)與DT相結合制成免疫原。
將肽CGGSKKEGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO15)與BSA連接制成用于ELISA中抗G17-Gly羧基末端的單克隆抗體的靶抗原。為篩選與G17-Gly結合但不與G17或G34相結合的單克隆抗體，本融合中采用了額外的證明對G17-Gly(SEQ ID NO2)具單克隆抗體抑制但對G17(SEQ ID NO1)不具抑制的選擇步驟。這種融合體被命名為F445。
F445生成兩種對甘氨酸延伸型G17具特異性的單克隆抗體。被命名為單克隆抗體445-1和445-2。這兩種單克隆抗體的制備尤其困難，需要進行約14次融合才能成功。通常，一次融合就足以獲得一種抗肽激素(如此處描述的其它胃泌素激素)的單克隆抗體。抑制ELISA證明了對G17-Gly的特異性，其中顯示只有G17-Gly肽(SEQ ID NO2)和免疫原肽CPPPPSSYGWMDFG(SEQ ID NO14)抑制了MAb 445-1和445-2與G17-Gly C-末端表位目標抗原(SEQ IDNO14)BSA綴合物的結合，而其它形式的胃泌素，包括G17、G34和馬G17，和CCK8(未硫酸化)和陰性對照GnRH，都不能抑制445-1和445-2單克隆抗體的結合(如表6所示)。
實施例6抗G34C-末端的單克隆抗體的分離及特征描述人G34和G17具有相同的C-末端表位；實施例1中的結合號F458中生成的單克隆抗體，生成了與G34和G17的C-末端表位相結合的單克隆抗體。這種結合中生成的單克隆抗體稱為458-1至-5。
抑制ELISA證明了單克隆抗體458-1至5對G17和G34的C-末端表位的特異性，其中顯示僅G17肽(SEQ ID NO1)、G34肽(SEQ ID NO3)和CCK8肽(SEQ ID NO13)(也表達C-末端表位)抑制了單克隆抗體MAb458-1至5與G17/34C末端表位肽(SEQ ID NO11)BSA綴合物的結合；而其它形式的胃泌素，包括G17-Gly、G17(1-9)的N末端和陰性對照組GnRH，不能抑制458-1至5單克隆抗體的結合(如表7所示)。
表7.抗-G17、G34(CCK8)單克隆抗體的特征描述
實施例7.F400單克隆抗體在體外對胰、胃和結腸癌細胞的抗-腫瘤細胞效果的說明對抗G17N-末端的單克隆抗體群(實施例4中圖3所示)的抑制取自人胰腺、胃和結腸癌的腫瘤細胞株生長的能力進行測試。每種器官來源的細胞株取兩種進行體外研究。測試的這六種單獨腫瘤細胞株都能產生自己的G17激素，可能引起自分泌效應(可通過抗G17中和單克隆抗體抵消)。
為制備針對細胞的體外試驗用的F400單克隆抗體混合物，使用層析儀按照Sulfo-Link工具盒提供的方法，對與瓊脂糖(Sulfo-Link，Pierce)相連的表達G17N-末端表位(SEQ ID NO12)的肽的抗體進行親和力純化。單克隆抗體用PBS透析，使用A280測量法確定它們的濃度。
在標準環(huán)境中(37℃，5％CO2，增濕孵育器)培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)基包括含有10％(v/v)熱滅活胎牛血清(FBS，Sigma)的完全RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)。
為收獲試驗用細胞，使用0.025％乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma)收獲半匯合狀態(tài)的單層細胞。將細胞在培養(yǎng)基中清洗，并用培養(yǎng)基重懸，使?jié)舛葹?×105個活細胞/mL，并放于96孔培養(yǎng)板上(0.1mL/孔)。孵育過夜后，吸去培養(yǎng)基，加入含500ug/mL F400單克隆抗體混合物或含正常小鼠免疫球蛋白(NMIg)的新鮮培養(yǎng)液。將細胞再孵育48小時，然后通過四甲基偶氮唑鹽MTT測定法(哺乳動物細胞培養(yǎng)中常用的細胞生長評估方法)對細胞增殖進行評估。從MTT測定中得到的每孔的吸光度被按組進行平均(n＝5)。然后計算出F400單克隆抗體相對于NMIg抑制細胞生長的百分比。
表8給出了這些試驗的結果，說明抗-G17單克隆抗體混合物抑制了每種試驗腫瘤細胞株的生長。抑制程度從19.5％(對于胰腺腫瘤株)至52.0％(對于胃細胞株)。
因此，表明本發(fā)明中的單克隆抗體在體外對三種常見胃腸道惡性腫瘤具有抗生長的治療作用。
表8.抗-G17單克隆抗體400-1，-2，-3，-4混合物對六種人類腫瘤細胞株的基礎生長抑制。
實施例8.F400單克隆抗體在體內對胃癌細胞的抗癌療效的說明對抗G17N-末端的單克隆抗體群(該抗體群含有相等量的含單克隆抗體400-1至-4的腹水混合物)的抑制來自人胃癌細胞MGLVA1的腫瘤細胞株生長的能力進行測試。MGLVA1細胞能產生其自身G17激素，潛在造成自分泌效應(可能被抗G17單克隆中和抗體抵消)。
為制備體內試驗用F400單克隆抗體腹水混合物，將腹水在56℃加熱30分鐘除去腹水中的補體。對購買自Sigma的陰性對照腹水進行類似處理。
在雌性裸小鼠中以皮下腫瘤的形式培育MGLVA1胃癌細胞。為在試驗小鼠身上植入腫瘤，通過手術從腫瘤攜帶小鼠身上取得腫瘤并切成約1mm3的小塊。隨后將這些小塊皮下植入本研究所用裸小鼠的側腹，使得腫瘤可摘取。觀察腫瘤部位并使用測徑器測量腫瘤的生長情況。當觀察到腫瘤可以摘取時，將小鼠隨機分為待測試單克隆抗體(F400mix)處理組或待陰性對照腹水處理組。研究中每組12只小鼠。
第一周，對小鼠進行腹膜內注射0.2mL腹水(F400混合物或陰性對照)，一周兩次。第一周后將注射量減至0.1mL，一周兩次。每周測量腫瘤3次。研究共進行27天。在研究結束時，處死小鼠，切取腫瘤并稱重。
使用F400測樣單克隆抗體混合物處理的小鼠體內的MGLVA1胃癌腫瘤平均重量為0.75g，而攜帶MGLVA1胃癌腫瘤，并使用腹水作為陰性對照處理的小鼠的腫瘤平均重量為1.5g。因此，F(xiàn)400測驗混合物中的抗-G17單克隆抗體表現(xiàn)出很強的對胃癌細胞生長抑制作用，使腫瘤重量減小了50％。
實施例9.確定抗G17和G34C-末端抗體滴度的ELISA測定本分析方法的目的是為了通過ELISA測定確定測驗血清中抗-hG17抗體的滴度。簡單地說，本發(fā)明中的抗-hG17抗體ELISA測定基于抗體(Ab，多克隆或單克隆)與hG17(1-9)-AAPPC-BSA綴合物(通過交聯(lián)劑SEQ ID NO16與BSA偶聯(lián)的人胃泌素肽的氨基酸1-9)所表達的hG17表位的特異性結合。
第一步，將綴合物與96孔ELISA板的孔相結合。使用96孔板洗滌器洗去游離綴合物。然后加入測試(或對照)抗血清。測試血清中的抗-hG17Ab通過抗原中的hG17肽表位與綴合物相結合。然后通過加入抗-IgG-堿性磷酸酶試劑對抗體進行檢測，這種試劑對所測的抗-hG17抗體具特異性。例如，使用與兔抗hG17Ab結合的山羊抗-兔IgG-堿性磷酸酶綴合物(″GAR-AP″)對兔抗-hG17抗體進行檢測。隨后抗-lg-AP綴合物的AP部分催化底物轉變?yōu)橛猩a物(p-硝基酚)。使用ELISA板閱讀器測量405nm處的吸光度對顏色變化進行測量。
使用取自與測試樣品相同種類的動物的，含混合抗hG17血清的標準血清或含具給定參考滴度的抗-hG17單克隆抗體的腹水作為陽性對照品。使用取自與測試樣品相同種類的動物的血清(如正常血清、免疫前血清等)作為陰性對照品。
線形范圍內的顏色變化值與與靶抗原相結合的抗-hG17Ab的量直接成比例。使用陽性標準(抗-hG17)血清系列稀釋曲線對比吸光度值制成標準曲線。然后根據產生與陽性標準(如兔抗-hG17陽性標準1∶200,000稀釋液)參考滴度相同吸光度的稀釋液確定測試樣品中抗-hG17Ab的滴度。
試劑溶液本分析方法中規(guī)定的試劑及溶液的量僅供方便參考。實際的量可根據要求進行稱量。
1.含0.02％NaN3的碳酸鹽緩沖液(“碳酸鹽緩沖液”)使用磁力攪拌器將1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶解于約750ml蒸餾水中。加入4ml 5％的NaN3溶液，攪動。加入水至1.0公升。測量溶液pH值(應為9.6±0.2)(如需要，使用1.0M NaOH或1.0M HCl調節(jié)溶液pH值)。儲存于冰箱中待用。
2.含0.05％吐溫-20和0.02％NaN3的FTA(PBS)(″FTA/吐溫″)將9.23g FTA溶于約750ml凈化水中。加入0.5ml吐溫-20和4ml 5％NaN3。加入水調至1.000公升。
3.含1％BSA的FTA/吐溫(“BSA/FTA/吐溫”)將10g BSA溶解于1000ml FTA/吐溫中。
4.底物緩沖液將50mg MgCl2*6H2O溶于448ml凈化水中。加入50ml DEA和2ml 5％NaN3。使用濃縮HCl將溶液pH值調至9.8。于室溫避光保存。
5.PBS，pH值7.2可使用固體FTA(FTA血凝緩沖(“FTA”)(BectonDickenson Microbiology Systems，Cockeysville，MD))制備。
ELISA測定步驟抗原包被于碳酸鹽緩沖液中制備含1ug/ml hG17(1-9)-AAPPC-BSA綴合物(通過交聯(lián)劑SEQ ID NO16與BSA偶聯(lián)的人胃泌素肽的氨基酸1-9)的溶液。每張板包被需要至少5.2ml抗原溶液。使用碳酸鹽緩沖液對1mg/ml的綴合物儲備液進行1∶1000的稀釋制備抗原溶液。板可以是任何適用于ELISA測定的板，例如Microtiter免疫測定板、硬苯乙烯板(如Immulon2“U”底96孔板，Dynatech Laboratories，Inc.，VA；或平底96孔板，聚苯乙烯如微孔板，NUNC，vendor VWR)。往每孔中加入50μl抗原溶液對Immulon2“U”底板進行包被。將板儲存于保濕腔(如，帶濕巾的封閉容器)中防止水份流失，并置于冰箱(2-8℃)中孵育過夜。
制備血清稀釋液如表9所示制備1/100.5的陽性標準、陰性對照及測試血清的系列稀釋液。在平底96孔板(12-道加液器可同時進行最多12種血清的稀釋)使用BSA/FTA/吐溫溶液對血清進行稀釋。
表9如表所示制備從1∶1000開始的系列稀釋液
1稀釋度的倒數(shù)為每次稀釋的滴度。
制備足夠量的每種血清稀釋液(最小工作容量為200μl)。根據血清滴度，從1/100(對于低滴度血清)或1/1000(對于高滴度血清)開始對A行中的每種血清進行稀釋，然后向下對每列進行系列稀釋直至H行(見表9)，生成共計8種不同的樣品稀釋液。陰性對照品的稀釋系列從1/100開始。陽性標準血清和免疫前采血/陰性對照血清的系列稀釋液樣品在每板上設置雙份。
洗滌板使用板洗滌器(如Ultrawash Plus；或DynaWasher II(Dynatech Laboratories，Inc.，VA)或等同物)和FTA/吐溫將每塊包被板洗滌四次，然后將板在紙巾上“拍擊”除去殘留溶液。
抗體結合按照下表10所示的板稀釋系列示例，將稀釋血清轉移至抗原包被“U”板的對應的孔中(50μl/孔)。將板置于保濕腔中室溫孵育1小時。
表1096孔板ELISA測定方案示例
縮寫Pos.＝陽性標準血清；Neg.＝免疫前采血/陰性對照血清；TS1-TS8＝測試血清抗體檢測試劑在FTA/吐溫中制備合適的抗-Ig-堿性磷酸酶綴合物稀釋液。本測定中每張板需要至少5.2ml。按上述說明對板進行洗滌。往“U”板的每個孔中加入50μl/孔的GAR-AP溶液(抗-Ig-堿性磷酸酶綴合物，如，測試兔抗-hG17抗體用的山羊抗-兔IgG(H+L)-堿性磷酸酶(Antibodies Inc.，Davis，CA))，并置于保濕腔中室溫孵育1小時。
要檢測取自兔以外的動物的血清中的抗-hG17抗體，必須使用對產生測試血清的動物具特異性的抗-Ig-AP綴合物進行檢測。(例如人抗-hG17抗體需使用抗-人IgG-AP試劑(在每批試劑規(guī)定的稀釋度下使用)進行檢測)。陽性標準血清和陰性對照血清應取自與測試血清同樣的同種動物。
底物溶液將p-NPP片劑(p-對硝基苯酚磷酸鹽，以磷酸酶底物片劑的形式提供，Sigma 104(″p-NPP″)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO))從冷凍柜中取出并使其恢復至室溫。在即將使用前，往5ml DEA底物緩沖液中加入1片p-NPP片劑制備1mg/ml的p-NPP溶液(室溫)。每1測試板用5-ml底物溶液即足夠。將底物溶液儲存于黑暗環(huán)境中待用。
底物添加按上述說明對板進行洗滌。從1列A排開始，使用8(或12)道加液器往所有孔中同時加入p-NPP溶液(50μl/孔)。
監(jiān)測反應當最接近參考滴度的陽性標準稀釋液的吸光度達到ELISA板閱讀器最大線性讀數(shù)范圍的10-30％時，終止底物溶液的反應。使用ELISA板閱讀器(如MRX自動板閱讀器；或MR 580 MicroELISA自動閱讀器(Dynatech Laboratories，Inc.，VA)或等同物)對陽性標準稀釋液的吸光度進行監(jiān)測以確定與參考滴度相對應的稀釋達到閱讀器范圍的10-30％的時間(通常為反應開始后10-30分鐘)。ELISA讀數(shù)器被設置為在A405nm波長對對硝基苯酚進行測量。
終止反應當上述所選的陽性標準稀釋液的吸光度值達到閱讀器線性范圍的10-30％時，使用8(或12)道加液器往每個孔中加入50μl 1.0MNaOH終止反應。往孔中添加NaOH溶液的順序及時間與底物溶液的相同。小心搖動計數(shù)器頂上的板，輕輕對試劑進行混合。
測量吸光度使用一個ELISA閱讀器對整張板進行閱讀。
數(shù)據分析按以下所述對每種血清的滴度進行確定將陰性對照血清的吸光度值從每種對應陽性標準血清和測試血清稀釋液的吸光度中減去。(取每種陽性標準和陰性對照稀釋液吸光度的平均值。)以縱軸(線性標度)為吸光度，橫坐標為(I/稀釋度)，對每種血清(包括陽性標準)進行半對數(shù)作圖。通過標繪稀釋逆轉，滴度可直接在X-軸上讀取。有的時候，吸光度值明顯在某特定血清的結合曲線以下(溢出點)；這類值被排除曲線以外。每種血清的滴度被確定產生與陽性標準參考滴度相同吸光度值的稀釋度的倒數(shù)(例如，兔抗-hG17陽性標準的稀釋度1∶200,000)。圖1提供了一個數(shù)據分析的例子。
實施例10通過抑制ELISA測定確定抗體特異性除以下描述外，按上述實施例中同樣的方法進行肽抑制ELISA測定制備抑制物使用合適的靶激素肽(此例中為hG17)制備1μmol/ml(1000μM)工作儲備溶液。使用工作儲備溶液制備抑制稀釋液系列，稀釋率為1∶2至1∶10，根據板的設計，生成共計8種或12種稀釋液。
制備樣品稀釋液在抑制測定前對樣品進行系列稀釋以制備最大結合率為50％的抗體樣品稀釋液。然后將樣品制備為2倍50％結合濃度，用于與等量的肽抑制物及緩沖液相混合，作為抑制測定中的對照品。將樣品混合物置于保濕腔中孵育約30分鐘，然后加入洗滌過的包被ELISA板中，在保濕腔中孵育約1小時。
根據吸光度讀數(shù)(從本底中減去)確定結合百分率用帶抑制物的樣品的吸光度值除以不帶抑制物的對照樣品的吸光度值，并將得到的值乘以100。最后，用100％減去結合百分率得到抑制百分率。
測試樣品可以是血清、細胞培養(yǎng)液上清中的單克隆抗體、腹水或親和力純化抗體(Ab)。對于抗除G17氨基端以外的靶抗原的親和力純化抗體(Abs)，使用合適的靶激素抗原和抑制物。將無關的肽作為陰性對照。
ELISA測定數(shù)據分析圖1顯示了一個從上述ELISA測定中獲得的數(shù)據的例子。用平均陽性標準和測試血清吸光度值減去平均陰性對照血清吸光度值得到每次稀釋的凈吸光度值。將凈吸光度值對應滴度進行標繪。(在本實施例中，陰性對照值也被進行了標繪以顯示典型值。)胃泌素-17的穩(wěn)定性通過上述總胃泌素測定對胃泌素在室溫下(約22℃)的穩(wěn)定性進行評估在樣品制備好后立即測量總G17以獲得已知G17濃度15、100和600pM，并在2小時后在室溫下在實驗臺上再次測量。下表11中顯示的測量結果表明每種樣品中的G17濃度出現(xiàn)大量下降。
表11總胃泌素17測定室溫(ca 22℃)下人血漿中的胃泌素17的穩(wěn)定性
a作為基線的平均結果sd標準差CV變異系數(shù)(rounding前計算)RE相對誤差(rounding后計算)實施例11.抗HG17抗血清的抑制放射性免疫測定(RIA)-用于確定抗人胃泌素17(hG17)抗血清的抗原結合能力(ABC)的血清滴定和抗原抑制RIA測定。
稀釋緩沖液1.磷酸鹽緩沖鹽水，pH值7.2(PBS)+0.02％疊氮化鈉(NaN3)?？扇苄怨腆w物的商業(yè)銷售用制劑，“FTA血凝緩沖液”可被溶于蒸餾水中生成PBS(9.23g/l對用的溶液pH值為7.2+0.1)。
2.含1％牛血清蛋白(BSA)和0.02％NaN3的FTA。
3.補充小牛血清(SCS；GIBCO)，分成50ml或更少量冷凍儲存。
4.PEG，MW8000，配制為25％溶液，(250g/公升；緩慢溶解)。于4℃儲存。
5.人胃泌素17(15-Leu)(Research Plus，#07-027-002)；FTA/1％BSA/疊氮化合物中濃度為5-10ug/ml的一次用量。于-70℃儲存。
6.人胃泌素17-125I(NEN)。
方法首先對試驗血清進行一系列量的hG17-125I的滴定以建立抑制RIA中待測的每種抗血清溶液量，并通過Scatchard分析計算抗原結合能力(ABC)。
滴定RIA測定實驗規(guī)范1.對于陽性對照抗血清和所有測試抗血清，為每種待測抗血清稀釋液配置雙份試管；優(yōu)選5種10倍稀釋的血清，以使測試管中的最終稀釋度為1∶40至1∶400,000。這等同于往每支試管中加入10μl至0.001μl的抗血清。
2.將300μl稀釋緩沖液分裝入兩支作為試劑空白的試管中；將200μl稀釋緩沖液加入所有余下試管中。
3.將100μl稀釋抗血清轉移至雙份血清試管(需要2×100μl每種稀釋液)。使用30μl抗血清開始系列稀釋(生成300μl 1∶10稀釋液)足以彌補轉移中的損耗。
4.將至少一種陰性血清稀釋液(1∶40，測試血清的最低稀釋度)作為非特異性結合對照品。
5.在RIA緩沖液中稀釋至約10,000cpm/0.1ml的125I-標記抗原(Ag)。稀釋步驟見下。
6.將100μl標記胃泌素加入所有試管中。將100μl標記hG17加入10個閃爍瓶或γ-計數(shù)管中以確立加入的總計數(shù)。
7.通過搖動或渦旋對試管內物質進行混合并用石蠟膜封口。
8.將試管在4℃孵育，過夜，～18小時。這是最短的孵育期滴定RIA中也可以進行更長時間的孵育，但通常不需要。
9.將100μl SCS加入所有試管中并搖晃試管。
10.將500μl 25％PEG(4℃或RT)加入所有試管中并進行漩渦混合。
11.將試管于在4-12℃，2000 Xg離心30分鐘。
12.吸出并丟棄所有試管中的上清。
13.按以下所述，在γ-計數(shù)器中對測試管中的沉淀物進行計數(shù)或將沉淀物制備用于進行如下所述的閃爍計數(shù)。
計算取雙份樣品每分鐘計數(shù)的平均值。非特異性本底結合未被減去。對數(shù)據進行標繪hG17-125I結合％vs.加入的血清量。選取結合了加入每種樣品中的總cpm35％的量的每種血清用于抑制RIA測定。
抑制RIA測定1.如滴度RIA的測定一樣，每種抑制系列使用一種抗血清稀釋液。需要配置的試管對的數(shù)量由待測抑制物稀釋液(包括未抑制對照品)的數(shù)量決定。典型情況下，每種抗血清需要8種抑制物稀釋液(16支試管)加2未抑制試管。
2.將300μl稀釋緩沖液分裝入兩支試管中作為倒數(shù)時間空白(為建立天然本底計數(shù))。
3.將200μl緩沖液分裝入六支試管中以接收陰性對照血清(用于本底非特異性結合)；其中兩支在測定結束時使用。將200μl緩沖液分裝入每種血清的兩支試管中(用于總計數(shù)結合)。這些試管中未加入任何hG17抑制物。
4.將100μl稀釋緩沖液加入所有余下試管中。
5.將100μl稀釋至適當最終濃度(見下)的未標記hG17(抑制物)分裝入每種測試血清和對照血清的試管對中。這些系列建立了每種抗血清的hG17抑制曲線。hG17抑制物在FTA/疊氮化鈉中從5120pg/0.1ml開始以1∶1系列稀釋配制。
8.將試管混合。
9.將RIA緩沖液中的125I-標記抗原稀釋至約10,000cpm/0.1ml。
10.將100μl hG17-125I加入所有試管(包括12支或更多測定的各處試管)中，以建立總計數(shù)。
11.最后，將100μl適當稀釋的抗-hG17對照血清、陰性對照或測試血清加入合適的試管對的每支試管中。
12.將試管進行混合并封口(如，用石蠟膜)。
表12.方案概要
A.小含血清的非特異性本底對照B.總計數(shù)結合數(shù)＝抗血清的數(shù)量C.含陰性對照血清的非特異性本底D.hG17抑制系列.i＝抑制物濃度數(shù)13.將試管在4℃孵育～42小時(兩天)。
14.將100μl SCS加入所有試管中并混合。
15.將500μl 25％的PEG加入所有試管中并混合。
16.將試管于4℃，2,000 Xg離心30分鐘。
17.吸出并丟棄所有試管中的上清。
18.使用γ-計數(shù)器對測驗管中的沉淀物進行計數(shù)或對沉淀物進行閃爍計數(shù)。為進行閃爍計數(shù)，將250μl dH2O加入所有測試管中；將水加熱至90-100℃加速片劑的溶解(需要2-3小時)。然后將3ml閃爍液加入每個閃爍瓶中。將所有溶解了的片劑從單管中轉移至閃爍瓶中，并置于支架上計數(shù)。
計算1.取兩份樣品cpm平均值，并減去非特異性本底結合數(shù)(通過陰性血清對照的平均值確定)。
2.將總計數(shù)相加，并使用基線本底對照以確保未抑制抗-HG17抗體結合的總計數(shù)在預期的范圍內。
3.使用總計數(shù)和每種數(shù)量的抑制物的計數(shù)結合，通過Scatchard分析(結合/游離vs結合抗原)對ABC及抗血清的親和常數(shù)進行確定。對于每種抗血清個體，選擇達到最佳線性回歸線的點，刪去其余點。這通過觀察標繪及標注回歸常數(shù)完成。曲線的較低部分通常不被使用。ABC和親和常數(shù)通過表格程序設置被自動相加。
稀釋HG17-125IhG17-125I的來源為NEN。放射示蹤激素(15μCi)在運輸時的比放射性為2200μCi/mmole。按照包裝所附的說明，在衰變天數(shù)的基礎上，使用dH2O將親液物稀釋至50μCi/ml。溶解后，制成50μl分包裝并置于鉛容器中-70℃儲存。
稀釋至10,000CPM往每支測試管(0.1ml)中加入大約10,000cpm的標記復合物。(通常為10,000-10,400cpm/管)。當確定所需的稀釋hG17-125I的量時，額外加入3-4ml用于進行總計數(shù)的確定和轉移及發(fā)泡過程中的損耗的補充。
注意本測定中使用的測試樣品可以是血清、細胞培養(yǎng)液上清中的單克隆抗體、腹水或親和力純化抗體(Ab)。對于抗除G17氨基端以外的靶抗原的抗體，使用合適的125I-標記的靶激素抗原和抑制物。將無關的肽作為測試的陰性對照。
實施例12使用兔a-GRE 11抗體對石蠟包埋組織上的CCK2受體進行檢測將組織切片浸入3次分開的二甲苯浴(5-6浸，每次)中去石蠟，然后在100％工業(yè)用甲醇化酒精(IMS)(5-6浸，每次)中孵育進行再水化。用蒸餾水對切片沖洗5分鐘。將切片在15％的醋酸中孵育20分鐘，阻斷內生堿性磷酸酶活性。用蒸餾水對切片沖洗5分鐘。將切片兩兩相隔置于塑料載玻片支架上，在pH值為6的檸檬酸鹽緩沖液(2.1g檸檬酸一水化合物，約＝12.5mL 2M NaOH/1 L)中微波(600W)處理10分鐘，確保在整個處理期間，緩沖液足夠覆蓋切片。然后立即將切片轉移至冷的、流動的蒸餾水中放置3-4分鐘。小心勿使切片變干。
用疏水筆對切片進行標記，將切片置于保濕腔并浸漬于TRIS緩沖鹽水(TBS)中，pH7.6，5分鐘，(0.66g TRIS-(羧甲基)鉀胺，8.75g NaCl，#4.15mL HCL)，室溫(″RT″)。將切片置于10％的正常山羊血清中，在TBS中室溫孵育20分鐘，阻斷第二抗體(“Ab”)的非特異性結合。將切片弄干，往每片切片上加入第一抗體(200μl/片)，在室溫下在保濕腔中放置1小時。先使用TBS輕輕沖洗切片，(在噴瓶中；注意不要將水流直接對準組織切片)，然后將切片放入緩沖液中浸泡5分鐘。
將堿性磷酸酶結合山羊抗-兔第二抗體(或適當?shù)尼槍y試抗體源的抗體)在TBS中的稀釋液(1/50稀釋度)加入切片(200μl/片)。將切片在室溫下孵育1小時，然后放入TBS中清洗5分鐘。
在即將使用前制備快速紅底物(Vector Red，Vector Labs/Fast Red，Sigma)，并將其加入每片切片上，最長時間為20分鐘(Vector)或30分鐘(Sigma)。將切片在TBS和蒸餾水中漂洗，然后在Mayer′s蘇木紫中進行復染(時間不定)。染色后，將切片轉移至蒸餾水中。
然后將切片浸泡于1％的酸性酒精中(10mL conc HCL，700mLIMS，290mL蒸餾水/公升)除去多余的復染劑，(如果使用的是快速紅底物(Sigma)則除外)，然后將切片轉移至蒸餾水中。將切片在0.5％硼砂溶液(用水稀釋)中浸泡數(shù)次。在這一步中建議在顯微鏡下對一片切片進行檢查看細胞核是否被染成藍色而不是紫色。然后將染色后的切片轉移至蒸餾水中，然后放入IMS中，最后放入二甲苯中，之后使用DPX(xylenemontant)封片。
使用系列稀釋來建立合適的測試和對照血清/純化抗體稀釋液。使用堿性磷酸酶試劑系統(tǒng)對胃腸切片進行染色效果最好。盡管ABC更具特異性，由于其高度靈敏性會產生許多非特異性染色。可使用左旋咪唑(Levamisole)(Vector labs)對腸內堿性磷酸酶進行阻斷，左旋咪唑在制備切片時被加入底物溶液中。Vector紅底物比Sigma底物存在的問題少。但是，需要在制備好的底物溶液中加入一滴左旋咪唑(Vector Labs)。
用于本免疫組織化學方法中的初級抗體(Ab)可以是血清、單克隆抗體、細胞培養(yǎng)液上清中的Ab、腹水或親和力純化Ab。
本領域人員將馬上意識到此處以上所描述的步驟可用于分離適用于其它肽(尤其是其它激素肽，包括其它形式的胃泌素激素)的免疫檢測和免疫酶分析的最佳單克隆抗體。本發(fā)明包括此處所教導及通過非限制性實施例進行說明的全部范圍的單克隆抗體。所有本發(fā)明書中所引用的專利及出版物均通過引用將其全文并入本文中。
雜交瘤細胞系的保藏產生本發(fā)明中的特定單克隆抗體的以下雜交瘤于2004年3月25日被保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)1.產生單克隆抗體400-1的雜交瘤400-1，指定保藏號為PTA-5889。
2.產生單克隆抗體400-2的雜交瘤400-2，指定保藏號為PTA-5890。
3.產生單克隆抗體400-3的雜交瘤400-3，指定保藏號為PTA-5891。
4.產生單克隆抗體400-4的雜交瘤400-4，指定保藏號為PTA-5892。
5.產生單克隆抗體401-2的雜交瘤401-2，指定保藏號為PTA-5893。
6.產生單克隆抗體445-1的雜交瘤445-1，指定保藏號為PTA-5894。
7.產生單克隆抗體445-2的雜交瘤445-2，指定保藏號為PTA-5895。
8.產生單克隆抗體458-1的雜交瘤458-1，指定保藏號為PTA-5896。
序列表<110>RECEPTOR BIOLOGIX，INC.
<120>抗胃泌素激素單克隆抗體<130>1102865-0076<150>US 60/557,759<151>2004-03-29<150>10/813,336<151>2004-03-29<160>16<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>17<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID<220>
<221>MOD_RES<222>(17)..(17)<223>AMIDATION<400>1Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp1 5 10 15Phe<210>2<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID<400>2Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp1 5 10 15
Phe Gly<210>3<211>34<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID<220>
<221>MOD_RES<222>(34)..(34)<223>AMIDATION<400>3Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys1 5 10 15Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met20 25 30Asp Phe<210>4<211>35<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>AMIDATION<400>4Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys1 5 10 15Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met20 25 30Asp Phe Gly35<210>5<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens
<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID<400>5Glu Gly Pro Trp Leu Glu1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MOD_RES<222>(9)..(9)<223>AMIDATION<400>6Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe1 5<210>7<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID<400>7Glu Leu Gly Pro Gln Gly1 5<210>8<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly1 5<210>9<211>20<212>PRT<213>Artificial sequence
<220>
<223>Lys-Lys-linked G17-Gly<400>9Lys Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp1 5 10 15Met Asp Phe Gly20<210>10<211>12<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Spacer copupled to G17 C terminus<220>
<221>MOD_RES<222>(12)..(12)<223>AMIDATION<400>10Cys Ser ser Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe1 5 10<210>11<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>11Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu1 5<210>12<211>12<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>G34 N terminal peptide coupled to spacer<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID<400>12Glu Leu Gly Pro Gln Gly Arg Pro Pro Pro Pro Cys1 5 10
<210>13<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MOD_RES<222>(8)..(8)<223>AMIDATION<400>13Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe1 5<210>14<211>14<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Spacer coupled to C terminal peptide of G17-Gly<400>14Cys Pro Pro Pro Pro Ser Ser Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly1 5 10<210>15<211>24<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Spacer coupled to G34-Gly peptide<400>15Cys Gly Gly Ser Lys Lys Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu1 5 10 15Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly20<210>16<211>14<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>G17 N terminal peptide plus spacer<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400>16Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Pro Pro Cys1 5 10
權利要求
1.一種單克隆抗體，其與胃泌素激素形式選擇性結合于(i)胃泌素-17(G17)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(SEQ ID NO5)中的表位；(ii)胃泌素-17(G17)的C-末端和胃泌素-34(G34)的氨基酸序列KKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO6)中的表位；(iii)人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ IDNO7)中的表位；或(iv)甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列YGWMDFG(SEQ ID NO8)中的表位。
2.權利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體具有由選自以下一組的雜交瘤所產生的單克隆抗體的結合特性雜交瘤400-1(ATCC保藏號PTA-5889)、雜交瘤400-2(ATCC保藏號PTA-5890)、雜交瘤400-3(ATCC保藏號PTA-5891)和雜交瘤400-4(ATCC保藏號PTA-5892)。
3.權利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體具有由雜交瘤458-1(ATCC保藏號PTA-5896)產生的單克隆抗體的結合特性。
4.權利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體具有由雜交瘤401-2(ATCC保藏號PTA-5893)產生的單克隆抗體的結合特性。
5.權利要求1的單克隆抗體，其中所述抗體具有由雜交瘤445-1(ATCC保藏號PTA-5894)或445-2(ATCC保藏號PTA-5895)產生的單克隆抗體的結合特性。
6.權利要求1-5中任一項的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是人源化的。
7.包括兩種或多種以下抗體的單克隆抗體組(i)一種選擇性與胃泌素-17(G17)的N-末端的氨基酸序列pEGPWLE(SEQ ID NO5)中的表位結合的抗體；(ii)一種選擇性與胃泌素-17(G17)的C-末端或胃泌素-34(G34)的氨基酸序列KKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2(SEQ ID NO6)中的表位結合的抗體；(iii)一種選擇性與人胃泌素-34(G34)的N-末端的氨基酸序列pELGPQG(SEQ ID NO7)中的表位結合的抗體；和/或(iv)一種選擇性與甘氨酸延伸型胃泌素-17(G17-Gly)和甘氨酸延伸型胃泌素-34(G34-Gly)的C-末端的氨基酸序列YGWMDFG(SEQ ID NO8)中的表位結合的抗體。
8.一種產生權利要求2的抗體的雜交瘤，其具有雜交瘤400-1(ATCC保藏號PTA-5889)；雜交瘤400-2(ATCC保藏號PTA-5890)；雜交瘤400-3(ATCC保藏號PTA-5891)或雜交瘤400-4(ATCC保藏號PTA-5892)的特性。
9.一種產生權利要求3的抗體的雜交瘤，其具有雜交瘤401-2(ATCC保藏號PTA-5893)的特性。
10.一種產生權利要求4的抗體的雜交瘤，其具有雜交瘤445-1(ATCC保藏號PTA-5894)或雜交瘤445-2(ATCC保藏號PTA-5895)的特性。
11.一種產生權利要求2的抗體的雜交瘤，其具有雜交瘤458-1(ATCC保藏號PTA-5896)的特性。
12.一種藥物組合物，其包含權利要求1-6中任一項的單克隆抗體和藥用可接受載體。
13.權利要求1-6中任一項的單克隆抗體在制備用于預防或治療胃泌素介導的疾病或狀況的藥物中的應用。
14.一種診斷患者的胃泌素介導的疾病或狀況的方法，所述方法包括測定患者生物學液體樣品中的胃泌素激素形式的水平，并將該樣品中的胃泌素激素形式的水平與一組健康個體的生物學液體樣品中的該胃泌素激素形式的正常水平相比較。
15.一種監(jiān)測患者的胃泌素介導的疾病或狀況的過程的方法，所述方法包括在初始時間點測定患有胃泌素介導的疾病或狀況或存在患胃泌素介導的疾病或狀況的風險的患者的生物學液體樣品中的胃泌素激素形式的水平；在不同時間點測定患者的一個或多個生物學液體樣品中的該胃泌素激素形式的水平；并由此對胃泌素介導的疾病或狀況的過程進行監(jiān)測。
16.一種進行免疫測定用的試劑盒，所述試劑盒包括一種單克隆抗體和一種合適的容器，所述單克隆抗體具有由選自400-1、400-2、400-3、400-4、401-2、445-1、445-2、458-1的雜交瘤所產生的單克隆抗體的特性。
17.一種對患有胃泌素激素介導的疾病或狀況的患者的胃泌素激素阻斷治療進行評估的方法，所述方法包括以下步驟a)在治療前或治療早期自患者取得第一個生物學液體樣品；b)通過免疫測定法測定第一個樣品中的胃泌素激素水平；c)基于待治療疾病或狀況和第一個樣品中的胃泌素激素水平進行診斷；d)對患者進行治療，包括施用與胃泌素激素結合以調整其與體內靶受體的結合的第一藥劑或能生成該第一藥劑的物質；e)在治療起效所需的適當時間之后，自患者取得第二個生物學液體樣品；f)通過免疫測定法測定第二個樣品的第一部分中的總胃泌素激素水平，所述總胃泌素激素包括結合胃泌素激素和游離胃泌素激素，其中將第二個樣品的第一部分與以下物質孵育(i)置換任何與第一藥劑相結合的胃泌素激素的第二藥劑，和(ii)固定化的抗胃泌素激素抗體，其中所述固定化抗體不與第二藥劑結合；洗滌除去第二藥劑并加入一種可檢測的抗體，所述可檢測的抗體與胃泌素激素結合且不與所述固定化抗體相競爭，由此形成一種包含與胃泌素激素相結合的固定化抗體的免疫復合物，所述免疫復合物，其中該胃泌素激素與所述可檢測的抗體相結合；g)檢測免疫復合物中可檢測的抗體的量并由此確定所述第二個樣品中總胃泌素激素的量；h)使用第二個樣品的第二部分重復步驟f)和g)以測定游離胃泌素激素水平，其中進行步驟f)中的孵育過程時未加入所述第二藥劑；和j)比較在第一個樣品中測得的游離胃泌素激素的量和第二個樣品中的游離胃泌素激素和總胃泌素激素的量，以確定對患者進行胃泌素激素阻斷治療的效果。
18.權利要求17的方法，其中所述生物學液體為血清。
19.權利要求17的方法，其中所述第一藥劑是針對G17的N-末端的抗體或是G17受體模擬物，而第二藥劑為N-末端G17肽。
20.權利要求17的方法，其中所述固定化抗胃泌素激素抗體或所述可檢測的抗體為單克隆抗體，或兩者均為單克隆抗體。
21.權利要求17的方法，所述方法包括以下一項或多項(i)其中所述固定化的抗胃泌素激素抗體與G17的C-末端結合，而所述可檢測的抗體與G17的N-末端結合；(ii)其中所述第一藥劑為針對G34的N-末端的抗體，而所述第二藥劑為N-末端G34肽；(iii)其中所述固定化的抗體與G17或G34的C-末端結合；(iv)其中所述可檢測的抗體與G34的N-末端結合；(v)其中所述第一藥劑是針對G17-Gly的N-末端的抗體或是G17-Gly受體模擬物，而所述第二藥劑為N-末端G17肽；(vi)其中所述可檢測的抗體與G17-Gly的N-末端結合；(vii)其中所述第一藥劑為針對G34-Gly的C-末端的抗體，而所述第二藥劑為N-末端G34肽；(viii)其中所述可檢測的抗體與G34-Gly的N-末端結合。
全文摘要
本發(fā)明提供了對胃泌素激素形式的N－末端和C－末端，即胃泌素－17(G17)、甘氨酸延伸型胃泌素－17(G17－Gly)、胃泌素－34(G34)和甘氨酸延伸型胃泌素－34(G34－Gly)具選擇性的單克隆抗體(MAb)；以及產生這些MAb的雜交瘤。本發(fā)明還提供了用于檢測和定量測定G17、G17－Gly、G34及G34－Gly的MAb組。這些測定法可用于監(jiān)測胃泌素介導的疾病或狀況，或監(jiān)測治療的進展過程。本發(fā)明還提供了用于對固體樣品(如活檢樣品或組織切片)中的胃泌素類型進行檢測和顯像的固相測定法，包括免疫組織化學(IHC)和免疫熒光(IF)測定法。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的MAb的藥物組合物，以及胃泌素介導的疾病或狀況的診斷、預防和治療方法。本發(fā)明還公開了對胃泌素激素阻斷治療進行評估的方法?？赏ㄟ^本發(fā)明提供的測定方法對患者的胃泌素介導的疾病或狀況的過程進行監(jiān)測。
文檔編號C12N5/20GK1997669SQ200580017341
公開日2007年7月11日 申請日期2005年3月29日 優(yōu)先權日2004年3月29日
發(fā)明者斯蒂芬·格蘭姆斯, 羅納德·牧島 申請人:受體生物技術公司