專利名稱：生產(chǎn)伯醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從醛開始生產(chǎn)伯醇的方法。借助于輔因子依賴的氧化還原酶進行還原，所述輔因子又通過第二個酶系統(tǒng)再生。
食品工業(yè)對伯醇的生產(chǎn)感興趣，因為這種產(chǎn)物以直接形式或在已經(jīng)轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的酯化合物后用作芳香化學(xué)物質(zhì)。優(yōu)選的生產(chǎn)方式是通過還原醛得到伯醇。原則上，通過使用非天然的化學(xué)還原劑，如文獻中的大量現(xiàn)有方法所述，例如通過使用金屬氫化物，實現(xiàn)該還原。但是這樣的途徑只能獲得“等同天然的”、而不是“天然的”伯醇。但是在食品工業(yè)中得到天然伯醇恰恰是非常重要的。生產(chǎn)它們的一種途徑是醛的酶促還原。
原則上，已經(jīng)在文獻中廣泛地描述了醛的酶促還原。特別是其中已知用于生產(chǎn)反式-3-己烯醇、反式-2-己烯醇、肉桂醇和2-苯基乙醇的實例，因為這些物質(zhì)在食品工業(yè)部門中用作芳香化學(xué)試劑或芳香化學(xué)試劑的中間體。但是，所述反應(yīng)在高度稀釋的介質(zhì)中進行，從技術(shù)上講所具有的缺點是由此帶來的低產(chǎn)物濃度。
G.Bock等(G.Bock等，Z.Lebensm.Unters.Forsch.1988，186，33-35)描述了在灰葡萄孢(Botyriscinerea)菌株存在下，以0.05g/升反應(yīng)體積的底物濃度還原肉桂醛。最高產(chǎn)率是0.019和0.025g/升反應(yīng)體積。
還描述了通過還原反應(yīng)，使用醇脫氫酶來生產(chǎn)2-苯基乙醇。典型地，在標(biāo)準(zhǔn)批式條件下得到的產(chǎn)物濃度僅僅是＜1g/L(M.W.T.Etschmann，D.Sell，J.Schr ader，Biotechnol.Lett.2003，25，531-536)。采用原位產(chǎn)物去除技術(shù)，已經(jīng)增加到2g/L，其中需要油醇作為另一個第二相中的輔助化合物(M.W.T.Etschmann，D.Sell，J.Schrader，Biotechnol.Lett.2003，25，531-536)。使用含有作為另一個有機相的油酸的提取補料批式生物轉(zhuǎn)化，Stark等成功地使用這樣的特定反應(yīng)系統(tǒng)，以12.6g/L的產(chǎn)物濃度得到2-苯基乙醇，該濃度相應(yīng)于約100mM的量(D.Stark，T.Münch，B.Sonnleitner，I.W.Marison，U.von Stockar，Biotechnol.Prog.2002，18，514-523)。
已經(jīng)描述了生產(chǎn)反式-3-己烯醇和反式-2-己烯醇的一系列酶方法，其在每種情況下，包含對應(yīng)醛的酶促還原作為最終的關(guān)鍵步驟(S.K.Goers等，美國專利4806379，1989；B.Muller等，美國專利5464761，1995；P.Brunerie等，美國專利5620879，1997；M.-L.Fauconnier等，Biotechnology Lett.1999，21，629-633；R.B.Holtz等，US 6274358，2001)。Muller等報道的最高產(chǎn)率是在反式-3-己烯醇的情況下，4.2g/kg；在反式-2-己烯醇的情況下，1.5g/kg(B.Muller等，美國專利5464761，1995；也參見J.Schrader等，Biotechnology Letters 2004，26，463-472)。這些方法的缺點主要是，在操作中使用的低底物濃度和由此得到的＜5g/kg反應(yīng)溶液的低產(chǎn)物濃度。
為了避免該缺點，以100mM的底物濃度，用反式-2-己烯醛進行相應(yīng)的酶促反應(yīng)(實施例4＝對比實施例)。在此采用的酶是來自紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)的醇脫氫酶，已經(jīng)確定這些酶具有對反式-2-己烯醛的活性。用甲酸脫氫酶(Formiatdehydrogenase)實現(xiàn)輔因子再生，該輔因子再生性酶已經(jīng)在許多情況下成功地用于酮的酶促還原(M.-R.Kula，U.Kragl，Dehydrogenases in theSynthesis of Chiral Compounds inStereoselective Biocatalysis(Ed.R.N.Patel)，Marcel Dekker，New York，2000，chapter 28，839頁及其后)。但是，在這兩種酶組分存在下，僅僅以微小的程度觀察到所希望的反應(yīng)，即72小時后的轉(zhuǎn)化率僅為16％(實施例4)，可能是因為已經(jīng)很低的反式-2-己烯醛濃度導(dǎo)致的抑制和/或去穩(wěn)定化作用。
M.-L.Fauconnier等也報道了，當(dāng)采用含有醇脫氫酶的微生物時，通過反式-3-己烯醛對醇脫氫酶的抑制，甚至發(fā)生在非常低的底物濃度下(M.-L.Fauconnier等，Biotechnology Lett.1999，21，629-633)。典型地，在0.67mM(！)進行反應(yīng)，相應(yīng)于0.066g/L。最大轉(zhuǎn)化率是82％。
簡而言之，用于生產(chǎn)伯醇的所有酶促還原醛的方法，目前僅僅產(chǎn)生較低的技術(shù)上沒有吸引力的＜15g/L的產(chǎn)物濃度。相應(yīng)地，只有最高至～100mM的低底物濃度，會產(chǎn)生技術(shù)上有意義的＞80％的轉(zhuǎn)化率。其根本原因可以解釋為，通過醛組分引起的抑制作用和酶被滅活。因為醛與酮相比是更易反應(yīng)的組分，這些化合物可以以加強的程度以不希望的方式與酶的官能團(尤其是胺)反應(yīng)并相應(yīng)地滅活它們。
因此，本發(fā)明的任務(wù)是，開發(fā)快速的、簡單的、低廉的且有效的從醛生產(chǎn)伯醇的酶促方法。針對已知的現(xiàn)有方法特別是在空間/時間產(chǎn)量方面有所改善。這需要一方面在穩(wěn)固的操作中在高底物濃度下具有相應(yīng)的高產(chǎn)率。更特別地可以采用這樣的方法還原不飽和醛。
按照權(quán)利要求解決了所述任務(wù)。權(quán)利要求1涉及根據(jù)本發(fā)明的方法，其中采用rec全細胞催化劑。權(quán)利要求2包含該方法的優(yōu)選實施方案。權(quán)利要求3涉及用于本發(fā)明的目的的游離的酶的應(yīng)用。權(quán)利要求3至9保護根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案。
由此，在通過還原醛生產(chǎn)伯醇的方法中，在重組全細胞催化劑(其包含醇脫氫酶和能再生輔因子的酶)存在下進行該轉(zhuǎn)化，完全令人驚奇地、但是一點也不缺少優(yōu)點地，解決了提出的問題。令人驚奇地，使用該方法，在＞150mM的高底物濃度，尤其是＞250mM，且非常優(yōu)選地＞500mM，得到了高的直至非常高的轉(zhuǎn)化率。所述轉(zhuǎn)化率典型地高于80％，尤其是大于90-95％產(chǎn)率?；谝郧胺椒ǖ牡娃D(zhuǎn)化率即使在低底物濃度下也不能被預(yù)見到，且非常令人驚奇的是，恰恰還在由現(xiàn)有技術(shù)已知的通過所采用的底物施加給脫氫酶的嚴(yán)重抑制或去穩(wěn)定化作用的背景下。
原則上，專業(yè)人員可能針對本申請所想到的所有醇脫氫酶都適用于建立rec全細胞催化劑。但是，優(yōu)選地在重組(rec)全細胞催化劑(其包含醇脫氫酶和選自葡萄糖脫氫酶或蘋果酸脫氫酶的能再生輔因子的酶)存在下，進行根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化。
通過在有分離的醇脫氫酶和來自葡萄糖脫氫酶或蘋果酸脫氫酶的分離的能再生輔因子的酶存在下，實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化，完成了上面提出的問題的另一個解決方案。這里令人驚奇的是，醇脫氫酶與來自以分離的形式采用的酶形式的葡萄糖脫氫酶或蘋果酸脫氫酶的能再生輔因子的酶的組合的特別適合性，尤其是考慮到當(dāng)以該形式采用甲酸脫氫酶時產(chǎn)率不令人滿意(也參見實施例4＝對比實施例)。
通過例如對比在還原反式-2-己烯醛時得到的轉(zhuǎn)化率，解釋了醇脫氫酶與選自葡萄糖脫氫酶或蘋果酸脫氫酶的能再生輔因子的酶的組合比與甲酸脫氫酶的類似組合顯著提高的性能(參見實施例4(＝對比實施例)和實施例5至7)。
優(yōu)選地，在＞150mM、尤其是＞250mM和非常優(yōu)選地＞500mM醛的高底物濃度進行轉(zhuǎn)化。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“在＞150mM的高底物濃度”應(yīng)當(dāng)理解為指，當(dāng)使用所述方法時，轉(zhuǎn)化了＞150mM的底物/采用的水性溶劑的起始體積(包括緩沖系統(tǒng))?；谒匀軇┑钠鹗俭w積，是否確實達到了＞150mM底物的反應(yīng)混合物濃度，或是否總轉(zhuǎn)化了共＞150mM的底物濃度，在此不是至關(guān)重要的。
但是，一個非常特別優(yōu)選的變體是這樣的，其中確實提供了＞150mM的底物濃度等的醛用于轉(zhuǎn)化。本文所述的濃度指，在反應(yīng)混合物中實際上得到的基于水性溶劑的起始體積的底物(醛)濃度，其中在采用的全細胞催化劑或分離的酶(以純化的或部分純化的形式，或作為粗提取物)的溫育過程中，與何時達到該起始濃度無關(guān)。它僅僅達到至少一次。
當(dāng)使用全細胞催化劑時，可以直接在全細胞反應(yīng)開始時在這些濃度采用以批式形式的醛，或者可以首先使全細胞催化劑直到某光密度，然后加入醛。同樣地，可以首先在低濃度使用醛，然后在細胞反應(yīng)的溫育階段加入到所述濃度。但是，優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明，在底物向目標(biāo)醇的轉(zhuǎn)化過程中，可以在反應(yīng)中至少一次達到＞150mM等的底物濃度。對于較高濃度是按此意義的。
可以使用所有醛作為醛組分。優(yōu)選地，采用的醛組分可以包含在下面的一般結(jié)構(gòu)式中 其中R是(C1-C20)-烷基、(C2-C20)-鏈烯基、(C2-C20)-炔基、(C1-C20)-烷氧基、HO-(C1-C20)-烷基、(C2-C20)-烷氧基烷基、(C6-C18)-芳基、(C7-C19)-芳烷基、(C3-C18)-雜芳基、(C4-C19)-雜芳烷基、(C1-C20)-烷基-(C6-C18)-芳基、(C1-C20)-烷基-(C3-C18)-雜芳基、(C3-C8)-環(huán)烷基、(C1-C20)-烷基-(C3-C8)-環(huán)烷基、(C3-C8)-環(huán)烷基-(C1-C20)-烷基、(C6-C18)-芳基-(C2-C20)-鏈烯基。該方法特別突出地用于還原在基團中包含至少一個C＝C雙鍵的醛。在此非常優(yōu)選地采用的物質(zhì)是2-反式-己烯醛、2-順式-己烯醛、3-反式-己烯醛、3-順式-己烯醛和/或肉桂醛。
對于本發(fā)明，優(yōu)選地選擇的酶之一是醇脫氫酶。專業(yè)人員在選擇醇脫氫酶時不受限制。已經(jīng)證實優(yōu)選的醇脫氫酶是，例如，來自乳桿菌屬(Lactobacillus)菌株，特別是來自高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)和短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的醇脫氫酶，或來自紅球菌屬(Rhodococcus)菌株，特別是來自紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)的醇脫氫酶，或來自節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)菌株，特別是來自石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacter paraffineus)的醇脫氫酶。
已經(jīng)證實用于輔因子再生的優(yōu)選脫氫酶是葡萄糖脫氫酶，優(yōu)選來自芽孢桿菌屬(Bacillus)、熱原體屬(Thermoplasma)和假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株的葡萄糖脫氫酶。葡萄糖脫氫酶被例如A.Bommarius記載在Enzyme Catalysis in Organic Syn thesis(Ed.K.Drauz，H.Waldmann)，Volume III，Wiley-VCH，Weinheim，2002，Kapitel 15.3。
專業(yè)人員熟知蘋果酸脫氫酶(S.-I.Suye，M.Kawagoe，S.Inuta，Can.J.Chem.Eng.1992，70，306-312；S.-I.Suye，Recent Res.Devel.Ferment.Bioeng.1998，1，55-64；Dissertation S.Naamnieh，Universitt Düsseldorf；WO2004/022764)。另外，專業(yè)人員能選擇可以最有效地用于他的目的的脫氫酶。原則上，優(yōu)選這樣的蘋果酸脫氫酶，其能再生NAD(P)H至在其它所使用的酶的反應(yīng)過程中不產(chǎn)生瓶頸的程度。采用的蘋果酸脫氫酶(“蘋果酸酶”)優(yōu)選地是來自硫葉菌屬(Sulfolobus)、梭菌屬(Clostridium)、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬菌株和來自大腸桿菌(E.coli)的“蘋果酸酶”。在此相關(guān)的，非常優(yōu)選的是已知的大腸桿菌K12蘋果酸脫氫酶。基因分離和克隆記載在S.Naamnieh，Dissertation，Universitt Düsseldorf，70頁及其后。
可以以任意的方式加入醛。優(yōu)選地，在開始時(批式反應(yīng))加入所有量的醛，或作為替代方案計量地加入。也可以采用連續(xù)加入(連續(xù)補料方法)。這些方法是專業(yè)人員熟知的，且在本發(fā)明的情況下類似地采用。
根據(jù)本發(fā)明，“重組全細胞催化劑”應(yīng)當(dāng)理解為指，其中表達或已經(jīng)表達至少一個重組基因的細胞，也就是說，存在至少一種能催化根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化(醛的還原和/或輔因子的再生)的重組蛋白。重組蛋白不限于以活的或非活的全細胞催化劑的形式存在，但是可以以任何活性形式存在。在此“活性形式”應(yīng)當(dāng)理解為指，重組蛋白的催化酶促反應(yīng)的能力。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，重組蛋白僅以游離形式分布在細胞的胞質(zhì)溶膠中，且不以包涵體的形式存在。根據(jù)本發(fā)明，細胞能或已經(jīng)能表達醇脫氫酶和能再生輔因子的脫氫酶。
所有已知的細胞都適于包含醇脫氫酶和能再生輔因子的酶的全細胞催化劑。在該上下文中，要提及的微生物是有機體，例如，酵母例如多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、畢赤酵母屬(Pichia sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，原核生物例如大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或真核生物例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞。克隆方法是專業(yè)人員熟知的(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratorymanual，2nded.，Cold Spring Har borLa bora tory Press，New York)。優(yōu)選地，為該目的使用大腸桿菌菌株。非常特別優(yōu)選的是大腸桿菌XL1 Blue，NM522，JM101，JM109，JM105，RR1，DH5α，TOP10-，HB101，BL21 codon plus，BL21(DE3)codon plus，BL21，BL21(DE3)，MM294。用于將含有根據(jù)本發(fā)明的核酸的基因構(gòu)建體優(yōu)選地克隆進宿主有機體中的質(zhì)粒對于專業(yè)人員同樣是已知的(也參見PCT/EP03/07148；參見下文)。
原則上，合適的質(zhì)?；蜉d體是專業(yè)人員可得到用于該目的的所有實施方案。這樣的質(zhì)粒和載體可以參見例如Studier和同事(Studier，W.F.；Rosenberg A.H.；Dunn J.J.；Dubendroff J.W.；(1990)，Useof the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes，Methods Enzymol.185，61-89)或Novagen公司，Promega，NewEngland Biolabs，Clontech或GibcoBRL的目錄。其它優(yōu)選的質(zhì)粒和載體可以參見Glover，D.M.(1985)，DNA cloninga practicalapproach，Vol.I-III，IRL Press Ltd.，Oxford；Rodriguez，R.L.和Denhardt，D.T.(eds)(1988)，Vectorsa survey of molecularcloning vectors and their uses，179-204，Butterworth，Stoneham；Goeddel，D.V.(1990)，Systems for heterologous gene expression，Methods Enzymol.185，3-7；Sambrook，J.；Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York。
可以用于將含有目標(biāo)核酸序列的基因構(gòu)建體以非常特別優(yōu)選的方式克隆進宿主有機體中的質(zhì)粒是，或基于pUC18/19(RocheBiochemicals)，pKK-177-3H(Roche Biochemicals)，pBTac2(RocheBiochemicals)，pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech)，pKK-233-3(Stratagene)或pET(Novagen)。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，優(yōu)選地預(yù)處理全細胞催化劑，相對于完整系統(tǒng)使細胞膜對底物和產(chǎn)物的滲透性增加。在此特別優(yōu)選的是其中例如通過冷凍和/或用有機溶劑(尤其是甲苯)處理來預(yù)處理全細胞催化劑。
在特別的方式中，其中合適的是含有來自紅串紅球菌或高加索酸奶乳桿菌的醇脫氫酶，以及蘋果酸脫氫酶(包括所謂的蘋果酸酶)的重組全細胞催化劑。同樣合適的是含有來自紅串紅球菌或高加索酸奶乳桿菌的醇脫氫酶和來自嗜酸熱原體或枯草桿菌的葡萄糖脫氫酶的所有可能組合的重組全細胞催化劑。在實驗部分所述的兩種重組全細胞催化劑優(yōu)選地用作特別合適的重組全細胞催化劑。
該重組全細胞催化劑的濃度優(yōu)選地最高至75g/L，在另一個優(yōu)選的實施方案中直至50g/L，非常特別優(yōu)選地直至25g/L，且特別優(yōu)選地直至15g/L，g指濕生物量(BFM)。
本發(fā)明的方法可以在任意的、尤其是對于所使用的重組全細胞催化劑適宜的反應(yīng)溫度下進行。特別合適的反應(yīng)溫度是10至90℃，優(yōu)選地15至50℃，和特別優(yōu)選地20至35℃。
關(guān)于反應(yīng)的pH-值，專業(yè)人員也是可以自由選擇的，在此反應(yīng)可以在固定的pH進行，或可以在pH區(qū)間內(nèi)變化pH-值。特別是考慮所采用的宿主有機體或所使用的分離的酶的需要選擇pH-值。優(yōu)選地，在pH 5至9、優(yōu)選地pH 6至8、特別優(yōu)選地在pH 6.5至7.5進行反應(yīng)。
所采用的底物向目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化優(yōu)選地在細胞培養(yǎng)物中在使用合適的重組全細胞催化劑的情況下進行。在此分別根據(jù)所使用的宿主有機體使用合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基。適用于宿主細胞的培養(yǎng)基通常是已知的且可商業(yè)上得到。此外，可以向細胞培養(yǎng)物中添加常用的添加劑，例如抗生素、生長促進劑例如血清(胎牛血清等)和類似的已知添加劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，在醛向目標(biāo)伯醇的轉(zhuǎn)化中不添加有機溶劑。這意味著，不向含有生物催化劑的反應(yīng)混合物中添加有機溶劑。或者，但是，可以將其它有機溶劑加入進行反應(yīng)所必須的補加水中，優(yōu)選可溶于水的有機溶劑。它們指，特別是水溶性的有機溶劑，例如醇，尤其是甲醇或乙醇，或醚例如THF或二噁烷。
此外，優(yōu)選地在合適的重組全細胞催化劑的細胞懸浮液中進行轉(zhuǎn)化，在細胞懸浮液中采用的醛也可以作為懸浮液存在，或以在細胞懸浮液中的乳狀液或溶液的形式存在。
當(dāng)使用分離的酶(以純化的或部分純化的形式，或作為粗提取物或以固定化的形式)時，優(yōu)選的實施方案添加適當(dāng)量的相應(yīng)的輔因子。典型地，輔因子的添加量范圍是0.00001至0.1當(dāng)量，優(yōu)選地0.0001至0.O1和非常特別地0.0001和0.001當(dāng)量。在一個優(yōu)選的實施方案中，在采用全細胞催化劑的情況下，可以放棄添加″外來″輔因子添加物，或可以在小于0.0005當(dāng)量的范圍內(nèi)使用這樣的″外來″輔因子添加物。
對于本反應(yīng)，在優(yōu)選的實施方案中遵循這樣的方法，其中將重組全細胞催化劑或分離的酶和底物在預(yù)置于所選擇的溶劑系統(tǒng)中。然后，可以根據(jù)需要，將特定量的相應(yīng)需要的輔因子(例如NADH或NADPH，或它們的氧化形式NAD+和NADP+)加入反應(yīng)混合物中。但是，可以改變添加的次序。通過專業(yè)人員已知的方法加工反應(yīng)混合物。在批式方法中，通過過濾或離心，可以將生物量容易地從產(chǎn)物中分離。所獲得的醇可以通過常規(guī)方法(例如萃取、蒸餾、結(jié)晶)進行分離。
但是，也可以連續(xù)進行本方法。為此在所謂的酶膜反應(yīng)器中進行反應(yīng)，其中高分子量物質(zhì)(酶或生物量)被阻留在超濾膜后，且低分子量物質(zhì)(例如經(jīng)生產(chǎn)的氨基酸)可以穿過膜。這類方法已經(jīng)重復(fù)記載在現(xiàn)有技術(shù)中(Wandrey等in Jahrbuch 1998，Verfahrenstechnikund Chemieingenieurwesen，VDI，151頁及其后；Kragl等，Angew.Chem.1996，6，684)。
作為(C1-C20)-烷基基團，特別是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基和所有它們的成鍵異構(gòu)體。按此意義，(C1-C8)-烷基基團是這樣的，其中在鏈中存在1至8個C原子。
(C2-C20)-鏈烯基基團指具有至少一個C＝C雙鍵的如上所述的(C1-C20)-烷基基團。(C2-C20)-炔基基團指具有至少一個C≡C三鍵的如上所述的(C1-C20)-烷基基團。(C1-C20)-烷氧基基團與(C1-C20)-烷基基團相對應(yīng)，條件是，前者通過氧原子結(jié)合到分子上。相應(yīng)地適用于(C1-C8)-烷氧基基團。
(C2-C20)-烷氧基烷基應(yīng)當(dāng)理解為指這樣的基團，其中烷基鏈被至少一個氧官能團中斷，不可能由兩個氧原子彼此連接。碳原子的數(shù)目指示著該基團中存在的碳原子的總數(shù)。
上述基團可以被鹵素和/或含有N、O、P、S、Si原子的基團單取代或多取代。它們特別是上述類型的烷基基團，其在它們的鏈中含有一個或多個所述雜原子，或其通過所述雜原子之一結(jié)合到分子上。
(C3-C8)-環(huán)烷基應(yīng)當(dāng)理解為指，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基等。它們可以被一個或多個鹵素和/或含有N、O、P、S、Si原子的基團取代，和/或可以在環(huán)中含有N、O、P、S原子，例如1-，2-，3-，4-哌啶基，1-，2-，3-吡咯烷基，2-，3-四氫呋喃基，2-，3-，4-嗎啉基。
(C3-C8)-環(huán)烷基-(C1-C20)-烷基基團指，通過如上所述的烷基基團結(jié)合到分子上的如上所述的環(huán)烷基基團。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，(C1-C8)-酰氧基指通過COO官能團結(jié)合到分子上的具有最高至8個碳原子的如上定義的烷基基團。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，(C1-C8)-?；竿ㄟ^CO官能團結(jié)合到分子上的具有最高至8個碳原子的如上定義的烷基基團。
(C6-C18)-芳基基團應(yīng)當(dāng)理解為指，具有6至18個C原子的芳族基團。特別是包括化合物例如苯基、萘基、蒽基、菲基、聯(lián)苯基基團或在相關(guān)分子上稠合的前述類型的系統(tǒng)，例如，可以任選地被(C1-C8)-烷基、(C1-C8)-烷氧基、NR1R2、(C1-C8)-?；?、(C1-C8)-酰氧基取代的茚基系統(tǒng)。
(C7-C26)-芳烷基基團是通過(C1-C8)-烷基基團結(jié)合到分子上的(C6-C18)-芳基基團。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，(C3-C18)-雜芳基基團指3至18個C原子的5-、6-或7-元芳環(huán)系統(tǒng)，其在環(huán)中具有雜原子，例如氮、氧或硫。特別是認(rèn)為這樣的雜芳族化合物是下述基團，如1-，2-，3-呋喃基、如1-，2-，3-吡咯基、1-，2-，3-噻吩基、2-，3-，4-吡啶基、2-，3-，4-，5-，6-，7-吲哚基、3-，4-，5-吡唑基、2-，4-，5-咪唑基、吖啶基、喹啉基、菲啶基、2-，4-，5-，6-嘧啶基。
(C4-C26)-雜芳烷基應(yīng)當(dāng)理解為指，與(C7-C26)-芳烷基基團相對應(yīng)的雜芳族化合物系統(tǒng)。
作為鹵素(Hal)考慮氟、氯、溴和碘。
術(shù)語“分離的酶”理解為根據(jù)本發(fā)明使用醇脫氫酶和選自葡萄糖脫氫酶或蘋果酸脫氫酶的能再生輔因子的酶作為分離的酶(以純化的或部分純化的形式，或作為粗提取物或以固定化的形式)。
稱作為“蘋果酸酶”的蘋果酸脫氫酶(MDH)，催化蘋果酸的氧化脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)楸?。已知大量來自各種有機體的蘋果酸脫氫酶，因此，尤其是來自高等動物、植物和微生物?？梢詤^(qū)分4種類型的蘋果酸脫氫酶，它們歸入酶類別E.C.1.1.1.37至EC1.1.1.40(http://www.genome.ad.jp)。根據(jù)蘋果酸脫氫酶的類型，需要NAD和/或NADP作為輔因子。
根據(jù)布達佩斯條約，申請人已經(jīng)于2001年8月24日將在實施例中使用的大腸桿菌保藏在DSMZ GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，保藏號為DSM 14459。
附圖

圖1顯示了質(zhì)粒pNO5c的質(zhì)粒圖譜。
圖2顯示了質(zhì)粒pNO8c的質(zhì)粒圖譜。
圖3顯示了質(zhì)粒pNO14c的質(zhì)粒圖譜。
實驗部分制備包含來自高加索酸奶乳桿菌的(R)-醇脫氫酶和來自嗜酸熱原體的葡萄糖脫氫酶的全細胞催化劑菌株生產(chǎn)用質(zhì)粒pNO5c轉(zhuǎn)化大腸桿菌DSM14459(記載在專利WO03/042412中)的化學(xué)感受態(tài)細胞(Sambrook等1989，Molecular cloningALaboratory Manua 1，2nd Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。該質(zhì)粒編碼來自高加索酸奶乳桿菌的醇脫氫酶(Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenasea useful catalystfor synthesis.Bradshaw等JOC 1992，571532-6，Reduction ofacetophenone to R(+)-phenylethanol by a new alcoholdehydrogenase from Lactobacillus kefir.Hummel W.Ap MicrobiolBiotech 1990，34，15-19)。使重組大腸桿菌DSM14459(pNO5c-圖1)化學(xué)感受，并用質(zhì)粒pNO8c(圖2)轉(zhuǎn)化，后者編碼來自嗜酸熱原體的密碼子優(yōu)化的葡萄糖脫氫酶的基因(Bright，J.R.等，1993 Eur.J.Biochem.211549-554)。兩個基因都在鼠李糖啟動子的控制下(Stumpp，Tina；Wilms，Burkhard；Altenbuchner，Josef.A new，L-rhamnose-inducible expression system for Escherichia coli.BIOspektrum(2000)，6(1)，33-36)。下文詳述了pNO5c和pNO8c的序列和質(zhì)粒圖譜。
活性細胞的制備在搖動(250轉(zhuǎn)每分)下，在37℃，在2ml添加了抗生素(50μg/L氨芐青霉素和20μg/ml氯霉素)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌DSM14459(pNO5c，pNO8c)單菌落18小時。在含有作為誘導(dǎo)物的鼠李糖(2g/L)、添加的抗生素(50μg/L氨芐青霉素和20μg/ml氯霉素)和1mM ZnCl2的新鮮LB培養(yǎng)基中1∶100稀釋該培養(yǎng)物，在搖動(250轉(zhuǎn)每分)下，在30℃培養(yǎng)18小時。離心(10000g，10min，4℃)細胞，拋棄上清液，將細胞沉淀直接地或在-20℃保藏后用于生物轉(zhuǎn)化實驗。
制備包含來自紅串紅球菌的(S)-醇脫氫酶和來自枯草桿菌的葡萄糖脫氫酶的全細胞催化劑菌株生產(chǎn)用質(zhì)粒pNO14c轉(zhuǎn)化大腸桿菌DSM14459(記載在專利WO03/042412中)的化學(xué)感受態(tài)細胞(Sambrook等1989，Molecular cloningALaboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。該質(zhì)粒編碼來自紅串紅球菌的醇脫氫酶(Cloning，sequenceanalysis and heterologous expression of the gene encoding a(S)-specific alcohol dehydrogenase from Rhodococcuserythropolis DSM 43297.Abokitse，K.；Hummel，W.AppliedMicrobiology and Biotechnology 2003，62 380-386)和來自枯草桿菌的葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilisexpressed in Escherichia coli.IPurification，characterization and comparison with glucose dehydrogenasefrom Bacillus megaterium.Hilt W；Pfleiderer G；Fortnagel PBiochimica et biophysica acta(1991 Jan 29)，1076(2)，298-304)。醇脫氫酶在鼠李糖啟動子的控制下(Stumpp，Tina；Wilms，Burkhard；Altenbuchner，Josef.A new，L-rhamnose-inducible expressionsystem for Escherichia coli.BIOspektrum(2000)，6(1)，33-36)。下文詳述了pNO14c的序列和質(zhì)粒圖譜。
活性細胞的制備在搖動(250轉(zhuǎn)每分)下，在37℃，在2ml添加了抗生素(50μg/L氨芐青霉素和20μg/ml氯霉素)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌DSM14459(pNO14c-圖3)單菌落18小時。在含有作為誘導(dǎo)物的鼠李糖(2g/L)、添加的抗生素(50μg/L氨芐青霉素和20μg/ml氯霉素)和1mM ZnCl2的新鮮LB培養(yǎng)基中1∶100稀釋該培養(yǎng)物，在搖動(250轉(zhuǎn)每分)下，在30℃培養(yǎng)18小時。離心(10000g，10min，4℃)細胞，拋棄上清液，將細胞沉淀直接地或在-20℃保藏后用于生物轉(zhuǎn)化實驗。
生產(chǎn)肉桂醇和反式-2-己烯-1-醇的實施例實施例1使用包含醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的全細胞催化劑，還原0.2M溶液中的肉桂醛在Titrino反應(yīng)器中，在室溫下，將光密度為OD＝24的細胞濃度的含有醇脫氫酶(大腸桿菌，來自紅串紅球菌的(S)-醇脫氫酶，來自芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶)的上述全細胞催化劑大腸桿菌DSMl4459(pNO14c)、1.05當(dāng)量的葡萄糖(當(dāng)量是基于使用的肉桂醛的量)和8mmol肉桂醛(基于使用的磷酸鹽緩沖液，相應(yīng)于0.2M底物濃度)加入40ml磷酸鹽緩沖液(調(diào)節(jié)到pH 7.0)。在室溫攪拌反應(yīng)混合物，通過添加氫氧化鈉溶液(2 M NaOH)，使pH保持恒定(在pH 6.5)。在固定間隔取樣，通過HPLC測定肉桂醛向肉桂醇的轉(zhuǎn)化。1小時后，轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達到93％，且在2小時后達到100％。
實施例2使用包含醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的全細胞催化劑，還原0.5M溶液中的肉桂醛在Titrino反應(yīng)器中，在室溫下，將光密度為OD＝16的細胞濃度的含有醇脫氫酶(大腸桿菌，來自紅串紅球菌的(S)-醇脫氫酶，來自芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶)的上述全細胞催化劑大腸桿菌DSMl4459(pNO14c)、1.05當(dāng)量的葡萄糖(當(dāng)量是基于使用的肉桂醛的量)和20mmol肉桂醛(基于使用的磷酸鹽緩沖液，相應(yīng)于0.5M底物濃度)加入40ml磷酸鹽緩沖液(調(diào)節(jié)到pH 7.0)。在室溫攪拌反應(yīng)混合物25小時，通過添加氫氧化鈉溶液(2 M NaOH)，使pH保持恒定(在pH 6.5)。在固定間隔取樣，通過HPLC測定肉桂醛向肉桂醇的轉(zhuǎn)化。1小時后，轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達到44％，在5小時后達到91％，且在25小時后達到93％。
實施例3使用包含(R)-選擇性的醇脫氫酶的全細胞催化劑還原1.5M溶液中的肉桂醛在Titrino反應(yīng)器中，在室溫下，將光密度為OD＝30的細胞濃度的含有(R)-選擇性的醇脫氫酶(大腸桿菌，來自高加索酸奶乳桿菌的(R)-醇脫氫酶，來自嗜酸熱原體的葡萄糖脫氫酶)的上述全細胞催化劑大腸桿菌DSM14459(pNO5c，pNO8c)、1.05當(dāng)量的葡萄糖(當(dāng)量是基于使用的肉桂醛的量)和60mmol肉桂醛(基于使用的磷酸鹽緩沖液，相應(yīng)于1.5M底物濃度)加入40ml磷酸鹽緩沖液(調(diào)節(jié)到pH 7.0)。在室溫攪拌反應(yīng)混合物，通過添加氫氧化鈉溶液(5 M NaOH)，使pH保持恒定。在固定間隔取樣，通過HPLC測定肉桂醛向肉桂醇的轉(zhuǎn)化。1小時后，轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達到15％，在5小時后達到58％，且在23.5小時后達到98％。
實施例4(對比實施例)使用甲酸脫氫酶進行輔因子再生，轉(zhuǎn)化100mM的反式-2-己烯醛在3 0℃的反應(yīng)溫度，在1ml磷酸鹽緩沖液(100mM；pH 7.0)中，攪拌由反式-2-己烯醛(100mM)和NADH(3.5mM，相應(yīng)于0.035當(dāng)量(基于醛))、甲酸鈉(455mM，相應(yīng)于4.55當(dāng)量(基于醛))和酶量為20U/mmol來自紅串紅球菌的(S)-ADH(在大腸桿菌中的實驗)和20U/mmol來自Candida boidinii的甲酸脫氫酶組成的反應(yīng)混合物72小時。在該階段內(nèi)，取樣，通過HPLC測定各轉(zhuǎn)化率。5小時后的轉(zhuǎn)化率為7％，且72小時后為16％。
實施例5使用葡萄糖脫氫酶進行輔因子再生，轉(zhuǎn)化100mM的反式-2-己烯醛在30℃的反應(yīng)溫度，在1ml磷酸鹽緩沖液(100mM；pH 7.0)中，攪拌由反式-2-己烯醛(100mM)和NADH(1.4mM，相應(yīng)于0.014當(dāng)量(基于醛))、葡萄糖(300mM，相應(yīng)于3當(dāng)量(基于醛))和酶量為20U/mmol來自紅串紅球菌的(S)-ADH(在大腸桿菌中的實驗)和150U/mmol來自芽孢桿菌屬的葡萄糖脫氫酶組成的反應(yīng)混合物72小時。在該階段內(nèi)，取樣，通過HPLC測定各轉(zhuǎn)化率。5小時后的轉(zhuǎn)化率為64％，且72小時后為72％。
實施例6使用葡萄糖脫氫酶進行輔因子再生，轉(zhuǎn)化100mM的反式-2-己烯醛在30℃的反應(yīng)溫度，在1ml磷酸鹽緩沖液(100mM；pH 7.0)中，攪拌由反式-2-己烯醛(100mM)和NADPH(1mM，相應(yīng)于0.01當(dāng)量(基于醛))、氯化鎂(5mM)、葡萄糖(300mM，相應(yīng)于3當(dāng)量(基于醛))和酶量為13U/mmol來自高加索酸奶乳桿菌的(R)-ADH和60U/mmol來自嗜酸熱原體的葡萄糖脫氫酶組成的反應(yīng)混合物72小時。在該階段內(nèi)，取樣，通過HPLC測定各轉(zhuǎn)化率。1小時后的轉(zhuǎn)化率為40％，5小時后為79％，且72小時后為86％。
實施例7使用包含醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的全細胞催化劑，還原0.5M溶液中的反式-2-己烯醛在Titrino反應(yīng)器中，在室溫下，將光密度為OD＝27的細胞濃度的含有(R)-選擇性的醇脫氫酶(大腸桿菌，來自高加索酸奶乳桿菌的(R)-醇脫氫酶，來自嗜酸熱原體的葡萄糖脫氫酶)的上述全細胞催化劑大腸桿菌DSM14459(pNO5c，pNO8c)、6當(dāng)量的葡萄糖(當(dāng)量是基于使用的肉桂醛的量)和20mmol反式-2-己烯醛(基于使用的磷酸鹽緩沖液，相應(yīng)于0.5M底物濃度)加入40ml磷酸鹽緩沖液(調(diào)節(jié)到pH 7.0)。在室溫攪拌反應(yīng)混合物24小時，通過添加氫氧化鈉溶液(2M NaOH)，使pH保持恒定。在固定間隔取樣，通過HPLC測定反式-2-己烯醛向反式-2-己烯-1-醇的轉(zhuǎn)化。1小時后，轉(zhuǎn)化率為24％，5小時后為61％，且在24小時后＞99％。
序列表<110>Degussa AG<120>酮的全細胞還原<130>36003P WO<150>DE102004038064.6<151>2004-08-05<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>5740<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>具有高加索酸奶乳桿菌<400>1aattcttaag aaggagatat acatatgact gatcgtttaa aaggcaaagt agcaattgta 60actggcggta ccttgggaat tggcttggca atcgctgata agtttgttga agaaggcgca 120aaggttgtta ttaccggccg tcacgctgat gtaggtgaaa aagctgccaa atcaatcggc 180ggcacagacg ttatccgttt tgtccaacac gatgcttctg atgaagccgg ctggactaag 240ttgtttgata cgactgaaga agcatttggc ccagttacca cggttgtcaa caatgccgga 300attgcggtca gcaagagtgt tgaagatacc acaactgaag aatggcgcaa gctgctctca 360gttaacttgg atggtgtctt cttcggtacc cgtcttggaa tccaacgtat gaagaataaa 420ggactcggag catcaatcat caatatgtca tctatcgaag gttttgttgg tgatccaact 480ctgggtgcat acaacgcttc aaaaggtgct gtcagaatta tgtctaaatc agctgccttg 540gattgcgctt tgaaggacta cgatgttcgg gttaacactg ttcatccagg ttatatcaag 600
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<213>人工序列<220>
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<223>具有紅串紅球菌-sADH和枯草芽孢桿菌-GDH的pNO14c<400>3tatgtatccg gatttaaaag gaaaagtcgt cgctattaca ggagctgctt cagggctcgg60aaaggcgatg gccattcgct tcggcaagga gcaggcaaaa gtggttatca actattatag120taataaacaa gatccgaacg aggtaaaaga agaggtcatc aaggcgggcg gtgaagctgt180tgtcgtccaa ggagatgtca cgaaagagga agatgtaaaa aatatcgtgc aaacggcaat240taaggagttc ggcacactcg atattatgat taataatgcc ggtcttgaaa atcctgtgcc300atctcacgaa atgccgctca aggattggga taaagtcatc ggcacgaact taacgggtgc360ctttttagga agccgtgaag cgattaaata tttcgtagaa aacgatatca agggaaatgt420cattaacatg tccagtgtgc acgaagtgat tccttggccg ttatttgtcc actatgcggc480aagtaaaggc gggataaagc tgatgacaga aacattagcg ttggaatacg cgccgaaggg540cattcgcgtc aataatattg ggccaggtgc gatcaacacg ccaatcaatg ctgaaaaatt600cgctgaccct aaacagaaag ctgatgtaga aagcatgatt ccaatgggat atatcggcga660accggaggag atcgccgcag tagcagcctg gcttgcttcg aaggaagcca gctacgtcac720
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權(quán)利要求
1.通過還原醛生產(chǎn)伯醇的方法，其特征在于，在包含醇脫氫酶和能再生輔因子的酶的重組全細胞催化劑存在下進行轉(zhuǎn)化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在包含醇脫氫酶和選自葡萄糖脫氫酶或蘋果酸脫氫酶的能再生輔因子的酶的重組全細胞催化劑存在下進行轉(zhuǎn)化。
3.通過還原醛生產(chǎn)伯醇的方法，其特征在于，在分離的醇脫氫酶和分離的來自葡萄糖脫氫酶或蘋果酸脫氫酶的能再生輔因子的酶存在下進行轉(zhuǎn)化。
4.如權(quán)利要求1、2或3中的任一項所述的方法，其特征在于，使用2-反式-己烯醛、2-順式-己烯醛、3-反式-己烯醛、3-順式-己烯醛和/或肉桂醛作為醛組分。
5.如權(quán)利要求1至4所述的方法，其特征在于，使用的醇脫氫酶是來自乳桿菌屬(Lactobacillus)菌株，特別是來自高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)和短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的醇脫氫酶，或來自紅球菌屬(Rhodococcus)菌株，特別是來自紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)。
6.如權(quán)利要求1至5所述的方法，其特征在于，使用的能再生輔因子的酶是葡萄糖脫氫酶，優(yōu)選地來自芽孢桿菌屬(Bacillus)、熱原體屬(Thermoplasma)和假單胞菌屬(Pseudomona s)菌株，或甲酸脫氫酶，優(yōu)選地來自念珠菌屬(candida)和假單胞菌屬菌株。
7.如權(quán)利要求1至6所述的方法，其特征在于，使用的能再生輔因子的酶是蘋果酸脫氫酶。
8.如權(quán)利要求1至7所述的方法，只要權(quán)利要求涉及全細胞催化劑的應(yīng)用，其特征在于，大腸桿菌用作宿主有機體。
全文摘要
本發(fā)明涉及在全細胞催化劑或分離的酶的輔助下從醛生產(chǎn)伯醇的方法。采用了醇脫氫酶和能再生輔因子的酶，其中優(yōu)選地具有＞150mM待轉(zhuǎn)化醛的底物濃度。
文檔編號C12P7/22GK101027403SQ200580032176
公開日2007年8月29日 申請日期2005年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月5日
發(fā)明者H·格羅戈, F·沙穆洛, C·阿熱多恩 申請人:卡吉爾公司