專利名稱：基因檢查用微反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在將從待檢樣品收容部注入的待檢樣品或?qū)υ摯龣z樣品進(jìn)行前處理了的處理液、和收容在擴(kuò)增試劑收容部的試劑輸送到反應(yīng)部進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)后，在上述各部通過微細(xì)流路連通的芯片內(nèi)進(jìn)行用檢測(cè)部檢測(cè)該基因擴(kuò)增反應(yīng)的操作的基因檢查用微反應(yīng)器，尤其是適合于檢測(cè)來自待檢樣品的菌體的微反應(yīng)器。
背景技術(shù)：
近年來，通過驅(qū)動(dòng)微反應(yīng)器技術(shù)和超微細(xì)加工技術(shù)，開發(fā)了將用于進(jìn)行現(xiàn)有的試樣調(diào)制、化學(xué)分析、化學(xué)合成等的裝置、元件(例如泵、閥、流路、傳感器等)微細(xì)化，集成在1個(gè)芯片上的系統(tǒng)(專利文獻(xiàn)1)。這也稱為μ-TAS(Micro total Analysis System)、生物反應(yīng)器、芯片上的實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-chips)、生物芯片，希望能應(yīng)用于醫(yī)療檢查/診斷領(lǐng)域、環(huán)境測(cè)定領(lǐng)域、農(nóng)產(chǎn)品制造領(lǐng)域。尤其如在基因檢查時(shí)所見到的那樣，在需要煩雜的工序、熟練的手法、器械類的操作的情況下，自動(dòng)化、高速化以及簡(jiǎn)便化的微型化分析系統(tǒng)，不僅成本、需要的試樣量、所需時(shí)間，而且時(shí)間以及場(chǎng)所不用加以選擇就能分析，可以說好處極大。
例如，在人、家畜中所見的新型感染癥突發(fā)性流行的過程中，確定致病原因的病毒、細(xì)菌，成為分秒必爭(zhēng)的預(yù)防對(duì)策的最初障礙。對(duì)于往往菌的培養(yǎng)決定全反應(yīng)速度的現(xiàn)有的檢測(cè)法來說，不選擇場(chǎng)所就能迅速地出結(jié)果的基因檢查技術(shù)，是順應(yīng)這一當(dāng)務(wù)之急的要求而產(chǎn)生的。再有，即使對(duì)于由于基因而引起的病的診斷、生活習(xí)慣病等的發(fā)病危險(xiǎn)度預(yù)測(cè)、基因治療來說，需求量也很大。
臨床檢查很重視這些分析用的芯片的分析的定量性、分析的精度、經(jīng)濟(jì)性等。因此，課題是用簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)確立高可靠性的送液系統(tǒng)。尋求精度高、可靠性優(yōu)異的微型流體控制元件。本發(fā)明人已經(jīng)提出了適合于該要求的微泵系統(tǒng)(專利文獻(xiàn)2和3)。
另外，對(duì)于將大量的臨床待檢樣品作為對(duì)象的芯片來說，最好是一次性的，再有，需要克服多用途對(duì)應(yīng)性、制造成本等問題。
以高密度固定了多個(gè)DNA片段的DNA芯片，存在搭載的信息內(nèi)容、增大的制作成本、還有檢測(cè)精度、再現(xiàn)性等還并不充分的問題。不過，由于基因檢查的目的和種類的不同，與在芯片基板上網(wǎng)絡(luò)狀配置多個(gè)DNA探針的方式相比，使用能適當(dāng)變更的引物、實(shí)時(shí)跟蹤DNA擴(kuò)增反應(yīng)的效率的方式，也能提供簡(jiǎn)便且迅速的檢查方法。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開2004-28589號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本專利特開2001-322099號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3日本專利特開2004-108285號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1「DNA芯片技術(shù)及其應(yīng)用」、「蛋白質(zhì)核酸酶」43卷、13號(hào)(1998年)君冢房夫、加藤郁之進(jìn)，共立出版(股份)發(fā)行

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于這些實(shí)際情況而提出的，其目的在于提供一種適合于通過基因擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)來自待檢樣品的菌體的基因檢查用微反應(yīng)器。
即，其目的在于提供一種確保廣泛應(yīng)用性和高靈敏度，能進(jìn)行適當(dāng)?shù)刈兏褂玫囊?、生物探針的方式的DNA擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)為一次性的低成本性，而且，在檢測(cè)時(shí)，能以簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)高精度地檢測(cè)的、用于檢測(cè)菌體的基因檢查用微反應(yīng)器。
用于解決問題的方法 本發(fā)明的基因檢查用微反應(yīng)器，是一種將從待檢樣品收容部注入的待檢樣品或?qū)υ摯龣z樣品進(jìn)行前處理的處理液和收容在擴(kuò)增試劑收容部的試劑輸送到反應(yīng)部，在進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)后，在上述各部通過微細(xì)流路連通的芯片內(nèi)進(jìn)行用檢測(cè)部檢測(cè)該基因擴(kuò)增反應(yīng)的操作的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征是在上述芯片內(nèi)設(shè)有收容溶解上述待檢樣品中的菌體的溶菌試劑的溶菌試劑的收容部；吸附由上述溶菌試劑溶解的菌體基因的微粒狀載體填充在微細(xì)流路內(nèi)的載體填充部；收容在將上述菌體基因吸附在上述載體上之后、向上述載體填充部輸送的清洗液的清洗液收容部；收容提取吸附在上述載體上的上述菌體基因的提取基因試劑的提取試劑收容部，而且，設(shè)有切換輸送到上述載體填充部的包含上述菌體基因的液體的送液方向、使上述液體在上述載體填充部反復(fù)前后運(yùn)動(dòng)的控制裝置。
發(fā)明效果 在上述發(fā)明中，作為待檢樣品的前處理，是在溶解待檢樣品中的菌體、使其基因吸附在微粒狀載體(珠子等)上的狀態(tài)下進(jìn)行清洗，接著在用提取試劑洗脫吸附基因后，輸送到反應(yīng)部使其進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，所以，能高效且迅速地獲得適合于擴(kuò)增反應(yīng)的前處理液。
特別是，由于使其沿流路的前后方向切換包含溶解的菌體基因的液體的送液方向，所以，能提高菌體基因和微粒狀載體相遇的概率，能高效地使許多菌體基因吸附在微粒狀載體上。


圖1是表示本發(fā)明的基因檢查用微反應(yīng)器的實(shí)施方式的芯片的簡(jiǎn)要結(jié)構(gòu)的平面圖。
圖2(a)是表示壓電泵的一個(gè)例子的截面圖，圖2(b)是其平面圖。圖2(c)是表示壓電泵的其它例子的截面圖。
圖3表示使壓電泵與芯片不是一體的情況下的芯片的泵連接部周邊的結(jié)構(gòu)的圖。
圖4是用于說明使來自待檢樣品的通過溶菌放出的菌體基因吸附在載體填充部的載體上的結(jié)構(gòu)的圖。
圖5是用于說明將來自待檢樣品的通過溶菌放出的菌體基因吸附在載體填充部的載體上的其他的結(jié)構(gòu)的圖。
圖6用于說明反復(fù)切換載體填充部?jī)?nèi)的包含菌體基因的液體的送液的前后方向的控制系統(tǒng)的圖。
圖7是表示進(jìn)行待檢樣品處理液和試劑的混合以及反應(yīng)的流路結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子的圖。
圖8是用于說明反復(fù)切換導(dǎo)入到微細(xì)流路內(nèi)的待檢樣品處理液和試劑的合流液的送液前后方向的控制系統(tǒng)的圖。
圖9是表示擴(kuò)增試劑收容部以及試劑混合部的結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子的圖。
圖10是表示在擴(kuò)增試劑收容部以及試劑混合部的芯片的下面設(shè)置珀耳帖元件(Peltier device)的狀態(tài)的截面圖。
圖11是表示用上述方法檢測(cè)ICAN法的擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)部和檢測(cè)部周邊的流路結(jié)構(gòu)的圖。
圖12是表示在微反應(yīng)器的流路中使用的單向閥的一個(gè)例子的截面圖。
圖13是用于說明利用單向閥的定量送液機(jī)構(gòu)的圖。
圖14是用于說明疏水性閥的結(jié)構(gòu)的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的基因檢查用微反應(yīng)器的特征是上述反應(yīng)部由從對(duì)上述待檢樣品進(jìn)行前處理的處理液和收容在上述擴(kuò)增試劑收容部的試劑合流的合流部開始的前面的微細(xì)流路構(gòu)成，具備切換輸送到上述反應(yīng)部的上述各液的合流液的送液方向、使上述合流液在上述反應(yīng)部反復(fù)前后運(yùn)動(dòng)的控制裝置。
在上述發(fā)明中，由于使在載體填充部進(jìn)行前處理的處理液和試劑的合流液在反應(yīng)部?jī)?nèi)切換送液方向、前后運(yùn)動(dòng)，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所以提高了菌體基因和試劑相遇的概率，提高了反應(yīng)速度。特別是，若使反應(yīng)部為微細(xì)流路，則由于粘性從流路中央部到流路內(nèi)壁側(cè)產(chǎn)生流速梯度，所以，在該條件下，通過切換向流路前后方向的送液而實(shí)現(xiàn)的試劑的擴(kuò)散是二維的，菌體基因和試劑相遇的概率變高了。
而且，最好是用微泵切換在載體填充部或反應(yīng)部的送液方向，該微泵具備流路阻力根據(jù)壓差的不同而變化的第1流路；與壓差的變化相對(duì)應(yīng)的流路阻力的變化比例比第1流路小的第2流路；與第1流路和第2流路連接的加壓室；改變?cè)摷訅菏业膬?nèi)部壓力的操作裝置；和驅(qū)動(dòng)該操作裝置的驅(qū)動(dòng)裝置。
本發(fā)明的基因檢查用微反應(yīng)器，是在將從待檢樣品收容部注入的待檢樣品或?qū)υ摯龣z樣品進(jìn)行前處理的處理液和收容在擴(kuò)增試劑收容部的試劑輸送到反應(yīng)部進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)后，在上述各部通過微細(xì)流路連通的芯片內(nèi)進(jìn)行用檢測(cè)部檢測(cè)該基因擴(kuò)增反應(yīng)的操作的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征是在上述芯片內(nèi)設(shè)有收容溶解上述待檢樣品中的菌體的溶菌試劑的溶菌試劑收容部；吸附由上述溶菌試劑溶解的菌體基因的微粒狀的載體填充在微細(xì)流路內(nèi)的載體填充部；收容在將上述菌體基因吸附在上述載體上之后向上述載體填充部輸送的清洗液的清洗液收容部；收容提取吸附在上述載體上的上述菌體基因的提取基因試劑的提取基因試劑收容部，而且，在連通上述各部的微細(xì)流路中的至少一個(gè)的微細(xì)流路中設(shè)有單向閥。
在上述的發(fā)明中，作為待檢樣品的前處理，是在溶解待檢樣品中的菌體、將該基因吸附在微粒狀載體上的狀態(tài)下進(jìn)行清洗，接著，用提取液洗洗脫附基因，輸送到反應(yīng)部使其進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，所以，能高效且迅速地獲得適合于擴(kuò)增反應(yīng)的前處理液。
再有，由于在上述各收容部和載體填充部之間的流路的適當(dāng)?shù)奈恢迷O(shè)置單向閥，所以，能防止液體在該位置倒流，能可靠地進(jìn)行規(guī)定的送液。
作為設(shè)置單向閥的理想的位置，在設(shè)置定量試劑或待檢樣品的處理液的后續(xù)結(jié)構(gòu)的情況下，可以列舉出該位置、還有由于在PCR法中被稱為交叉污染的污染所產(chǎn)生的影響顯著地變得嚴(yán)重，用于防止這些污染的適當(dāng)?shù)牟课?、除此之外，還有相對(duì)微泵和芯片的連接部的下游側(cè)的附近位置。
本發(fā)明的基因檢查用微反應(yīng)器，是在將從待檢樣品收容部注入的待檢樣品或?qū)υ摯龣z樣品進(jìn)行前處理的處理液和收容在擴(kuò)增試劑收容部的試劑輸送到反應(yīng)部進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)后，在上述各部通過微細(xì)流路連通的芯片內(nèi)進(jìn)行用檢測(cè)部檢測(cè)該基因擴(kuò)增反應(yīng)的操作的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征是在上述芯片內(nèi)設(shè)有收容溶解上述待檢樣品中的菌體的溶菌試劑的溶菌試劑收容部；吸附由上述溶菌試劑溶解的菌體基因的微粒狀的載體填充在微細(xì)流路內(nèi)的載體填充部；收容在將上述菌體基因吸附在上述載體上之后向上述載體填充部輸送的清洗液的清洗液收容部；收容提取吸附在上述載體上的上述菌體基因的提取基因試劑的提取基因試劑收容部，而且，設(shè)有冷卻上述擴(kuò)增試劑收容部、和/或混合來自多個(gè)上述擴(kuò)增試劑收容部的各試劑的試劑混合部的冷卻裝置。
上述冷卻裝置最好是珀耳帖元件。
在上述發(fā)明中，作為待檢樣品的前處理，是在溶解待檢樣品中的菌體、將該基因吸附在微粒狀載體上的狀態(tài)下進(jìn)行清洗，接著，用提取液洗脫附基因，輸送到反應(yīng)部使其進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，所以，能高效且迅速地獲得適合于擴(kuò)增反應(yīng)的前處理液。
再有，由于用珀耳帖元件等冷卻裝置冷卻擴(kuò)增試劑收容部和試劑混合部，所以，能防止因溫度(高)造成的試劑變質(zhì)。特別是，即使在其結(jié)構(gòu)為需要控制溫度、使其在PCR擴(kuò)增過程中，溫度在3個(gè)溫度之間升降、將ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleicamplification)法應(yīng)用于基因擴(kuò)增的情況下，由于需要使反應(yīng)部為50～65℃，所以雖然在反應(yīng)部升溫的過程中和混合試劑等時(shí)，試劑被加熱容易變質(zhì)，但由于在擴(kuò)增試劑收容部和試劑混合部的芯片上面或下面、或者上下兩面設(shè)有珀耳帖元件進(jìn)行冷卻，所以能防止其變質(zhì)。
本發(fā)明的基因檢查用微反應(yīng)器，是在將從待檢樣品收容部注入的待檢樣品或?qū)υ摯龣z樣品進(jìn)行前處理的處理液和收容在擴(kuò)增試劑收容部的試劑輸送到反應(yīng)部進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)后，在上述各部通過微細(xì)流路連通的芯片內(nèi)進(jìn)行用檢測(cè)部檢測(cè)該基因擴(kuò)增反應(yīng)的操作的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于在上述芯片內(nèi)設(shè)有收容溶解上述待檢樣品中的菌體的溶菌試劑的溶菌試劑收容部；吸附由上述溶菌試劑溶解的菌體基因的微粒狀的載體填充在微細(xì)流路內(nèi)的載體填充部；收容在將上述菌體基因吸附在上述載體上之后向上述載體填充部輸送的清洗液的清洗液收容部；收容提取吸附在上述載體上的上述菌體基因的提取基因試劑的提取基因試劑收容部，而且，在上述反應(yīng)部同時(shí)使上述菌體基因和內(nèi)部對(duì)照物擴(kuò)增，在其它檢測(cè)部對(duì)它們分別進(jìn)行檢測(cè)。
在上述發(fā)明中，由于作為待檢樣品的前處理，是溶解待檢樣品中的菌體、在將該基因吸附在微粒狀載體上的狀態(tài)下進(jìn)行清洗，接著，用提取液洗洗脫附基因，輸送到反應(yīng)部使其進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，所以，能高效且迅速地獲得適合于擴(kuò)增反應(yīng)的前處理液。
再有，由于使用于判別抑制物質(zhì)等引起的基因擴(kuò)增反應(yīng)的偽陰性的內(nèi)部對(duì)照物與待檢樣品的前處理液一起進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，在根據(jù)需要將反應(yīng)后的溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砗筮M(jìn)行分割，向其它的檢測(cè)部送液，在一方的檢測(cè)部檢測(cè)菌體基因的擴(kuò)增，在另一方的檢測(cè)部檢測(cè)內(nèi)部對(duì)照物的擴(kuò)增，因此，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能迅速地進(jìn)行高可靠性的檢查。

根據(jù)本發(fā)明提供的適合于細(xì)菌或病毒檢測(cè)的基因檢查用微反應(yīng)器，能確保廣泛應(yīng)用性和高靈敏性，能實(shí)現(xiàn)為一次性的低成本性，能用簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)進(jìn)行高精度的檢測(cè)，而且，能高效且迅速地對(duì)待檢樣品進(jìn)行適合于擴(kuò)增反應(yīng)的前處理。
在本說明書中，“基因”指的是指攜帶表達(dá)某種功能的遺傳信息的DNA或RNA，但有時(shí)也是指單獨(dú)的作為化學(xué)實(shí)體的DNA、RNA。
以下參照附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。圖1是表示本發(fā)明的基因檢查用微反應(yīng)器的實(shí)施方式的芯片的簡(jiǎn)要結(jié)構(gòu)的平面圖。本實(shí)施方式的基因檢查用微反應(yīng)器可以由圖示的芯片1和裝置本體構(gòu)成，裝置本體具備送液用微泵；與該送液、溫度、反應(yīng)的各控制有關(guān)的控制系；光學(xué)檢測(cè)系；負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的采集和處理的處理系。
芯片1以外的組成要素，可以制成使其為一體的裝置本體，能將芯片1安裝在該裝置上或拆下。微泵雖然也可以設(shè)置在芯片1上，但通過組裝在裝置本體上，將芯片1安裝在裝置本體上，也能將芯片1的泵連接部連接到裝置本體的微泵上。
芯片1是將例如樹脂、玻璃、硅、陶瓷等作為材料，用精密加工技術(shù)形成流路等制成的，例如，具有長(zhǎng)寬是幾十mm、高度是幾mm左右的尺寸。在芯片1上形成的微細(xì)流路，例如具有寬和高度大約是10μm～數(shù)百μm的尺寸。
溶菌試劑收容部3、清洗液收容部5、提取試劑收容部6、擴(kuò)增試劑收容部7、檢測(cè)試劑收容部8等各收容部?jī)?nèi)的液體，用與這些各收容部連通的微泵11進(jìn)行送液。微泵11可以通過使由光刻技術(shù)等形成的芯片狀的泵單元、和形成有圖示那樣的前處理、反應(yīng)以及檢測(cè)用的流路的芯片，面與面相互重合，將單個(gè)或多個(gè)微泵連接到各收容部上。
作為微泵11，雖然可以使用設(shè)有操作裝置的、將單向閥設(shè)置在閥腔的流出流入孔中的單向閥型的泵等各種微泵，但最好是使用壓電泵。圖2(a)是表示壓電泵的一個(gè)例子的截面圖，圖2(b)是其平面圖。在該微泵上設(shè)有形成有第1液室48、第1流路46、加壓室45、第2流路47以及第2第液室49的基板42；層疊在基板42上的上側(cè)基板41；層疊在上側(cè)基板41上的振動(dòng)板43；層疊在振動(dòng)板43的朝向加壓室45的一側(cè)的壓電元件44；用于驅(qū)動(dòng)壓電元件44的驅(qū)動(dòng)部(圖未示)。
在該例子中，基板42使用厚度為500μm的感光性玻璃基板，通過進(jìn)行蝕刻達(dá)至深100μm，形成第1液室48、第1流路46、加壓室45、第2流路47以及第2第液室49。第1流路46，使其寬為25μm，長(zhǎng)為20μm。另外，第2流路47，使其寬為25μm、長(zhǎng)為150μm。
通過將是玻璃基板的上側(cè)基板41層疊在基板42上，形成第1液室48、第1流路46、第2液室49以及第2流路47的上面。通過蝕刻等對(duì)上側(cè)基板41的相當(dāng)于加壓室45的上面的部分進(jìn)行加工，使其貫通。
在上側(cè)基板41的上面層疊由厚度為50μm的薄玻璃構(gòu)成的振動(dòng)板43，在它的上面層疊由例如厚度是50μm的鈦酸鋯酸鉛(PZT)陶瓷等構(gòu)成的壓電元件44。
由于來自驅(qū)動(dòng)部的驅(qū)動(dòng)電壓，壓電元件44和粘貼在它上面的振動(dòng)板43振動(dòng)，因此，加壓室45的體積增加或減少。第1流路46和第2流路47，其寬度和深度相同，第2流路一方的長(zhǎng)度比第1流路的長(zhǎng)，在第1流路46，若壓差變大，則在流路內(nèi)形成旋渦，產(chǎn)生紊流，增加流路阻力。另一方面，在第2流路47，由于流路長(zhǎng)，所以，即使壓差變大了，也容易變成層流，與第1流路相比，相對(duì)壓差變化的流路阻力的變化比例變小了。
例如，由對(duì)壓電元件44的驅(qū)動(dòng)電壓，若使振動(dòng)板43迅速地向加壓室45的內(nèi)側(cè)變位，一邊增大壓差，一邊使加壓室45的體積減小，接著，慢慢地使振動(dòng)板43從加壓室45向外側(cè)變位，一邊減小壓差，一邊使加壓室45的體積增大，則液體被送向該圖的B方向。反之，若使振動(dòng)板43迅速地向加壓室45的外側(cè)變位，一邊增大壓差，一邊使加壓室45的體積增大，接著慢慢地使振動(dòng)板43從加壓室45向內(nèi)側(cè)變位，一邊減小壓差，一邊使加壓室45的體積減小，則液體被送向該圖的A方向。
而且，第1流路和第2流路的、相對(duì)壓差變化的流路阻力的變化比例的不同，并不一定是由于流路的長(zhǎng)度的不同，也可以是基于其它的形狀的不同。
根據(jù)上述那樣的結(jié)構(gòu)的壓電泵，通過改變泵的驅(qū)動(dòng)電壓和頻率，能控制液體的輸送方向和輸送速度。在圖2(c)中示出了該泵的其它例子。在該例子中，由硅基板71、壓電元件44和未圖示的撓性線構(gòu)成泵。硅基板71是用光刻技術(shù)將硅片加工成規(guī)定的形狀制成的，通過蝕刻形成加壓室45、隔膜43、第1流路46、第1液室48、第2流路47、以及第2液室49。在第1液室48上設(shè)有孔72，在第2液室49上設(shè)有孔73，例如，在使該壓電泵為與圖1的芯片不是一體的情況下，通過該孔72、73與芯片1的泵連接部連通。例如，通過使穿有孔72、73的基板74與微反應(yīng)器的泵連接部附近上下重合，能將泵連接到芯片1上。另外，如以上所述，也可以在一片硅基板上形成多個(gè)泵。在這種情況下，希望將驅(qū)動(dòng)液罐連接到與芯片1連接的孔的相反一側(cè)的孔上。在具有多個(gè)泵的情況下，這些孔也可以連接到共同的驅(qū)動(dòng)液罐上。

圖3所示是使壓電泵為與圖1的芯片1不是一體的情況下的芯片1的泵連接部周邊的結(jié)構(gòu)。該圖(a)表示輸送驅(qū)動(dòng)液的泵部的結(jié)構(gòu)，該圖(b)表示輸送擴(kuò)增試劑的泵部的結(jié)構(gòu)。在此，24是驅(qū)動(dòng)液的收容部，驅(qū)動(dòng)液可以是礦物油等油類，或者水類的任何一種液體。25是密封預(yù)先收容的擴(kuò)增試劑的密封液的收容部。該密封液是用于防止由于試劑向微細(xì)流路泄漏而起反應(yīng)了等情況的，在使用前，在保存微反應(yīng)器(μ-TAS)芯片的冷藏條件下，固定或凝膠化，在使用時(shí)，若在室溫下則融化，變成能流動(dòng)的狀態(tài)。雖然空氣介于密封液和擴(kuò)增試劑之間也沒關(guān)系，但出于定量送液的考慮，最好是介入的空氣的量(相對(duì)試劑量)要充分地少。另外，密封液可以填充在微細(xì)流路中，或者也可以填充在為密封液用而設(shè)置的收容部中。
抽除空氣用的流路26設(shè)置在泵連接部12和擴(kuò)增試劑收容部7之間的流路上。該抽除空氣用的流路26從泵連接部12和擴(kuò)增試劑收容部7之間的流路上分出來，其末端敞開。例如在連接泵等時(shí)，使其從該抽除空氣用的流路26除去存在于流路內(nèi)的氣泡。
出于防止例如水等水性液體泄漏的考慮，該抽除空氣用的流路26，其流路直徑最好在10μm以下，且與流路里面的水的接觸角在30°以上。
13是具有圖14所示的結(jié)構(gòu)的疏水性閥，該疏水性閥13，切斷通過的液體，一直到向正方向輸送的液體壓力達(dá)到規(guī)定壓力，通過對(duì)輸送液體施加規(guī)定壓力以上的壓力，允許液體通過。如圖所示，疏水性閥13由截流流路直徑的部分構(gòu)成，由此限制從一端側(cè)到達(dá)了該截流流路51的圖14(b)的液體27向另一端側(cè)通過。該截流流路51制成相對(duì)兩側(cè)串聯(lián)連接的長(zhǎng)寬為200μm×200μm的流路，長(zhǎng)寬為200μm×30μm左右。

在將液體27從小直徑的截流流路51的端部擠向大直徑的流路50時(shí)，由于表面張力，需要規(guī)定的送液壓力。因此，由于能由來自微泵的泵壓力控制液體的停止和通過，所以，例如，能夠在流路的規(guī)定的部位，使液體暫時(shí)停止移動(dòng)，以規(guī)定的配時(shí)，恢復(fù)從該部位向原先的流路送液。
根據(jù)需要，也可以在截流流路51的內(nèi)面實(shí)施疏水性涂敷，例如實(shí)施氟類涂敷。
<待檢樣品的前處理>
從待檢樣品收容部2注入例如全血、血清、血沉棕黃層、尿、糞便、唾液、喀痰或其它的體液等待檢樣品。對(duì)于包含在這些待檢樣品中的、或者具有這種可能性的可能被檢測(cè)的細(xì)菌、病毒，并不進(jìn)行特別的限定。細(xì)菌、病毒的基因，最好是如果固有的DNA序列是已知的，則用于檢測(cè)的PCR引物可以用公知的技術(shù)制作，所以，任何東西都可以檢測(cè)。作為具體的例子，可以舉出結(jié)核菌、MRSA、流感病毒、新型感染病原菌等。所需要的待檢樣品量，例如，作為DNA是0.001～100ng。
如圖4所示，注入到待檢樣品收容部2中的待檢樣品，用與溶菌試劑收容部3連接的壓電泵1進(jìn)行輸送，與例如包含溶菌酶(lysozyme)的水溶液那樣的溶菌試劑混合，待檢樣品中的菌體被溶解。作為溶菌試劑可以使用任意的公知的。被溶解到菌體處的菌體基因，吸附在填充在載體填充部4的微細(xì)流路4a內(nèi)的微粒狀的載體55上。
作為載體55，可以使用例如由玻璃、硅膠、羥磷灰石、硅藻土等構(gòu)成的空心顆粒、粉末等。作為一個(gè)例子，顆粒直徑為0.05～1000μm的玻璃空心顆粒以0.05g/ml～1.3g/ml的密度填充在微細(xì)流路4a內(nèi)。
最好是，輸送到載體填充部4的、包含菌體基因的液體，如該圖的箭頭所示，切換其前后送液方向，驅(qū)動(dòng)微泵，使液體在載體填充部4內(nèi)向流路方向反復(fù)前后運(yùn)動(dòng)。因此，菌體基因56與微粒狀載體55相遇的概率提高了，能使多個(gè)菌體基因56在短時(shí)間內(nèi)吸附在微粒狀載體55上，能提高效率。雖然由于情況下的不同而有所不同，但最好是使其做往復(fù)運(yùn)動(dòng)，振幅是5mm、周期是5秒左右。
圖6是表示使在載體填充部4內(nèi)的包含菌體基因的液體前后運(yùn)動(dòng)的送液用微泵11的控制系統(tǒng)的圖。如圖所示，送液用微泵11通過放大器32、D/A轉(zhuǎn)換器33與微型計(jì)算機(jī)34連接。微型計(jì)算機(jī)34搭載有定時(shí)器35，以預(yù)先計(jì)劃的配時(shí)控制送液用微泵11的送液。而且，控制微泵11的32～35系統(tǒng)雖然可以在芯片內(nèi)，但也可以組裝在微反應(yīng)器裝置本體上，通過將芯片1安裝在裝置本體上，也能將芯片1的泵連接部連接到裝置本體的微泵上，控制其動(dòng)作。
圖5是表示待檢樣品收容部、溶菌試劑收容部以及載體填充部上的送液系的其它例子的圖。如圖所示，在待檢樣品收容部2上也連接有微泵11，也可以分別控制來自待檢樣品收容部2的待檢樣品送液、和來自溶菌試劑收容部3的溶菌試劑的送液。在這種情況下，例如在待檢樣品收容部2一側(cè)的微細(xì)流路上設(shè)置單向閥等閥57，在使導(dǎo)入到載體填充部4內(nèi)的包含菌體基因的液體前后運(yùn)動(dòng)時(shí)，關(guān)閉閥57、用與溶菌試劑收容部3連接的微泵11進(jìn)行送液的切換。
在使菌體基因吸附在載體填充部4的微粒狀載體上之后，從圖1的清洗液收容部4輸送例如Tris-EDTA-NaCl/乙醇混合液等清洗液，使其穿過載體填充部4，充分地進(jìn)行清洗。接著，切換設(shè)置在分支部31附近的有源閥等閥(圖未示)，從提取試劑收容部6向載體填充部4輸送例如Tris-EDTA緩沖液等提取試劑，洗提吸附在微粒狀載體上的菌體基因，作為前處理液向反應(yīng)部9送液。

而且，在菌體基因是RNA的情況下，在利用恰當(dāng)?shù)姆崔D(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變成cDNA之后，進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)。
<基因擴(kuò)增反應(yīng)以及檢測(cè)>
將對(duì)待檢樣品進(jìn)行前處理的待檢樣品處理液和來自擴(kuò)增試劑收容部7的擴(kuò)增試劑輸送到反應(yīng)部9，進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)部9，根據(jù)情況下的不同，既可以是寬的集液槽狀，也可以是微細(xì)流路。
與多個(gè)試劑相對(duì)應(yīng)，設(shè)置多個(gè)擴(kuò)增試劑收容部7，試劑與試劑的混合、以及待檢樣品處理液與試劑的混合，既可以在單一的混合部以所希望的比例進(jìn)行混合，或者也可以將哪個(gè)或雙方進(jìn)行分割，設(shè)置多個(gè)合流部進(jìn)行混合，使其最終為所希望的混合比例。
圖9所示是擴(kuò)增試劑收容部以及試劑混合部結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子。這樣一來，在各擴(kuò)增試劑收容部7a、7b、7c上連接有微泵(在該例子是壓電泵)11，在來自這些各收容部的流路合流的前方設(shè)有試劑混合部14。而且，這些各部由珀耳帖元件冷卻。即，在圖9中，在設(shè)置擴(kuò)增試劑收容部7a、7b、7c的區(qū)域A1，如圖10(a)所示，珀耳帖元件59設(shè)置在芯片的下面，在圖9中，在設(shè)置試劑混合部14的區(qū)域A2，如圖10(b)所示，珀耳帖元件59也設(shè)置在芯片的下面。
珀耳帖元件59也可以設(shè)置在這些各部的芯片的上面，或也可以設(shè)置在上下兩面上。這樣一來，通過冷卻擴(kuò)增試劑收容部7和試劑混合部4，能防止試劑由于加熱而變質(zhì)。特別是，在PCR擴(kuò)增，需要對(duì)溫度進(jìn)行控制，使其在3個(gè)溫度之間升降。另外，即使在為基因擴(kuò)增應(yīng)用ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleic acidamplification)法的結(jié)構(gòu)的情況下，由于需要使擴(kuò)增反應(yīng)部為50～65℃，所以，雖然在反應(yīng)部的升溫過程中、或試劑混合等時(shí)，試劑被加熱容易變質(zhì)，但如圖10所示，通過設(shè)置珀耳帖元件進(jìn)行冷卻能防止其變質(zhì)。通常，如果能將擴(kuò)增試劑收容部7和試劑混合部14保持在4℃以下的程度，則能充分地防止試樣變質(zhì)。
最好是預(yù)先將試劑收容在擴(kuò)增試劑收容部7，以使其不分場(chǎng)所或時(shí)間都能迅速地進(jìn)行檢查。為了防止內(nèi)藏在芯片內(nèi)的試劑類等，蒸發(fā)、漏失、混入氣泡、污染、變性等，其試劑部的表面進(jìn)行密封處理，用密封材料(密封液)密封。這些密封材料(在圖3中收容在密封液收容部25)，在使用前，在保存微反應(yīng)器(μ-TAS)芯片的冷藏條件下，固定或凝膠化，在使用時(shí)，若在室溫下則融化，變成能流動(dòng)的狀態(tài)。作為這樣的密封材料，可以使用對(duì)水難溶性的可塑性物質(zhì)，最好是對(duì)水的溶解度在1％以下，且融點(diǎn)是8℃～室溫(25℃)的油脂、以及明膠的水溶液。明膠的水溶液，可以通過改變明膠的濃度調(diào)整凝膠化溫度，例如，為了使其在10℃左右凝膠化，可以使其為大約為1％的水溶液。
以下對(duì)在反應(yīng)部進(jìn)行的基因擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行說明。
●擴(kuò)增法本發(fā)明的微反應(yīng)器并不限定擴(kuò)增方法。例如，作為DNA擴(kuò)增技術(shù)，可以使用在許多方面廣泛利用的PCR擴(kuò)增法。人們?cè)敿?xì)地研究了用于實(shí)施該擴(kuò)增技術(shù)的各種條件，也包含各種變化方法、改良點(diǎn)，記載于各種文獻(xiàn)等中。雖然PCR擴(kuò)增需要控制溫度，使其在3個(gè)溫度之間升降，但能對(duì)微型芯片進(jìn)行恰當(dāng)?shù)臏囟瓤刂频牧髀菲骷呀?jīng)由本發(fā)明人提出了(日本專利公報(bào)特開2004-108285號(hào))?？梢詫⒃摿髀菲骷?yīng)用于本發(fā)明的芯片的擴(kuò)增用流路。因此，熱循環(huán)能被高速切換，由于將微細(xì)流路作為熱容量小的微型反應(yīng)單元，所以，與通過手工作業(yè)、用微管、微小玻璃瓶等進(jìn)行的現(xiàn)有的方式相比，DNA能在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。
像PCR反應(yīng)那樣，不需要復(fù)雜的溫度控制的、最近開發(fā)的ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleic acidamplification)法，具有在50～65℃的任意一定的溫度下，能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)施DNA擴(kuò)增的特征(國際專利第3433929號(hào))。因此，ICAN法在本發(fā)明的微反應(yīng)器，由于以簡(jiǎn)便的溫度控制就可以了，所以，是恰當(dāng)?shù)臄U(kuò)增技術(shù)。用手作業(yè)需要1小時(shí)的本法，在本發(fā)明的微反應(yīng)器，用10～20分鐘，最好是用15分鐘就連分析都完成了。
DNA擴(kuò)增反應(yīng)，也可以是其它的PCR變化方法，本發(fā)明的微反應(yīng)器具有通過流路設(shè)計(jì)變更等使之能與任何變化相對(duì)應(yīng)的彈性。即使在使用任意的DNA擴(kuò)增反應(yīng)的情況下，其技術(shù)的詳細(xì)情況也公開了，本行業(yè)人員能很容易地引入。
●試劑類(i)引物PCR引物是在想要擴(kuò)增的特定部位的DNA鏈的兩端互補(bǔ)的2種寡核苷酸。該設(shè)計(jì)已經(jīng)開發(fā)了專用的用途，如果是本行業(yè)人員的話，通過用DNA合成儀、化學(xué)合成等能很容易地制成。ICAN法用的引物雖然是DNA和RNA的嵌合體引物，但它的制備法在技術(shù)方面也已經(jīng)確定(國際專利第3433929號(hào))。引物的設(shè)計(jì)、選擇，決定了擴(kuò)增反應(yīng)的成敗、效率，所以使用最恰當(dāng)?shù)氖呛苤匾摹?br> 另外，若使生物素與PCR引物結(jié)合，通過與基板上的鏈霉親合素蛋白的結(jié)合，能將擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA固定在基板上，可供于擴(kuò)增產(chǎn)物的定量。作為其它的引物標(biāo)記物質(zhì)，可以例舉出地高辛、各種熒光色素等。
(ii)擴(kuò)增反應(yīng)用試劑類以擴(kuò)增反應(yīng)所使用的酶為首的試劑類，PCR用、ICAN法的任意一種試劑都能很容易地得到。
PCR法的試劑類，至少除了2′-脫氧核糖核苷-5′-三磷酸之外，包含Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。

ICAN法的試劑類，至少包含2′-脫氧核糖核苷-5′-三磷酸、能特異地與要檢測(cè)的基因雜交的嵌合體引物、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶的RNase。
(iii)對(duì)照物內(nèi)部對(duì)照物，對(duì)于目標(biāo)核酸(DNA、RNA)來說，作為擴(kuò)增的監(jiān)控或者定量時(shí)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用。由于在與待檢樣品不同的序列的兩側(cè)具有與待檢樣品用引物相同的引物能使其雜交的序列，所以，內(nèi)部對(duì)照物的序列能與待檢樣品同樣地?cái)U(kuò)增。
陽性對(duì)照物的序列，是檢測(cè)待檢樣品的特異性序列，引物雜交的部分和它們之間的序列是與待檢樣品相同的。對(duì)照物所使用的核酸(DNA、RNA)最好是使用公知的技術(shù)文獻(xiàn)所記載的對(duì)照物。陰性對(duì)照物包含所有的核酸(DNA、RNA)以外的試劑等，用于有無污染的檢查、本底修正。
(iv)反轉(zhuǎn)錄用試劑在是RNA的試樣的情況下，是用于由RNA合成cDNA的反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄引物等，這些也是市場(chǎng)上銷售的，能很容易地得到。
圖7是表示待檢樣品處理液和試劑的混合以及進(jìn)行反應(yīng)的流路結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子的圖。如圖所示，由微泵(圖未示)從待檢樣品處理液側(cè)的流路54輸送的待檢樣品處理液和由微泵11從試劑收容部7輸送的試劑，在Y字流路的合流部58合流，送液到后續(xù)的微細(xì)流路9a。
微細(xì)流路9a，例如寬為0.2mm，深為0.2mm，在該微細(xì)流路9a內(nèi)進(jìn)行ICAN反應(yīng)。
在將待檢樣品處理液和試劑填充到微細(xì)流路9a內(nèi)后，驅(qū)動(dòng)輸送試劑的微泵11，使其反復(fù)切換送液方向，使微細(xì)流路9a內(nèi)的合流液在微細(xì)流路9a內(nèi)前后運(yùn)動(dòng)，進(jìn)行ICAN反應(yīng)。例如，在微細(xì)流路9a的寬是0.2mm、深是0.2mm、液量是25μl的情況下，最好是使其以振幅是25mm、周期是5秒左右往復(fù)運(yùn)動(dòng)。
由于該前后運(yùn)動(dòng)，微細(xì)流路9a內(nèi)的試劑和待檢樣品快速地?cái)U(kuò)散混合，而且，由于流路的中心部分和壁面附近的液體的流速梯度，DNA和試劑相遇的概率變高了，提高了反應(yīng)速度。
另外，在待檢樣品處理液側(cè)的流路54上設(shè)有單向閥、有源閥等閥57，在混合時(shí)若將關(guān)閉，而且，由輸送試劑的微泵11使微細(xì)流路9a內(nèi)的合流液前后運(yùn)動(dòng)，則沒有必要將混合用的其它的微泵配置在流路中。該微泵11，最好是圖2所示的壓電泵。
在圖7中，雖然僅用一方的微泵11使合流液往復(fù)運(yùn)動(dòng)，但也可以不設(shè)置閥57，通過驅(qū)動(dòng)待檢樣品處理液側(cè)的微泵和試劑收容部7側(cè)的微泵11使微細(xì)流路9a內(nèi)的合流液往復(fù)運(yùn)動(dòng)。
圖8是表示送液用微泵11和閥57的控制系統(tǒng)的圖。如圖所示，送液用微泵11通過放大器32、D/A轉(zhuǎn)換器33與微型計(jì)算機(jī)34連接。
再有，用于開關(guān)閥57的氣缸36通過D/A轉(zhuǎn)換器33與微型計(jì)算機(jī)34連接。
微型計(jì)算機(jī)34搭載有定時(shí)器35，以預(yù)先計(jì)劃的配時(shí)控制送液用微泵11的送液。而且，控制送液用微泵11的送液以及閥57的開關(guān)。即使對(duì)于這些控制部來說，在如以上所述組裝在微反應(yīng)器裝置本體上，將芯片1的泵連接部連接到裝置本體的微泵上的情況下，也可以控制其動(dòng)作。
當(dāng)在反應(yīng)部進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)后，用檢測(cè)部檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)。該檢測(cè)部10雖然根據(jù)情況的不同也可以兼為反應(yīng)部9，但在用后述的金屬膠體的檢測(cè)，是用吸附鏈霉親合素蛋白的其它的檢測(cè)部檢測(cè)。另外，在使內(nèi)部對(duì)照物與菌體基因同時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)后，最好是分割擴(kuò)增反應(yīng)液，用其它的檢測(cè)部進(jìn)行菌體基因的擴(kuò)增檢測(cè)和內(nèi)部對(duì)照物的擴(kuò)增檢測(cè)。來自檢測(cè)試劑收容部8的檢測(cè)試劑(例如金屬膠體溶液，發(fā)光試劑等)被輸送向檢測(cè)部10、或者反應(yīng)部9和檢測(cè)部10之間的流路，使其與反應(yīng)擴(kuò)增液或其處理物混合，或接觸。
在本發(fā)明，檢測(cè)擴(kuò)增的目標(biāo)基因的DNA的方法并沒有特別的限定，可以根據(jù)需要使用恰當(dāng)?shù)姆椒?。作為這樣的方法，稱為可視分光測(cè)光法、熒光測(cè)定法、發(fā)光冷光法的檢測(cè)方法是主流。再有，也可以舉出電化學(xué)方法、表面等離子體共振、石英晶體微天平等方法。檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)，最終能用可見光以高靈敏度測(cè)定的方式較為理想。與熒光測(cè)光相比，器械是廣泛使用的，妨礙因素少，且能簡(jiǎn)單地測(cè)定，數(shù)據(jù)處理也容易。
可以舉出作為本發(fā)明應(yīng)用的恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)、檢測(cè)方法包含(1)使來自待檢樣品的菌體基因的DNA和生物素修飾了的引物在反應(yīng)部9反應(yīng)，進(jìn)行基因擴(kuò)增的工序；(2)混合包含擴(kuò)增了的基因的擴(kuò)增反應(yīng)液和變性液，對(duì)擴(kuò)增了的基因進(jìn)行變性處理，使其為單鏈的工序；(3)將對(duì)擴(kuò)增了的基因進(jìn)行變性處理使其為單鏈的處理液輸送到吸附了鏈霉親合素蛋白的微細(xì)流路內(nèi)，固定上述擴(kuò)增了的基因的工序；(4)使由FITC(fluorescein isothio cyanate)標(biāo)記末端的探針DNA在固定了擴(kuò)增的基因的微細(xì)流路內(nèi)流動(dòng)，使其與能將其固定的基因雜交的工序；(5)使最好是由與FITC特異性結(jié)合的抗FITC抗體修飾了表面的金屬膠體液在上述微細(xì)流路內(nèi)流動(dòng)，由此使該金屬膠體吸附在與固定了的基因雜交的FITC修飾探針上的工序；(6)光學(xué)測(cè)定上述微細(xì)流路的金屬膠體的濃度的工序。
在上述方法中，生物素化DNA、用生物素-鏈霉親合素蛋白結(jié)合的固定、FITC熒光標(biāo)記、FITC抗體等是公知技術(shù)。另外，也可以是在使FITC標(biāo)記探針DNA與擴(kuò)增基因雜交之后，使其固定在吸附了鏈霉親合素蛋白的微細(xì)流路上的順序方式。在本發(fā)明，最好是上述(3)接著是(4)的順序的結(jié)構(gòu)。
最好是包含在上述各工序之間，根據(jù)需要將清洗液輸送到吸附了鏈霉親合素蛋白的上述流路內(nèi)的工序。作為這樣的清洗液，最好是例如各種緩沖液、鹽類水溶液、有機(jī)溶劑等。
在上述工序中，變性液是用于使基因DNA為單鏈的試劑，可以舉出例如氫氧化鈉、氫氧化鉀等。探針可以舉出寡聚脫氧核苷酸等。另外，除了FITC之外，可以舉出RITC(羅丹明異硫氰酸鹽)等熒光物質(zhì)。
上述前處理、擴(kuò)增以及檢測(cè)，是在將芯片安裝在裝置本體上的狀態(tài)下開始的，而該裝置本體，是預(yù)先將與送液順序、容量、配時(shí)等相關(guān)設(shè)定的各種條件與微泵以及溫度的控制一起作為程序的內(nèi)容所具有的軟件、上述微泵、檢測(cè)裝置以及溫度控制裝置是一體的。在注入試樣后開始分析，基于試樣以及試劑類的送液、前處理、混合的基因擴(kuò)增反應(yīng)、基因檢測(cè)反應(yīng)以及光學(xué)測(cè)定，作為一連串的連續(xù)工序自動(dòng)地實(shí)施，測(cè)定數(shù)據(jù)與必要條件、記錄事項(xiàng)一起存儲(chǔ)在外存儲(chǔ)器內(nèi)。
圖11是表示用上述方法檢測(cè)依據(jù)ICAN法的擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)部以及檢測(cè)部周邊的流路結(jié)構(gòu)的圖。特異性地與檢測(cè)對(duì)象——基因雜交的、生物素修飾的嵌合體引物、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、以及核酸內(nèi)切酶等試劑，收容在圖9的擴(kuò)增試劑收容部7a、7b、7c中，由各試劑收容部的上游側(cè)的微泵11，將試劑從各試劑收容部輸送到下游側(cè)的流路14進(jìn)行混合。
在各試劑收容部7a、7b、7c中，例如收容有總共超過7.5μl的試劑，切掉前端的計(jì)7.5μl的試劑混合液，各2.5μl輸送到分成3條的流路，其中一個(gè)流路，與圖11的B的位置連通，連向用于與待檢樣品處理液反應(yīng)以及其檢測(cè)的系統(tǒng)。雖然圖未示出，但另一流路與用于和陽性對(duì)照物的反應(yīng)以及其檢測(cè)的系統(tǒng)連通，剩下的一個(gè)流路，與用于陰性對(duì)照物的反應(yīng)以及其檢測(cè)的系統(tǒng)連通。
從圖11的B位置輸送的混合試劑填充在貯留部17a。待檢樣品處理液從圖11的A位置送出、定量地填充在貯留部17b(2.5μl)，定量輸送到后續(xù)的流路。填充在各貯留部17a、17b的待檢樣品處理液和試劑混合液通過Y字形流路輸送到流路15a(容積5μl)，在該流路15a內(nèi)進(jìn)行混合以及ICAN-PCR反應(yīng)。
將5μl的反應(yīng)液和收容在停止液收容部21a中的1μl的反應(yīng)停止液輸送到容積為6μl的流路15b，通過將它們混合，擴(kuò)增反應(yīng)停止。接著，將收容在變性液收容部21b中的變性液(1μl)和反應(yīng)液與停止液的混合液(0.5μl)輸送到容積為1.5μl的流路15c進(jìn)行混合，使擴(kuò)增了的基因變性成1條鏈。
將該處理液輸送到使鏈霉親合素蛋白吸附在流路內(nèi)的鏈霉親合素蛋白吸附部10a、10b，將擴(kuò)增基因固定在該流路內(nèi)，接著，使清洗液從清洗液收容部向鏈霉親合素蛋白吸附部10a、10b流動(dòng)，進(jìn)行清洗。
接著，將收容在雜交緩沖劑收容部21c中的雜交緩沖劑收容在鏈霉親合素蛋白吸附部10a、10b。接著，用單一的泵11，將收容在各收容部21f、21d、21e、21d的、用FITC熒光標(biāo)記末端的菌體基因的探針DNA溶液、清洗液、以及用FITC抗體標(biāo)記的金屬膠體的溶液，以該圖所示的順序向流路10a內(nèi)輸送。同樣，用單一的泵11，將收容在各收容部21g、21d、21e、21d的、內(nèi)部對(duì)照物探針DNA溶液、清洗液、以及用FITC抗體標(biāo)記的金屬膠體的溶液，以該圖所示的順序向固定了擴(kuò)增基因的流路10b內(nèi)輸送。
而且，最好是構(gòu)成流路，以使在將1條鏈的擴(kuò)增基因固定在鏈霉親合素蛋白吸附部10a、10b上之前的階段，使探針DNA與1條鏈的擴(kuò)增基因雜交。
通過輸送金屬膠體溶液，金屬膠體通過FITC與固定了的擴(kuò)增基因結(jié)合、固定。通過用光學(xué)技術(shù)檢測(cè)該固定了的金屬膠體，測(cè)定有沒有擴(kuò)增或擴(kuò)增效率。
這樣一來，使內(nèi)部對(duì)照物與待檢樣品的前處理液一起進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，分割擴(kuò)增反應(yīng)液，將其輸送到其它的檢測(cè)部10a、10b，由于用一方的檢測(cè)部10a檢測(cè)菌體基因的擴(kuò)增，用另一方的檢測(cè)部10b檢測(cè)內(nèi)部對(duì)照物的擴(kuò)增，所以能用簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，迅速地進(jìn)行高可靠性的檢查。
如圖11所示，在試劑收容部、反應(yīng)部以及檢測(cè)部之間的流路上的適當(dāng)?shù)奈恢?，設(shè)有單向閥16。除此之外，最好是像上述那樣，在用于防止稱為交叉污染的適當(dāng)?shù)奈恢?例如圖11的泵連接部12的下游側(cè)的附近位置)也設(shè)置單向閥。
圖12(a)、(b)是表示本實(shí)施方式的微反應(yīng)器的流路所使用的單向閥的一個(gè)例子的截面圖。圖12(a)的單向閥，將微小球67作為閥芯，通過該微小球67的移動(dòng)開關(guān)在基板62上形成的開口68，由此允許液體通過以及將切斷。即，在從A方向輸送液體時(shí)，由于液壓，微小球67離開基板62，打開開口68，因此，允許液體通過。另一方面，在液體從B方向反向流動(dòng)的情況下，微小球67坐在基板62上，關(guān)閉開口68，因此，液體的流路被切斷。
圖12(b)的單向閥，層疊在基板62上、其端部向開口68的上側(cè)延伸的撓性基板69，由于液壓在開口68的上側(cè)上下運(yùn)動(dòng)，由此開關(guān)開口68。即，在從A方向輸送液體時(shí)，由于液壓，撓性基板69的端部離開基板62，打開開口68，因此，允許液體通過。另一方面，在液體從B方向反向流動(dòng)的情況下，撓性基板69緊貼在基板62上，關(guān)閉開口68，因此，液體的流路被切斷。
這樣一來，雖然為了防止液體倒流、正確地進(jìn)行規(guī)定的送液，最好是配設(shè)單向閥，但作為利用單向閥的適當(dāng)?shù)臋C(jī)構(gòu)，可以舉出圖13所示的定量送液機(jī)構(gòu)。該機(jī)構(gòu)，如圖所示，在單向閥16和疏水性閥13a之間的流路(試劑填充流路15A)上填充有規(guī)定量的試劑。另外，設(shè)有從該試劑填充流路15A分出的、與輸送驅(qū)動(dòng)液的微泵11連通的分支流路15B。
像以下那樣定量輸送試劑。最初，由從疏水性閥13a向前方未通過的試劑液60的送液壓力將試劑液60供給到試劑填充流路15A，由此從單向閥16一側(cè)填充試劑液60。接著，由允許試劑液60從疏水性閥13a向前方通過的送液壓力，由微泵11通過疏水性閥13b從分支流路15B向朝向試劑填充流路15A的方向輸送驅(qū)動(dòng)液70，由此將填充在試劑填充流路15A中的試劑液60從送液控制部15A向前方擠出，由此定量地輸送試劑液60。雖然有時(shí)在分支流路15B存在有空氣、密封液等，但即使在這種情況下，由于用微泵11輸送驅(qū)動(dòng)液70，將空氣、密封液等送入到試劑填充流路15A，所以能擠出試劑。而且，由于在試劑填充流路15A上設(shè)有大容積的貯留部17a，所以能減小定量的偏差。
而且，將該定量送液機(jī)構(gòu)用于圖11的試劑混合液的定量(該圖的X2的位置)、以及待檢樣品處理液的定量(該圖的X1的位置)。
以上雖然對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行了說明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施方式，在不脫離其主要意思的范圍內(nèi)能作各種各樣的變形、變更。
權(quán)利要求
1.基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于，其具備載體填充部，填充有微粒狀載體，待檢樣品或?qū)ι鲜龃龣z樣品進(jìn)行了前處理的處理液、和溶菌試劑混合，所述微粒狀載體從包含用上述溶菌試劑溶解的菌體基因的液體吸附上述菌體基因；微泵連接部，與上述載體填充部的上游連通、連接向雙向進(jìn)行液體送液的微泵；以及控制裝置，控制微泵，使其切換輸送到上述載體填充部的上述菌體基因的液體的送液方向、使上述液體在上述載體填充部反復(fù)前后運(yùn)動(dòng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所記載的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于，其具有擴(kuò)增試劑收容部，收容擴(kuò)增試劑；溶菌試劑收容部，收容溶解注入的待檢樣品或?qū)ι鲜龃龣z樣品進(jìn)行了前處理的處理液中的菌體的溶菌試劑；提取試劑收容部，與上述載體填充部的上游連通、收容提取吸附在上述載體上的上述基因的提取基因試劑；擴(kuò)增試劑收容部，與上述載體填充部的下游連通、收容進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增試劑；反應(yīng)部，設(shè)置在上述載體填充部的下游、由從上述提取試劑收容部輸送的上述提取基因試劑從上述載體提取的基因、和從上述擴(kuò)增試劑收容部輸送的上述擴(kuò)增試劑混合，使該混合的液體反應(yīng)、進(jìn)行基因擴(kuò)增；以及第1檢測(cè)部，設(shè)置在上述反應(yīng)部的下游、輸送進(jìn)行了上述基因擴(kuò)增的上述擴(kuò)增試劑，對(duì)基因進(jìn)行檢測(cè)，上述載體填充部設(shè)置在上述溶菌試劑收容部的下游，混合上述注入了的待檢樣品或?qū)ι鲜龃龣z樣品進(jìn)行前處理的處理液、和收容在上述溶菌試劑收容部的溶菌試劑，輸送包含由上述溶菌試劑溶解了的菌體基因的液體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所記載的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于，其具有微泵連接部，連接與上述反應(yīng)部的上游連通的向雙向進(jìn)行送液的微泵；控制裝置，控制與上述反應(yīng)部的上游連通的微泵、切換送液方向，使混合上述基因和從上述擴(kuò)增試劑收容部輸送的上述擴(kuò)增試劑的液體在上述反應(yīng)部反復(fù)前后運(yùn)動(dòng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所記載的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于，上述微泵具備流路阻力根據(jù)壓差的不同而變化的第1流路；相對(duì)壓差的變化流路阻力的變化比例比第1流路小的第2流路；連接第1流路和第2流路的加壓室；改變?cè)摷訅菏业膬?nèi)部壓力的操作裝置；驅(qū)動(dòng)該操作裝置的驅(qū)動(dòng)裝置。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所記載的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于，上述微泵具備流路阻力根據(jù)壓差的不同變化的第1流路；相對(duì)壓差的變化流路阻力的變化比例比第1流路小的第2流路；連接第1流路和第2流路的加壓室；改變?cè)摷訅菏业膬?nèi)部壓力的操作裝置；驅(qū)動(dòng)該操作裝置的驅(qū)動(dòng)裝置。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所記載的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于，在上述擴(kuò)增試劑收容部、溶菌試劑收容部、載體填充部、提取試劑收容部、反應(yīng)部、第1檢測(cè)部、以及微泵連接部之間，設(shè)有至少1個(gè)阻止液體倒流的單向閥。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所記載的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于，上述擴(kuò)增試劑收容部設(shè)有冷卻混合的試劑混合部的冷卻裝置。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所記載的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于，上述冷卻裝置是珀耳帖元件。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所記載的基因檢查用微反應(yīng)器，其特征在于，具有送液分割裝置，將液體分割為2個(gè)流路；和第2檢測(cè)部，進(jìn)行基因檢測(cè)；在上述2個(gè)流路的各自的下游設(shè)置上述第1檢測(cè)部和第2檢測(cè)部，用上述送液分割裝置，將包含在上述反應(yīng)部同時(shí)擴(kuò)增了的上述菌體基因和內(nèi)部對(duì)照物的擴(kuò)增試劑分割成2部分，輸送到第1和第2檢測(cè)部，分別在檢測(cè)部檢測(cè)上述菌體基因和內(nèi)部對(duì)照物。
全文摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N確保廣泛應(yīng)用性和高靈敏度，實(shí)現(xiàn)一次性的低成本性，能以簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)高精度地檢測(cè)，而且，能高效且迅速地對(duì)待檢樣品進(jìn)行適合于擴(kuò)增反應(yīng)的前處理的、用于檢測(cè)菌體的基因檢查用微反應(yīng)器。在該反應(yīng)器中，由收容在溶菌試劑收容部3中的溶菌試劑溶解待檢樣品中的菌體，在使菌體基因吸附在填充在載體填充部4內(nèi)的載體上之后，進(jìn)行清洗和提取菌體基因的前處理。還設(shè)有切換包含輸送到載體填充部4的菌體基因的液體的送液方向使其反復(fù)前后運(yùn)動(dòng)的控制裝置、單向閥、冷卻擴(kuò)增試劑收容部7和試劑混合部的珀耳帖元件等冷卻裝置。
文檔編號(hào)C12M1/34GK101048490SQ20058003641
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月27日
發(fā)明者中島彰久, 上田榮一, 山東康博, 東野楠, 石田暢久 申請(qǐng)人:柯尼卡美能達(dá)醫(yī)療印刷器材株式會(huì)社