專利名稱：具有自主復(fù)制能力的經(jīng)修飾的人丙型肝炎病毒基因組rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使各種基因型的人丙型肝炎病毒(HCV)在培養(yǎng)細(xì)胞系中進(jìn)行自主復(fù)制的方法，和用于該方法的經(jīng)修飾的HCV基因組RNA，以及該HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞。
背景技術(shù)：
通過近年的研究可知，丙型肝炎病毒根據(jù)基因型或者血清型可分為多種類型。作為現(xiàn)在主流的HCV基因型分類法，在Simmonds等使用的HCV株的堿基序列的系統(tǒng)解析法(phyloanalysis)中，HCV被分為6種類型基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型3a、基因型3b(非專利文獻(xiàn)1)，其各種類型又分為若干亞型。所以，對于HCV的多種基因型，也決定了其基因組全長的堿基序列(專利文獻(xiàn)1、和非專利文獻(xiàn)2～4)。
HCV通過持續(xù)的感染引起慢性肝炎。現(xiàn)在，在世界范圍內(nèi)認(rèn)為的慢性肝炎的主要原因為HCV的持續(xù)感染。實際上，有50％左右的持續(xù)感染者罹患慢性肝炎，其中，有大約20％的患者在10年～20年后轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不?，進(jìn)而，部分發(fā)展為肝癌這樣的致命性疾病。
目前對丙型肝炎的治療主要通過干擾素-α、干擾素-β、以及聯(lián)合應(yīng)用干擾素-α和作為嘌呤-核苷衍生物的利巴韋林的治療方法。但是，即使進(jìn)行該治療，在全部治療患者中也僅有60％觀察到治療效果，如果在產(chǎn)生效果后中止治療，則半數(shù)以上的患者復(fù)發(fā)。已知干擾素的治療效果與HCV的基因型相關(guān)聯(lián)，據(jù)稱其對基因型1b的效果低，對基因型2a的效果高(非專利文獻(xiàn)5)。此外，因基因型的不同，HCV所具有的、針對蛋白質(zhì)酶的底物特異性也有所不同，利用基因型1b的NS3蛋白質(zhì)酶而開發(fā)的抑制藥物對其他基因型的NS3蛋白質(zhì)酶的抑制活性降低50倍以上(非專利文獻(xiàn)6)。因此，為了開發(fā)效率高的HCV治療藥物，必須在確認(rèn)在HCV各基因型中的反應(yīng)性的同時進(jìn)行開發(fā)。
最近，通過制備HCV亞基因組RNA復(fù)制子作為HCV來源的具有自主復(fù)制能力的RNA(專利文獻(xiàn)2、3，和非專利文獻(xiàn)7～9)，能夠使用培養(yǎng)細(xì)胞對HCV的復(fù)制結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。該HCV亞基因組RNA復(fù)制子是將存在于HCV基因組RNA 5’非翻譯區(qū)中的HCV IRES的下游結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)取代為新霉素抗性基因及其下游連接的EMCV-IRES而得到的。通過將該RNA復(fù)制子導(dǎo)入肝癌細(xì)胞Huh7中，在新霉素的共存下培養(yǎng)，證實其在Huh7細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制。進(jìn)而，還證實了部分HCV亞基因組RNA不僅限于在Huh7細(xì)胞中，在人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人肝癌細(xì)胞HepG2等中也進(jìn)行自主復(fù)制(專利文獻(xiàn)3)。
但是，這種HCV的細(xì)胞內(nèi)RNA復(fù)制系統(tǒng)，與其說是針對限定的基因型的，不如說是僅使用限定的HCV的基因組RNA而制備的。因此，對于存在有大量基因型的HCV，討論開發(fā)的HCV治療藥物因基因型的不同所導(dǎo)致的治療效果差異，是極為困難的。此外，RNA復(fù)制子是僅能評價在HCV病毒的增殖復(fù)制過程中的病毒RNA復(fù)制的實驗系統(tǒng)，無法評價HCV病毒顆粒在感染細(xì)胞內(nèi)的形成和向細(xì)胞外的釋放，進(jìn)而感染新的細(xì)胞這樣的過程。
目前，HCV病毒顆粒的形成和向細(xì)胞外的釋放，進(jìn)而感染新的細(xì)胞這樣的過程的評價方法僅限于使用黑猩猩等動物的實驗系統(tǒng)(非專利文獻(xiàn)10)。但是，直接使用動物這樣的活體的實驗系統(tǒng)操作復(fù)雜，分析非常困難。因此，需要建立能夠再現(xiàn)HCV病毒顆粒的形成和向細(xì)胞外的釋放，進(jìn)而感染新的細(xì)胞這樣的過程的極為簡單的實驗系統(tǒng)，即，構(gòu)建使用培養(yǎng)細(xì)胞系的HCV病毒顆粒復(fù)制系統(tǒng)，用于分析該過程、開發(fā)以抑制該過程為作用機(jī)制的抗HCV藥物。
此外，如果能夠通過培養(yǎng)細(xì)胞系提供穩(wěn)定的HCV病毒顆粒，那么也能夠使病毒減毒，或使用分子生物學(xué)方法制備非感染性的HCV，而用于疫苗。但是，由于HCV的蛋白質(zhì)序列因基因型的不同而不同，所以HCV的抗原性也因基因型的不同而不同。實際上，多種基因型的存在一直是HCV疫苗生產(chǎn)中的很大阻礙(非專利文獻(xiàn)11)。因此，為了高效生產(chǎn)HCV疫苗，也期望通過培養(yǎng)細(xì)胞系穩(wěn)定生產(chǎn)各基因型的HCV病毒顆粒。
已知HCV為55～65nm的球狀顆粒，存在于HCV感染患者的血液中。作為純化存在于人血清中的HCV的方法，已知有使用凝集素的親和層析(非專利文獻(xiàn)12)以及使用肝素的層析(非專利文獻(xiàn)13)。但是，以這些方法只能純化不足1ml濃度為大約1M拷貝/mL的病毒，完全不適于產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。
迄今為止，已發(fā)明了多種HCV之外的病毒的純化方法(例如，專利文獻(xiàn)4、5和6)。但是，正如從這些文獻(xiàn)中知道的那樣，病毒顆粒的性質(zhì)各不相同，因而沒有提供關(guān)于最適合人丙型肝炎病毒純化方法的可參考的信息。此外，關(guān)于同樣是肝炎病毒的甲型肝炎病毒，在專利文獻(xiàn)7中公開了通過以陰離子交換層析除去DNA能夠純化甲型肝炎病毒。然而，甲型肝炎病毒雖然也為肝炎病毒，但其是以DNA作為基因的病毒，由于丙型肝炎病毒已知是以RNA作為基因的病毒，所以它們之間完全沒有相似點，因而沒有提供關(guān)于純化的方法的可參考的信息。今后，為了將人丙型肝炎病毒顆粒產(chǎn)業(yè)性應(yīng)用于疫苗等，需要大量并且高度純化，因此亟待開發(fā)出純化方法。
專利文獻(xiàn)1特開2002-171978號公報專利文獻(xiàn)2特開2001-17187號公報專利文獻(xiàn)3WO2004/104198A1專利文獻(xiàn)4特許3313117號專利文獻(xiàn)5特表2002-503484號專利文獻(xiàn)6特表2000-510682號專利文獻(xiàn)7特公平6-48980非專利文獻(xiàn)1Simmonds，P.et al.，Hepatology，10(1994)p1321-1324非專利文獻(xiàn)2Choo，Q.L et al.，Science，244(1989)p359-362非專利文獻(xiàn)3Okamoto，H et al.，J.Gen.Virol.，73(1992)p673-679非專利文獻(xiàn)4Mori，S.et al Biochem.Biophis.Res.Commun.183(1992)p334-342非專利文獻(xiàn)5Yoshioka，K.et al.，Hepatology，16(1992)p293-299非專利文獻(xiàn)6Thibeault，D.et al.，J.Virol.，78(2004)p7352-7359非專利文獻(xiàn)7Blight et al.，Science，290(2000)p1972-1974非專利文獻(xiàn)8Friebe et al.，J.Virol.，75(2001)p12047-12057非專利文獻(xiàn)9Kato，T.et al.，Gastroenterology，125(2003)p1808-1817非專利文獻(xiàn)10Kolykhalov et al.，Science，277(1997)p570-574非專利文獻(xiàn)11Farci，P.，et al.，Semin Liver Dis 20(2000)p103-126
非專利文獻(xiàn)12Virology，196(1993)p354-357非專利文獻(xiàn)13Journal of General Virology 86(2005)p677-685發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用培養(yǎng)細(xì)胞系復(fù)制增殖各種基因型的丙型肝炎病毒的方法。
本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)，將具有自主復(fù)制能力的HCV JFH1株的基因組RNA和在體外(in vitro)沒有自主復(fù)制能力的HCV株的基因組RNA進(jìn)行組合，制備經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，該經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA在細(xì)胞系中能夠自主復(fù)制。具體來說，上述發(fā)明發(fā)現(xiàn)，通過導(dǎo)入JFH1株的從NS3蛋白質(zhì)編碼序列開始到3’末端的基因組，可以將在體外沒有自主復(fù)制能力的HCV基因組RNA改變?yōu)槟軌蛟谂囵B(yǎng)細(xì)胞系中自主復(fù)制的RNA。
即，本發(fā)明涉及一種經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，其含有兩種或以上的丙型肝炎病毒的基因組RNA的5’非翻譯區(qū)、核心(core)蛋白質(zhì)編碼序列、E1蛋白質(zhì)編碼序列、E2蛋白質(zhì)編碼序列、p7蛋白質(zhì)編碼序列、NS2蛋白質(zhì)編碼序列、和JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B各蛋白質(zhì)編碼序列、以及3’非翻譯區(qū)的堿基序列，并且具有自主復(fù)制能力。
具體來說，作為本發(fā)明的一個實施方案，提供一種將從丙型肝炎病毒基因組RNA的NS3蛋白質(zhì)編碼序列開始到3’末端為止的基因組序列NS5B蛋白質(zhì)編碼序列取代為序列號1所示的編碼JFH1株的NS3、NS4、NS5A、以及NS5B蛋白質(zhì)的RNA部分序列(將Genbank AccessionNo.AB047639的DNA序列3867-9678位所示的序列的T以U取代后的RNA序列)、并且具有自主復(fù)制能力的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
此外，作為另一個實施方案，提供了將丙型肝炎病毒基因組RNA的NS5B蛋白質(zhì)編碼序列取代為序列號2所示的編碼JFH1株的NS5B蛋白質(zhì)編碼序列、并且具有自主復(fù)制能力的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
作為2種或以上的丙型肝炎病毒，優(yōu)選使用基因型1b核基因型1a的丙型肝炎病毒。作為基因型1b的病毒株，例如HCV-con1株、HCV-TH株、HCV-J株、HCV-JT株、以及HCV-BK株；此外，作為基因型1a的病毒株，例如HCV-J6株、HCV-JFH1株、以及HCV-JCH1株。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA也可以進(jìn)一步包含至少一個選擇性標(biāo)記基因和/或至少一個報告基因，和至少一個IRES序列。
此時，在經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA中，從5’到3’依次含有上述5’非翻譯區(qū)、至少一個選擇性標(biāo)記基因和/或至少一個報告基因、至少一個IRES序列、核心蛋白質(zhì)編碼序列、E1蛋白質(zhì)編碼序列、E2蛋白質(zhì)編碼序列、p7蛋白質(zhì)編碼序列、NS2蛋白質(zhì)編碼序列、NS3蛋白質(zhì)編碼序列、NS4A蛋白質(zhì)編碼序列、NS4B蛋白質(zhì)編碼序列、NS5A蛋白質(zhì)編碼序列、NS5B蛋白質(zhì)編碼序列、以及3’非翻譯區(qū)。
在本說明書中，作為該經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA的一個例子，例如含有(a)序列號11所示的堿基序列構(gòu)成的RNA，或者(b)在序列號11所示的堿基序列中，1個或多個、優(yōu)選為100個，更優(yōu)選為50個，進(jìn)一步優(yōu)選為10個堿基發(fā)生缺失、取代、或者附加的堿基序列構(gòu)成的RNA，具有自主復(fù)制能力和丙型肝炎病毒顆粒產(chǎn)生能力的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
本發(fā)明還提供一種導(dǎo)入了本發(fā)明的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，可以復(fù)制該丙型肝炎病毒，并且產(chǎn)生病毒顆粒的細(xì)胞。在本發(fā)明中，宿主細(xì)胞優(yōu)選為增殖性細(xì)胞，特別優(yōu)選真核細(xì)胞，例如，Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、IMY-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、或者293細(xì)胞等人肝臟來源細(xì)胞、人宮頸來源細(xì)胞、或者人胚腎來源細(xì)胞。
本發(fā)明也提供一種以培養(yǎng)上述細(xì)胞、從培養(yǎng)液中回收病毒顆粒為特征的丙型肝炎病毒顆粒的制備方法，以及通過該方法制備的丙型肝炎病毒顆粒。
本發(fā)明也提供一種以培養(yǎng)上述細(xì)胞、使培養(yǎng)物中的病毒顆粒感染其它細(xì)胞為特征的丙型肝炎病毒感染細(xì)胞的制備方法，以及通過該方法制備的丙型肝炎病毒感染細(xì)胞。本發(fā)明通過使用柱層析和/或密度梯度離心純化HCV病毒顆粒，能夠得到具有可用于產(chǎn)業(yè)和醫(yī)療的純度的HCV病毒顆粒。此時使用的柱層析為選自離子交換層析、凝膠過濾層析、以及親和層析中的一種或多種層析。密度梯度離心為使用含有選自氯化銫、蔗糖、以及糖聚合物的一種或多種溶質(zhì)的溶劑進(jìn)行密度梯度離心，以純化HCV。
本發(fā)明也提供一種使用本發(fā)明的細(xì)胞或丙型肝炎病毒感染細(xì)胞篩選抗丙型肝炎病毒物質(zhì)的方法。該方法的特征在于，在被檢物質(zhì)的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞或丙型肝炎病毒感染細(xì)胞，通過檢測培養(yǎng)物中的丙型肝炎病毒RNA或者病毒顆粒，評價該被檢物質(zhì)的抗丙型肝炎病毒的效果。
此外，本發(fā)明提供一種使用本發(fā)明的丙型肝炎病毒顆?；蚱湟徊糠肿鳛榭乖谋透窝滓呙绲闹苽浞椒?。
本發(fā)明還提供一種在細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)外源基因的方法，和含有靶向本發(fā)明的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA的肝細(xì)胞的病毒載體，其特征在于，將編碼外源基因的RNA插入本發(fā)明的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA中，將其導(dǎo)入目的細(xì)胞中，使其進(jìn)行復(fù)制或者表達(dá)。
采用本發(fā)明，就能夠使用培養(yǎng)細(xì)胞系制備具有感染性的HCV病毒顆粒。進(jìn)而，即使對于從患者中分離的不具有自主復(fù)制能力的HCV株，也可以通過將其從NS3區(qū)到3’端的區(qū)域取代為JFH1的病毒基因組RNA，或者通過將其NS5B區(qū)取代為JFH1的NS5B區(qū)，來使其在體外自主復(fù)制。因此，就能夠通過培養(yǎng)細(xì)胞系制備各種基因型的HCV株的病毒顆粒，這對于研究HCV感染過程、篩選影響HCV感染的各種物質(zhì)、以及制備HCV疫苗等是有用的。


圖1為表示用于制備本發(fā)明的HCV基因組RNA的模板DNA的構(gòu)建步驟的概略圖，表示在T7啟動子的下游插入全長HCV基因組制備的質(zhì)粒克隆pJFH1的結(jié)構(gòu)。圖中的標(biāo)記如下T7T7 RNA啟動子；5’UTR5’非翻譯區(qū)；C核心蛋白質(zhì)；E1、E2包膜蛋白質(zhì)；NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)；3’UTR3’非翻譯區(qū)；AgeI、PmeI、XbaI限制性內(nèi)切酶AgeI、PmeI、和XbaI的酶切位點；GDPNS5B蛋白質(zhì)的活性中心的氨基酸基序GDP相應(yīng)的位置。
圖2為表示Northern blot結(jié)果的照片，提示在導(dǎo)入作為HCV基因組RNA的rJFH1后的Huh7細(xì)胞中的rJFH1的復(fù)制。
圖3為表示在培養(yǎng)基中的HCV核心蛋白質(zhì)、NS3蛋白質(zhì)、NS5A蛋白質(zhì)、E2蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果。
圖4為表示導(dǎo)入HCV基因組RNA后的細(xì)胞向培養(yǎng)基中經(jīng)時釋放核心蛋白質(zhì)的結(jié)果。
圖5為表示在通過蔗糖密度梯度離心將導(dǎo)入rJFH1后的Huh7細(xì)胞的培養(yǎng)上清分離后的各部分中，HCV核心蛋白質(zhì)和HCV基因組RNA量的圖。黑色圓圈表示HCV Core(core)蛋白質(zhì)，白色圓圈表示HCV基因組RNA。圖5A表示未處理、圖5B表示RNase處理、圖5C表示NP40處理、圖5D表示NP40+RNase處理后的導(dǎo)入rJFH1的Huh7細(xì)胞。
圖6關(guān)于分泌到導(dǎo)入rJFH1的Huh7細(xì)胞的培養(yǎng)液中的病毒顆粒的感染性。圖6A為表示通過抗Core抗體(左)、抗NS5A抗體(右)的免疫染色的結(jié)果的照片。圖6B為表示抗Core抗體染色陽性細(xì)胞數(shù)量的圖。圖6C為表示在細(xì)胞內(nèi)(左)及上清(右)中的HCV RNA量的經(jīng)時變化的圖。
圖7關(guān)于分泌到導(dǎo)入rJCH1/NS5B(jfh1)的Huh7細(xì)胞的培養(yǎng)液中的病毒顆粒的感染性。圖7A為關(guān)于分泌到導(dǎo)入JCH1/NS5B(jfh1)的Huh7細(xì)胞的培養(yǎng)液中的病毒顆粒在Huh7稚細(xì)胞中的HCV RNA的擴(kuò)增的圖。圖7B為表示抗Core抗體染色陽性細(xì)胞數(shù)量的圖。
圖8表示TH/JFH1嵌合復(fù)制子的結(jié)構(gòu)圖9為通過轉(zhuǎn)染TH/JFH1嵌合復(fù)制子RNA而形成集落的觀察結(jié)果。
圖10為通過TH/JFH1嵌合復(fù)制子培養(yǎng)上清感染而形成集落的觀察結(jié)果。
圖11為表示在凝膠過濾層析中的洗脫圖。縱軸表示在波長490nm的吸光度。S-300、S-400、S-500分別為Sephacryl(注冊商標(biāo))S-300、S-400、S-500。此外，橫軸表示從柱中洗脫出的溶液量。
圖12為表示在離子交換層析中的洗脫圖。縱軸表示HCV病毒顆粒的核心蛋白質(zhì)的量。
圖13為表示在凝集素親和層析中的洗脫圖?？v軸表示HCV病毒顆粒的核心蛋白質(zhì)的量。
圖14為表示在肝素、硫酸化cellulofine層析中的洗脫圖?？v軸表示在波長490nm的吸光度。
圖15為表示在藍(lán)染料親和層析中的洗脫圖?？v軸表示HCV病毒顆粒的核心蛋白質(zhì)的量。
圖16表示組合了柱層析和蔗糖密度梯度離心的純化圖?？v軸表示HCV病毒顆粒的核心蛋白質(zhì)的量。此外，在縱軸中表示了在蔗糖密度梯度離心中，HCV病毒顆粒的核心蛋白質(zhì)的量和各部分溶液的密度。
本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的特愿2004-243975號、特愿2004-290801號、特愿2005-69527號、以及特愿2005-69725號的說明書中所述內(nèi)容。
具體實施方案以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
1.經(jīng)修飾的嵌合丙型肝炎病毒基因組RNA丙型肝炎病毒(HCV)的基因組是由9600個核苷酸構(gòu)成的(+)鏈單鏈RNA。該基因組RNA由5’非翻譯區(qū)(也稱為5’-NTR或者5’-UTR)、由結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)構(gòu)成的翻譯區(qū)、以及3’非翻譯區(qū)(也稱為3’-NTR或者3’-UTR)構(gòu)成。其結(jié)構(gòu)區(qū)編碼HCV的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，非結(jié)構(gòu)區(qū)編碼HCV的多種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。
該HCV的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(Core、E1、以及E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、以及NS5B)是從翻譯區(qū)翻譯而成一個連續(xù)的多聚蛋白質(zhì)之后，通過蛋白質(zhì)酶的限制性分解而釋放生成的。在這些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(即，HCV的病毒蛋白質(zhì))之中，Core是核心蛋白質(zhì)，E1和E2是包膜蛋白質(zhì)。非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是與病毒自身的復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)，已知NS2具有金屬蛋白質(zhì)酶的活性，NS3具有絲氨酸蛋白質(zhì)酶(N末端側(cè)的三分之一)的活性和解旋酶(C末端側(cè)的三分之二)的活性。此外也有報告，NS4是與NS3的蛋白質(zhì)酶活性相對的輔因子，NS5B具有依賴RNA的RNA聚合酶的活性。
目前，作為HCV的基因型，已知至少有1型～6型，Simmonds等(參照Simmonds，P.et al，Hepatology，(1994)10，p.1321-1324)根據(jù)其序列，以國際分類將HCV分為各種基因型(HCV1a、HCV1b、HCV2a、HCV2b等)。在本發(fā)明中，沒有自主復(fù)制能力的HCV基因組RNA不限于這些已知的病毒型，而是包括全部的沒有自主復(fù)制能力，即，不具有將感染性顆粒釋放到細(xì)胞外的能力的HCV基因組RNA。此外，在本發(fā)明中，所謂RNA“具有自主復(fù)制能力”或者“進(jìn)行自主復(fù)制”，是指將HCV基因組RNA導(dǎo)入細(xì)胞中后，該HCV基因組RNA具有自我增殖的能力，即，具有將感染性顆粒釋放到細(xì)胞外的能力。
在本說明書中，將包括上述這樣的具有培養(yǎng)細(xì)胞系自主復(fù)制能力的HCV基因組RNA在內(nèi)的RNA稱為“復(fù)制子RNA”或者“RNA復(fù)制子”。在本說明書中，將包含復(fù)制子RNA全長的本發(fā)明的復(fù)制子RNA稱為“全長HCV復(fù)制子RNA”。本發(fā)明的全長HCV復(fù)制子RNA具有產(chǎn)生病毒顆粒的能力。此外，本發(fā)明的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA為全長HCV復(fù)制子RNA。
本發(fā)明涉及的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA是由包含2種或以上的丙型肝炎病毒的基因組RNA的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白質(zhì)編碼序列、E1蛋白質(zhì)編碼序列、E2蛋白質(zhì)編碼序列、p7蛋白質(zhì)編碼序列、NS2蛋白質(zhì)編碼序列和JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B各蛋白質(zhì)編碼序列以及3’非翻譯區(qū)的堿基序列構(gòu)成，并且具有自主復(fù)制能力的，經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。具體來說，作為本發(fā)明的一個實施方案涉及將從丙型肝炎病毒基因組RNA的NS3蛋白質(zhì)編碼序列開始到3’末端為止的基因組序列NS5B蛋白質(zhì)編碼序列取代為序列號1所示的編碼JFH1株的NS3、NS4、NS5A、以及NS5B蛋白質(zhì)的RNA部分序列(將GenBank Accession No.AB047639的DNA序列3867-9678位所示的序列的T以U取代后的RNA序列)，具有自主復(fù)制能力的、經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
此外，作為另一個實施方案提供了將丙型肝炎病毒基因組RNA的NS5B蛋白質(zhì)編碼序列取代為序列號2所示的編碼JFH1株的NS5B蛋白質(zhì)編碼序列、具有自主復(fù)制能力的、經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
更優(yōu)選，采用基因型1b及基因型2a的丙型肝炎病毒獲得的，由包含有5’非翻譯區(qū)、核心蛋白質(zhì)編碼序列、E1蛋白質(zhì)編碼序列、E2蛋白質(zhì)編碼序列、p7蛋白質(zhì)編碼序列、NS2蛋白質(zhì)編碼序列和JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B的各蛋白質(zhì)編碼序列、以及3’非翻譯區(qū)的堿基序列構(gòu)成的，并且具有自主復(fù)制能力的，經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
上述經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA也可以進(jìn)一步含有至少一個選擇性標(biāo)記基因和/或至少一個報告基因、和至少一個IRES序列。
在本發(fā)明中，作為2種或以上的丙型肝炎病毒，通過將在培養(yǎng)細(xì)胞系中具有自主復(fù)制能力的HCV株和在培養(yǎng)細(xì)胞系中不具有自主復(fù)制能力的HCV株進(jìn)行組合，能夠?qū)⒉痪哂凶灾鲝?fù)制能力的HCV株轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蜃灾鲝?fù)制的HCV株?；蛘?，能夠?qū)⒆灾鲝?fù)制能力低的HCV株轉(zhuǎn)變?yōu)樽灾鲝?fù)制能力高的HCV株。
作為HCV株，具體來說，已知有，在1a型中的HCV-1株、HCV-H株、HCV-J1株等；在1b型中的HCV-con1株、HCV-TH株、HCV-J株HCV-JT株、HCV-BK株等；在2a型中的HCV-J6株、HFH-1株、JCH1株等；在2b型中的HC-J8株；在3a型中的E-b1株等。這些病毒的結(jié)構(gòu)基本上由5’-UTR、Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4a、NS5a、NS5b、3’-UTR構(gòu)成(如前述)。上述各HCV株的各區(qū)域的堿基序列也已經(jīng)明確，例如，在TH株的全長序列中，已經(jīng)明確了Core、E1、E2、p7、NS2的區(qū)域。此外，在HCV-JT株中，已經(jīng)明確了Core、E1、E2、p7、NS2的區(qū)域。作為本發(fā)明涉及的復(fù)制子RNA的一個實施方案，例如使用HCV2a型的JFH1株和除了JFH-1株以外的其他株，例如，HCV-1株、HCV-H株、HCV-J1株、HCV-con1株、HCV-TH株(Wakita et al.，J.Biol.chem.，(1994)269，p.14205-14210，和Moradpour et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(1998)246，p.920-924)、HCV-J株、HCV-JT株、HCV-BK株、HCV-J6株、JCH1、HC-J8、E-b1株的嵌合HCV復(fù)制子RNA。
進(jìn)而，作為本發(fā)明的經(jīng)修飾的HCV基因組RNA的合適的實施方案，例如將丙型肝炎病毒JFH1株的HCV基因組RNA中的從NS3區(qū)域開始到3’側(cè)的區(qū)域以JFH1的病毒基因組RNA取代，或者將NS5B蛋白質(zhì)編碼序列以其他的HCV基因組RNA中的NS5B蛋白質(zhì)編碼序列取代或者插入的HCV基因組RNA。例如，通過將已知在體外不能復(fù)制的HCV基因組RNA JCH1(ref)的從NS3區(qū)域開始到3’側(cè)的區(qū)域以JFH1的病毒基因組RNA取代，就能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榭勺灾鲝?fù)制HCV基因組RNA的HCV基因組RNA。
此外，通過將作為HCV基因組RNA的HCV基因型1b的Con-1克隆(ref)(EMBL Accession No.AJ238799)的編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列取代為JFH1株的編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列，或者僅將HCV基因型1b的編碼Con-1克隆(ref)的NS5B蛋白質(zhì)的序列取代為JFH1株的編碼NS5B蛋白質(zhì)的序列，就能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榭勺灾鲝?fù)制HCV基因組RNA的HCV基因組RNA。
使用了Con-1克隆的基因的全長復(fù)制子盡管具有自主復(fù)制能力，但是不形成HCV病毒顆粒(參照Pietschmann et al，Journal of Virology，(2002)76，p.4008-4021)。但是，如本發(fā)明的實施例所示，通過將編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列取代為JFH1株的編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列，就能夠形成顆粒。即，通過本發(fā)明的方法，能夠?qū)⒈M管具有自主復(fù)制能力，但是不能形成顆粒的丙型肝炎病毒基因組RNA變?yōu)槟軌蛐纬深w粒的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
此外，即使在如TH株和JCH株這樣的不能生成具有自主復(fù)制能力的復(fù)制子的HCV中，也能夠通過如本發(fā)明的實施例所示的那樣制備其與JFH-1株的嵌合體基因而形成顆粒。因此，就能夠使不能自主復(fù)制的HCV基因組RNA成為能夠形成顆粒的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
進(jìn)而，通過向JFH株的RNA序列中的NS5B中引入突變，HCV的基因組RNA的增殖停止，HCV的顆粒產(chǎn)生停止，因此可知，NS5B對于賦予自主復(fù)制能力和顆粒產(chǎn)生能力是重要的。
目前，Simmonds等(參照Simmonds，P.et al，Hepatology，(1994)10，p.1321-1324)根據(jù)HCV的序列，以國際分類將其分為各種基因型(HCV1a、HCV1b、HCV2a、HCV2b等)。在本發(fā)明中，沒有自主復(fù)制能力的HCV基因組RNA不限于這些已知的病毒型，而是包括全部的不具備自主復(fù)制能力的HCV基因組RNA。
本說明書涉及的編碼NS5B蛋白質(zhì)的序列為編碼JFH1株來源的NS5B蛋白質(zhì)的序列(序列號3)，具有序列號2所示的堿基序列。但是，只要是能夠在嚴(yán)格的條件下與序列號2所示的堿基序列雜交的堿基序列，其編碼發(fā)揮NS5B蛋白質(zhì)的功能的氨基酸(例如，含有保守取代的NS5B蛋白質(zhì))，均包含在本發(fā)明的NS5B蛋白質(zhì)編碼序列中。
此外，所謂嚴(yán)格的條件，例如，是指鈉濃度為300～2000mM，溫度為40～75℃，優(yōu)選為鈉濃度為600～900mM，溫度為65℃的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠參照Molecular Cloning(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloninga Laboratory Manual 2nded.，Cold Spring HarborLaboratory Press，10Skyline Drive Plainiew，NY(1989))等容易地獲得如上述這樣的NS5B的同源物。
本發(fā)明涉及的HCV基因組RNA具有JFH1 HCV基因組RNA中的編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列，或者具有編碼NS5B蛋白質(zhì)的序列。
在一個實施方案中，本發(fā)明的HCV基因組RNA是由含有丙型肝炎病毒株的基因組RNA上的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白質(zhì)編碼序列、E1蛋白質(zhì)編碼序列、E2蛋白質(zhì)編碼序列、NS2蛋白質(zhì)編碼序列、NS3蛋白質(zhì)編碼序列、NS4A蛋白質(zhì)編碼序列、NS4B蛋白質(zhì)編碼序列、NS5A蛋白質(zhì)編碼序列、NS5B蛋白質(zhì)編碼序列、以及3’非翻譯區(qū)的堿基序列構(gòu)成的RNA，并且，上述編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列為外源導(dǎo)入的JFH1 HCV基因組RNA來源的編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列部分。優(yōu)選NS5B蛋白質(zhì)編碼序列為外源導(dǎo)入的JFH1 HCV基因組RNA來源的編碼NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列。
在本說明書中，“5’非翻譯區(qū)(5’NTR或者5’UTR)”、“核心蛋白質(zhì)編碼序列(Core區(qū)或者C區(qū))”、“E1蛋白質(zhì)編碼序列(E1區(qū))”、“E2蛋白質(zhì)編碼序列(E2區(qū))”、“NS2蛋白質(zhì)編碼序列(NS2區(qū))”、“NS3蛋白質(zhì)編碼序列(NS3區(qū))”、“NS4A蛋白質(zhì)編碼序列(NS4A區(qū))”、“NS4B蛋白質(zhì)編碼序列(NS4B區(qū))”、“NS5A蛋白質(zhì)編碼序列(NS5A區(qū))”、“NS5B蛋白質(zhì)編碼序列(NS5B區(qū))”、“以及3’非翻譯區(qū)(3’NTR或者3’UTR)”、和其他的特定區(qū)域或位點，在各種基因型中已經(jīng)公知。至于未知的HCV株的上述個區(qū)域或位點，能夠通過將已知的HVC全長基因組RNA序列與該HCV株的全長RNA序列進(jìn)行比對而容易地確定。
在本發(fā)明中，所謂“選擇性標(biāo)記”，是指能夠賦予細(xì)胞選擇性的基因，該選擇性使得只有表達(dá)該基因的細(xì)胞能夠被選擇。作為選擇標(biāo)記基因的一般的例子，例如抗生素抗性基因。在本發(fā)明中，作為合適的選擇性標(biāo)記基因的例子，例如新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等，優(yōu)選新霉素抗性基因、胸苷激酶基因，進(jìn)一步優(yōu)選新霉素抗性基因。但是本發(fā)明的選擇性標(biāo)記基因不限于此。
此外，在本發(fā)明中，所謂“報告基因”，是指編碼成為該基因表達(dá)指標(biāo)的基因產(chǎn)物的標(biāo)記基因。作為報告基因的一般的例子，例如催化發(fā)光反應(yīng)或者顯色反應(yīng)的酶的結(jié)構(gòu)基因。在本發(fā)明中，作為合適的報告基因的例子，例如轉(zhuǎn)座子Tn9來源的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、大腸桿菌來源的β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶基因、螢光素酶基因、綠色熒光蛋白質(zhì)基因、水母來源的水母發(fā)光蛋白質(zhì)基因、分泌型胎盤堿性磷酸酶(SEAP)基因等。但是本發(fā)明的報告基因并不限于此。
上述選擇性標(biāo)記基因和報告基因在復(fù)制子RNA中可以只含有任何一個，也可以二者都含有。選擇性標(biāo)記基因或者報告基因在經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA中可以含有一種，也可以含有兩種或以上。
本發(fā)明涉及的HCV基因組RNA也可以進(jìn)一步含有編碼希望在其全長HCV基因組RNA導(dǎo)入的細(xì)胞中表達(dá)的外源基因的RNA。編碼外源基因的RNA可以連接在5’非翻譯區(qū)下游，也可以插入在3’非翻譯區(qū)的上游。此外，也可以在核心蛋白質(zhì)編碼序列、E1蛋白質(zhì)編碼序列、E2蛋白質(zhì)編碼序列、NS2蛋白質(zhì)編碼序列、NS3蛋白質(zhì)編碼序列、NS4A蛋白質(zhì)編碼序列、NS4B蛋白質(zhì)編碼序列、NS5A蛋白質(zhì)編碼序列、NS5B蛋白質(zhì)編碼序列的任意二者之間。
當(dāng)含有編碼外源基因的RNA的HCV基因組RNA在導(dǎo)入的細(xì)胞中翻譯的時候，能夠表達(dá)該外源基因編碼的基因產(chǎn)物。因此，當(dāng)以在細(xì)胞內(nèi)生成外源基因的基因產(chǎn)物為目的時，也能夠適當(dāng)?shù)厥褂煤芯幋a外源基因的RNA的HCV基因組RNA。
在本發(fā)明涉及的HCV基因組RNA中，編碼上述的病毒蛋白質(zhì)的序列以及外來基因等的連接，要保證其以正確的閱讀框從HCV基因組RNA中被翻譯。優(yōu)選通過蛋白質(zhì)酶的酶切位點等互相連接，這樣，當(dāng)HCV基因組RNA編碼的蛋白質(zhì)作為一個連續(xù)的多肽被翻譯和表達(dá)后，就能夠利用蛋白質(zhì)酶將各蛋白質(zhì)切斷、游離。
若將這樣制備的含有JFH1株的編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列部分的HCV基因組RNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，則可以獲得能夠自主復(fù)制，優(yōu)選能夠連續(xù)自主復(fù)制HCV基因組RNA(即具有HCV基因組RNA的自主復(fù)制能力)的重組細(xì)胞。以下，在本說明書中，將擁有含有JFH1株的編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列部分的HCV基因組RNA的復(fù)制能力的重組細(xì)胞稱為“HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞”。
用于“HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞”的宿主細(xì)胞，只要是能夠繼代培養(yǎng)的細(xì)胞即可，沒有特殊限定，優(yōu)選真核細(xì)胞，更優(yōu)選人細(xì)胞，進(jìn)一步優(yōu)選人肝臟來源細(xì)胞、人宮頸來源細(xì)胞、或者人胚腎(fetalkidney)來源細(xì)胞。此外，作為細(xì)胞，優(yōu)選包括癌細(xì)胞或者干細(xì)胞在內(nèi)的增殖性細(xì)胞，特別優(yōu)選Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、IMY-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、或者293細(xì)胞等。這些細(xì)胞可以使用市售的，也可以從細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)獲得，也可以使用從任意細(xì)胞(例如癌細(xì)胞或干細(xì)胞)株化的細(xì)胞。
將HCV基因組RNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以使用公知的任意技術(shù)進(jìn)行。作為該導(dǎo)入方法，例如，例如電穿孔、基因槍法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法、顯微注射法、DEAE瓊脂糖法等。特別優(yōu)選通過電穿孔的方法。
HCV基因組RNA可以單獨導(dǎo)入，也可以與其他核酸混合導(dǎo)入。當(dāng)希望導(dǎo)入的RNA量為一定，而改變HCV基因組RNA的導(dǎo)入量時，將所期望的導(dǎo)入量的HCV基因組RNA與從導(dǎo)入細(xì)胞中提取的總細(xì)胞RNA混合而成一定的RNA總量，將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)即可。用于導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的HCV基因組RN的量根據(jù)使用的導(dǎo)入方法決定即可，優(yōu)選使用的量為1皮克～100微克，更優(yōu)選為10皮克～10微克。
在“HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞”中的HCV基因組RNA的復(fù)制能夠依據(jù)公知的任意的RNA檢測方法進(jìn)行確認(rèn)，例如，能夠使用以對導(dǎo)入的HCV基因組RNA特異的DNA片段作為探針，對從細(xì)胞提取的總RNA進(jìn)行Northern雜交的方法，或者使用對導(dǎo)入的HCV基因組RNA特異的引物的RT-PCR方法。
進(jìn)而，如果從“HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞”提取的蛋白質(zhì)中檢測出了HCV蛋白質(zhì)，則能夠判斷該細(xì)胞正在復(fù)制HCV基因組RNA。HCV基因組RNA的檢測能夠依據(jù)公知的任意的蛋白質(zhì)檢測方法進(jìn)行，例如，能夠通過將針對由導(dǎo)入的HCV基因組RNA表達(dá)的HCV蛋白質(zhì)的抗體與從細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)而進(jìn)行。更具體來說，例如，能夠通過下述方法進(jìn)行將從細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)樣品印跡在硝酸纖維素上，使抗HCV蛋白質(zhì)抗體(例如抗NS3特異抗體，或由丙型肝炎患者采集的抗血清)對其進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而檢測該抗HCV蛋白質(zhì)抗體。
HVC基因組RNA的自主復(fù)制的確認(rèn)方法沒有限定，例如，能夠通過下述方法進(jìn)行確認(rèn)將目的RNA轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中，培養(yǎng)該Huh7細(xì)胞，使用能夠特異地檢測出導(dǎo)入的RNA的探針，對提取自得到的培養(yǎng)物中的細(xì)胞的RNA進(jìn)行Northern blot。用于確認(rèn)自主復(fù)制能力的具體操作例示于本說明書的實施例中所述的HCV蛋白質(zhì)表達(dá)的確認(rèn)、HCV基因組RNA的檢測等的表述中。
2.HCV病毒顆粒的制備如上述這樣制備的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞，能夠體外產(chǎn)生HCV病毒顆粒。即，能夠通過在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞，從其培養(yǎng)物(優(yōu)選為培養(yǎng)液)收集產(chǎn)生的病毒顆粒，就能夠簡單地獲得HCV病毒顆粒。
HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞的病毒顆粒產(chǎn)生能力能夠使用公知的任意的病毒檢測方法來確認(rèn)。例如，當(dāng)通過蔗糖密度梯度將認(rèn)為產(chǎn)生病毒顆粒的細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行分離，測定各部分的密度、HCV核心蛋白質(zhì)的濃度、以及HCV基因組RNA的量，結(jié)果為HCV核心蛋白質(zhì)與HCV基因組RNA的峰一致，而且，相比較于將培養(yǎng)上清以0.25％NP40(聚氧乙烯(9)辛基苯醚(polyoxyethylene(9)octylphenylether))處理后分離時的相同成分的密度，檢測出峰的部分的密度較輕(例如，1.15mg～1.22mg)時，則能夠判定該細(xì)胞具有病毒顆粒產(chǎn)生能力。
釋放于培養(yǎng)液中的HCV病毒顆粒，例如，也能夠使用針對核心蛋白質(zhì)、E1蛋白質(zhì)、或者E2蛋白質(zhì)的抗體檢測出來。此外，也能夠通過使用特異的引物以RT-PCR的方法對培養(yǎng)液中的HCV病毒顆粒含有的HCV基因組RNA進(jìn)行擴(kuò)增，緊接檢測出HCV病毒顆粒的存在。
3.本發(fā)明的HCV顆粒對其他細(xì)胞的感染以本發(fā)明的方法產(chǎn)生的HCV病毒顆粒具有對細(xì)胞(優(yōu)選為HCV感受性細(xì)胞)的感染能力。本發(fā)明包括培養(yǎng)HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞，將得到的培養(yǎng)物(優(yōu)選為培養(yǎng)液)中的病毒顆粒感染其他細(xì)胞(優(yōu)選為HCV感受性細(xì)胞)，也提供丙型肝炎病毒感染細(xì)胞的制備方法。在本說明書中，所謂“HCV感受性細(xì)胞”，是指對HCV具有感染性的細(xì)胞，雖然優(yōu)選為肝細(xì)胞或者淋巴細(xì)胞，但是并不限于此。具體來說，作為肝細(xì)胞，例如原代肝細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、IMY-N9細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、203細(xì)胞等；作為淋巴細(xì)胞，例如Molt4細(xì)胞、HPB-Ma細(xì)胞、Daudi細(xì)胞等，但是并不限于此。
如果將在本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞中產(chǎn)生的HCV病毒顆粒感染細(xì)胞(例如，HCV感受性細(xì)胞)，則HCV基因組RNA在感染的細(xì)胞中復(fù)制，進(jìn)而形成病毒顆粒。通過將在本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞中產(chǎn)生的HCV病毒顆粒感染細(xì)胞，HCV基因組RNA在細(xì)胞內(nèi)被復(fù)制，就能夠進(jìn)而制備病毒顆粒。
在本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞中產(chǎn)生的HCV病毒顆粒，感染黑猩猩等可感染HCV病毒的動物能夠引起HCV來源的肝炎。
4.HCV病毒顆粒的純化在純化HCV病毒顆粒時，含有該病毒的溶液可以選自HCV感染患者來源的血液、HCV感染培養(yǎng)細(xì)胞、和通過基因重組技術(shù)而產(chǎn)生HCV病毒顆粒的細(xì)胞的培養(yǎng)液以及細(xì)胞勻漿液中的任何一種或多種。
將含有HCV病毒的溶液進(jìn)行離心和/或使用濾器等，除去細(xì)胞及細(xì)胞殘渣。除去殘渣后的溶液能夠使用截留分子量為100000～500000的超濾膜濃縮10～100倍左右。
除去殘渣后的含有HCV的溶液能夠通過將下述的層析法和/或密度梯度離心以任意的順序組合或者單獨使用而進(jìn)行純化。以下對代表性的層析法和密度梯度離心的方法進(jìn)行表述，但是本發(fā)明并不限于此。
凝膠過濾層析法通過優(yōu)選使用以丙烯基葡聚糖、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物作為凝膠基質(zhì)的層析載體，進(jìn)一步優(yōu)選使用由Sephacryl(注冊商標(biāo))S-300、S-400和S-500構(gòu)成的層析法，能夠進(jìn)行HCV病毒顆粒的純化。
離子交換層析法優(yōu)選使用Q Sepharose(注冊商標(biāo))等作為陰離子交換樹脂，以及優(yōu)選使用SP Sepharose(注冊商標(biāo))等作為陽離子交換樹脂，能夠進(jìn)行HCV病毒顆粒的純化。
親和層析優(yōu)選使用結(jié)合有選自肝素、硫酸化的cellulofine、凝集素、以及各種色素的基質(zhì)作為配體的樹脂作為載體，能夠進(jìn)行HCV病毒顆粒的純化。進(jìn)一步優(yōu)選使用結(jié)合有hiTrap Heparin HP(注冊商標(biāo))、hiTrap Blue HP(注冊商標(biāo))、hiTrap Benzamidine FF(注冊商標(biāo))、硫酸化的cellulofine，以及LCA、ConA、RCA-120、和WGA的載體，能夠進(jìn)行HCV病毒顆粒的純化。最優(yōu)選使用硫酸化的cellulofine作為載體進(jìn)行HCV病毒顆粒的純化，該純化使得在純化前和純化后，溶液中的總蛋白質(zhì)量與HCV的RNA拷貝數(shù)的比率達(dá)到30倍或以上。
通過密度梯度離心的純化，能夠優(yōu)選使用氯化銫、蔗糖、Nycodenz(注冊商標(biāo))、以及Ficoll(注冊商標(biāo))和Percoll(注冊商標(biāo))這樣的糖聚合物作為形成密度梯度的溶質(zhì)。優(yōu)選使用蔗糖。此外，能夠優(yōu)選使用水、磷酸緩沖液、Tris緩沖液、醋酸緩沖液、甘氨酸緩沖液作為使用的溶劑。
進(jìn)行純化時的溫度優(yōu)選為0～40℃，進(jìn)一步優(yōu)選為0～25℃，最優(yōu)選為0～10℃。
通過密度梯度離心進(jìn)行精制時的離心力優(yōu)選為1×104～1×109g，進(jìn)一步優(yōu)選為5×104～1×107g，最優(yōu)選為5×104～5×105g，純化方法的組合，可以將密度梯度離心和層析法以任意的順序進(jìn)行任意的組合，優(yōu)選在通過多種柱層析純化后，應(yīng)用密度梯度離心的組合，更優(yōu)選將使用陰離子交換柱、然后應(yīng)用親和層析得到的含有HCV病毒顆粒的部分，應(yīng)用密度梯度離心進(jìn)行純化的組合，最優(yōu)選將通過使用Q Sepharose(注冊商標(biāo))的柱得到的含有HCV病毒顆粒的部分，應(yīng)用使用硫酸cellulofine的柱進(jìn)行進(jìn)一步純化的組合。此外，在柱層析和密度梯度離心的步驟之間，能夠通過使用透析或超濾將含有HCV病毒顆粒的溶液的溶質(zhì)進(jìn)行置換和/或進(jìn)行HCV病毒顆粒的濃縮。
5.本發(fā)明的其他實施方案在本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞中，HCV基因組RNA被高效復(fù)制。因此，使用本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞就能夠高效制備HCV基因組RNA。
在本發(fā)明中，通過培養(yǎng)HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞，從培養(yǎng)物(培養(yǎng)細(xì)胞和/或培養(yǎng)液)中提取RNA，通過電泳法將其分離，將分離后的HCV基因組RNA進(jìn)行分離純化，就能夠制備HCV基因組RNA。這樣所制備的RNA含有HCV基因組序列。通過提供含有HCV基因組序列的RNA的制備方法，就能夠?qū)CV基因組進(jìn)行更加詳細(xì)的分析。
進(jìn)而，本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞能夠適用于制備HCV蛋白質(zhì)。HCV蛋白質(zhì)的制備能夠通過公知的任意方法進(jìn)行，例如，通過將HCV基因組RNA導(dǎo)入細(xì)胞，制備重組細(xì)胞，培養(yǎng)該重組細(xì)胞，通過常規(guī)方法從得到的培養(yǎng)物(培養(yǎng)細(xì)胞和/或培養(yǎng)液)中回收蛋白質(zhì)即可。
HCV病毒顆?？删哂懈渭?xì)胞靶向性。因此，能夠使用本發(fā)明的HCV基因組RNA制備肝細(xì)胞靶向性病毒載體。該病毒載體適用于基因治療。在本發(fā)明中，通過將編碼外源基因的RNA重組于HCV基因組RNA中，將該RNA導(dǎo)入細(xì)胞，就能夠?qū)⒃撏庠椿驅(qū)爰?xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。
進(jìn)而，通過制備將HCV基因組RNA中的E1蛋白質(zhì)編碼序列和/或E2蛋白質(zhì)編碼序列改變?yōu)槠渌锓N來源的病毒的外殼蛋白質(zhì)的RNA，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，制備病毒顆粒，就能夠使該RNA感染各種物種的細(xì)胞。此時，以可以將外源基因重組于HCV基因組RNA中，該外源基因依賴于重組病毒外殼蛋白質(zhì)的靶向性，能夠?qū)⑵渥鳛橛糜谠诟鞣N細(xì)胞中表達(dá)細(xì)胞靶向性病毒載體來使用。
本發(fā)明也涉及含有外源基因的病毒載體的制備方法，該方法包括將編碼外源基因的RNA插入HCV基因組RNA中，將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)該細(xì)胞，產(chǎn)生病毒顆粒。
本發(fā)明也提供一種以本發(fā)明的HCV病毒顆?；蚱湟徊糠肿鳛榭乖?，或者以為了改變細(xì)胞靶向性而重組病毒外殼蛋白質(zhì)所制備的顆?；蚱湟徊糠肿鳛榭乖谋透窝滓呙?、或者用于針對重組病毒外殼蛋白質(zhì)的病毒的疫苗的制備方法。進(jìn)而，使用以本發(fā)明涉及的HCV病毒顆?；蚱湟徊糠肿鳛榭乖?，或者以為了改變細(xì)胞靶向性而重組病毒外殼蛋白質(zhì)所制備的顆?；蚱湟徊糠肿鳛榭乖材軌蛑瞥蒆CV的感染中和抗體。
本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞，或者感染了該細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒的HCV感染細(xì)胞，例如，能夠作為用于HCV復(fù)制、病毒顆粒的重構(gòu)、篩選促進(jìn)或者抑制病毒顆粒釋放的物質(zhì)(抗丙型肝炎病毒物質(zhì))的實驗系統(tǒng)而使用。具體來說，例如，在被檢物質(zhì)的存在下培養(yǎng)該細(xì)胞，檢測得到的培養(yǎng)物中的HCV基因組RNA或者病毒顆粒，通過判斷該被檢物質(zhì)是否促進(jìn)或者抑制復(fù)制子RNA或HCV基因組RNA的復(fù)制或者病毒顆粒的形成或釋放，能夠篩選促進(jìn)或者抑制丙型肝炎病毒增殖的物質(zhì)。此時，培養(yǎng)物中的HCV基因組RNA的檢測可以通過檢測從上述細(xì)胞中提取的RNA中的HCV基因組RNA的量、比率、或者有無來進(jìn)行。培養(yǎng)物(主要為培養(yǎng)液)中的病毒顆粒的檢測可以通過檢測培養(yǎng)液中所含HCV蛋白質(zhì)的量、比率、或者有無來進(jìn)行。
在本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞中產(chǎn)生的HCV病毒顆粒和HCV感受性細(xì)胞也能夠作為用于篩選促進(jìn)或者抑制HCV對細(xì)胞的結(jié)合的物質(zhì)的實驗系統(tǒng)而使用。具體來說，例如，在被檢物質(zhì)的存在下，將在本發(fā)明的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞中產(chǎn)生的HCV病毒顆粒與HCV感受性細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢測得到的培養(yǎng)物中的HCV基因組RNA或者病毒顆粒，通過判斷該被檢物質(zhì)是否促進(jìn)或者抑制HCV基因組RNA的復(fù)制或者病毒顆粒的形成，能夠篩選促進(jìn)或者抑制丙型肝炎病毒增殖的物質(zhì)。
該HCV基因組RNA或者病毒顆粒的檢測能夠依照上述的方法或者后述的實施例進(jìn)行。上述實驗系統(tǒng)也能夠用于丙型肝炎病毒感染的預(yù)防劑、治療劑、或者診斷劑的制備或評價。
具體來說，作為本發(fā)明的上述實驗系統(tǒng)的利用例，例如以下例子(1)抑制HCV的增殖和感染的物質(zhì)的探索作為抑制HCV的增殖和感染的物質(zhì)，例如，例如直接或者間接對HCV的增殖和感染產(chǎn)生影響的有機(jī)化合物，或者通過與HCV基因組或其互補(bǔ)鏈的靶序列雜交而直接或者間接對HCV的增殖或HCV蛋白質(zhì)的翻譯產(chǎn)生影響的反義寡核苷酸等。
(2)在細(xì)胞培養(yǎng)中具有抗病毒作用的各種物質(zhì)的評價作為上述的各種物質(zhì)，例如使用推理性藥物設(shè)計或者高通量篩選得到的物質(zhì)(例如經(jīng)分離純化的酶)等。
(3)用于HCV感染患者的治療的新靶點的鑒定例如，為了鑒定在HCV病毒復(fù)制中發(fā)揮重要功能的宿主細(xì)胞性蛋白質(zhì)，可以使用本發(fā)明涉及的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞。
(4)HCV病毒對藥物等的抗性獲得能力的評價以及該抗性涉及的突變的鑒定(5)用于丙型肝炎病毒感染的診斷藥物或者治療藥物的開發(fā)、制備以及評價所使用的作為可能的抗原的病毒蛋白質(zhì)的制備(6)用于丙型肝炎病毒感染的疫苗的開發(fā)、制備、以及評價所使用的作為可能的抗原的病毒蛋白質(zhì)和減毒HCV的制備實施例根據(jù)以下的實施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。但是，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于這些實施例。
HCV基因組RNA的制備1.表達(dá)載體的構(gòu)建從含有從暴發(fā)性肝炎患者中分離的丙型肝炎病毒JFH1株(基因型為2a)的全長基因組cDNA的JFH1克隆(Kato，T.，et al，J.Med.Vitrol.64(2001)p334-339)中，獲得與該病毒株總的基因組區(qū)域?qū)?yīng)的DNA，將其插入在已經(jīng)插入到pUC19質(zhì)粒中的T7RNA啟動子序列的下游。具體來說，將JFH1株的病毒RNA擴(kuò)增后的RT-PCR片段克隆入pGEM-T EASY vector(Promega)中，得到pGEM1-258、pGEM44-486、pGEM317-849、pGEM617-1323、pGEM1141-2367、pGEM2285-3509、pGEM3471-4665、pGEM4547-5970、pGEM5883-7003、pGEM6950-8035、pGEM7984-8892、pGEM8680-9283、pGEM9231-9634和pGEM9594-9678各質(zhì)粒(Kato，T.，et al，Gastroenterology，125(2003)p.1808-1817)。使用PCR法和限制性內(nèi)切酶連接該各質(zhì)粒中所含的病毒基因組cDNA，克隆全長基因組cDNA，在上游插入T7R RNA啟動子序列，得到JFH克隆(pJFH1)(圖1)。此外，pJFH1的全長cDNA序列登錄在國際DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ/EMBL/GenBank)中，登錄號為AB047639。
接下來，針對pJFH1中的NS5B區(qū)(堿基序列序列號2；氨基酸序列序列號3)，將該區(qū)域編碼的相當(dāng)于RNA聚合酶活性中心的氨基酸基序GDD突變?yōu)镚ND導(dǎo)入突變，制備突變質(zhì)?？寺JFH1/GND。由于其編碼NS5B蛋白質(zhì)的活性中心發(fā)生了突變，所以突變質(zhì)?？寺JFH1/GND不能表達(dá)HCV RNA的復(fù)制所必須的活性NS5B蛋白質(zhì)。
接下來，制備缺失JFH1的E1區(qū)到E2區(qū)的pJFH1/ΔE1-E2。此外，將不同于JFH1株的J6CF株(GenBank Accession No.AF177036)以及JCH1(Kato，T.，et al，J.Med.Vitrol.64(2001)p334-339)的全長HCV cDNA插入到已經(jīng)插入在pUC19質(zhì)粒中的T7RNA啟動子序列的下游，制備pJ6CF和p JCH1。進(jìn)而，以JFH1的NS5B取代p JCH1的編碼NS5B的區(qū)域，制備p JCH1/NS5B(jfh1)。
2.HCV基因組RNA的制備為了制備用于RNA合成的模板DNA，分別將上述構(gòu)建的pJFH1、pJFH1/GND、pJFH1/ΔE1-E2、pJ6CF、p JCH1、以及p JCH1/NS5B(jfh1)用限制性內(nèi)切酶XbaI切斷。然后，分別將10～20μg的這些XbaI酶切片段與20U的Mung Bean Nuclease(總反應(yīng)溶液量為50μl)在30℃下孵育30分鐘。Mung Bean Nuclease為催化對雙鏈DNA中的單鏈部分進(jìn)行選擇性分解的反應(yīng)的酶。通常，如果直接將上述XbaI酶切片段作為模板使用進(jìn)行RNA合成，則作為XbaI的識別序列的一部分的4個堿基CUGA就會使合成的復(fù)制子RNA在3’末端添加了多余部分。因此，在本實施例中，通過以Mung Bean Nuclease處理XbaI酶切片段，將4個堿基CUGA從XbaI酶切片段中除去。然后，通過依照常規(guī)方法對含有XbaI酶切片段的Mung Bean Nuclease處理后的溶液進(jìn)行除蛋白質(zhì)的處理，純化除去4個堿基CUGA后的XbaI酶切片段，將其作為模板DNA。
接下來，以該模板DNA在體外合成RNA。使用Ambion公司的MEGAscript，將20μl含有0.5～1.0μg模板DNA的反應(yīng)溶液在37℃下反應(yīng)3小時～16小時，進(jìn)行RNA的合成。
RNA合成后，向反應(yīng)溶液中添加DNase(2U)，在37℃下反應(yīng)15分鐘后，再以酸性酚進(jìn)行RNA的抽提，除去模板DNA。這樣，將由pJFH1和pJFH1/GND來源的上述模板DNA合成的HCV RNA分別命名為rJFH1、rJFH1/GND、rJFH1/ΔE1-E2、rJ6CF、rJCH1、以及rJCH1/NS5B(jfh1)。
這些HCV RNA為，rJFH1是以GenBank Accession No.AB047639的DNA為模板而制備的RNA，rJFH1/GND是以將GenBank AccessionNo.AB047639的第8618位的G取代為A后的DNA為模板而制備的RNA，rJFH1/ΔE1-E2是以將GenBank Accession No.AB047639的序列989-2401序列缺失后的DNA為模板而制備的RNA，pJ6CF是以GenBank Accession No.AF177036的DNA為模板而制備的RNA，pJCH1是以GenBank Accession No.AB047640的DNA為模板而制備的RNA，rJCH1/NS5B(jfh1)是以將GenBank Accession No.AB047640的DNA序列1-3866和GenBank Accession No.AB047639的DNA序列3867-9678的序列利用限制性內(nèi)切酶Avr II的位點連接后的DNA為模板而制備的RNA，其堿基序列能夠被確認(rèn)。
在細(xì)胞內(nèi)的HCV基因組RNA復(fù)制細(xì)胞和HCV病毒顆粒的產(chǎn)生1.在細(xì)胞內(nèi)的HCV基因組復(fù)制和HCV病毒顆粒的產(chǎn)生分別制備上述的合成全長HCV基因組RNA(rJFH1、rJFH1/GND)，使其RNA總量為10μg。然后以電穿孔法將該混合RNA導(dǎo)入Huh7細(xì)胞內(nèi)。將進(jìn)行電穿孔處理后的Huh7細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12小時、24小時、48小時、72小時后，回收細(xì)胞，從細(xì)胞中提取RNA，通過Northern blot的方法進(jìn)行分析。Northern blot分析依照Molecular Cloning，a Laboratory Manual，2nd edition，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis著，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)中所述的進(jìn)行。將從細(xì)胞中提取的RNA進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將該RNA轉(zhuǎn)印到正電荷尼龍膜上。用由pJFH1制備的32P標(biāo)記的DNA或者RNA探針對上述轉(zhuǎn)印到膜上的RNA進(jìn)行雜交，然后洗凈該膜，讓該膜使膠片感光，由此檢測除HCV基因組特異的RNA條帶。
如圖2所示，當(dāng)轉(zhuǎn)染JFH1/GND時，在轉(zhuǎn)染4小時后，能夠確認(rèn)有弱信號的導(dǎo)入的RNA條帶，信號隨著時間的推移而減弱，在24小時后幾乎不能確認(rèn)條帶的信號。
另一方面，當(dāng)轉(zhuǎn)染rJFH1時，雖然在轉(zhuǎn)染后4小時～12小時后，導(dǎo)入的RNA條帶的信號強(qiáng)度與導(dǎo)入JFH1/GND時幾乎相同地暫時減弱，但是在24小時以后仍然能夠確認(rèn)清楚的RNA條帶的信號。該信號是HCV所特異的。即，認(rèn)為導(dǎo)入的一部分rJFH1 RNA進(jìn)行了復(fù)制和增殖。在RNA復(fù)制酶NS5B的活性基序發(fā)生突變后的rJFH1/GND中則看不到復(fù)制，確認(rèn)NS5B的活性對HCV的全長RNA的復(fù)制使重要的。此外，發(fā)明人在從慢性肝炎分離的JCH1株(Kato，T.，et al，J.Med.Vitrol.69(2001)p334-339)中進(jìn)行了同樣的實驗，在該株中完全不能確認(rèn)HCV RNA的復(fù)制。
2.HCV蛋白質(zhì)的檢測以常規(guī)方法從轉(zhuǎn)染了rJFH1或者rJFH1/GND RNA的細(xì)胞中經(jīng)時提取蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析。在分析時，以含有NS3、NS5A、Core或者E2基因的表達(dá)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，將得到的細(xì)胞提取液作為陽性對照(NS3蛋白質(zhì))。進(jìn)而，將從未轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)作為陰性對照。將從每個細(xì)胞克隆中提取的蛋白質(zhì)試樣印記在PVDF膜(Immobilon-P，Millipore公司生產(chǎn))上，使用抗NS3特異性抗體(Dr.Moradpour惠贈；Wolk B，et al，J.Virology.2000；742293-2304)、抗NS5A特異性抗體(將JFH1的NS5A區(qū)插入到表達(dá)載體中，在小鼠中使用DNA免疫法制備)、抗Core特異性抗體(克隆2H9抗體)、抗E2特異性抗體(合成JFH1 E2區(qū)的GTTTVGGAVARSTN(序列號4)和CDLEDRDRSQLSPL(序列號5)的肽，以2個合成肽免疫兔子而制備)，檢測JFH1 RNA編碼的NS3、NS5A、Core以及E2蛋白質(zhì)。此外，使用抗actin抗體檢測actin蛋白質(zhì)，作為內(nèi)對照。
如圖3所示，確認(rèn)在轉(zhuǎn)染了rJFH1的細(xì)胞中，從轉(zhuǎn)染24小時后開始，能夠檢測出NS3、NS5A、Core以及E2蛋白質(zhì)，表達(dá)量經(jīng)時增加。另一方面，在轉(zhuǎn)染了rJFH1/GND的細(xì)胞或者未轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞中，未檢測出NS3、NS5A、Core以及E2蛋白質(zhì)，表明被轉(zhuǎn)染后的rJFH1因自主復(fù)制而表達(dá)其蛋白質(zhì)。
從以上的1和2的結(jié)果可確認(rèn)，在轉(zhuǎn)染rJFH1而建立的細(xì)胞中，rJFH1被復(fù)制。
3.HCV核心蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液中的檢測將以電穿孔將rJFH1、rJFH1/GND、rJFH1/ΔE1-E2、rJ6CF、以及rJCH1進(jìn)行細(xì)胞導(dǎo)入后的Huh7細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2小時、12小時、24小時、48小時、72小時后，測定培養(yǎng)液中的HCV核心蛋白質(zhì)。使用Ortho HCV抗原IRMA實驗(Aoyagi et al.，J.Clin.Microbiol.，37(1999)p.1802-1808)進(jìn)行測定。
如圖4所示，從轉(zhuǎn)染rJFH1 48小時開始到72小時后的培養(yǎng)液中，檢測出核心蛋白質(zhì)。另一方面，在轉(zhuǎn)染了rJFH1/GND、rJ6CF、以及rJCH1的細(xì)胞的培養(yǎng)液中，沒有檢測出HCV核心蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)染了rJFH1/ΔE1-E2的細(xì)胞的培養(yǎng)液中，檢測出少量的HCV核心蛋白質(zhì)。rJFH1/GND、rJ6CF、以及rJCH1在Huh7細(xì)胞中不能自主復(fù)制，rJFH1和rJFH1/ΔE1-E2在Huh7細(xì)胞中能夠自主復(fù)制。因此表明，導(dǎo)入的HCV RNA的自主復(fù)制對于核心蛋白質(zhì)的釋放是必須的，并且，E1和E2對于使核心蛋白質(zhì)向細(xì)胞外穩(wěn)定大量地釋放是必須的。
4.HCV在轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液中的檢測為了分析在上述實施例中釋放到培養(yǎng)液中的核心蛋白質(zhì)是否是作為病毒顆粒被分泌的，將轉(zhuǎn)染rJFH1 6天后的培養(yǎng)液以蔗糖密度梯度進(jìn)行分離。將60％(重量/重量)蔗糖溶液(溶解于50mM Tris pH7.5/0.1MNaCl/1mM EDTA中)2ml、50％蔗糖溶液1ml、40％蔗糖溶液1ml、30％蔗糖溶液1ml、20％蔗糖溶液1ml、10％蔗糖溶液1ml層加于離心管中，然后層加4ml樣品培養(yǎng)上清。使用貝克曼轉(zhuǎn)子SW41Ti，以400000RPM在4℃下離心16小時，離心結(jié)束后，從離心管底開始每部分回收0.5ml。定量各部分的密度、HCV核心蛋白質(zhì)的密度、HCV RNA拷貝數(shù)。以定量RT-PCR檢測復(fù)制子RNA依照Takeuchi等的方法(Takeuchi，T.，et al，Gastroenterology，116636-642(1999))，通過檢測HCV RNA的5’非翻譯區(qū)的RNA而進(jìn)行的。具體來說，使用以下的合成引物和EZ rTth RNA kit(Applied Biosystems)，對從細(xì)胞中提取的RNA中所含的復(fù)制子RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過ABI Prism 7700sequence detector system(Applied Biosystems)檢測。
R6-130-S175’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’(序列號6)
R6-290-R195’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’(序列號7)TagMan Probe，R6-148-S21FT5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(序列號8)如圖5所示，在1.17mg/ml的部分中，核心蛋白質(zhì)與HCV RNA的峰一致。該部分的密度約為1.17mg/ml，該比重小于此前報告的核心蛋白質(zhì)與核酸的結(jié)合物的比重。如果存在于1.17mg/ml的部分的核心蛋白質(zhì)與HCV RNA形成了HCV病毒顆粒結(jié)構(gòu)，則認(rèn)為其對核酸酶具有抗性。由此，將轉(zhuǎn)染rJFH1 6天后的培養(yǎng)液以10μg/ml的RNase A處理20分鐘后，通過蔗糖密度梯度進(jìn)行分離。
其結(jié)果如圖5B所示，HCV RNA被分解，如RNase A未處理時那樣，在1.17mg/ml的部分中，檢測出核心蛋白質(zhì)與HCV RNA的峰。即，確認(rèn)存在于1.17mg/ml的部分的核心蛋白質(zhì)與HCV RNA形成了HCV病毒顆粒結(jié)構(gòu)。
進(jìn)而，將培養(yǎng)液以0.25％的NP40處理后進(jìn)行同樣的分離，核心蛋白質(zhì)與HCV RNA的峰的比重變?yōu)?.28mg/ml(圖5C)。進(jìn)而，如果在以0.25％的NP40處理的同時進(jìn)行RNase A處理，則HCV RNA的峰消失(圖5D)。即，認(rèn)為含脂質(zhì)比重小的外膜通過NP40從病毒的表面剝離，變成未保持病毒樣結(jié)構(gòu)的僅由核酸和核心蛋白質(zhì)構(gòu)成的Core顆粒，比重變大。
由以上確認(rèn)，通過將rJFH1轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中，病毒RNA進(jìn)行復(fù)制，進(jìn)而形成病毒顆粒，分泌到培養(yǎng)液中。
5.培養(yǎng)液中的病毒顆粒的感染實驗對通過將rJFH1轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中而分泌到培養(yǎng)液中的病毒顆粒是否具有感染性進(jìn)行了研究。將rJFH1或者rJFH1/ΔE1-E2轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中3天后，回收培養(yǎng)上清。將回收的培養(yǎng)上清進(jìn)行離心，回收離心上清，再以0.45μm的濾膜過濾。在該培養(yǎng)液存在下，培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染RNA的Huh7細(xì)胞，在48小時后，以抗Core抗體或者抗NS5A抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。如圖6A所示，在將rJFH1轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中得到的培養(yǎng)液存在下培養(yǎng)的細(xì)胞中，在細(xì)胞內(nèi)觀察到核心蛋白質(zhì)和NS5A蛋白質(zhì)的表達(dá)。另一方面，在將rJFH1/ΔE1-E2轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中得到的培養(yǎng)液的存在下培養(yǎng)的細(xì)胞中，在細(xì)胞內(nèi)沒有觀察到核心蛋白質(zhì)和NS5A蛋白質(zhì)的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
接下來，將rJFH1轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中3天后，回收培養(yǎng)上清，使用超濾膜(cut off 1×105Da)濃縮30倍。以100μl濃縮后的含有HCV病毒顆粒的培養(yǎng)液在15mm蓋玻片上培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染RNA的Huh7細(xì)胞，48小時后以抗Core抗體進(jìn)行免疫染色，計數(shù)抗Core抗體染色陽性，即，感染細(xì)胞，如圖6B所示，確認(rèn)了394.0±26.5個感染細(xì)胞(占總細(xì)胞數(shù)的0.51％)。因此確認(rèn)，該感染是由將rJFH1轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中而分泌到培養(yǎng)液中的HCV病毒顆粒所引起的。即，將用于感染的培養(yǎng)液進(jìn)行UV處理，或者使用不經(jīng)過RNA轉(zhuǎn)染的過程而制備的培養(yǎng)液，在15mm蓋玻片上培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞，48小時后以抗Core抗體進(jìn)行免疫染色，計數(shù)感染細(xì)胞。其結(jié)果為，在UV處理下，感染細(xì)胞驟減，在使用不經(jīng)過RNA轉(zhuǎn)染的過程而制備的培養(yǎng)液時，確認(rèn)沒有感染的細(xì)胞。
進(jìn)而，研究了感染的HCV病毒顆粒是否在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行RNA擴(kuò)增，將新的HCV病毒顆粒釋放到培養(yǎng)液中。將rJFH1轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中48小時后的培養(yǎng)液濃縮，在100μl該濃縮后的含有HCV病毒顆粒的培養(yǎng)液中培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染RNA的Huh7細(xì)胞，每天回收細(xì)胞、培養(yǎng)液，回收RNA，以上述方法對HCV RNA進(jìn)行定量。其結(jié)果為，如圖6C所示，在細(xì)胞內(nèi)，HCV RNA擴(kuò)增了一定量，在上清中，HCV RNA量逐日增加。另一方面，使用將rJFH1/ΔE1-E2轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中得到的培養(yǎng)液進(jìn)行同樣的研究，在細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)液中均無法檢測出HCVRNA。
由這些結(jié)果確認(rèn)，通過將rJFH1轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中而分泌到培養(yǎng)液中的HCV病毒顆粒具有感染能力，而且具有在感染的細(xì)胞中擴(kuò)增HCV RNA，產(chǎn)生新的HCV病毒顆粒的能力。
6.使用rJCH1/NS5B(jfh1)制備HCV病毒顆粒對通過將rJCH1/NS5B(jfh1)轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中是否能夠?qū)CV病毒顆粒分泌到培養(yǎng)液中，分泌的HCV病毒顆粒是否具有感染性進(jìn)行了研究。將rJCH1/NS5B(jfh1)轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中6天后的培養(yǎng)液以5.中所述方法進(jìn)行濃縮后，在該培養(yǎng)液存在下，培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染RNA的Huh7細(xì)胞，經(jīng)時定量HCV RNA量，從培養(yǎng)開始后12小時后開始，細(xì)胞內(nèi)的HCV RNA量經(jīng)時增加(圖7A)。進(jìn)而，在15mm蓋玻片上培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染RNA的Huh7細(xì)胞，在濃縮后的培養(yǎng)液的存在下培養(yǎng)48小時后，以抗Core抗體進(jìn)行免疫染色，計數(shù)抗Core抗體染色陽性，即，感染細(xì)胞，如圖7B所示，確認(rèn)了感染細(xì)胞。這些結(jié)果表示，通過將rJCH1/NS5B(jfh1)轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中而分泌到培養(yǎng)液中的HCV病毒顆粒獲得了感染能力，而且具有在感染的細(xì)胞中擴(kuò)增HCV RNA，產(chǎn)生新的HCV病毒顆粒的能力。
因此，對于從患者分離的HCV株這樣的在體外不具有自主復(fù)制能力的株，通過將該株的NS5B區(qū)取代為rJFH1的NS5B，就能夠使其在培養(yǎng)細(xì)胞系中自主復(fù)制、產(chǎn)生HCV病毒顆粒。
1.使用Con1/C-NS2/JFH-1制備HCV病毒顆粒對通過將含有HCV基因型1b的Con-1株和JFH-1的NS5B部分的嵌合HCV RNA轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中是否能夠?qū)CV病毒顆粒分泌到培養(yǎng)液中，分泌的HCV病毒顆粒是否具有感染性進(jìn)行了研究。
制備了如下構(gòu)建體將HCV基因型1b的Con-1株的基因編號1～1026的序列(Con-1株的Core、E1、E2、p7、以及NS2區(qū))連接于JFH-1株的5’UTR下游，其下游連接JFH-1株的1031～3030的區(qū)域(NS3～NS5b)，進(jìn)而在其下游連接JFH-1株的3’UTR。使用該構(gòu)建體，以實施例1的2中所述方法制備r Con1/C-NS2/JFH-1嵌合HCVRNA，以實施例2的1中所述方法，將RNA轉(zhuǎn)染入Huh7中。將HCVRNA轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中，經(jīng)時測定上清中的核心蛋白質(zhì)，從大約48小時以后開始，在上清中檢測出核心蛋白質(zhì)，確認(rèn)在細(xì)胞上清中產(chǎn)生了HCV病毒顆粒。然后，將該上清以超濾膜濃縮20倍之后，將濃縮液添加于Huh7細(xì)胞中。培養(yǎng)48小時后，以兔抗NS3抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色。
其結(jié)果為，在mock和rJFH-1/ΔEE1-E2中，沒有觀察到抗NS3抗體陽性細(xì)胞，而在rJFH-1和rCon1/C-NS2/JFH-1中，檢測出抗NS3抗體陽性細(xì)胞。由以上結(jié)果能夠確認(rèn)，rCon1/C-NS2/JFH-1與rJFH-1一樣，能夠產(chǎn)生感染性HCV病毒顆粒。
全長嵌合HCV基因組RNA來源的全長嵌合HCV復(fù)制子RNA的制備
(1)表達(dá)載體的構(gòu)建制備將含有從暴發(fā)性肝炎患者中分離的丙型肝炎病毒JFH-1株(基因型為2a)的全長基因組cDNA的DNA(JFH-1克隆序列號9)插入在已經(jīng)插入到pUC19質(zhì)粒中的T7RNA啟動子序列的下游的質(zhì)粒DNA。
具體來說，將JFH-1株的病毒RNA擴(kuò)增后的RT-PCR片段克隆入pGEM-T EASY載體(Promega)中，得到pGEM1-258、pGEM44-486、pGEM317-849、pGEM617-1323、pGEM1141-2367、pGEM2285-3509、pGEM3471-4665、pGEM4547-5970、pGEM5883-7003、pGEM6950-8035、pGEM7984-8892、pGEM8680-9283、pGEM9231-9634和pGEM9594-9678的各質(zhì)粒DNA(Kato，T.，et al，Gastroenterology，(2003)125p.1808-1817)。使用PCR法和限制性內(nèi)切酶連接該各質(zhì)粒中所含的病毒基因組RNA來源的cDNA，克隆全長的病毒基因組cDNA。全長的病毒基因組的上游插入了T7R RNA啟動子序列。以下，將這樣構(gòu)建的質(zhì)粒DNA稱為pJFH1。此外，關(guān)于上述JFH-1克隆的制備，記述于特開2002-171978號以及Kato等(Kato，T.，et al，J.Med.Vitrol.(2001)64(3)p.334-339)中。此外，pJFH1克隆的全長cDNA的堿基序列登錄在國際DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ/EMBL/GenBank)中，登錄號為AB047639。
然后，在質(zhì)粒DNA pJFH1的5’非翻譯區(qū)與core區(qū)之間，插入EMCV-IRES(腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點)及新霉素抗性基因(neo；也稱為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)，構(gòu)建質(zhì)粒DNA pFGREP-JFH1。該構(gòu)建步驟依照Ikeda(Ikeda et al，J.Vitrol.(2002)76(6)p.2997-3006)。
(2)嵌合表達(dá)載體的構(gòu)建JFH株是HCV2a型來源的HCV，使用HCV1b型來源的TH株(Wakita et al.，J.Biol.Chem..，(1994)269，p.14205-14210，和Moradpour et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(1998)246，p.920-924)制備嵌合HCV載體。將上述所制備的pFGREP-JFH1的Core、E1、E2、p7部分取代為TH株來源的Core、E1、E2、p7，制備嵌合HCV、pFGREP-TH/JFH1。
此外，在本說明書中，上述JFH1株(JFH-1克隆來源)的全長以及在嵌合體中使用的TH株的部分RNA序列(含有HCV TH株的從5’非翻譯區(qū)到NS3區(qū)的一部分的部分基因組RNA序列(1-3748))分別表示于序列表的序列號9和10中。在上述JFH-1株的全長基因組RNA序列(序列號9)中，“5’非翻譯區(qū)”對應(yīng)于1～340、“核心蛋白質(zhì)編碼序列”對應(yīng)于341～913、“E1蛋白質(zhì)編碼序列”對應(yīng)于914～1489、“E2蛋白質(zhì)編碼序列”對應(yīng)于1490～2590、“NS2蛋白質(zhì)編碼序列”對應(yīng)于2780～3430、“NS3蛋白質(zhì)編碼序列”對應(yīng)于3431～5323、“NS4A蛋白質(zhì)編碼序列”對應(yīng)于5324～5486、“NS4B蛋白質(zhì)編碼序列”對應(yīng)于5487～6268、“NS5A蛋白質(zhì)編碼序列”對應(yīng)于6269～7663、“NS5B蛋白質(zhì)編碼序列”對應(yīng)于7664～9442。
(3)全長嵌合HCV復(fù)制子RNA的制備為了制備用于合成全長嵌合HCV復(fù)制子RNA的模板DNA，將上述構(gòu)建的表達(dá)載體pFGREP-TH/JFH1以限制性內(nèi)切酶XbaI切斷。然后，以10～20μg該XbaI酶切片段制成50μl反應(yīng)溶液，使用20U的Mung Bean Nuclease在30℃下孵育30分鐘，由此進(jìn)一步處理。MungBean Nuclease為催化對雙鏈DNA中的單鏈部分進(jìn)行選擇性分解反應(yīng)的酶。通常，如果直接將上述XbaI酶切片段作為模板使用進(jìn)行RNA合成，則作為XbaI的識別序列的一部分的4個堿基CUGA就會使合成的復(fù)制子RNA在3’末端添加了多余部分。因此，在本實施例中，通過以Mung Bean Nuclease處理XbaI酶切片段，將4個堿基CUGA從XbaI酶切片段中除去。然后，通過依照常規(guī)方法對含有XbaI酶切片段的Mung Bean Nuclease處理后的溶液進(jìn)行除蛋白質(zhì)的處理，純化除去4個堿基CUGA后的XbaI酶切片段，將其作為模板DNA。
接下來，使用T7RNA聚合酶以該模板DNA在體外合成RNA。使用Ambion公司的MEGAscript用于RNA的合成。依照生產(chǎn)商的使用說明書，使20μl含有0.5～1.0μg模板DNA的反應(yīng)溶液進(jìn)行反應(yīng)。
RNA合成后，向反應(yīng)溶液中添加DNAse(2U)，在37℃下反應(yīng)15分鐘后，再以酸性酚進(jìn)行RNA的抽提，除去模板DNA。這樣，將由pFGREP-TH/JFH1來源的上述模板DNA合成的HCV RNA命名為rFGREP-TH/JFH1。該rFGREP-TH/JFH1中的嵌合HCV基因組RNA的堿基序列如序列號11所示。rFGREP-TH/JFH1是本發(fā)明的全長嵌合HCV復(fù)制子RNA的一個例子。
全長嵌合HCV復(fù)制子RNA的復(fù)制細(xì)胞的制備和細(xì)胞克隆的建立(1)全長嵌合HCV基因組RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)將上述合成的全長嵌合HCV復(fù)制子RNA(rFGREP-TH/JFH1)以多種劑量與從Huh7細(xì)胞中提取的細(xì)胞總RNA混合，使其總量為10μg。然后，以電穿孔法將該RNA導(dǎo)入Huh7細(xì)胞中。培養(yǎng)16小時～24小時后，以多種濃度添加G418。每周更換2次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)21天后，以結(jié)晶紫對存活細(xì)胞進(jìn)行染色。計測被染色的集落，計算每單位重量的轉(zhuǎn)染RNA得到的集落數(shù)量。此外，將一部分培養(yǎng)皿中存活的細(xì)胞集落進(jìn)行克隆化，繼續(xù)培養(yǎng)。從克隆化的細(xì)胞中分別提取RNA、基因組DNA、蛋白質(zhì)后，研究全長嵌合HCV復(fù)制子RNA的檢測、新霉素抗性基因重組進(jìn)入基因組DNA的有無、HCV蛋白質(zhì)的表達(dá)。這些結(jié)果的詳細(xì)內(nèi)容在下述中表示。
(2)集落形成能力上述轉(zhuǎn)染的結(jié)果為，即使在G418濃度為1.0mg/ml時，也能夠觀察到細(xì)胞集落的形成。認(rèn)為這是由于rFGREP-TH/JFH1復(fù)制子RNA的自主復(fù)制，新霉素抗性基因持續(xù)表達(dá)，持續(xù)維持了G418抗性，結(jié)果使轉(zhuǎn)染了rFGREP-TH/JFH1復(fù)制子RNA的Huh7細(xì)胞具有集落形成能力，細(xì)胞能夠增殖。
培養(yǎng)上清中的嵌合HCV病毒的感染培養(yǎng)上清中的嵌合HCV病毒顆粒的感染實驗回收將rFGREP-TH/JFH1轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中建立的全長嵌合HCV復(fù)制子RNA復(fù)制細(xì)胞克隆的培養(yǎng)上清，將該培養(yǎng)上清再添加于未感染的Huh7細(xì)胞中，使培養(yǎng)上清中的病毒顆粒感染Huh7細(xì)胞。在感染的第二天，向Huh7細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加0.3mg/ml的G418，再培養(yǎng)21天。培養(yǎng)結(jié)束后將細(xì)胞固定，以結(jié)晶紫進(jìn)行染色后，在使用轉(zhuǎn)染rFGREP-TH/JFH1得到的全長嵌合HCV復(fù)制子RNA復(fù)制細(xì)胞克隆的培養(yǎng)上清而被感染細(xì)胞中，觀察到集落形成。該結(jié)果表示，從轉(zhuǎn)染rFGREP-TH/JFH1得到的全長嵌合HCV復(fù)制子RNA復(fù)制細(xì)胞克隆中產(chǎn)生了感染性的HCV，而且，該HCV保持著對新細(xì)胞的感染性。
HCV病毒顆粒的純化(1)凝膠過濾在圖11中表示了通過凝膠過濾層析，HCV病毒顆粒在各部分中的分布。使用的凝膠載體為Sephacryl(注冊商標(biāo))S300、S400和S500。采用分別含有上述凝膠載體的柱層析，對用于柱層析的含有HCV病毒顆粒的溶液進(jìn)行純化。在純化時使用的緩沖液為10mM Tris鹽酸鹽、1mM乙二胺四乙酸和100mM氯化鈉(pH8.0)。其結(jié)果為，在使用Sephacryl(注冊商標(biāo))S300時，在稱為Void部分的通過部分中得到HCV病毒顆粒，因此，通過使用Sephacryl(注冊商標(biāo))S300能夠分離分子量小的蛋白質(zhì)，改變?nèi)芤旱柠}濃度。此時，HCV核心蛋白質(zhì)/總蛋白質(zhì)量的比率變?yōu)?.78，相比于純化前的HCV病毒顆粒，HCV顆粒在總蛋白質(zhì)中所占比率升高了。另一方面，在使用Sephacryl(注冊商標(biāo))S400和S500時，由于HCV存在于依據(jù)分子量的不同被洗脫下來的部分中，所以能夠?qū)⑵渑c其他分子量的蛋白質(zhì)分離。
(2)離子交換層析在圖12中表示了通過離子交換層析，HCV病毒顆粒在各部分中的分布。使用的載體為SP Sepharose HP(注冊商標(biāo))和Q Sepharose HP(注冊商標(biāo))。
在采用使用了SP Sepharose HP(注冊商標(biāo))的柱時，以50mM的檸檬酸緩沖液(pH6.2)對柱進(jìn)行平衡。將使用截留分子量為100000～500000的超濾膜進(jìn)行濃縮、以50mM檸檬酸緩沖液(pH6.2)稀釋后的含有HCV病毒顆粒的溶液添加在柱上，然后將50mM檸檬酸緩沖液(pH6.2)以10倍柱容量左右流過柱子。然后，分別將添加了0.1MNaCl、0.3M NaCl、或1M NaCl的50mM檸檬酸緩沖液(pH6.2)以柱容量的3倍左右依次流過柱子。然后，將添加了1M NaCl的50mM檸檬酸緩沖液(pH6.2)以柱容量的5倍左右流過柱子(1M NaCl W部分)。其結(jié)果為，HCV病毒顆粒在添加了0.1M NaCl的50mM檸檬酸緩沖液(pH6.2)部分中被洗脫下來。
在采用Q Sepharose HP(注冊商標(biāo))時，以50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)對柱進(jìn)行平衡。將使用截留分子量為100000～500000的超濾膜進(jìn)行濃縮、以50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)稀釋后的含有HCV病毒顆粒的溶液添加在柱上，然后將50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)以10倍柱容量左右流過柱子。然后，分別將添加了0.1MNaCl、0.3M NaCl、或1M NaCl的50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)以柱容量的3倍左右依次流過柱子。然后，將添加了1M NaCl的50mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)以柱容量的5倍左右流過柱子(1M NaCl W部分)。其結(jié)果為，HCV病毒顆粒在添加了0.3M NaCl的50mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)部分中被洗脫下來。此時，HCV核心蛋白質(zhì)/總蛋白質(zhì)量的比率變?yōu)?.32，相比于純化前的HCV病毒顆粒，HCV顆粒在總蛋白質(zhì)中所占比率升高了。
(3)親和層析在圖13中表示了通過親和層析，HCV病毒顆粒在各部分中的分布。親和層析使用分別接合有RCA-120、ConA、LCA、以及WGA的載體。
在采用ConA、LCA、以及WGA親和層析時，以磷酸鹽緩沖生理鹽水對柱進(jìn)行平衡。將使用截留分子量為100000～500000的超濾膜進(jìn)行濃縮、以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋后的含有HCV病毒顆粒的溶液添加在柱上，然后將磷酸鹽緩沖生理鹽水以10倍柱容量左右流過柱子。然后，將添加了0.35M乳糖的磷酸鹽緩沖生理鹽水以柱容量的3倍左右流過柱子。然后，將添加了0.5M乳糖的磷酸鹽緩沖生理鹽水以柱容量的5倍左右流過柱子。其結(jié)果為，在采用LCA和ConA親和層析時，HCV沒有與載體特異接合。在采用WGA親和層析時，HCV病毒顆粒在添加了0.35M乳糖的磷酸鹽緩沖生理鹽水部分中被洗脫下來。
在采用RCA-120親和層析時，以磷酸鹽緩沖生理鹽水對柱進(jìn)行平衡。將使用截留分子量為100000～500000的超濾膜進(jìn)行濃縮、以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋后的含有HCV病毒顆粒的溶液添加在柱上，然后將磷酸鹽緩沖生理鹽水以10倍柱容量左右流過柱子。然后，將添加了0.38M乳糖的磷酸鹽緩沖生理鹽水以柱容量的3倍左右流過柱子。然后，將添加了0.38M乳糖的磷酸鹽緩沖生理鹽水以柱容量的5倍左右流過柱子。在采用RCA-120親和層析時，HCV病毒顆粒在添加了0.38M乳糖的磷酸鹽緩沖生理鹽水部分中被洗脫下來。
在圖14中表示了通過肝素、硫酸化cellulofine層析，HCV病毒顆粒在各部分中的分布。
在每次層析中，以20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)對柱進(jìn)行平衡。將使用截留分子量為100000～500000的超濾膜進(jìn)行濃縮、以20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋后的含有HCV病毒顆粒的溶液添加在柱上，然后將20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以10倍柱容量左右流過柱子。然后，分別將添加了0.1M NaCl、0.3M NaCl、或1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以柱容量的3倍左右依次流過柱子。然后，將添加了1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以柱容量的5倍左右流過柱子。其結(jié)果為，在采用肝素親和層析時，HCV病毒顆粒在添加了0.3M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)部分中被洗脫下來。此時，HCV核心蛋白質(zhì)/總蛋白質(zhì)量的比率變?yōu)?.36，相比于純化前的HCV病毒顆粒，HCV顆粒在總蛋白質(zhì)中所占比率降低了。在采用硫酸化cellulofine層析時，HCV病毒顆粒在添加了0.1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)部分中被洗脫下來。
在圖15中表示了通過藍(lán)染料親和層析(blue dye affinitychromatography)，HCV病毒顆粒在各部分中的分布。
在藍(lán)染料親和層析中，將Cibacron Blue F3G-A結(jié)合于瓊脂糖顆粒的載體用于柱子。以20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)對柱進(jìn)行平衡。將使用截留分子量為100000～500000的超濾膜進(jìn)行濃縮、以20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋后的含有HCV病毒顆粒的溶液添加在柱上，然后將磷酸鹽緩沖生理鹽水以10倍柱容量左右流過柱子。然后，分別將添加了1M NaCl或2M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以柱容量的3倍左右依次流過柱子。然后，將添加了2M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以柱容量的5倍左右流過柱子。其結(jié)果為，HCV病毒顆粒在柱不結(jié)合部分中被洗脫下來。此時，HCV核心蛋白質(zhì)/總蛋白質(zhì)量的比率變?yōu)?.33，相比于純化前的HCV病毒顆粒，HCV顆粒在總蛋白質(zhì)中所占比率降升高了。
(4)蔗糖密度梯度離心參考上述實施例，將柱層析和蔗糖密度梯度離心組合，進(jìn)行HCV病毒顆粒的純化。
首先，使用Q Sepharose HP(注冊商標(biāo))進(jìn)行HCV病毒顆粒的純化。以50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)對柱進(jìn)行平衡。將使用截留分子量為100000～500000的超濾膜進(jìn)行濃縮、以50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)稀釋后的含有HCV病毒顆粒的溶液添加在柱上，然后將50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)以10倍柱容量左右流過柱子。然后，分別將添加了0.1M NaCl、0.3M NaCl、或1M NaCl的50mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)以柱容量的3倍左右依次流過柱子。然后，將添加了1M NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)以柱容量的5倍左右流過柱子(1M NaCl W部分)。如圖16A所示，HCV病毒顆粒在添加了0.3M NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)部分中、添加了1M NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)部分中、以及1M NaClW部分中洗脫下來。收集含有HCV病毒顆粒的部分，此時，HCV核心蛋白質(zhì)/總蛋白質(zhì)量的比率變?yōu)?.29，相比于純化前的HCV病毒顆粒，HCV顆粒在總蛋白質(zhì)中所占比率升高了。
然后，使用硫酸化cellulofine層析對HCV進(jìn)行純化。在每次層析中，以20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)對柱進(jìn)行平衡。將使用Q SepharoseHP(注冊商標(biāo))純化后的含有HCV病毒顆粒的部分，使用截留分子量為100000～500000的超濾膜進(jìn)行濃縮，以20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋，將稀釋后的含有HCV病毒顆粒的溶液添加在柱上，然后將磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以10倍柱容量左右流過柱子。然后，分別將添加了0.25M NaCl或1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以柱容量的3倍左右依次流過柱子。然后，將添加了1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)以柱容量的5倍左右流過柱子。如圖16B所示，HCV病毒顆粒主要在添加了1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)部分中洗脫下來。在添加了1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，HCV核心蛋白質(zhì)/總蛋白質(zhì)量的比率變?yōu)?1.4，相比于純化前的HCV病毒顆粒，HCV顆粒在總蛋白質(zhì)中所占比率提高了。
進(jìn)而，進(jìn)行蔗糖密度梯度離心。將使用硫酸化cellulofine層析后的添加了1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)部分使用截留分子量為100000～500000的超濾膜進(jìn)行濃縮，以TEN緩沖液(10mM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)、0.1M氯化鈉、1mM乙二胺四乙酸(pH8.0))稀釋。將含有HCV病毒顆粒的溶液層加在已層加好的60％、50％、40％、30％、20％、10％蔗糖溶液上，在4℃下以390k×g離心18小時。由于HCV集中在比重大約為1.2的部分中，所以收集該部分。在收集的部分中，HCV核心蛋白質(zhì)/總蛋白質(zhì)量的比率變?yōu)?.69，相比于純化前的HCV病毒顆粒，HCV顆粒在總蛋白質(zhì)中所占比率升高了。
通過蔗糖密度梯度離心純化的含有HCV病毒顆粒的部分，相比于開始純化前，HCV核心蛋白質(zhì)/總蛋白質(zhì)量的比率被純化達(dá)到120倍左右。在最終的部分中，含有109copies/mL的HCV。
在本說明書中引用的全部出版物、專利以及專利申請，作為直接的參考納入到本說明書中。
工業(yè)實用性通過本發(fā)明，能夠在培養(yǎng)細(xì)胞系中生產(chǎn)各種基因型的HCV株的病毒顆粒。即，即使對于從患者分離的HCV株這樣的在體外不具有自主復(fù)制能力的HCV株，通過將其編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列部分取代為JFH1的編碼從NS3開始的NS4、NS5A、NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列部分，就能夠使其在培養(yǎng)細(xì)胞系中自主復(fù)制，產(chǎn)生HCV病毒顆粒。以本發(fā)明純化的HCV病毒顆粒能夠直接用作醫(yī)療用途的疫苗。本發(fā)明提供的HCV基因組RNA或病毒顆粒也能夠用作外源基因的病毒載體。此外，本發(fā)明的方法也能夠用作HCV感染過程的研究、影響HCV的感染過程的各種物質(zhì)的篩選系統(tǒng)。
序列表自由內(nèi)容序列號1JFH1株的編碼NS3、NS4、NS5A和NS5B蛋白質(zhì)的RNA部分序列(cDNA序列)序列號2JFH1的NS5B蛋白質(zhì)編碼序列(cDNA序列)序列號3JFH1的NS5B蛋白質(zhì)序列號4基于JFH1 E2區(qū)設(shè)計的合成肽序列號5基于JFH1 E2區(qū)設(shè)計的合成肽序列號6引物(R6-130-S17)序列號7引物(R6-290-S19)序列號8TaqMan探針(R6-148-S21FT)序列號9HCV JFH1株(JFH-1克隆)的全長基因組RNA序列號10HCV TH株的包含從5’非翻譯區(qū)到NS3區(qū)的部分的基因組RNA
序列號11由HCV JFH1株(JFH-1克隆)的基因組RNA和HCVTH株的基因組RNA構(gòu)成的嵌合HCV基因組RNA。
序列表<110>Tokyo Metropolitan Organization for Medical ResearchToray Industries Inc.
<120>具有自主復(fù)制能力的經(jīng)修飾的人丙型肝炎病毒基因組RNA<130>PH-2565-PCT<140>
<141>
<150>JP 2004-290801<151>2004-10-01<150>JP 2004-243975<151>2004-08-24<150>JP 2005-069527<151>2005-03-11<150>JP 2005-069725<151>2005-03-11<160>11<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>6013<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<220>
<223>InventorWakita，TakajiInventorKato，TakanobuInventorDate，TomokoInventorBartenchlager，RalfInventorTanabe，JunichiInventorSone，Saburou<220>
<223>編碼JFH1的NS3到NS5蛋白質(zhì)的序列(cDNA序列)<400>1
gctcccatca ctgcttatgc ccagcaaaca cgaggcctcc tgggcgccat agtggtgagt 60atgacggggc gtgacaggac agaacaggcc ggggaagtcc aaatcctgtc cacagtctct 120cagtccttcc tcggaacaac catctcgggg gttttgtgga ctgtttacca cggagctggc 180aacaagactc tagccggctt acggggtccg gtcacgcaga tgtactcgag tgctgagggg 240gacttggtag gctggcccag cccccctggg accaagtctt tggagccgtg caagtgtgga 300gccgtcgacc tatatctggt cacgcggaac gctgatgtca tcccggctcg gagacgcggg 360gacaagcggg gagcattgct ctccccgaga cccatttcga ccttgaaggg gtcctcgggg 420gggccggtgc tctgccctag gggccacgtc gttgggctct tccgagcagc tgtgtgctct 480cggggcgtgg ccaaatccat cgatttcatc cccgttgaga cactcgacgt tgttacaagg 540tctcccactt tcagtgacaa cagcacgcca ccggctgtgc cccagaccta tcaggtcggg 600tacttgcatg ctccaactgg cagtggaaag agcaccaagg tccctgtcgc gtatgccgcc 660caggggtaca aagtactagt gcttaacccc tcggtagctg ccaccctggg gtttggggcg 720tacctatcca aggcacatgg catcaatccc aacattagga ctggagtcag gaccgtgatg 780accggggagg ccatcacgta ctccacatat ggcaaatttc tcgccgatgg gggctgcgct 840agcggcgcct atgacatcat catatgcgat gaatgccacg ctgtggatgc tacctccatt 900ctcggcatcg gaacggtcct tgatcaagca gagacagccg gggtcagact aactgtgctg 960gctacggcca caccccccgg gtcagtgaca accccccatc ccgatataga agaggtaggc 1020ctcgggcggg agggtgagat ccccttctat gggagggcga ttcccctatc ctgcatcaag 1080ggagggagac acctgatttt ctgccactca aagaaaaagt gtgacgagct cgcggcggcc 1140cttcggggca tgggcttgaa tgccgtggca tactatagag ggttggacgt ctccataata 1200ccagctcagg gagatgtggt ggtcgtcgcc accgacgccc tcatgacggg gtacactgga 1260gactttgact ccgtgatcga ctgcaatgta gcggtcaccc aagctgtcga cttcagcctg 1320gaccccacct tcactataac cacacagact gtcccacaag acgctgtctc acgcagtcag 1380cgccgcgggc gcacaggtag aggaagacag ggcacttata ggtatgtttc cactggtgaa 1440cgagcctcag gaatgtttga cagtgtagtg ctttgtgagt gctacgacgc aggggctgcg 1500tggtacgatc tcacaccagc ggagaccacc gtcaggctta gagcgtattt caacacgccc 1560ggcctacccg tgtgtcaaga ccatcttgaa ttttgggagg cagttttcac cggcctcaca 1620cacatagacg cccacttcct ctcccaaaca aagcaagcgg gggagaactt cgcgtaccta 1680gtagcctacc aagctacggt gtgcgccaga gccaaggccc ctcccccgtc ctgggacgcc 1740atgtggaagt gcctggcccg actcaagcct acgcttgcgg gccccacacc tctcctgtac 1800cgtttgggcc ctattaccaa tgaggtcacc ctcacacacc ctgggacgaa gtacatcgcc 1860acatgcatgc aagctgacct tgaggtcatg accagcacgt gggtcctagc tggaggagtc 1920ctggcagccg tcgccgcata ttgcctggcg actggatgcg tttccatcat cggccgcttg 1980cacgtcaacc agcgagtcgt cgttgcgccg gataaggagg tcctgtatga ggcttttgat 2040gagatggagg aatgcgcctc tagggcggct ctcatcgaag aggggcagcg gatagccgag 2100atgttgaagt ccaagatcca aggcttgctg cagcaggcct ctaagcaggc ccaggacata 2160caacccgcta tgcaggcttc atggcccaaa gtggaacaat tttgggccag acacatgtgg 2220aacttcatta gcggcatcca atacctcgca ggattgtcaa cactgccagg gaaccccgcg 2280gtggcttcca tgatggcatt cagtgccgcc ctcaccagtc cgttgtcgac cagtaccacc 2340atccttctca acatcatggg aggctggtta gcgtcccaga tcgcaccacc cgcgggggcc 2400accggctttg tcgtcagtgg cctggtgggg gctgccgtgg gcagcatagg cctgggtaag 2460gtgctggtgg acatcctggc aggatatggt gcgggcattt cgggggccct cgtcgcattc 2520aagatcatgt ctggcgagaa gccctctatg gaagatgtca tcaatctact gcctgggatc 2580ctgtctccgg gagccctggt ggtgggggtc atctgcgcgg ccattctgcg ccgccacgtg 2640ggaccggggg agggcgcggt ccaatggatg aacaggctta ttgcctttgc ttccagagga 2700aaccacgtcg cccctactca ctacgtgacg gagtcggatg cgtcgcagcg tgtgacccaa 2760
ctacttggct ctcttactat aaccagccta ctcagaagac tccacaattg gataactgag 2820gactgcccca tcccatgctc cggatcctgg ctccgcgacg tgtgggactg ggtttgcacc 2880atcttgacag acttcaaaaa ttggctgacc tctaaattgt tccccaagct gcccggcctc 2940cccttcatct cttgtcaaaa ggggtacaag ggtgtgtggg ccggcactgg catcatgacc 3000acgcgctgcc cttgcggcgc caacatctct ggcaatgtcc gcctgggctc tatgaggatc 3060acagggccta aaacctgcat gaacacctgg caggggacct ttcctatcaa ttgctacacg 3120gagggccagt gcgcgccgaa accccccacg aactacaaga ccgccatctg gagggtggcg 3180gcctcggagt acgcggaggt gacgcagcat gggtcgtact cctatgtaac aggactgacc 3240actgacaatc tgaaaattcc ttgccaacta ccttctccag agtttttctc ctgggtggac 3300ggtgtgcaga tccataggtt tgcacccaca ccaaagccgt ttttccggga tgaggtctcg 3360ttctgcgttg ggcttaattc ctatgctgtc gggtcccagc ttccctgtga acctgagccc 3420gacgcagacg tattgaggtc catgctaaca gatccgcccc acatcacggc ggagactgcg 3480gcgcggcgct tggcacgggg atcacctcca tctgaggcga gctcctcagt gagccagcta 3540tcagcaccgt cgctgcgggc cacctgcacc acccacagca acacctatga cgtggacatg 3600gtcgatgcca acctgctcat ggagggcggt gtggctcaga cagagcctga gtccagggtg 3660cccgttctgg actttctcga gccaatggcc gaggaagaga gcgaccttga gccctcaata 3720ccatcggagt gcatgctccc caggagcggg tttccacggg ccttaccggc ttgggcacgg 3780cctgactaca acccgccgct cgtggaatcg tggaggaggc cagattacca accgcccacc 3840gttgctggtt gtgctctccc cccccccaag aaggccccga cgcctccccc aaggagacgc 3900cggacagtgg gtctgagcga gagcaccata tcagaagccc tccagcaact ggccatcaag 3960acctttggcc agcccccctc gagcggtgat gcaggctcgt ccacgggggc gggcgccgcc 4020gaatccggcg gtccgacgtc ccctggtgag ccggccccct cagagacagg ttccgcctcc 4080tctatgcccc ccctcgaggg ggagcctgga gatccggacc tggagtctga tcaggtagag 4140cttcaacctc ccccccaggg ggggggggta gctcccggtt cgggctcggg gtcttggtct 4200acttgctccg aggaggacga taccaccgtg tgctgctcca tgtcatactc ctggaccggg 4260gctctaataa ctccctgtag ccccgaagag gaaaagttgc caatcaaccc tttgagtaac 4320tcgctgttgc gataccataa caaggtgtac tgtacaacat caaagagcgc ctcacagagg 4380gctaaaaagg taacttttga caggacgcaa gtgctcgacg cccattatga ctcagtctta 4440aaggacatca agctagcggc ttccaaggtc agcgcaaggc tcctcacctt ggaggaggcg 4500tgccagttga ctccacccca ttctgcaaga tccaagtatg gattcggggc caaggaggtc 4560cgcagcttgt ccgggagggc cgttaaccac atcaagtccg tgtggaagga cctcctggaa 4620gacccacaaa caccaattcc cacaaccatc atggccaaaa atgaggtgtt ctgcgtggac 4680cccgccaagg ggggtaagaa accagctcgc ctcatcgttt accctgacct cggcgtccgg 4740gtctgcgaga aaatggccct ctatgacatt acacaaaagc ttcctcaggc ggtaatggga 4800gcttcctatg gcttccagta ctcccctgcc caacgggtgg agtatctctt gaaagcatgg 4860gcggaaaaga aggaccccat gggtttttcg tatgataccc gatgcttcga ctcaaccgtc 4920actgagagag acatcaggac cgaggagtcc atataccagg cctgctccct gcccgaggag 4980gcccgcactg ccatacactc gctgactgag agactttacg taggagggcc catgttcaac 5040agcaagggtc aaacctgcgg ttacagacgt tgccgcgcca gcggggtgct aaccactagc 5100atgggtaaca ccatcacatg ctatgtgaaa gccctagcgg cctgcaaggc tgcggggata 5150gttgcgccca caatgctggt atgcggcgat gacctagtag tcatctcaga aagccagggg 5220actgaggagg acgagcggaa cctgagagcc ttcacggagg ccatgaccag gtactctgcc 5280cctcctggtg atccccccag accggaatat gacctggagc taataacatc ctgttcctca 5340aatgtgtctg tggcgttggg cccgcggggc cgccgcagat actacctgac cagagaccca 5400accactccac tcgcccgggc tgcctgggaa acagttagac actcccctat caattcatgg 5460ctgggaaaca tcatccagta tgctccaacc atatgggttc gcatggtcct aatgacacac 5520
ttcttctcca ttctcatggt ccaagacacc ctggaccaga acctcaactt tgagatgtat 5580ggatcagtat actccgtgaa tcctttggac cttccagcca taattgagag gttacacggg 5640cttgacgcct tttctatgca cacatactct caccacgaac tgacgcgggt ggcttcagcc 5700ctcagaaaac ttggggcgcc acccctcagg gtgtggaaga gtcgggctcg cgcagtcagg 5760gcgtccctca tctcccgtgg agggaaagcg gccgtttgcg gccgatatct cttcaattgg 5820gcggtgaaga ccaagctcaa actcactcca ttgccggagg cgcgcctact ggacttatcc 5880agttggttca ccgtcggcgc cggcgggggc gacatttttc acagcgtgtc gcgcgcccga 5940ccccgctcat tactcttcgg cctactccta cttttcgtag gggtaggcct cttcctactc 6000cccgctcggt aga 6013<210>2<211>1773<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(1773)<220>
<223>編碼JFH1的NS3到NS5蛋白質(zhì)的序列(cDNA序列)<400>2tcc atg tca tac tcc tgg acc ggg gct cta ata act ccc tgt agc ccc48Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ser Pro1 5 10 15gaa gag gaa aag ttg cca atc aac cct ttg agt aac tcg ctg ttg cga96Glu Glu Glu Lys Leu Pro Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg20 25 30tac cat aac aag gtg tac tgt aca aca tca aag agc gcc tca cag agg144Tyr His Asn Lys Val Tyr Cys Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Gln Arg35 40 45gct aaa aag gta act ttt gac agg acg caa gtg ctc gac gcc cat tat192Ala Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Thr Gln Val Leu Asp Ala His Tyr50 55 60gac tca gtc tta aag gac atc aag cta gcg gct tcc aag gtc agc gca240Asp Ser Val Leu Lys Asp Ile Lys Leu Ala Ala Ser Lys Val Ser Ala65 70 75 80agg ctc ctc acc ttg gag gag gcg tgc cag ttg act cca ccc cat tct288
Arg Leu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Cys Gln Leu Thr Pro Pro His Ser85 90 95gca aga tcc aag tat gga ttc ggg gcc aag gag gtc cgc agc ttg tcc336Ala Arg Ser Lys Tyr Gly Phe Gly Ala Lys Glu Val Arg Ser Leu Ser100 105 110ggg agg gcc gtt aac cac atc aag tcc gtg tgg aag gac ctc ctg gaa384Gly Arg Ala Val Asn His Ile Lys Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu115 120 125gac cca caa aca cca att ccc aca acc atc atg gcc aaa aat gag gtg432Asp Pro Gln Thr Pro Ile Pro Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val130 135 140ttc tgc gtg gac ccc gcc aag ggg ggt aag aaa cca gct cgc ctc atc480Phe Cys Val Asp Pro Ala Lys Gly Gly Lys Lys Pro Ala Arg Leu Ile145 150 155 160gtt tac cct gac ctc ggc gtc cgg gtc tgc gag aaa atg gcc ctc tat528Val Tyr Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr165 170 175gac att aca caa aag ctt cct cag gcg gta atg gga gct tcc tat ggc576Asp Ile Thr Gln Lys Leu Pro Gln Ala Val Met Gly Ala Ser Tyr Gly180 185 190ttc cag tac tcc cct gcc caa cgg gtg gag tat ctc ttg aaa gca tgg624Phe Gln Tyr Ser Pro Ala Gln Arg Val Glu Tyr Leu Leu Lys Ala Trp195 200 205gcg gaa aag aag gac ccc atg ggt ttt tcg tat gat acc cga tgc ttc672Ala Glu Lys Lys Asp Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe210 215 220gac tca acc gtc act gag aga gac atc agg acc gag gag tcc ata tac720Asp Ser Thr Val Thr Glu Arg Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ser Ile Tyr225 230 235 240cag gcc tgc tcc ctg ccc gag gag gcc cgc act gcc ata cac tcg ctg768Gln Ala Cys Ser Leu Pro Glu Glu Ala Arg Thr Ala Ile His Ser Leu245 250 255act gag aga ctt tac gta gga ggg ccc atg ttc aac agc aag ggt caa816Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Met Phe Asn Ser Lys Gly Gln260 265 270
acc tgc ggt tac aga cgt tgc cgc gcc agc ggg gtg cta acc act agc864Thr Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser275 280 285atg ggt aac acc atc aca tgc tat gtg aaa gcc cta gcg gcc tgc aag912Met Gly Asn Thr Ile Thr Cys Tyr Val Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys290 295 300gct gcg ggg ata gtt gcg ccc aca atg ctg gta tgc ggc gat gac cta960Ala Ala Gly Ile Val Ala Pro Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu305 310 315 320gta gtc atc tca gaa agc cag ggg act gag gag gac gag cgg aac ctg1008Val Val Ile Ser Glu Ser Gln Gly Thr Glu Glu Asp Glu Arg Asn Leu325 330 335aga gcc ttc acg gag gcc atg acc agg tac tct gcc cct cct ggt gat1056Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp340 345 350ccc ccc aga ccg gaa tat gac ctg gag cta ata aca tcc tgt tcc tca1104Pro Pro Arg Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser355 360 365aat gtg tct gtg gcg ttg ggc ccg cgg ggc cgc cgc aga tac tac ctg1152Asn Val Ser Val Ala Leu Gly Pro Arg Gly Arg Arg Arg Tyr Tyr Leu370 375 380acc aga gac cca acc act cca ctc gcc cgg gct gcc tgg gaa aca gtt1200Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Val385 390 395 400aga cac tcc cct atc aat tca tgg ctg gga aac atc atc cag tat gct1248Arg His Ser Pro Ile Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Gln Tyr Ala405 410 415cca acc ata tgg gtt cgc atg gtc cta atg aca cac ttc ttc tcc att1296Pro Thr Ile Trp Val Arg Met Val Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile420 425 430ctc atg gtc caa gac acc ctg gac cag aac ctc aac ttt gag atg tat1344Leu Met Val Gln Asp Thr Leu Asp Gln Asn Leu Asn Phe Glu Met Tyr435 440 445gga tca gta tac tcc gtg aat cct ttg gac ctt cca gcc ata att gag1392
Gly Ser Val Tyr Ser Val Asn Pro Leu Asp Leu Pro Ala Ile Ile Glu450 455 460agg tta cac ggg ctt gac gcc ttt tct atg cac aca tac tct cac cac1440Arg Leu His Gly Leu Asp Ala Phe Ser Met His Thr Tyr Ser His His465 470 475 480gaa ctg acg cgg gtg gct tca gcc ctc aga aaa ctt ggg gcg cca ccc1488Glu Leu Thr Arg Val Ala Ser Ala Leu Arg Lys Leu Gly Ala Pro Pro485 490 495ctc agg gtg tgg aag agt cgg gct cgc gca gtc agg gcg tcc ctc atc1536Leu Arg Val Trp Lys Ser Arg Ala Arg Ala Val Arg Ala Ser Leu Ile500 505 510tcc cgt gga ggg aaa gcg gcc gtt tgc ggc cga tat ctc ttc aat tgg1584Ser Arg Gly Gly Lys Ala Ala Val Cys Gly Arg Tyr Leu Phc Asn Trp515 520 525gcg gtg aag acc aag ctc aaa ctc act cca ttg ccg gag gcg cgc cta1632Ala Val Lys Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Leu Pro Glu Ala Arg Leu530 535 540ctg gac tta tcc agt tgg ttc acc gtc ggc gcc ggc ggg ggc gac att1680Leu Asp Leu Ser Ser Trp Phe Thr Val Gly Ala Gly Gly Gly Asp Ile545 550 555 560ttt cac agc gtg tcg cgc gcc cga ccc cgc tca tta ctc ttc ggc cta1728Phe His Ser Val Ser Arg Ala Arg Pro Arg Ser Leu Leu Phe Gly Leu565 570 575ctc cta ctt ttc gta ggg gta ggc ctc ttc cta ctc ccc gct cgg1773Leu Leu Leu Phe Val Gly Val Gly Leu Phe Leu Leu Pro Ala Arg580 585 590<210>3<211>591<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<220>
<223>JFH1的NS5B蛋白質(zhì)<400>3Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ser Pro
1 5 10 15Glu Glu Glu Lys Leu Pro Ile Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg20 25 30Tyr His Asn Lys Val Tyr Cys Thr Thr Ser Lys Ser Ala Ser Gln Arg35 40 45Ala Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Thr Gln Val Leu Asp Ala His Tyr50 55 60Asp Ser Val Leu Lys Asp Ile Lys Leu Ala Ala Ser Lys Val Ser Ala65 70 75 80Arg Leu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Cys Gln Leu Thr Pro Pro His Ser85 90 95Ala Arg Ser Lys Tyr Gly Phe Gly Ala Lys Glu Val Arg Ser Leu Ser100 105 110Gly Arg Ala Val Asn His Ile Lys Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu115 120 125Asp Pro Gln Thr Pro Ile Pro Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val130 135 140Phe Cys Val Asp Pro Ala Lys Gly Gly Lys Lys Pro Ala Arg Leu Ile145 150 155 160Val Tyr Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr165 170 175Asp Ile Thr Gln Lys Leu Pro Gln Ala Val Met Gly Ala Ser Tyr Gly180 185 190Phe Gln Tyr Ser Pro Ala Gln Arg Val Glu Tyr Leu Leu Lys Ala Trp195 200 205Ala Glu Lys Lys Asp Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe210 215 220Asp Ser Thr Val Thr Glu Arg Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ser Ile Tyr225 230 235 240Gln Ala Cys Ser Leu Pro Glu Glu Ala Arg Thr Ala Ile His Ser Leu245 250 255
Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Met Phe Asn Ser Lys Gly Gln260 265 270Thr Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser275 280 285Met Gly Asn Thr Ile Thr Cys Tyr Val Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys290 295 300Ala Ala Gly Ile Val Ala Pro Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu305 310 315 320Val Val Ile Ser Glu Ser Gln Gly Thr Glu Glu Asp Glu Arg Asn Leu325 330 335Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp340 345350Pro Pro Arg Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser355 360 365Asn Val Ser Val Ala Leu Gly Pro Arg Gly Arg Arg Arg Tyr Tyr Leu370 375 380Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Val385 390 395 400Arg His Ser Pro Ile Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Gln Tyr Ala405 410 415Pro Thr Ile Trp Val Arg Met Val Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile420 425 430Leu Met Val Gln Asp Thr Leu Asp Gln Asn Leu Asn Phe Glu Met Tyr435 440 445Gly Ser Val Tyr Ser Val Asn Pro Leu Asp Leu Pro Ala Ile Ile Glu450 455 460Arg Leu His Gly Leu Asp Ala Phe Ser Met His Thr Tyr Ser His His465 470 475 480Glu Leu Thr Arg Val Ala Ser Ala Leu Arg Lys Leu Gly Ala Pro Pro485 490 495
Leu Arg Val Trp Lys Ser Arg Ala Arg Ala Val Arg Ala Ser Leu Ile500 505 510Ser Arg Gly Gly Lys Ala Ala Val Cys Gly Arg Tyr Leu Phe Asn Trp515 520 525Ala Val Lys Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Leu Pro Glu Ala Arg Leu530 535 540Leu Asp Leu Ser Ser Trp Phe Thr Val Gly Ala Gly Gly Gly Asp Ile545 550 555 560Phe His Ser Val Ser Arg Ala Arg Pro Arg Ser Leu Leu Phe Gly Leu565 570 575Leu Leu Leu Phe Val Gly Val Gly Leu Phe Leu Leu Pro Ala Arg580 585 590<210>4<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述基于JFH1 E2片段設(shè)計的合成肽<400>4Gly Thr Thr Thr Val Gly Gly Ala Val Ala Ara Ser Thr Asn1 5 10<210>5<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述基于JFH1 E2片段設(shè)計的合成肽<400>5Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Gln Leu Ser Pro Leu1 5 10
<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物(R6-130-S17)<400>6cgggagagcc atagtgg 17<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物(R6-290-R19)<400>7agtaccacaa ggcctttcg 19<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述TaqMan探針(R6-148-S21FT)<400>8ctgcggaacc ggtgagtaca c21<210>9<211>9707<212>RNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<223>源于JFH1株的全長丙型肝炎病毒基因組RNA(JFH-1克隆)
<400>9gaauucuaau acgacucacu auagaccugc cccuaauagg ggcgacacuc cgccaugaau 60cacuccccug ugaggaacua cugucuucac gcagaaagcg ccuagccaug gcguuaguau 120gagugucgua cagccuccag gccccccccu cccgggagag ccauaguggu cugcggaacc 180ggugaguaca ccggaauugc cgggaagacu ggguccuuuc uuggauaaac ccacucuaug 240cccggccauu ugggcgugcc cccgcaagac ugcuagccga guagcguugg guugcgaaag 300gccuuguggu acugccugau agggcgcuug cgagugcccc gggaggucuc guagaccgug 360caccaugagc acaaauccua aaccucaaag aaaaaccaaa agaaacacca accgucgccc 420agaagacguu aaguucccgg gcggcggcca gaucguuggc ggaguauacu uguugccgcg 480caggggcccc agguugggug ugcgcacgac aaggaaaacu ucggagcggu cccagccacg 540ugggagacgc cagcccaucc ccaaagaucg gcgcuccacu ggcaaggccu ggggaaaacc 600aggucgcccc uggccccuau augggaauga gggacucggc ugggcaggau ggcuccuguc 660cccccgaggc ucucgccccu ccuggggccc cacugacccc cggcauaggu cgcgcaacgu 720ggguaaaguc aucgacaccc uaacgugugg cuuugccgac cucauggggu acauccccgu 780cguaggcgcc ccgcuuagug gcgccgccag agcugucgcg cacggcguga gaguccugga 840ggacgggguu aauuaugcaa cagggaaccu acccgguuuc cccuuuucua ucuucuugcu 900ggcccuguug uccugcauca ccguuccggu cucugcugcc caggugaaga auaccaguag 960cagcuacaug gugaccaaug acugcuccaa ugacagcauc acuuggcagc ucgaggcugc 1020gguucuccac guccccgggu gcgucccgug cgagagagug gggaauacgu cacgguguug 1080ggugccaguc ucgccaaaca uggcugugcg gcagcccggu gcccucacgc agggucugcg 1140gacgcacauc gauaugguug ugauguccgc caccuucugc ucugcucucu acguggggga 1200ccucuguggc ggggugaugc ucgcggccca gguguucauc gucucgccgc aguaccacug 1260guuugugcaa gaaugcaauu gcuccaucua cccuggcacc aucacuggac accgcauggc 1320augggacaug augaugaacu ggucgcccac ggccaccaug auccuggcgu acgugaugcg 1380cguccccgag gucaucauag acaucguuag cggggcucac uggggcguca uguucggcuu 1440ggccuacuuc ucuaugcagg gagcgugggc gaaggucauu gucauccuuc ugcuggccgc 1500ugggguggac gcgggcacca ccaccguugg aggcgcuguu gcacguucca ccaacgugau 1560ugccggcgug uucagccaug gcccucagca gaacauucag cucauuaaca ccaacggcag 1620uuggcacauc aaccguacug ccuugaauug caaugacucc uugaacaccg gcuuucucgc 1680ggccuuguuc uacaccaacc gcuuuaacuc gucagggugu ccagggcgcc uguccgccug 1740ccgcaacauc gaggcuuucc ggauagggug gggcacccua caguacgagg auaaugucac 1800caauccagag gauaugaggc cguacugcug gcacuacccc ccaaagccgu guggcguagu 1860ccccgcgagg ucugugugug gcccagugua cuguuucacc cccagcccgg uaguaguggg 1920cacgaccgac agacguggag ugcccaccua cacaugggga gagaaugaga cagaugucuu 1980ccuacugaac agcacccgac cgccgcaggg cucaugguuc ggcugcacgu ggaugaacuc 2040cacugguuuc accaagacuu guggcgcgcc accuugccgc accagagcug acuucaacgc 2100cagcacggac uuguugugcc cuacggauug uuuuaggaag cauccugaug ccacuuauau 2160uaaguguggu ucugggcccu ggcucacacc aaagugccug guccacuacc cuuacagacu 2220cuggcauuac cccugcacag ucaauuuuac caucuucaag auaagaaugu auguaggggg 2280gguugagcac aggcucacgg ccgcaugcaa cuucacucgu ggggaucgcu gcgacuugga 2340ggacagggac aggagucagc ugucuccucu guugcacucu accacggaau gggccauccu 2400gcccugcacc uacucagacu uacccgcuuu gucaacuggu cuucuccacc uucaccagaa 2460caucguggac guacaauaca uguauggccu cucaccugcu aucacaaaau acgucguucg 2520augggagugg gugguacucu uauuccugcu cuuagcggac gccagagucu gcgccugcuu 2580guggaugcuc aucuuguugg gccaggccga agcagcauug gagaaguugg ucgucuugca 2640cgcugcgagu gcggcuaacu gccauggccu ccuauauuuu gccaucuucu ucguggcagc 2700
uuggcacauc aggggucggg ugguccccuu gaccaccuau ugccucacug gccuauggcc 2760cuucugccua cugcucaugg cacugccccg gcaggcuuau gccuaugacg caccugugca 2820cggacagaua ggcguggguu uguugauauu gaucacccuc uucacacuca ccccggggua 2880uaagacccuc cucggccagu gucuguggug guugugcuau cuccugaccc ugggggaagc 2940caugauucag gaguggguac cacccaugca ggugcgcggc ggccgcgaug gcaucgcgug 3000ggccgucacu auauucugcc cggguguggu guuugacauu accaaauggc uuuuggcguu 3060gcuugggccu gcuuaccucu uaagggccgc uuugacacau gugccguacu ucgucagagc 3120ucacgcucug auaaggguau gcgcuuuggu gaagcagcuc gcggggggua gguauguuca 3180gguggcgcua uuggcccuug gcagguggac uggcaccuac aucuaugacc accucacacc 3240uaugucggac ugggccgcua gcggccugcg cgacuuagcg gucgccgugg aacccaucau 3300cuucaguccg auggagaaga aggucaucgu cuggggagcg gagacggcug caugugggga 3360cauucuacau ggacuucccg uguccgcccg acucggccag gagauccucc ucggcccagc 3420ugauggcuac accuccaagg gguggaagcu ccuugcuccc aucacugcuu augcccagca 3480aacacgaggc cuccugggcg ccauaguggu gaguaugacg gggcgugaca ggacagaaca 3540ggccggggaa guccaaaucc uguccacagu cucucagucc uuccucggaa caaccaucuc 3600ggggguuuug uggacuguuu accacggagc uggcaacaag acucuagccg gcuuacgggg 3660uccggucacg cagauguacu cgagugcuga gggggacuug guaggcuggc ccagcccccc 3720ugggaccaag ucuuuggagc cgugcaagug uggagccguc gaccuauauc uggucacgcg 3780gaacgcugau gucaucccgg cucggagacg cggggacaag cggggagcau ugcucucccc 3840gagacccauu ucgaccuuga agggguccuc gggggggccg gugcucugcc cuaggggcca 3900cgucguuggg cucuuccgag cagcugugug cucucggggc guggccaaau ccaucgauuu 3960cauccccguu gagacacucg acguuguuac aaggucuccc acuuucagug acaacagcac 4020gccaccggcu gugccccaga ccuaucaggu cggguacuug caugcuccaa cuggcagugg 4080aaagagcacc aaggucccug ucgcguaugc cgcccagggg uacaaaguac uagugcuuaa 4140ccccucggua gcugccaccc ugggguuugg ggcguaccua uccaaggcac auggcaucaa 4200ucccaacauu aggacuggag ucaggaccgu gaugaccggg gaggccauca cguacuccac 4260auauggcaaa uuucucgccg augggggcug cgcuagcggc gccuaugaca ucaucauaug 4320cgaugaaugc cacgcugugg augcuaccuc cauucucggc aucggaacgg uccuugauca 4380agcagagaca gccgggguca gacuaacugu gcuggcuacg gccacacccc ccgggucagu 4440gacaaccccc caucccgaua uagaagaggu aggccucggg cgggagggug agauccccuu 4500cuaugggagg gcgauucccc uauccugcau caagggaggg agacaccuga uuuucugcca 4560cucaaagaaa aagugugacg agcucgcggc ggcccuucgg ggcaugggcu ugaaugccgu 4620ggcauacuau agaggguugg acgucuccau aauaccagcu cagggagaug ugguggucgu 4680cgccaccgac gcccucauga cgggguacac uggagacuuu gacuccguga ucgacugcaa 4740uguagcgguc acccaagcug ucgacuucag ccuggacccc accuucacua uaaccacaca 4800gacuguccca caagacgcug ucucacgcag ucagcgccgc gggcgcacag guagaggaag 4860acagggcacu uauagguaug uuuccacugg ugaacgagcc ucaggaaugu uugacagugu 4920agugcuuugu gagugcuacg acgcaggggc ugcgugguac gaucucacac cagcggagac 4980caccgucagg cuuagagcgu auuucaacac gcccggccua cccguguguc aagaccaucu 5040ugaauuuugg gaggcaguuu ucaccggccu cacacacaua gacgcccacu uccucuccca 5100aacaaagcaa gcgggggaga acuucgcgua ccuaguagcc uaccaagcua cggugugcgc 5160cagagccaag gccccucccc cguccuggga cgccaugugg aagugccugg cccgacucaa 5220gccuacgcuu gcgggcccca caccucuccu guaccguuug ggcccuauua ccaaugaggu 5280cacccucaca cacccuggga cgaaguacau cgccacaugc augcaagcug accuugaggu 5340caugaccagc acgugggucc uagcuggagg aguccuggca gccgucgccg cauauugccu 5400ggcgacugga ugcguuucca ucaucggccg cuugcacguc aaccagcgag ucgucguugc 5460
gccggauaag gagguccugu augaggcuuu ugaugagaug gaggaaugcg ccucuagggc 5520ggcucucauc gaagaggggc agcggauagc cgagauguug aaguccaaga uccaaggcuu 5580gcugcagcag gccucuaagc aggcccagga cauacaaccc gcuaugcagg cuucauggcc 5640caaaguggaa caauuuuggg ccagacacau guggaacuuc auuagcggca uccaauaccu 5700cgcaggauug ucaacacugc cagggaaccc cgcgguggcu uccaugaugg cauucagugc 5760cgcccucacc aguccguugu cgaccaguac caccauccuu cucaacauca ugggaggcug 5820guuagcgucc cagaucgcac cacccgcggg ggccaccggc uuugucguca guggccuggu 5880gggggcugcc gugggcagca uaggccuggg uaaggugcug guggacaucc uggcaggaua 5940uggugcgggc auuucggggg cccucgucgc auucaagauc augucuggcg agaagcccuc 6000uauggaagau gucaucaauc uacugccugg gauccugucu ccgggagccc uggugguggg 6060ggucaucugc gcggccauuc ugcgccgcca cgugggaccg ggggagggcg cgguccaaug 6120gaugaacagg cuuauugccu uugcuuccag aggaaaccac gucgccccua cucacuacgu 6180gacggagucg gaugcgucgc agcgugugac ccaacuacuu ggcucucuua cuauaaccag 6240ccuacucaga agacuccaca auuggauaac ugaggacugc cccaucccau gcuccggauc 6300cuggcuccgc gacguguggg acuggguuug caccaucuug acagacuuca aaaauuggcu 6360gaccucuaaa uuguucccca agcugcccgg ccuccccuuc aucucuuguc aaaaggggua 6420caagggugug ugggccggca cuggcaucau gaccacgcgc ugcccuugcg gcgccaacau 6480cucuggcaau guccgccugg gcucuaugag gaucacaggg ccuaaaaccu gcaugaacac 6540cuggcagggg accuuuccua ucaauugcua cacggagggc cagugcgcgc cgaaaccccc 6600cacgaacuac aagaccgcca ucuggagggu ggcggccucg gaguacgcgg aggugacgca 6660gcaugggucg uacuccuaug uaacaggacu gaccacugac aaucugaaaa uuccuugcca 6720acuaccuucu ccagaguuuu ucuccugggu ggacggugug cagauccaua gguuugcacc 6780cacaccaaag ccguuuuucc gggaugaggu cucguucugc guugggcuua auuccuaugc 6840ugucgggucc cagcuucccu gugaaccuga gcccgacgca gacguauuga gguccaugcu 6900aacagauccg ccccacauca cggcggagac ugcggcgcgg cgcuuggcac ggggaucacc 6960uccaucugag gcgagcuccu cagugagcca gcuaucagca ccgucgcugc gggccaccug 7020caccacccac agcaacaccu augacgugga cauggucgau gccaaccugc ucauggaggg 7080cgguguggcu cagacagagc cugaguccag ggugcccguu cuggacuuuc ucgagccaau 7140ggccgaggaa gagagcgacc uugagcccuc aauaccaucg gagugcaugc uccccaggag 7200cggguuucca cgggccuuac cggcuugggc acggccugac uacaacccgc cgcucgugga 7260aucguggagg aggccagauu accaaccgcc caccguugcu gguugugcuc uccccccccc 7320caagaaggcc ccgacgccuc ccccaaggag acgccggaca gugggucuga gcgagagcac 7380cauaucagaa gcccuccagc aacuggccau caagaccuuu ggccagcccc ccucgagcgg 7440ugaugcaggc ucguccacgg gggcgggcgc cgccgaaucc ggcgguccga cguccccugg 7500ugagccggcc cccucagaga cagguuccgc cuccucuaug cccccccucg agggggagcc 7560uggagauccg gaccuggagu cugaucaggu agagcuucaa ccuccccccc aggggggggg 7620gguagcuccc gguucgggcu cggggucuug gucuacuugc uccgaggagg acgauaccac 7680cgugugcugc uccaugucau acuccuggac cggggcucua auaacucccu guagccccga 7740agaggaaaag uugccaauca acccuuugag uaacucgcug uugcgauacc auaacaaggu 7800guacuguaca acaucaaaga gcgccucaca gagggcuaaa aagguaacuu uugacaggac 7860gcaagugcuc gacgcccauu augacucagu cuuaaaggac aucaagcuag cggcuuccaa 7920ggucagcgca aggcuccuca ccuuggagga ggcgugccag uugacuccac cccauucugc 7980aagauccaag uauggauucg gggccaagga gguccgcagc uuguccggga gggccguuaa 8040ccacaucaag uccgugugga aggaccuccu ggaagaccca caaacaccaa uucccacaac 8100caucauggcc aaaaaugagg uguucugcgu ggaccccgcc aaggggggua agaaaccagc 8160ucgccucauc guuuacccug accucggcgu ccgggucugc gagaaaaugg cccucuauga 8220
cauuacacaa aagcuuccuc aggcgguaau gggagcuucc uauggcuucc aguacucccc 8280ugcccaacgg guggaguauc ucuugaaagc augggcggaa aagaaggacc ccauggguuu 8340uucguaugau acccgaugcu ucgacucaac cgucacugag agagacauca ggaccgagga 8400guccauauac caggccugcu cccugcccga ggaggcccgc acugccauac acucgcugac 8460ugagagacuu uacguaggag ggcccauguu caacagcaag ggucaaaccu gcgguuacag 8520acguugccgc gccagcgggg ugcuaaccac uagcaugggu aacaccauca caugcuaugu 8580gaaagcccua gcggccugca aggcugcggg gauaguugcg cccacaaugc ugguaugcgg 8640cgaugaccua guagucaucu cagaaagcca ggggacugag gaggacgagc ggaaccugag 8700agccuucacg gaggccauga ccagguacuc ugccccuccu ggugaucccc ccagaccgga 8760auaugaccug gagcuaauaa cauccuguuc cucaaaugug ucuguggcgu ugggcccgcg 8820gggccgccgc agauacuacc ugaccagaga cccaaccacu ccacucgccc gggcugccug 8880ggaaacaguu agacacuccc cuaucaauuc auggcuggga aacaucaucc aguaugcucc 8940aaccauaugg guucgcaugg uccuaaugac acacuucuuc uccauucuca ugguccaaga 9000cacccuggac cagaaccuca acuuugagau guauggauca guauacuccg ugaauccuuu 9060ggaccuucca gccauaauug agagguuaca cgggcuugac gccuuuucua ugcacacaua 9120cucucaccac gaacugacgc ggguggcuuc agcccucaga aaacuugggg cgccaccccu 9180cagggugugg aagagucggg cucgcgcagu cagggcgucc cucaucuccc guggagggaa 9240agcggccguu ugcggccgau aucucuucaa uugggcggug aagaccaagc ucaaacucac 9300uccauugccg gaggcgcgcc uacuggacuu auccaguugg uucaccgucg gcgccggcgg 9360gggcgacauu uuucacagcg ugucgcgcgc ccgaccccgc ucauuacucu ucggccuacu 9420ccuacuuuuc guagggguag gccucuuccu acuccccgcu cgguagagcg gcacacacua 9480gguacacucc auagcuaacu guuccuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 9540uuuuuuuucu uuuuuuuuuu uuucccucuu ucuucccuuc ucaucuuauu cuacuuucuu 9600ucuugguggc uccaucuuag cccuagucac ggcuagcugu gaaagguccg ugagccgcau 9660gacugcagag agugccguaa cuggucucuc ugcagaucau gucuaga9707<210>10<211>3748<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<220>
<223>包含TH1株的5’UTR到NS3區(qū)域的RNA序列<400>10gccagccccc gattgggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg 60tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 180gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 240gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 300gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg aatcctaaac 360ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc gccgcccaca ggacgtcaag ttcccgggcg 420gtggccagat cgttggtgga gtttacctgt tgccgcgcag gggccccagg ttgggtgtgc 480gcgcgactag gaagacttcc gagcggtcgc aacctcgtgg aaggcgacaa cctatcccca 540aggatcgccg acccgagggc agggcctggg ctcagcccgg gtacccttgg cccctctatg 600
gcaacgaggg catggggtgg gcaggatggc tcctgtcacc ccgtggctcc cggcctagtt 660ggggccccaa tgacccccgg cgcaggtcgc gtaatttggg taaagtcatc gataccctta 720catgcggctt cgccgacctc atggggtaca ttccgctcgt cggcgctccc ttggggggcg 780ctgccagggc cttggcgcat ggcgtccggg ttctggagga cggcgtgaac tatgcaacag 840ggaatctgcc cggttgctct ttctctatct tcctcttggc tctgctgtcc tgtctaacca 900tcccagcttc cgcttatgaa gtgcgcaacg tgtccggggt gtaccatgtc acgaacgact 960gctccaactc gagcattgtg tacgagacag gggacatgat tatgcacacc cctgggtgcg 1020tgccctgtgt tcgggagaac aactcctccc gctgctgggc agcgctcact cccacgctcg 1080cggccaggaa cgccagcgtc cccaccacga caatacggcg ccacgtcgat ttgctcgttg 1140gggcggctgc tttctgctcc gctatgtacg tgggggatct ctgcggatct gttttcctcg 1200tctcccagtt gttcaccttc tcgcctcgcc ggcatgagac agtgcaggac tgcaattgtt 1260caatctatcc cggccacgta tcaggtcacc gcatggcttg ggatatgatg atgaactggt 1320cacctacaac agccctactg gtatcgcagt tactccggat cccacaagcc gtcgtggaca 1380tggtggcggg ggcccactgg ggagtcctgg cgggccttgc ctactattcc atggcgggga 1440actgggctaa ggttttgatt gtgctgctac tctttgccgg cgttgatggg gcgacctacg 1500tgacgggggg gtcggaagcc agaggggcct ctggcttagc aaacctcttt tcatttgggg 1560cgtctcagaa gatccagctc ataaatacca acggcagttg gcacatcaat agaactgccc 1620tgaactgcaa tgactccctc cacactgggt ttcttgccgc gctattctac acacacaaat 1680tcaacgcgtc cggatgtcca gagcgcatgg ccagctgccg ccccattgaa gagttcgctc 1740aggggtatgg tcccatcact tatgctgagc cctccccctc ggaccagagg ccctattgct 1800ggcactacgc gcctcgaccg tgtggtatca tacccgcgtc gcaggtgtgt ggtccagtgt 1860actgcttcac cccaagccct gttgtggtgg ggacgaccga tcgctccggt gcccccacgt 1920ataattgggg ggcgaatgag acggacgtgc tgtatctcaa caacacgcgg ccgccgcaag 1980gcaactggtt cggctgcaca tggatgaatg gcaccgggtt caccaagacg tgcgggggcc 2040ccccgtgcaa catcgggggg ggcggcaaca acaacacctt gacctgcccc acggactgtt 2100tccggaaaca ccccgaggcc acctacacca aatgtggttc gggaccttgg ttgacaccta 2160ggtgcatggt cgactaccca tacaggctct ggcactaccc ctgcaccgtt aactttacca 2220tctttaaggt taggatgtac gtgggaggtg tggagcacag gctcaacgcc gcatgcaatt 2280ggacccgagg agagcgttgt aacttagagg acagggatag atcagagctt agcccgctgc 2340tgctgtcaac aacagagtgg caggtgctac cttgttcctt caccacccta ccggctctgt 2400ccactggttt gatccatctc caccagaaca tcgtggacgt gcaatacctg tacggtatag 2460ggtcggcggt tgtctcctat gcaatcaaat gggaatatgt cttgttgctc ttcctcctcc 2520tggcagacgc gcgcgtctgc gcctgcttgt ggatgatgct gctgatagct caagctgagg 2580ccgccttaga gaacctggtg gtcctcaatg cggcgtccct ggctggagcg catggccttc 2640tctctttcct tgtgttcttc tgtgccgctt ggtacatcaa gggcaggttg atccccgggg 2700cggcgtatgc tttttacggc gtatggccgc tgctcctact cctgctggcg ttaccaccac 2760gagcatacgc catggaccgg gagatggctg catcgtgcgg aggcgcggtt tttgtaggtc 2820tggcattcct gaccttgtca ccacactata aggcattcct cgccaagctc atatggtggt 2880tacaatattt tatcaccaga gccgaggccc atttgcaagt gtggatcccc cccctcaacg 2940tccggggggg ccgcgatgcc atcatcctcc tcacatgcgc gatccatcca gaccttatct 3000ttgacatcac caaactcttg ctcgccatgc tcggtccact catggtgctc caggctggca 3060taactagagt gccgtacttc gtgcgcgctc aagggctcat tcgtgcatgc atgttggtgc 3120ggaaagtcgc tgggggtcat tatgtccaaa tggccctcat gaagctggcc tcgctgacag 3180gtacgtacgt ttacgaccat cttactccac tgcgggactg ggcccacggg ggcctacgag 3240accttgcggt ggcagttgag cccgtcatct tctctgacat ggagaccaaa atcatcactt 3300ggggagcaga caccgcggcg tgtggggaca tcatctcggg tctgcccgtc tccgcccgaa 3360
gggggaggga gatatttctg ggaccggccg acaagatcag agagcagggg tggcgactcc 3420ttgcccccat cacggcctat tcccaacaga cgcgaggcct actcggctgc atcatcacta 3480gcctcacagg ccgggacaag aaccaggtcg agggggaggt tcaagtggtc tctaccgcaa 3540cgcaatcttt cctggcgacc tgcgtcaacg gcgtgtgttg gactgtctac catggtgccg 3600gctcgaaaac tctagccggc ccgaagggac caatcaccca aatgtacacc aatgtagacc 3660aggacctcgt cggctggcag gcgccccccg gggcgcgctc cttaacacca tgcacctgcg 3720gcagctcgga cctttacttg gtcacgag 3748<210>11<211>11102<212>RNA<213>智人<220>
<223>源于HCV JFH1株和HCV TH株的嵌合丙型肝炎病毒基因在RNA(JFH-1克隆)<400>11accugccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60cuucacgcag aaagcgccua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300cgcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcacc augagcacaa auccuaaacc 360ucaaagaaaa accaaaagaa acaccaaccg ucgcccaaug auugaacaag auggauugca 420cgcagguucu ccggccgcuu ggguggagag gcuauucggc uaugacuggg cacaacagac 480aaucggcugc ucugaugccg ccguguuccg gcugucagcg caggggcgcc cgguucuuuu 540ugucaagacc gaccuguccg gugcccugaa ugaacugcag gacgaggcag cgcggcuauc 600guggcuggcc acgacgggcg uuccuugcgc agcugugcuc gacguuguca cugaagcggg 660aagggacugg cugcuauugg gcgaagugcc ggggcaggau cuccugucau cucaccuugc 720uccugccgag aaaguaucca ucauggcuga ugcaaugcgg cggcugcaua cgcuugaucc 780ggcuaccugc ccauucgacc accaagcgaa acaucgcauc gagcgagcac guacucggau 840ggaagccggu cuugucgauc aggaugaucu ggacgaagag caucaggggc ucgcgccagc 900cgaacuguuc gccaggcuca aggcgcgcau gcccgacggc gaggaucucg ucgugaccca 960uggcgaugcc ugcuugccga auaucauggu ggaaaauggc cgcuuuucug gauucaucga 1020cuguggccgg cugggugugg cggaccgcua ucaggacaua gcguuggcua cccgugauau 1080ugcugaagag cuuggcggcg aaugggcuga ccgcuuccuc gugcuuuacg guaucgccgc 1140ucccgauucg cagcgcaucg ccuucuaucg ccuucuugac gaguucuucu gaguuuaaac 1200ccucucccuc cccccccccu aacguuacug gccgaagccg cuuggaauaa ggccggugug 1260cguuugucua uauguuauuu uccaccauau ugccgucuuu uggcaaugug agggcccgga 1320aaccuggccc ugucuucuug acgagcauuc cuaggggucu uuccccucuc gccaaaggaa 1380ugcaaggucu guugaauguc gugaaggaag caguuccucu ggaagcuucu ugaagacaaa 1440caacgucugu agcgacccuu ugcaggcagc ggaacccccc accuggcgac aggugccucu 1500gcggccaaaa gccacgugua uaagauacac cugcaaaggc ggcacaaccc cagugccacg 1560uugugaguug gauaguugug gaaagaguca aauggcucuc cucaagcgua uucaacaagg 1620ggcugaagga ugcccagaag guaccccauu guaugggauc ugaucugggg ccucggugca 1680
caugcuuuac auguguuuag ucgagguuaa aaaaacgucu aggccccccg aaccacgggg 1740acgugguuuu ccuuugaaaa acacgaugau accaugagca cgaauccuaa accucaaaga 1800aaaaccaaac guaacaccaa ccgccgccca caggacguca aguucccggg cgguggccag 1860aucguuggug gaguuuaccu guugccgcgc aggggcccca gguugggugu gcgcgcgacu 1920aggaagacuu ccgagcgguc gcaaccucgu ggaaggcgac aaccuauccc caaggaucgc 1980cgacccgagg gcagggccug ggcucagccc ggguacccuu ggccccucua uggcaacgag 2040ggcauggggu gggcaggaug gcuccuguca ccccguggcu cccggccuag uuggggcccc 2100aaugaccccc ggcgcagguc gcguaauuug gguaaaguca ucgauacccu uacaugcggc 2160uucgccgacc ucauggggua cauuccgcuc gucggcgcuc ccuugggggg cgcugccagg 2220gccuuggcgc auggcguccg gguucuggag gacggcguga acuaugcaac agggaaucug 2280cccgguugcu cuuucucuau cuuccucuug gcucugcugu ccugucuaac caucccagcu 2340uccgcuuaug aagugcgcaa cguguccggg guguaccaug ucacgaacga cugcuccaac 2400ucgagcauug uguacgagac aggggacaug auuaugcaca ccccugggug cgugcccugu 2460guucgggaga acaacuccuc ccgcugcugg gcagcgcuca cucccacgcu cgcggccagg 2520aacgccagcg uccccaccac gacaauacgg cgccacgucg auuugcucgu uggggcggcu 2580gcuuucugcu ccgcuaugua cgugggggau cucugcggau cuguuuuccu cgucucccag 2640uuguucaccu ucucgccucg ccggcaugag acagugcagg acugcaauug uucaaucuau 2700cccggccacg uaucagguca ccgcauggcu ugggauauga ugaugaacug gucaccuaca 2760acagcccuac ugguaucgca guuacuccgg aucccacaag ccgucgugga caugguggcg 2820ggggcccacu ggggaguccu ggcgggccuu gccuacuauu ccauggcggg gaacugggcu 2880aagguuuuga uugugcugcu acucuuugcc ggcguugaug gggcgaccua cgugacgggg 2940gggucggaag ccagaggggc cucuggcuua gcaaaccucu uuucauuugg ggcgucucag 3000aagauccagc ucauaaauac caacggcagu uggcacauca auagaacugc ccugaacugc 3060aaugacuccc uccacacugg guuucuugcc gcgcuauucu acacacacaa auucaacgcg 3120uccggauguc cagagcgcau ggccagcugc cgccccauug aagaguucgc ucagggguau 3180ggucccauca cuuaugcuga gcccuccccc ucggaccaga ggcccuauug cuggcacuac 3240gcgccucgac cgugugguau cauacccgcg ucgcaggugu gugguccagu guacugcuuc 3300accccaagcc cuguuguggu ggggacgacc gaucgcuccg gugcccccac guauaauugg 3360ggggcgaaug agacggacgu gcuguaucuc aacaacacgc ggccgccgca aggcaacugg 3420uucggcugca cauggaugaa uggcaccggg uucaccaaga cgugcggggg ccccccgugc 3480aacaucgggg ggggcggcaa caacaacacc uugaccugcc ccacggacug uuuccggaaa 3540caccccgagg ccaccuacac caaauguggu ucgggaccuu gguugacacc uaggugcaug 3600gucgacuacc cauacaggcu cuggcacuac cccugcaccg uuaacuuuac caucuuuaag 3660guuaggaugu acgugggagg uguggagcac aggcucaacg ccgcaugcaa uuggacccga 3720ggagagcguu guaacuuaga ggacagggau agaucagagc uuagcccgcu gcugcuguca 3780acaacagagu ggcaggugcu accuuguucc uucaccaccc uaccggcucu guccacuggu 3840uugauccauc uccaccagaa caucguggac gugcaauacc uguacgguau agggucggcg 3900guugucuccu augcaaucaa augggaauau gucuuguugc ucuuccuccu ccuggcagac 3960gcgcgcgucu gcgccugcuu guggaugaug cugcugauag cucaagcuga ggccgccuua 4020gagaaccugg ugguccucaa ugcggcgucc cuggcuggag cgcauggccu ucucucuuuc 4080cuuguguucu ucugugccgc uugguacauc aagggcaggu ugauccccgg ggcggcguau 4140gcuuuuuacg gcguauggcc gcugcuccua cuccugcugg cguuaccacc acgagcauac 4200gccuaugacg caccugugca cggacagaua ggcguggguu uguugauauu gaucacccuc 4260uucacacuca ccccggggua uaagacccuc cucggccagu gucuguggug guugugcuau 4320cuccugaccc ugggggaagc caugauucag gaguggguac cacccaugca ggugcgcggc 4380ggccgcgaug gcaucgcgug ggccgucacu auauucugcc cggguguggu guuugacauu 4440
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1.一種經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，其由兩種或以上的丙型肝炎病毒的基因組RNA構(gòu)成，含有5’非翻譯區(qū)、核心蛋白質(zhì)編碼序列、E1蛋白質(zhì)編碼序列、p7蛋白質(zhì)編碼序列、E2蛋白質(zhì)編碼序列、NS2蛋白質(zhì)編碼序列，序列號1所示的編碼JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的部分RNA序列，以及3’非翻譯區(qū)，并且所述的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA具有自主復(fù)制能力。
2.一種經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，其由兩種或以上的丙型肝炎病毒的基因組RNA構(gòu)成，含有5’非翻譯區(qū)、核心蛋白質(zhì)編碼序列、E1蛋白質(zhì)編碼序列、p7蛋白質(zhì)編碼序列、E2蛋白質(zhì)編碼序列、NS2蛋白質(zhì)編碼序列、NS3蛋白質(zhì)編碼序列、NS4A蛋白質(zhì)編碼序列、NS4B蛋白質(zhì)編碼序列、NS5A蛋白質(zhì)編碼序列，序列號2所示的JFH1株的NS5B蛋白質(zhì)編碼序列以及3’非翻譯區(qū)，并且經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA具有自主復(fù)制能力。
3.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，其是選自基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型3a、以及基因型3b的病毒株。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項所述的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，其是選自基因型1b和基因型2a的病毒株。
5.如權(quán)利要求3或4所述的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，其中的基因型1b的病毒株選自HCV-con1株、HCV-TH株、HCV-J株、HCV-JT株、以及HCV-BK株。
6.如權(quán)利要求3～5中任一項所述的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，其中的基因型2a的病毒株選自HCV-J6株、HCV-JFH1株、以及HCV-JCH1株。
7.一種靶向肝細(xì)胞的病毒載體，其含有權(quán)利要求1～6中任一項所述的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
8.一種導(dǎo)入了權(quán)利要求1～6中任一項所述的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA、能夠復(fù)制該丙型肝炎病毒基因組RNA且產(chǎn)生病毒顆粒的細(xì)胞。
9.丙型肝炎病毒顆粒，其是通過培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，從培養(yǎng)物中得到的。
10.純化HCV病毒顆粒的方法，該方法通過將權(quán)利要求9所述的含有HCV的液體、或者細(xì)胞碎片通過組合柱層析和/或密度梯度離心來進(jìn)行的。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述柱層析是選自離子交換層析、凝膠過濾層析、以及親和層析的一種或以上的層析。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述離子交換層析是選自陰離子交換層析和陽離子交換層析的一種或以上的層析；所述凝膠過濾層析是使用選自注冊商標(biāo)為Sepahcryl-S300、Sepahcryl-S400、Sepahcryl-S500的樹脂的一種或以上的層析；所述親和層析是使用選自硫酸化cellulofine、肝素、以及凝集素的樹脂的一種或以上的層析。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述層析為硫酸cellulofine層析。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述密度梯度離心是使用選自氯化銫、蔗糖、以及糖聚合物的一種或以上的溶質(zhì)進(jìn)行的。
15.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，在所述純化方法中，將陰離子交換層析、硫酸cellulofine層析、以及蔗糖密度梯度離心分別以任意順序組合一次或以上。
16.HCV病毒顆粒，其是通過將權(quán)利要求9所述的含有HCV的液體或者細(xì)胞碎片以組合柱層析和密度梯度離心來純化HCV病毒顆粒的方法得到的。
17.如權(quán)利要求16所述的HCV病毒顆粒，其是通過柱層析進(jìn)行純化的，其中，所述柱層析是選自離子交換層析、凝膠過濾層析、以及親和層析中的一種或以上的層析。
18.如權(quán)利要求16所述的HCV病毒顆粒，其是通過柱層析進(jìn)行純化的，其中，所述離子交換層析為選自陰離子交換層析和陽離子交換層析中的一種或以上的層析；所述凝膠過濾層析為使用選自注冊商標(biāo)為Sepahcryl-S300、Sepahcryl-S400、Sepahcryl-S500的樹脂的一種或以上的層析；所述親和層析為使用選自硫酸化cellulofine、肝素、以及凝集素的樹脂的一種或以上的層析。
19.如權(quán)利要求16所述的HCV病毒顆粒，其是通過柱層析進(jìn)行純化的，其中，所述層析為硫酸cellulofine層析。
20.如權(quán)利要求16所述的HCV病毒顆粒，其是通過密度梯度離心進(jìn)行純化的，其中，所述密度梯度離心是使用選自氯化銫、蔗糖、以及糖聚合物的一種或以上的溶質(zhì)進(jìn)行的。
21.如權(quán)利要求16所述的HCV病毒顆粒，其是以所述的純化方法將離子交換層析、硫酸cellulofine層析、以及蔗糖密度梯度離心分別以任意順序組合一次或以上進(jìn)行純化的。
22.丙型肝炎疫苗和/或中和抗體，其是使用權(quán)利要求8所述的丙型肝炎病毒顆粒或其一部分作為抗原得到的。
23.丙型肝炎病毒感染細(xì)胞，其是經(jīng)權(quán)利要求8所述的丙型肝炎病毒顆粒感染得到的。
24.一種丙型肝炎病毒感染細(xì)胞的制備方法，其中，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，從培養(yǎng)液中回收病毒顆粒。
25.一種丙型肝炎病毒感染細(xì)胞的制備方法，其中，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，使培養(yǎng)液中的病毒顆粒感染其他細(xì)胞。
26.一種抗丙型肝炎病毒物質(zhì)的篩選方法，其中，在被檢物質(zhì)存在下，培養(yǎng)權(quán)利要求8或權(quán)利要求23所述的細(xì)胞，通過檢測培養(yǎng)物中的丙型肝炎RNA或者病毒顆粒，評價被檢物質(zhì)的抗丙型肝炎病毒的效果。
27.制備權(quán)利要求22所述的丙型肝炎疫苗和/或中和抗體的方法。
28. 在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和/或表達(dá)的外源基因的方法，其特征在于將編碼外源基因的RNA插入權(quán)利要求1～6中任一項所述的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA中，再將其導(dǎo)入目的細(xì)胞中，進(jìn)行復(fù)制或者表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA，其由含有兩種或以上的丙型肝炎病毒的基因組RNA的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白質(zhì)編碼序列、E1蛋白質(zhì)編碼序列、p7蛋白質(zhì)編碼序列、E2蛋白質(zhì)編碼序列、NS2蛋白質(zhì)編碼序列、NS3蛋白質(zhì)編碼序列、NS4A蛋白質(zhì)編碼序列、NS4B蛋白質(zhì)編碼序列、NS5A蛋白質(zhì)編碼序列、NS5B蛋白質(zhì)編碼序列、以及3’非翻譯區(qū)的堿基序列構(gòu)成，并且具有自主復(fù)制能力。特別涉及通過將丙型肝炎病毒基因組RNA的編碼從NS3開始的NS4、NS5A和NS5B蛋白質(zhì)的RNA序列部分取代為序列號1所示的JFH1株的編碼NS3、NS4、NS5A、以及NS5B蛋白質(zhì)的RNA部分序列而獲得自主復(fù)制能力的經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒基因組RNA。
文檔編號C12N5/10GK101048502SQ20058003641
公開日2007年10月3日 申請日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者脅田隆字, 加藤孝宣, 伊達(dá)朋子, 宮本道子, R·巴頓施勞格, 田邊純一, 曾根三郎 申請人:財團(tuán)法人東京都醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu), 東麗株式會社