專利名稱：細(xì)胞的冷藏的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求于2004年11月5日遞交的美國臨時(shí)申請系列號60/625,401的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的冷藏方法。還通過本發(fā)明提供已冷藏細(xì)胞的恢復(fù)方法。并提供從冷藏成功恢復(fù)的細(xì)胞培養(yǎng)物。
背景技術(shù)：
用于生物藥品和生物農(nóng)用化學(xué)品生產(chǎn)的“萬能種子”原理利用活生物體作為制備方法的部分并基于一些基本原則1)起源和傳代史確定的單一培養(yǎng)物被保藏，所述培養(yǎng)物具有限定特征的細(xì)胞表型和期望的制備特征；2)長期的(跨越幾年或更多)保藏(特別是冷藏)；3)細(xì)胞可以被恢復(fù)、擴(kuò)增、無限傳代成為“工作種子”并用于另一輪的冷藏(該原理需要細(xì)胞強(qiáng)壯)；和4)在限定數(shù)目的傳代之后，細(xì)胞未丟失在初始冷凍狀態(tài)之前具有的限定特征的細(xì)胞表型和期望的制備特征。
涉及植物細(xì)胞的冷藏技術(shù)缺乏關(guān)于在生物藥品制備環(huán)境中使用生物物質(zhì)所需特征的教導(dǎo)。特別是為延長保存活生物物質(zhì)設(shè)計(jì)的任何技術(shù)應(yīng)該優(yōu)選地符合以下原則1)保藏方法必須提供長期(數(shù)年)穩(wěn)定的生物物質(zhì)；2)保藏條件不應(yīng)改變制備方法所需要的生物物質(zhì)；和3)一旦從保藏中移出，該物質(zhì)應(yīng)該容易地得到再生并且能夠增殖為可再生的工作種子。
在現(xiàn)有技術(shù)中很少提供關(guān)于冷藏時(shí)間長度(通常以月或甚至小時(shí)計(jì))的信息，并且關(guān)于細(xì)胞是否能夠在普通培養(yǎng)條件下無限生長或至少生長至期望的代數(shù)的信息有限。此外，幾乎沒有數(shù)據(jù)揭示靶基因或基因產(chǎn)物(均來自初始的萬能種子貯備物和經(jīng)擴(kuò)增并重新冷藏的工作種子貯備物)經(jīng)過長期保藏或從保藏中移出之后長期培養(yǎng)，其遺傳和生產(chǎn)的穩(wěn)定性。
因此，需要提供植物細(xì)胞的長期保藏方法或系列處理技術(shù)用于以萬能種子原理生物制備目標(biāo)成分的長期生長、重新冷藏和穩(wěn)定性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的冷藏方法。還通過本發(fā)明提供已冷藏細(xì)胞的恢復(fù)方法。并提供從冷藏成功恢復(fù)的細(xì)胞培養(yǎng)物。


圖1A-2B.細(xì)胞轉(zhuǎn)移頻率對恢復(fù)百分?jǐn)?shù)(圖1B)和健康愈傷組織百分?jǐn)?shù)(黃色愈傷組織；圖1A)的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的冷藏方法。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述方法提供形成冷藏組合物以及冷藏轉(zhuǎn)化或非轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞的方法。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供形成包含轉(zhuǎn)化(或非轉(zhuǎn)化)真核細(xì)胞的冷藏組合物的方法。這些方法包括步驟a)在選擇培養(yǎng)基上/中生長轉(zhuǎn)化(或非轉(zhuǎn)化)細(xì)胞；b)用所述細(xì)胞接種含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成液體培養(yǎng)物，并對所述轉(zhuǎn)化(或非轉(zhuǎn)化)細(xì)胞的液體培養(yǎng)物傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢復(fù)所述傳代細(xì)胞；和d)將所述恢復(fù)細(xì)胞加至冷藏培養(yǎng)基形成冷藏組合物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供冷藏轉(zhuǎn)化(或非轉(zhuǎn)化)真核細(xì)胞的方法，包括步驟a)在選擇培養(yǎng)基上/中生長轉(zhuǎn)化(或非轉(zhuǎn)化)細(xì)胞；
b)用所述細(xì)胞接種含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成液體培養(yǎng)物，并對所述轉(zhuǎn)化(或非轉(zhuǎn)化)細(xì)胞的液體培養(yǎng)物傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢復(fù)所述傳代細(xì)胞；和d)將所述恢復(fù)的轉(zhuǎn)化(或非轉(zhuǎn)化)細(xì)胞加至冷藏培養(yǎng)基形成冷藏組合物；和e)冷藏所述冷藏組合物。
本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供冷藏轉(zhuǎn)化(或非轉(zhuǎn)化)細(xì)胞的方法，其包括a)在選擇培養(yǎng)基上/中生長轉(zhuǎn)化(或非轉(zhuǎn)化)細(xì)胞1-10天；b)用所述細(xì)胞接種含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成液體培養(yǎng)物；c)培養(yǎng)所述液體培養(yǎng)物至約對數(shù)中期生長期；d)回收第一體積(VOL1)的所述液體培養(yǎng)物并將其接種于含有第二體積(VOL2)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶；e)另外重復(fù)步驟d)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次(傳代所述細(xì)胞)；f)恢復(fù)所述傳代細(xì)胞；g)將所述傳代細(xì)胞懸浮于一定體積的第二培養(yǎng)基；h)將冷藏培養(yǎng)基加入步驟g)中提供的懸浮細(xì)胞以形成冷藏組合物；i)冷卻所述冷藏組合物；和j)冷凍所述冷藏組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供植物細(xì)胞的冷藏。根據(jù)本發(fā)明可以冷藏來自單子葉或雙子葉的細(xì)胞。因此，可以使用這里教導(dǎo)的多種方法冷藏轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化的單子葉或雙子葉細(xì)胞。在這里教導(dǎo)的本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，冷藏、貯存和恢復(fù)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的煙草細(xì)胞和稻細(xì)胞，以建立保留原始培養(yǎng)物基因型和表型的生長細(xì)胞培養(yǎng)物。
因此，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的冷藏方法(任選地，依據(jù)萬能種子原理)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將所述方法以萬能種子原理用于煙草(Nicotiana tabacum)(NT-1和BY-2)細(xì)胞以及T309稻細(xì)胞的冷藏。見Biotechnology in Agriculture and Forestry，T.Nagata、S.Hasezawa和D.Inze編輯；Springer-Verlag；Heidelberg，Germany；2004。
使用標(biāo)準(zhǔn)植物組織培養(yǎng)技術(shù)從可商購的稻T309品種制備T309稻細(xì)胞系。適于本發(fā)明操作的其它轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞列于表1。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供形成冷藏組合物的方法，所述冷藏組合物包含轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。這些方法包括步驟a)使愈傷組織上的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長；b)用來自所述愈傷組織的所述植物細(xì)胞接種含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成液體培養(yǎng)物，并對所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的液體培養(yǎng)物傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢復(fù)所述傳代的植物細(xì)胞；和d)將所述恢復(fù)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞加至冷藏培養(yǎng)基形成冷藏組合物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的冷藏方法。這些方法包括a)使愈傷組織上的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長；b)用來自所述愈傷組織的所述植物細(xì)胞接種含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成液體培養(yǎng)物，并對所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的液體培養(yǎng)物傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢復(fù)所述傳代的植物細(xì)胞；d)將所述恢復(fù)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞加至冷藏培養(yǎng)基形成冷藏組合物；和e)冷藏所述冷藏組合物。
冷藏轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的又一方法包括a)使愈傷組織上的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長1-10天；b)用來自所述愈傷組織的所述細(xì)胞接種含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成液體培養(yǎng)物；c)培養(yǎng)所述液體培養(yǎng)物至約對數(shù)中期生長期；d)回收生長至約對數(shù)中期的第一體積(VOL1)所述液體培養(yǎng)物，將所述第一體積接種于含有第二體積(VOL2)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成傳代培養(yǎng)物，并培養(yǎng)所述傳代培養(yǎng)物至約對數(shù)中期生長期；
e)任選地，另外重復(fù)步驟d)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；f)從所述傳代培養(yǎng)物恢復(fù)植物細(xì)胞；g)將所述植物細(xì)胞懸浮于一定體積的第二培養(yǎng)基(CULT)；h)將一定體積的冷藏培養(yǎng)基(CRYO)加入步驟g)中提供的懸浮植物細(xì)胞以形成冷藏組合物；i)冷卻所述冷藏組合物；和j)冷凍所述冷藏組合物。
術(shù)語“傳代”可與“短周期條件”一詞交換地使用。傳代或短周期條件是描述在指數(shù)中期(對數(shù)中期)生長期收獲(回收)細(xì)胞；在指數(shù)中期生長期用新鮮培養(yǎng)基稀釋或分傳細(xì)胞，并培養(yǎng)稀釋的(分傳的)細(xì)胞培養(yǎng)物至指數(shù)中期生長期。
出于本發(fā)明的目的，普通技術(shù)人員將理解術(shù)語“對數(shù)中期”和“指數(shù)中期”并非指精確的指數(shù)生長中點(diǎn)，而指在數(shù)學(xué)中點(diǎn)左右的范圍。至指數(shù)中期生長期的每輪培養(yǎng)被認(rèn)為是一個(gè)細(xì)胞世代?？梢猿晒洳鼐哂袃H1個(gè)短周期(世代)或高達(dá)20個(gè)短周期的來自懸液的待冷藏細(xì)胞。優(yōu)選3-6個(gè)短周期，最優(yōu)選6個(gè)短周期。發(fā)明人已顯示6個(gè)短周期(世代)使細(xì)胞能夠從冷藏狀態(tài)優(yōu)異地恢復(fù)用于重培養(yǎng)。此外，只要在1-6次短周期條件下將細(xì)胞置于懸液中，在培養(yǎng)后可以多次冷藏細(xì)胞。在稀釋或分傳步驟中加于新鮮培養(yǎng)基體積(VOL2)的細(xì)胞體積(VOL1)可以以VOL1相對VOL2的比率改變，其中VOL1和VOL2各自獨(dú)立地范圍從1至至少20；1至至少10；或1至至少5(包括任意這些數(shù)值之間的分?jǐn)?shù)值)。在一個(gè)實(shí)施方案中，VOL1∶VOL2為1∶3。
還應(yīng)指出的是，以下教導(dǎo)的每一方法可以包括另外的方法步驟。例如，可以解凍冷藏的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、在培養(yǎng)基中懸浮冷藏細(xì)胞(或在固體選擇培養(yǎng)基上生長該細(xì)胞以形成愈傷組織)并使其生長用于生物制備方法(如，將細(xì)胞培養(yǎng)在生長容器，例如發(fā)酵罐、攪拌釜反應(yīng)器等等)。來自生物制備方法的細(xì)胞可以用于本發(fā)明的冷藏方法并根據(jù)萬能種子原理貯存。
適用于非轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化的單子葉和雙子葉細(xì)胞生長的選擇培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以由個(gè)人容易地使用(見，例如DifcoTM和BBLTM手冊，微生物培養(yǎng)基手冊)。
當(dāng)欲形成冷藏組合物時(shí)，可以將含有懸浮細(xì)胞的多種體積的培養(yǎng)基(CULT)與多種體積的冷藏培養(yǎng)基(CRYO)混合。這些混合物是以CULT∶CRYO的比率混合，其中CULT范圍從1至100(包括其間的分?jǐn)?shù)值)且CRYO范圍從1至100(包括其間的分?jǐn)?shù)值)。在一些實(shí)施方案中，CULT和CRYO范圍從1至10。在其它實(shí)施方案中，將等體積的CULT和CRYO混合形成冷藏組合物。
本發(fā)明還提供由任何的上述冷藏方法產(chǎn)生的冷藏細(xì)胞或細(xì)胞系。
在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，并未如在美國專利號5,965,438或6,127,181提出的教導(dǎo)的那樣(其公開在此被完整引入作為參考，特別是美國專利號5,965,438的第6欄第16行至第7欄第34行和美國專利號6,127,181的第6欄第60行至第9欄第22行)，使用物質(zhì)(如穩(wěn)定劑)對所述將欲冷藏的細(xì)胞進(jìn)行“預(yù)處理”或“預(yù)培養(yǎng)”，從而通過移去由細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基的有害物質(zhì)增加細(xì)胞的存活力。如在‘438專利所討論，穩(wěn)定劑預(yù)處理涉及移去在細(xì)胞生長或死亡期間分泌的有害物質(zhì)。此外，本發(fā)明可以排除使用一種或多種“滲壓劑”、乙烯抑制劑和/或膜穩(wěn)定劑在培養(yǎng)條件下加入細(xì)胞的預(yù)處理。具體而言，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，未將穩(wěn)定劑、滲壓劑、乙烯抑制劑和/或膜穩(wěn)定劑加入預(yù)處理方案中本發(fā)明已制備的培養(yǎng)基，盡管在‘438或‘181專利中鑒定的物質(zhì)可能是根據(jù)本發(fā)明預(yù)先制備用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組分。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)期間未如在‘438或‘181專利所提出的那樣將穩(wěn)定劑、滲壓劑、乙烯抑制劑和/或膜穩(wěn)定劑加入培養(yǎng)基(或作為必需的補(bǔ)充)(見，例如美國專利號5,965,438的第7欄第7-16行和美國專利號6,127,181的第9欄第36-47行)。
相應(yīng)的，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，下列物質(zhì)未被加入培養(yǎng)基或不作為需要的補(bǔ)充穩(wěn)定劑如還原的谷胱甘肽、1，1，3，3-四甲基脲、1，1，3，3-四甲基-2-硫脲、硫代硫酸鈉、硫代硫酸銀、甜菜堿、n，n-二甲基甲酰胺、n-(2-巰基丙?；?甘氨酸、β-巰基乙胺、硒代甲硫氨酸、硫脲、沒食子酸丙酯、二巰基丙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、精胺、亞精胺、阿魏酸、芝麻酚、間苯二酚、沒食子酸丙酯、mdl-71，897、尸毒素、腐胺、1，3-和1，2-二氨基丙烷、脫氧葡萄糖、尿酸、水楊酸、3-和4-氨基-1，2，4-三唑、苯甲酸、羥胺和這些物質(zhì)的組合及衍生物；妨礙或完全阻止乙烯生物合成和/或乙烯作用的物質(zhì)如根瘤菌毒素(rhizobitoxin)、甲氧胺鹽酸鹽、羥胺類似物、α-副刀豆氨酸、DNP(2，4-二硝基苯酚)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、Triton X-100、吐溫20、精胺、亞精胺、ACC類似物、α-氨基異丁酸、沒食子酸正丙酯、苯甲酸和其衍生物、阿魏酸、水楊酸和其衍生物、水楊酸、芝麻酚、尸毒素、氫醌、alar、amo-1618、BHA(丁化羥基苯甲醚)、苯乙胺、油菜素類固醇、對氯高汞苯甲酸、n-乙基馬來酰亞胺、碘乙酸鹽、氯化鈷和其它鈷鹽、雙吡啶、氨基(羥基乙)酸、氯化汞和其它汞鹽、水楊醇、水楊苷、氯化鎳和其它鎳鹽、兒茶酚、間苯三酚(pffloroglucinol)、1，2-二氨基丙烷、去鐵胺、吲哚美辛、1，3-二氨基丙烷、異硫氰酸芐酯、8-羥基喹啉硫酸鹽、8-羥基喹啉檸檬酸鹽、2，5-降冰片二烯、正乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二羥基喹啉、反式環(huán)辛烯、7-溴代-5-氯代-8-羥基喹啉、順丙烯磷酸、重氮環(huán)戊二烯、甲基環(huán)丙烷、2-甲基環(huán)丙烷、羧酸、甲基環(huán)丙烷羧酸酯、環(huán)辛二烯、cyclooctodine、(氯甲基)環(huán)丙烷和/或銀鹽如硫代硫酸銀、硝酸銀、氯化銀、乙酸銀、磷酸銀、檸檬酸三銀鹽、苯甲酸銀、硫酸銀、氧化銀、亞硝酸銀、氰酸銀、乳酸銀鹽、五氟丙酸銀、六氟磷酸銀、甲苯磺酸銀鹽以及它們的組合；膜穩(wěn)定劑如插入脂雙層的化合物(如，固醇、磷脂、糖脂、糖蛋白)或二價(jià)陽離子。
實(shí)施例1冷藏在本實(shí)施例中使用的培養(yǎng)基和組分陳列于表2-4。供應(yīng)商提供的組分也被列出。待冷藏的細(xì)胞生長在25℃含有NT1培養(yǎng)基的搖瓶中；在對數(shù)中期(指數(shù)中期)生長期(接種培養(yǎng)瓶后3-4天)以1∶3分傳細(xì)胞(或30％接種)，傳代至少1-10代(一個(gè)實(shí)施方案為至少6代)。在轉(zhuǎn)移至無菌生物安全柜之前使用1％高氯酸鈉溶液清潔培養(yǎng)瓶外表面，在將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無菌的225ml離心管之前再用無菌酒精墊擦拭培養(yǎng)瓶外表面。細(xì)胞以1000RPM于4℃離心1分鐘，用無菌吸管移去上清液。用合適的培養(yǎng)基將細(xì)胞以初始體積重懸并轉(zhuǎn)移至無菌的1升三角瓶，向懸液加入等體積的冷藏培養(yǎng)基并輕輕混旋。
接著，冷藏細(xì)胞如下，于2-7℃定軌搖床中輕輕搖動細(xì)胞懸液(130RPM)1小時(shí)，繼而在冰上轉(zhuǎn)移至生物安全柜并用無菌酒精墊擦凈。在無菌條件下使用自動移取器將細(xì)胞立即分散至冷凍管。每管容納2.5ml細(xì)胞懸液并被立即置于液氮保藏用的盒子中；裝載盒子應(yīng)該保持在2-7℃直至冷凍。接著將盒子轉(zhuǎn)移至速度控制冷凍機(jī)。冷凍程序以4℃15分鐘起始，繼之溫度以每分鐘-0.5℃速度從4℃連續(xù)下降至-40℃。接著取出盒子并置于在干冰上預(yù)冷的貯存架中；一旦全部盒子裝于貯存架時(shí)，將該支架立即放入利用氣相的液氮貯存罐。
為了從冷藏恢復(fù)細(xì)胞用于多種生物過程，將冷凍管從液氮貯存罐移出，迅速從儲存盒取出冷凍管并放入45℃水浴?；煨茏蛹s2.5分鐘，并通過顛倒管子懸浮細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞被完全懸浮時(shí)，將管子轉(zhuǎn)移至防生物柜，用無菌酒精墊擦拭管子并將內(nèi)容物倒至培養(yǎng)皿中的10層Whatman紙上；蓋上培養(yǎng)皿，使冷藏培養(yǎng)基吸收細(xì)胞至少2分鐘。將上層濾紙轉(zhuǎn)移至含有NT1瓊脂培養(yǎng)基的有蓋培養(yǎng)皿(確保在Whatman紙與瓊脂之間沒有氣泡)，使用3M手術(shù)帶包裹NT1瓊脂板一次并將其保存于25℃。在4-5天之后應(yīng)該可檢測到愈傷組織的最小生長。表1顯示NT-1細(xì)胞的幾個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，所述細(xì)胞表達(dá)來自新城疫病毒的血凝素/神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白、禽流感病毒(AIV)的血凝素(HA)、大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素和感染性法式囊病毒(IBDV)的VP2蛋白。無論其表達(dá)的基因或使用的啟動子系統(tǒng)如何都獲得了成功。此外，數(shù)據(jù)證明與使用塑料帶或膜(如NESCO膜)相比，使用3M手術(shù)帶對NT1細(xì)胞的生長具有顯著影響。
實(shí)施例2-冷藏?zé)煵菁?xì)胞的解凍可以解凍單管細(xì)胞或多管細(xì)胞的集合。將管子從貯存單元中移出置于干冰上。將其浸沒于45℃水浴中，輕輕移動水浴中的管架以幫助促進(jìn)管子迅速且一致的解凍。約2.5分鐘之后(至剛剛解凍時(shí))，輕輕顛倒管子3次以混合沉在管底的細(xì)胞。在層流柜中，從多管的集合或單個(gè)管子中吸出2ml細(xì)胞置于無菌培養(yǎng)皿中的8-10層無菌的70mm 4號Whatman濾紙上，蓋上蓋子使排液2分鐘。
此刻對少量細(xì)胞(～0.5ml)進(jìn)行TTC存活力染色。排液2分鐘后，將帶有細(xì)胞的頂層濾紙轉(zhuǎn)移至無雙丙磷(bialaphos)選擇的半固體NTB1培養(yǎng)基。接著使用3M膠帶包裹培養(yǎng)板并在25℃黑暗中孵育3天。3天之后，用Nesco膜代替3M膠帶。在第7天將帶有細(xì)胞的濾紙轉(zhuǎn)移至新的NT1培養(yǎng)板并用Nesco膜包裹。在約7天內(nèi)細(xì)胞生長明顯。另外7天之后，將細(xì)胞從濾紙轉(zhuǎn)移至帶有雙丙磷選擇劑的新的半固體NT1平板。一旦累積足夠的細(xì)胞量，則按照需要開始懸浮培養(yǎng)。
第一組試驗(yàn)測試?yán)洳睾箐伆寮?xì)胞的再生產(chǎn)性和最佳解凍后處理。為了測試再生產(chǎn)性，將八管細(xì)胞解凍、混合細(xì)胞并置于8個(gè)平板上，做三組重復(fù)。測試的其它參數(shù)為含有細(xì)胞的濾紙向新鮮平板轉(zhuǎn)移的頻率。參考文獻(xiàn)表明更頻繁的轉(zhuǎn)移可以提高細(xì)胞的恢復(fù)(通過移去冷凍保護(hù)劑中的組分)；然而，冷凍保護(hù)劑的一些組分也提供保護(hù)效果。測試的三個(gè)轉(zhuǎn)移方案包括“1天轉(zhuǎn)移”(在前三天每天轉(zhuǎn)移，3天之后轉(zhuǎn)移和接著每周轉(zhuǎn)移)、“3天轉(zhuǎn)移”(以三天為間隔轉(zhuǎn)移兩次，接著每周轉(zhuǎn)移)和“7天轉(zhuǎn)移”(每周轉(zhuǎn)移)。兩周后，基于細(xì)胞的恢復(fù)水平和顏色對試驗(yàn)結(jié)果評分(圖1)。
來自測試不同時(shí)間排液的全部處理的細(xì)胞恢復(fù)非常迅速(5天)。對平板的主觀評估表明排液1或2分鐘的細(xì)胞恢復(fù)好于其它處理，盡管差異不大。
放大試驗(yàn)方案為了測試放大試驗(yàn)，將操作中的步驟成比例放大。在小規(guī)模和大規(guī)模之間的基本差異為冷凍保護(hù)劑中大體積的細(xì)胞可能限制空氣交換，并且方法中每個(gè)步驟需要更長的時(shí)間。在放大試驗(yàn)中短周期和長周期細(xì)胞都得到測試。將細(xì)胞解凍、匯集5管并鋪于5個(gè)平板上或解凍15管并分別鋪平板。短周期細(xì)胞在5天之內(nèi)以100％恢復(fù)率恢復(fù)。盡管需要更長的時(shí)間恢復(fù)(兩周)，來自長周期細(xì)胞的平板也全部恢復(fù)。還檢測了在冷藏溶液中保留細(xì)胞延長的時(shí)間(由于分配大量管子所需時(shí)間)的可能影響。在這一試驗(yàn)中，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至管子中并在第一組樣品之后冷凍約2小時(shí)。來自兩次冷凍的細(xì)胞恢復(fù)之間沒有明顯差異。




1Phytotechnology Laboratories(Shawnee Mission，KS)2Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)3Meiji Seika(Kaisha，Japan)



*加至體積并調(diào)至pH 5.81Phytotechnology Laboratories(Shawnee Mission，KS)2Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)3Meiji Seika(Kaisha，Japan)
權(quán)利要求
1.制備冷藏植物細(xì)胞的方法，包括a)傳代細(xì)胞至約對數(shù)中期生長期至少1代；b)濃縮所述傳代細(xì)胞；和c)將冷藏培養(yǎng)基加至所述濃縮的傳代細(xì)胞以形成冷藏組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括冷卻所述冷藏組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括冷凍所述冷藏組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，還包括冷凍所述冷藏組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是經(jīng)轉(zhuǎn)化的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞選自表1中的細(xì)胞。
7.形成冷藏組合物的方法，包括步驟a)使轉(zhuǎn)化或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中或之上生長；b)用所述細(xì)胞接種含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成液體培養(yǎng)物，并傳代所述轉(zhuǎn)化或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的液體培養(yǎng)物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；c)恢復(fù)所述傳代細(xì)胞；和d)將所述恢復(fù)細(xì)胞加至冷藏培養(yǎng)基以形成冷藏組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞是單子葉或雙子葉植物細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述細(xì)胞是經(jīng)轉(zhuǎn)化的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述細(xì)胞是煙草細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述細(xì)胞是稻細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述冷藏培養(yǎng)基是在水中配制并含有342.27g蔗糖/L、46.06g甘油/L、35.5mL DMSO/L和226.64mL的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基選自NT1 VP培養(yǎng)基、VP培養(yǎng)基或T309培養(yǎng)基。
14.冷藏轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，包括步驟a)使愈傷組織上的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長；b)用來自所述愈傷組織的所述植物細(xì)胞接種含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成液體培養(yǎng)物；c)培養(yǎng)所述液體培養(yǎng)物至約對數(shù)中期生長期；d)回收生長至約對數(shù)中期的第一體積(VOL1)的所述液體培養(yǎng)物，將所述第一體積接種于含有第二體積(VOL2)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶以形成傳代培養(yǎng)物并培養(yǎng)所述傳代培養(yǎng)物至約對數(shù)中期生長期；e)任選地另外重復(fù)步驟d)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；f)從所述傳代培養(yǎng)物恢復(fù)植物細(xì)胞；g)將所述傳代細(xì)胞懸浮于一定體積的第二培養(yǎng)基(CULT)；h)將一定體積的冷藏培養(yǎng)基(CRYO)加入步驟g)中提供的懸浮植物細(xì)胞以形成冷藏組合物；i)冷卻所述冷藏組合物；和j)冷凍所述冷藏組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中另外重復(fù)步驟d)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述植物細(xì)胞為煙草或稻。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述植物細(xì)胞為煙草或稻。
18.根據(jù)權(quán)利要求14、15、16或17的方法，其中VOL1和VOL2各自獨(dú)立地范圍從1至至少20；1至至少10；或1至至少5，包括任何這些數(shù)值之間的分?jǐn)?shù)值。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中VOL1∶VOL2為1∶3。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中以CULT∶CRYO的比率添加在一起，并且CULT范圍從1至100而CRYO范圍從1至100。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中CULT∶CRYO為1∶1。
22.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中以CULT∶CRYO的比率添加在一起，并且CULT范圍從1至100而CRYO范圍從1至100。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中CULT∶CRYO為1∶1。
24.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，還包括解凍所述冷藏組合物的步驟。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，還包括從所述冷藏組合物恢復(fù)和培養(yǎng)細(xì)胞的步驟。
26.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，還包括解凍所述冷藏組合物的步驟。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，還包括從所述冷藏組合物恢復(fù)和培養(yǎng)細(xì)胞的步驟。
28.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，還包括解凍所述冷藏組合物的步驟。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，還包括從所述冷藏組合物恢復(fù)和培養(yǎng)細(xì)胞的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，還包括解凍所述冷藏組合物的步驟。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，還包括從所述冷藏組合物恢復(fù)和培養(yǎng)細(xì)胞的步驟。
32.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中重復(fù)步驟d)6次。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的冷藏方法。還通過本發(fā)明提供已冷藏細(xì)胞的恢復(fù)方法。也提供從冷藏成功恢復(fù)的細(xì)胞培養(yǎng)物。
文檔編號C12N5/04GK101048494SQ200580036431
公開日2007年10月3日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者W·M·愛因雷, J·R·博林格爾, C·M·L·拉爾森, M·盧, L·Y·沈, P·S·亞佳庫馬爾, R·J·佳里森, D·R·帕雷迪 申請人:美國陶氏益農(nóng)公司