專利名稱：產(chǎn)生l－氨基酸的細(xì)菌和產(chǎn)生l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在棒狀桿菌型細(xì)菌發(fā)酵期間，通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸具體為L(zhǎng)-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸和L-賴氨酸。
背景技術(shù)：
L-氨基酸如L-谷氨酸是通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的，且通常以利用棒狀桿菌型細(xì)菌的發(fā)酵方法以工業(yè)規(guī)模產(chǎn)生，棒狀桿菌型細(xì)菌包括具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的短桿菌屬(Brevibacterium)和棒桿菌屬(Corynebacterium)。為了改進(jìn)棒狀桿菌型細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)力，已使用從自然界分離的菌株或其人工突變體(JP07-121228B，JP07-121228B，JP06-237779A，Adv Biochem Eng Biotechnol.2003；7959-112.J Biotechnol.2003 Sep 4；104(1-3)155-72.和WO95/34672)。
當(dāng)需氧細(xì)菌(aerobic bacteria)，特別是棒狀桿菌型細(xì)菌，在限氧(oxygen-limited)條件下培養(yǎng)時(shí)，除目標(biāo)物質(zhì)(target substance)以外的有機(jī)酸如乳酸和乙酸作為副產(chǎn)物過(guò)量積累。這種積累抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，并大大地降低發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌的生產(chǎn)力。此外，中和這些有機(jī)酸的過(guò)量的反荷離子(counterion)是必需的，這增加了生產(chǎn)成本。因此，希望創(chuàng)造出在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生更少乙酸的菌株，如催化乙酸產(chǎn)生的酶的活性被減少或消除的菌株。
使用催化乙酸產(chǎn)生的酶的活性被減少或消除的菌株的發(fā)酵方法實(shí)例包括，使用乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶(pta)和乳酸脫氫酶(ldh)活性缺陷的大腸桿菌(Escherichia coli)來(lái)產(chǎn)生L-氨基酸(WO99/06532)，利用丙酮酸氧化酶(poxB)活性缺陷的腸細(xì)菌科(Enterobacteriaceae family)來(lái)產(chǎn)生L-氨基酸，和利用丙酮酸氧化酶(poxB)活性缺陷的腸桿菌科可來(lái)產(chǎn)生D-泛酸(D-panthotheic acid)(WO02/36797)。
已將乙酸激酶(ack)和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶(pta)報(bào)導(dǎo)為參與棒狀桿菌型細(xì)菌中乙酸的同化作用(assimilation)的酶(Microbiology，1999 Feb；145(Pt2)503-13)。同樣，已報(bào)導(dǎo)了棒狀桿菌型細(xì)菌，其中產(chǎn)生乙酸的酶丙酮酸氧化酶(poxB)被破壞(EP1096013A)。
乙酰輔酶A水解酶是一種從乙酰輔酶A和水產(chǎn)生乙酸的酶(3.1.2.1)，且已公開(kāi)了預(yù)測(cè)編碼谷氨酸棒桿菌的乙酰輔酶A水解酶的核苷酸序列(EP1108790A)。但是，還沒(méi)有關(guān)于該基因?qū)嶋H克隆和表達(dá)分析的報(bào)導(dǎo)；因此該基因的實(shí)際(actual)功能也還未確認(rèn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供棒狀桿菌型細(xì)菌，所述棒狀桿菌型細(xì)菌具有改進(jìn)的、通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生L-氨基酸的能力，并提供使用這種細(xì)菌有效地產(chǎn)生上述L-氨基酸的方法。
本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行了廣泛的研究以完成上述目的。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)通過(guò)減少棒狀桿菌型細(xì)菌中乙酰輔酶A水解酶的活性，提高了產(chǎn)生L-氨基酸，尤其是L-谷氨酸、L-纈氨酸和L-丙氨酸的能力，并因此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有產(chǎn)生L-氨基酸能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述棒狀桿菌型細(xì)菌被修飾以使乙酰輔酶A水解酶活性減少，而且其中所述L-氨基酸是通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的一種或多種L-氨基酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中通過(guò)在染色體的乙酰輔酶A水解酶基因的編碼區(qū)或表達(dá)調(diào)控區(qū)引入突變來(lái)減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中是通過(guò)破壞染色體乙酰輔酶A水解酶基因來(lái)減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶選自下組(A)包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B)包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中在所述蛋白質(zhì)中取代、缺失、插入或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且其中所述蛋白質(zhì)具有乙酰輔酶A水解酶活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶基因選自下組(a)包含SEQ ID NO23的核苷酸1037到2542的基因；和(b)DNA，其能夠在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO23的核苷酸1037至2542的多核苷酸或由所述多核苷酸制備的探針雜交，并編碼了具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述棒狀桿菌型細(xì)菌被進(jìn)一步地修飾，以提高谷氨酸脫氫酶活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)生L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌；和從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸，其中所述L-氨基酸是通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的一種或多種L-氨基酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pBS3的方法。
圖2顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pBS4的方法。
圖3顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pBS5T的方法。
圖4顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pΔldh56-1的方法。
圖5顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pBS4S::Δach的方法。
優(yōu)選實(shí)施方案描述以下將對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)地描述。
<1>具有通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生L-氨基酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌在本發(fā)明中，棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括常規(guī)的棒狀桿菌型細(xì)菌，也包括曾經(jīng)被歸入短桿菌屬，但現(xiàn)在被歸入棒桿菌屬的細(xì)菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，以及與棒桿菌屬細(xì)菌非常接近的(close)短桿菌屬細(xì)菌。這些棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括如下嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)烷醇棒桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)美棒桿菌(Corynebacterium callunae)谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)二歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum)黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)Brevibacterium immariophilum乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒桿菌)玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)白色短桿菌(Brevibacterium album)蠟狀短桿菌(Brevibacterium cerinum)嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)棒狀桿菌型細(xì)菌的具體實(shí)例如下嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷棒桿菌ATCC15806烷醇棒桿菌ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060，ATCC13869百合花棒桿菌ATCC15990棲糖蜜棒桿菌ATCC17965
嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868二歧短桿菌ATCC14020黃色短桿菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)Brevibacterium immariophilum ATCC 14068乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產(chǎn)氨短桿菌ATCC6871，ATCC6872白色短桿菌ATCC15111蠟狀短桿菌ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354這些菌株可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United States of America)獲得。即，給予每個(gè)菌株唯一的登記號(hào)，該登記號(hào)列于ATCC的目錄中?？梢岳眠@個(gè)登記號(hào)定購(gòu)菌株。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)的規(guī)定，將AJ12340菌株于1989年10月27日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Instituteof Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，Ministry of International Trade and Industry(目前為，獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，地3址Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，并給予登錄號(hào)FERM BP-1539。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將AJ12418菌株于1989年1月5日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，并給予登錄號(hào)FERM BP-2205。
“通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的L-氨基酸”優(yōu)選指具有衍生自丙酮酸的碳骨架的L-氨基酸。這類L-氨基酸的實(shí)例包括L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。如本文所用的，“通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生L-氨基酸的能力”，指在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌時(shí)，導(dǎo)致在培養(yǎng)基中積累一種或多種上述L-氨基酸的能力。
產(chǎn)生L-氨基酸的能力可以是棒狀桿菌型細(xì)菌的野生型菌株的原始能力，或是通過(guò)培育被賦予的能力。此外，產(chǎn)生L-氨基酸的能力可以通過(guò)修飾被賦予，所述修飾導(dǎo)致乙酰輔酶A水解酶活性的減少，如后文所述。
為了賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力，可以使用培育棒狀桿菌型細(xì)菌所用的常規(guī)方法，例如創(chuàng)造代謝調(diào)節(jié)突變菌株，或創(chuàng)造目標(biāo)物質(zhì)的生物合成酶的活性增強(qiáng)的重組菌株(見(jiàn)“Amino Acid Fermentation”，Center for AcademicPublications Japan Co.，Ltd.，1st ed.Published on May 30，1986，p.77 to 100)。在這些方法中，可以單獨(dú)或組合使用引入代謝調(diào)節(jié)突變和增強(qiáng)目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的方法。此外，可以引入兩個(gè)或兩個(gè)以上的突變，且可以增強(qiáng)兩個(gè)或兩個(gè)以上的酶活性。
賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的實(shí)例是增強(qiáng)編碼L-谷氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的實(shí)例包括谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、果糖磷酸激酶和葡糖磷酸異構(gòu)酶。
增強(qiáng)這些基因的表達(dá)可以通過(guò)以下方法完成，將含有所述基因的DNA插入適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌中自主復(fù)制，然后用所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞；或通過(guò)同源重組、接合(conjugation)、轉(zhuǎn)座(transposition)等將所述基因整合到染色體上(EP0756007B，EP0332488A EP0771879A)；或在所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域引入突變(WO/0018935)，或以強(qiáng)啟動(dòng)子取代。
當(dāng)上述基因通過(guò)質(zhì)粒引入或整合到染色體上時(shí)，用于表達(dá)這些基因的啟動(dòng)子可以是任何啟動(dòng)子，只要該啟動(dòng)子能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌中起作用。這類啟動(dòng)子的實(shí)例包括lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、PS2啟動(dòng)子和pL啟動(dòng)子。也可以使用每個(gè)基因的天然(native)啟動(dòng)子。
通過(guò)修飾以使檸檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因，和/或谷氨酸脫氫酶基因表達(dá)增強(qiáng)的微生物的實(shí)例包括，在JP2001-333769A(EP1078989A)、JP2000-106869A(EP955368A)、JP2000-189169A(EP952221A)和JP2001-333769A(EP1078989A)中所公開(kāi)的微生物。
賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的修飾也包括減少或消除酶的活性，所述的酶催化除L-谷氨酸之外的化合物的合成，和從L-谷氨酸生物合成途徑分支。這類酶的實(shí)例包括異檸檬酸裂合酶、α-酮戊二酸脫氫酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase)、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(formate acetyltransferase)，乳酸脫氫酶和谷氨酸脫羧酶。
為了減少或消除上述酶的活性，可以在染色體上這些酶的基因處，引入導(dǎo)致酶活性減少或喪失的突變或缺失。這可以通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)，例如，破壞染色體上編碼這些酶的基因，或修飾所述基因的表達(dá)控制序列如啟動(dòng)子和/或Shine Dargarno(SD)序列。另外，可以通過(guò)引入導(dǎo)致氨基酸取代的錯(cuò)義突變、產(chǎn)生終止密碼子的無(wú)義突變、或在編碼區(qū)添加或缺失一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的移碼突變；或通過(guò)缺失該基因的一部分來(lái)減少或消除這些酶的活性(Journalof Biological Chemistry 2728611-8617(1997))。此外，可以通過(guò)如下方法減少或消除這些酶的活性構(gòu)建編碼突變酶的基因，所述基因的編碼區(qū)缺失，并通過(guò)同源重組用所得基因取代染色體基因。α-酮戊二酸脫氫酶活性被減少的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括在JP7-834672A和JP06-237779中公開(kāi)的菌株。
此外，賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的方法實(shí)例包括修飾菌株以增強(qiáng)編碼yggB基因的基因表達(dá)，或修飾菌株以在YggB中引入突變的方法(NCgl 1221；NP_600492.Reports small-conductance...[gi19552490])(美國(guó)專利申請(qǐng)No.60/715131)。
也可以通過(guò)下方法賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力篩選對(duì)有機(jī)酸類似物、呼吸抑制劑、或超氧化物產(chǎn)生物具有抗性的菌株，或篩選對(duì)細(xì)胞壁合成的抑制劑具有敏感性的菌株。這類方法的實(shí)例包括賦予對(duì)苯并吡喃酮(benzopirone)或萘醌(naphtoquinone)的抗性(JP56-1889A)，賦予對(duì)單氟乙酸(monofluoroaceticacid)的抗性(JP 50-113209A)，賦予對(duì)腺嘌呤和胸腺嘧啶的抗性(JP57-065198)，賦予對(duì)HOQNO的抗性(JP56-140895A)，賦予對(duì)α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid)的抗性(JP57-2689A)，賦予對(duì)胍的抗性(JP56-35981A)，賦予對(duì)道諾霉素(daunomicin)的抗性(JP58-158192A)，以及賦予對(duì)青霉素的敏感性(JP04-88994A)。
這類細(xì)菌的具體實(shí)例包括下列菌株黃色短桿菌AJ3949(FERM BP-2632；JP 50-113209A)
谷氨酸棒桿菌AJ11628(FERM P-5736；JP57-065198A)黃色短桿菌AJ11355(FERM P-5007；JP56-1889A)谷氨酸棒桿菌AJ11355(FERM P-5020；JP56-1889A)黃色短桿菌AJ11217(FERM P-4318；JP57-2689A)谷氨酸棒桿菌AJ11218(FERM P-4319；JP57-2689A)黃色短桿菌AJ11564(FERM P-5472；JP56-140895A)黃色短桿菌AJ11439(FERM P-5136；JP56-35981A)谷氨酸棒桿菌H7684(FERM BP-3004；JP04-88994A)乳發(fā)酵短桿菌AJ11426(FERM P5123；JP56-048890A)谷氨酸棒桿菌AJ11440(FERM P5137；JP56-048890A)乳發(fā)酵短桿菌AJ11796(FERM P6402；JP58-158192A)賦予產(chǎn)生L-纈氨酸的能力的方法實(shí)例包括修飾菌株以增強(qiáng)編碼L-纈氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)的方法。L-纈氨酸生物合成酶的實(shí)例包括由ilvBNC操縱子編碼的酶，即，由ilvBN編碼的乙酰羥酸合成酶和由ilvC編碼的異構(gòu)還原酶(isomero-reductase)(WO00/50624)。ilvBNC操縱子受到L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的任何組合的轉(zhuǎn)錄阻抑(transcriptional repression)，所以最好進(jìn)行釋放稀釋(release attenuation)，以避免作為產(chǎn)物的L-纈氨酸的轉(zhuǎn)錄阻抑。
可以通過(guò)減少或消除至少一種酶的活性將產(chǎn)生L-纈氨酸的能力賦予棒狀桿菌型細(xì)菌，所述酶催化減少L-纈氨酸的產(chǎn)生量的反應(yīng)。例如，可以通過(guò)減少催化異亮氨酸合成的蘇氨酸脫水酶的活性，或通過(guò)減少催化D-泛酸(D-panthothenate)合成的酶的活性賦予產(chǎn)生L-纈氨酸的能力(WO00/50624)。
也可以通過(guò)將對(duì)氨基酸類似物等的抗性賦予棒狀桿菌型細(xì)菌來(lái)賦予產(chǎn)生L-纈氨酸的能力。
例如，可以使用對(duì)于L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的，并對(duì)D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的產(chǎn)生L-纈氨酸的突變菌株(FERM P-1841，F(xiàn)ERM P-29，JP-B-53-025034)，對(duì)聚酮化合物有抗性的產(chǎn)生L-纈氨酸的突變菌株(FERM P-1763，F(xiàn)ERM P-1764；JP-B006-065314)，對(duì)L-纈氨酸有抗性，且對(duì)丙酮酸類似物如β-氟丙酮酸(β-fluoropyruvic acid)敏感的產(chǎn)生L-纈氨酸的突變菌株(FERM BP-3006，BP-3007，Patent 3006929)。
具有產(chǎn)生L-丙氨酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括H+-腺苷三磷酸酶(H+-ATPase)活性缺陷的棒狀桿菌型細(xì)菌(Appl Microbiol Biotechnol.2001Nov；57(4)534-40)，以及擴(kuò)增的具有(amplified with)編碼天冬氨酸β-脫羧酶結(jié)構(gòu)基因的棒狀桿菌型細(xì)菌(JP-A-7-163383)。
可以通過(guò)修飾棒狀桿菌型細(xì)菌以增強(qiáng)編碼L-精氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)來(lái)賦予產(chǎn)生L-精氨酸的能力。L-精氨酸生物合成酶的實(shí)例包括N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argC)、鳥(niǎo)氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(argD)、鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合成酶。這些精氨酸生物合成基因存在于Arg操縱子(argCJBDFRGH)上，且受到由argR編碼的精氨酸抑制劑(repressor)的調(diào)控(J Bacteriol.2002 Dec；184(23)6602-14)。因此，精氨酸抑制劑的破壞導(dǎo)致Arg操縱子表達(dá)的增加，因此增強(qiáng)產(chǎn)生L-精氨酸的酶的活性(US2002-0045223)。
賦予產(chǎn)生L-精氨酸的能力的另一種方法是，例如通過(guò)賦予對(duì)氨基酸類似物的抗性。棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括對(duì)2-噻唑丙氨酸(2-thiazolealanine)有抗性，并且對(duì)于L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的棒狀桿菌型細(xì)菌(JP-A-54-044096)；對(duì)酮丙二酸、氟丙二酸(fluoromalonic acid)或單氟乙酸有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(JP-A-57-18989)；對(duì)精氨醇(argininol)有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(JP-B-62-024075)；對(duì)x-胍有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(x是脂肪酸或脂肪鏈衍生物)(JP-A-2-186995)；和對(duì)精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)和6-氮尿嘧啶有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(JP-A-57-150381)。
賦予產(chǎn)生L-谷氨酰胺的能力的方法實(shí)例是通過(guò)修飾棒狀桿菌型細(xì)菌來(lái)增強(qiáng)編碼L-谷氨酰胺生物合成酶的基因的表達(dá)。L-谷氨酰胺生物合成酶的實(shí)例包括谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶(US2003-0003550)。
也可以通過(guò)減少或消除催化反應(yīng)的酶的活性來(lái)賦予產(chǎn)生L-谷氨酰胺的能力，所述反應(yīng)從L-谷氨酰胺生物合成途徑分支、且產(chǎn)生其它化合物。例如，可以通過(guò)減少谷氨酰胺酶的活性來(lái)賦予產(chǎn)生L-谷氨酰胺的能力(US2004-0152175)。
也可以通過(guò)賦予對(duì)L-氨基酸類似物的抗性來(lái)賦予產(chǎn)生L-谷氨酰胺的能力。這些方法的實(shí)例包括，賦予對(duì)于6-重氮-5-氧-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-norleucine)的抗性的方法(JP-A-3-232497)，賦予對(duì)于嘌呤類似物和/或甲硫氨酸亞砜(methionine sulfoxide)的抗性的方法(JP-A-61-202694)，賦予對(duì)于α-酮丙二酸的抗性的方法(JP-A-56-151495)，以及賦予對(duì)于含谷氨酸的肽的抗性的方法(JP-2-186994)。
產(chǎn)生L-谷氨酰胺的棒狀桿菌型細(xì)菌的具體實(shí)例包括以下菌株黃色短桿菌AJ11573(FERM P-5492，JP56-161495A)黃色短桿菌AJ11576(FERM BP-10381，JP56-161495A)黃色短桿菌AJ12212(FERM P-8123，JP61-202694A)黃色短桿菌AJ12418(FERM BP-2205，JP02-186994A)黃色短桿菌DH18(FERM P-11116，JP03-232497A)棲糖蜜棒桿菌DH344(FERM P-11117，JP3-232497A)谷氨酸棒桿菌AJ11574(FERM P-5493，JP56-151495A)賦予產(chǎn)生L-脯氨酸的能力的方法實(shí)例包括修飾棒狀桿菌型細(xì)菌以增強(qiáng)編碼L-脯氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)的方法。L-脯氨酸生物合成酶的實(shí)例包括谷氨酸激酶、γ-谷氨酰磷酸還原酶(γ-glutamyl phosphate reductase)和脯氨酸-5-羧化物還原酶(pyroline-5-carboxylate reductase)(J Bacteriol.1996Aug；178(15)4412-9.)。
也可以通過(guò)減少或消除催化反應(yīng)的酶的活性賦予產(chǎn)生L-脯氨酸的能力，所述反應(yīng)從L-脯氨酸生物合成途徑分支、并產(chǎn)生其它化合物。例如，可以通過(guò)減少鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ornithine-aminotransferase)的活性來(lái)賦予產(chǎn)生L-脯氨酸的能力(J Bacteriol.1996 Aug；178(15)4412-9.)。
同時(shí)，因?yàn)長(zhǎng)-精氨酸、L-谷氨酰胺和L-脯氨酸含有L-谷氨酸作為碳骨架，所以可以通過(guò)擴(kuò)增編碼酶的基因賦予產(chǎn)生這些氨基酸的能力，所述酶在上述產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌中，催化導(dǎo)致從L-谷氨酸產(chǎn)生上述每種L-氨基酸的反應(yīng)。
此外，由于L-丙氨酸是通過(guò)L-天冬氨酸的β-脫羧合成的，所以可以通過(guò)修飾產(chǎn)生L-天冬氨酸的細(xì)菌以使乙酰輔酶A水解酶活性減少來(lái)獲得產(chǎn)生L-丙氨酸的細(xì)菌。
通過(guò)育種賦予或增強(qiáng)L-賴氨酸生產(chǎn)力可以通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)下列的突變來(lái)進(jìn)行。這樣的人工突變體如下所示對(duì)于S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(在下文中稱為“AEC”)具有抗性的突變體；生長(zhǎng)需要氨基酸例如L-高絲氨酸的突變體(參見(jiàn)日本專利公布號(hào)4828078和566499)；對(duì)于AEC具有抗性且需要氨基酸例如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸等的突變體(參見(jiàn)美國(guó)專利3,708,395和3,825,472)；對(duì)于DL-氨基己內(nèi)酰胺、氨基月桂基內(nèi)酰胺(aminolauryllactam)、天冬氨酸類似物、磺胺類藥、醌型化合物和N-月桂基亮氨酸(N-lauroylleucine)具有抗性的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體，和對(duì)于草酰乙酸脫羧酶或呼吸系統(tǒng)酶抑制劑具有抗性的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體(參見(jiàn)日本專利Laid-Open編號(hào)5053588，5031093，52102498，539394，5386089，559783，559759，5632995和5639778，日本專利公布號(hào)5343591和531833)；需要肌醇或乙酸的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體(見(jiàn)日本專利Laid-Open編號(hào)559784和568692)；對(duì)于氟丙酮酸或?qū)?4℃或更高的溫度敏感的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變體(見(jiàn)日本專利LaidOpen編號(hào)5386090)；對(duì)于乙二醇具有抗性的短桿菌和棒桿菌的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體(見(jiàn)美國(guó)專利4,411,997)。
賦予產(chǎn)生L-賴氨酸的能力的方法實(shí)例是增強(qiáng)編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)。參與了L-賴氨酸生物合成的酶的實(shí)例包括，但不限于二氨基庚二酸途徑酶，如二氫吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dihydrodipicolinatedreductase)基因(dapB)、二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)(上述所有；國(guó)際公布號(hào)96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因(ppc)(日本專利申請(qǐng)Laid-Open編號(hào)60-87788)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因(aspC)(日本專利公布號(hào)6-102028)、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶基因(dapF)(日本專利申請(qǐng)Laid-Open編號(hào)2003-135066)和天冬氨酸半醛脫氫酶(aspartate semialdehydedehydrogenease)基因(asd)(國(guó)際公布號(hào)00/61723)；和氨基己二酸途徑酶，如同型烏頭酸水合酶(homoaconitate hydratase)基因(日本專利申請(qǐng)Laid-Open編號(hào)2000-157276)。
此外，本發(fā)明的細(xì)菌可具有減少的催化反應(yīng)的酶的活性，或者可使所述酶具有缺陷，所述反應(yīng)通過(guò)從L-賴氨酸生物合成途徑分支，生成除L-賴氨酸之外的產(chǎn)物。催化反應(yīng)的酶包括高絲氨酸脫氫酶和賴氨酸脫羧酶，所述反應(yīng)通過(guò)從L-賴氨酸生物合成途徑分支生成除L-賴氨酸之外的產(chǎn)物。這些酶的活性減少的菌株在WO95/23864和WO96/178930中有所描述。
<2>減少乙酰輔酶A水解酶活性的修飾如上所述本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力，所述L-氨基酸是通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的，且經(jīng)過(guò)修飾以使乙酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.1)活性減少。
本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌可以通過(guò)以下方法獲得，修飾上述的具有通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生L-氨基酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，以使乙酰輔酶A水解酶活性減少。培育本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌時(shí)，賦予細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的能力，或修飾細(xì)菌以使乙酰輔酶A水解酶活性減少，可以以任何順序進(jìn)行。
“乙酰輔酶A水解酶(ACH)活性”指催化從乙酰輔酶A和水產(chǎn)生乙酸的活性。“修飾以使乙酰輔酶A水解酶活性減少”的含義是乙酰輔酶A水解酶活性低于未修飾的菌株，包括野生型棒狀桿菌型細(xì)菌。與未修飾的菌株相比，每單位細(xì)胞重量的ACH活性優(yōu)選減少到50％或以下，更優(yōu)選30％或以下，還更優(yōu)選10％或以下。在此，作為對(duì)照的野生型棒狀桿菌型細(xì)菌包括，例如，乳發(fā)酵短桿菌2256菌株(ATCC 13869)或谷氨酸棒桿菌ATCC 13032；(被用作對(duì)照的)未修飾的菌株包括乳發(fā)酵短桿菌Δldh菌株。乙酰輔酶A水解酶活性可以根據(jù)Gergely，J.等的方法測(cè)量(Gergely，J.，Hele，P.&Ramkrishnan，C.V.(1952)J.Biol.Chem.198p323-334)?！皽p少”包括活性完全消失的情況。優(yōu)選的是，本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌具有的乙酰輔酶A水解酶活性比野生型或未修飾的菌株低，且引起的L-氨基酸積累比野生型或未修飾的菌株高。
ACH的實(shí)例包括含有SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，和包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列，其中在一個(gè)或多個(gè)位置取代、缺失、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，但保留了ACH活性的蛋白質(zhì)。盡管此處所指的“幾個(gè)”氨基酸殘基的數(shù)量可能依據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸殘基的三維結(jié)構(gòu)中的位置或種類而不同，但可以優(yōu)選為2到20個(gè)，更優(yōu)選2到10個(gè)，特別優(yōu)選2到5個(gè)。在保留ACH活性的同時(shí)，ACH基因編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO24所示氨基酸序列的同源性優(yōu)選不低于80％，更優(yōu)選不低于90％，還更優(yōu)選不低于95％，特別優(yōu)選不低于97％。這些ACH同源物中的氨基酸取代優(yōu)選為保守取代，包括以ser或thr取代ala，以gln、his或lys取代arg，以glu、gln、lys、his或asp取代asn，以asn、glu或gln取代asp，以ser或ala取代cys，以asn、glu、lys、his、asp或arg取代gln，以gly、asn、gin、lys或asp取代glu，以pro取代gly，以asn、lys、gln、arg或tyr取代his，以leu、met、val或phe取代ile，以ile、met、val或phe取代leu，以asn、glu、gln、his或arg取代lys，以ile、leu、val或phe取代met，以trp、tyr、met、ile或leu取代phe，以thr或ala取代ser，以ser或ala取代thr，以phe或tyr取代trp，以his、phe或trp取代tyr和以met、ile或leu取代val。
“修飾以使乙酰輔酶A水解酶活性減少”包括每個(gè)細(xì)胞中乙酰輔酶A水解酶分子數(shù)量減少的情況，和每分子輔酶A水解酶活性減少的情況。具體地說(shuō)，這些修飾可以通過(guò)以下方法完成，例如，破壞染色體上編碼乙酰輔酶A水解酶的基因，或修飾表達(dá)調(diào)控序列，如啟動(dòng)子和/或Shine-Dalgarno(SD)序列。染色體上的乙酰輔酶A水解酶基因包括，例如，包含SEQ ID NO23的核苷酸1037到2542的DNA。此外，乙酰輔酶A水解酶基因包括，例如，通過(guò)使用引物SEQ ID 7和8用PCR方法可獲得的DNA。另外，染色體上的乙酰輔酶A水解酶基因可以是在嚴(yán)緊條件下能夠與SEQ ID No.23的核苷酸1037到2542或可由所述核苷酸制備的探針雜交的DNA，只要其編碼具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋白質(zhì)。“嚴(yán)緊條件”指這樣的條件，在該條件下，形成所謂的特異性雜交，而不形成所謂的非特異性的雜交。盡管難以用數(shù)值清晰地說(shuō)明這些條件，但這些條件的實(shí)例包括，在60℃，并在對(duì)應(yīng)于1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS的鹽濃度，進(jìn)行一次，優(yōu)選兩次或三次洗滌。
可以通過(guò)合成基于谷氨酸棒桿菌的核苷酸序列(例如，SEQ ID No.23，NCgl2480 of Gen Bank登錄號(hào)NC 003450(NC 003450的2729376到2730884的互補(bǔ)鏈))的合成寡核苷酸，并使用谷氨酸棒桿菌的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR來(lái)克隆乙酰輔酶A水解酶基因(在下文中稱為“ach基因”)。另外，源自棒狀桿菌型細(xì)菌如乳發(fā)酵短桿菌的另一個(gè)核苷酸序列也是可用的?？梢杂砂魻顥U菌型細(xì)菌作為DNA供體，通過(guò)例如Saito和Miura的方法(H.Saitoand K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，“BiotechnologyExperiments Handbook”，ed.By The Society for Biotechnology Japan，p.97 to 98，Baifukan，1992)制備染色體DNA。
由此制備的ach基因或其部分可用于破壞染色體ach基因。另外，用于破壞染色體ach基因的ach基因也可以是具有足夠同源性以導(dǎo)致與目標(biāo)棒狀桿菌型細(xì)菌染色體上的ach基因同源重組的基因(例如，具有SEQ ID NO23的核苷酸1037到2542的基因)。這里，足夠引起同源重組的同源性優(yōu)選80％或以上，更優(yōu)選90％或以上，還更優(yōu)選95％或以上，特別優(yōu)選97％或以上。此外，在嚴(yán)緊條件下可以與上述基因雜交的DNA也可以被用于基因破壞。
可通過(guò)如下方法破壞ach基因，例如，制備“缺失型ach基因”，其中ach基因的部分序列缺失，以至于不產(chǎn)生功能正常的乙酰輔酶A水解酶，用含有此缺失型ach基因的DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌，以導(dǎo)致缺失型ach基因和染色體上ach基因之間的重組。這種利用同源重組進(jìn)行基因置換的基因破壞已經(jīng)被建立，并包括使用線性DNA的方法，或使用含溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法(美國(guó)專利6,303,383或JP-A-05-007491)。利用同源重組進(jìn)行基因置換的基因破壞也可以通過(guò)使用在棒狀桿菌型細(xì)菌中無(wú)法復(fù)制的質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選使用在棒狀桿菌型細(xì)菌中無(wú)法復(fù)制，但在埃希氏菌屬細(xì)菌(Escherichiabacteria)中能夠復(fù)制的質(zhì)粒。這種質(zhì)粒的實(shí)例包括pHSG299(Takara Bio)和pHSG399(Takara Bio)。
可以用缺失型ach基因，例如，通過(guò)使用sacB(Schafer，A.et al.，Gene 145(1994)69-73)的同源重組來(lái)替換染色體ach基因。sacB基因編碼果聚糖蔗糖酶，且用于有效地選擇菌株，在所述菌株中染色體目標(biāo)基因被突變基因所取代，并將載體部分從染色體中消除(cured)。
首先，可以通過(guò)以下方法制備重組質(zhì)粒在具有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒中，插入缺失型(突變體)ach基因、sacB基因和選擇標(biāo)記，如氯霉素抗性基因。將所得質(zhì)粒引入棒狀桿菌型細(xì)菌的宿主菌株。當(dāng)果聚糖蔗糖酶在棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，由蔗糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的果聚糖對(duì)于細(xì)菌是致死的，因此該細(xì)菌無(wú)法在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所以，通過(guò)在含有蔗糖的平板中培養(yǎng)，可選擇菌株，所述菌株中在質(zhì)粒的突變體ach基因和染色體ach基因之間發(fā)生取代，并由此將質(zhì)粒的其他部分從細(xì)胞中消除。
sacB基因的實(shí)例包括下列枯草芽孢桿菌(Bacillus subillus)sacB GenBank登錄號(hào)X02730(SEQ IDNO19)解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliqufaciens)sacB GenBank登錄號(hào)X52988運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)sacB GenBank登錄號(hào)L33402嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)surB GenBank登錄號(hào)U34874Lactobacillus sanfranciscensisfrfA GenBank登錄號(hào)AJ508391
Acetobacter xylinuslsxA GenBank登錄號(hào)AB034152Gluconacetobacter diazotrophicuslsdA GenBank登錄號(hào)L41732可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如，可以使用以氯化鈣處理受體細(xì)胞從而增加DNA通透性的方法，其已被報(bào)導(dǎo)用于大腸桿菌(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，以及使用由生長(zhǎng)細(xì)胞制備的感受態(tài)細(xì)胞以引入DNA的方法，其以被報(bào)導(dǎo)用于枯草芽孢桿菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.andYoung，F(xiàn).E.，Gene，1，153(1977))。除了這些方法之外，可以使用將重組DNA引入到原生質(zhì)體-樣或原生質(zhì)球-樣(protoplast-or spheroplast-like)受體細(xì)胞中的方法，其已被報(bào)導(dǎo)可用于枯草芽孢桿菌、放線菌類(actinomytetes)和酵母(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，.A.Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.USA，75，1929(1978))。此外，棒狀桿菌型細(xì)菌的轉(zhuǎn)化還可以通過(guò)電脈沖法進(jìn)行(Sugimoto et al.，JP2-207791A)。
用于棒狀桿菌型細(xì)菌的溫度敏感性質(zhì)粒的實(shí)例包括p48K和pSFKT2(EP1038966)、pHSC4(法國(guó)專利Laid-open公布號(hào)2667875，1992和JP5-7491A)、pBS5T等等。在棒狀桿菌型細(xì)菌中，這些質(zhì)?？梢栽谥辽贋?5℃的溫度自主復(fù)制，但不能在37℃的溫度自主復(fù)制。含有pHSC4的AJ12571菌株依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1991年8月26日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade andIndustry)(目前為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，其地址為T(mén)sukuba Central 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-5466，Japan)，并給予保藏號(hào)FERMBP-3524。
在溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)不起作用的溫度(例如25℃)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的菌株，以獲得已引入所述質(zhì)粒的菌株。然后，在高溫下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以消除溫度敏感性質(zhì)粒，并涂布在含抗生素藥物如卡那霉素的平板培養(yǎng)基上。雖然消除了所述質(zhì)粒的菌株不能在含這種抗生素藥物的平板上生長(zhǎng)，但其中染色體ach基因用突變的ach基因取代的少數(shù)菌株能夠生長(zhǎng)并作為菌落出現(xiàn)。
在這種將含突變ach基因的重組DNA整合到染色體DNA的菌株中，重組DNA導(dǎo)致了與原來(lái)存在于染色體上的ach基因的重組，并將染色體ach基因與突變ach基因的融合基因插入到染色體，以使重組DNA的其它部分(載體區(qū)段、溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)和藥物抗性標(biāo)記)存在于融合基因之間。然后，為了在染色體DNA上只留下突變的ach基因，將一個(gè)拷貝的ach基因連同載體區(qū)段(包括溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)和藥物抗性標(biāo)記)從染色體DNA消除。在這種情況下，正常ach基因被留在染色體DNA上，并將突變的ach基因從染色體DNA中消除，或者相反，將突變的ach基因留在染色體DNA上，并將正常的ach基因從染色體DNA中消除。然后，可以通過(guò)使用PCR、Southern雜交等選擇在染色體上只留下突變ach基因的菌株。
減少乙酰輔酶A水解酶活性也可以通過(guò)修飾表達(dá)調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、Shine-Dalgarno(SD)序列、操縱子、終止子或衰減子(attenuator)來(lái)實(shí)現(xiàn)。染色體上的表達(dá)調(diào)控序列可以通過(guò)基因分析軟件如Genetix，通過(guò)用于表達(dá)分析的載體如啟動(dòng)子搜索載體(promoter-searching vector)，以及通過(guò)已知的信息，如Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定。例如，減少乙酰輔酶A水解酶活性的突變實(shí)例包括，修飾乙酰輔酶A水解酶基因的啟動(dòng)子區(qū)以使其效力減少的突變，和破壞乙酰輔酶A水解酶基因啟動(dòng)子區(qū)共有序列的突變?？梢酝ㄟ^(guò)使用不能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的溫度敏感性質(zhì)粒或自殺載體(suicide vector)來(lái)引入這些突變。
減少乙酰輔酶A水解酶活性也可以通過(guò)以下方法完成在染色體上乙酰輔酶A水解酶基因的編碼區(qū)引入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)；引入終止密碼子(無(wú)義突變)；通過(guò)添加或缺失一個(gè)或兩個(gè)核苷酸引入移碼突變；或缺失基因的一部分(Journal of Biologial Chemistry 2728611-8617(1997))。
減少乙酰輔酶A水解酶活性的實(shí)例還包括如下方法用紫外線照射或用在常規(guī)突變處理中使用的致突變?cè)?mutagen)如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸處理棒狀桿菌型細(xì)菌，以選擇乙酰輔酶A水解活性減少的菌株(“Amino Acid Fermentation”，Center for Academic Publications Japan Co.，Ltd.，1st ed.Published on May 30，1986，p.77至100)。
同時(shí)，本發(fā)明中優(yōu)選使用被進(jìn)一步修飾以使谷氨酸脫氫酶(以下稱為“GDH”)活性增強(qiáng)的菌株。
為使具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力、且經(jīng)修飾以減少ACH活性的棒狀桿菌型細(xì)菌中的GDH活性得到擴(kuò)增，將編碼GDH的基因片段連接到可在棒狀桿菌型細(xì)菌中起作用的載體，優(yōu)選連接到多拷貝型載體上以制備重組DNA，再用得到的DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌。由于轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中編碼GDH的基因拷貝數(shù)增加，GDH活性得到擴(kuò)增。
編碼GDH的基因可以源自棒狀桿菌型細(xì)菌或可源自其他生物體如大腸桿菌。
已經(jīng)鑒定了編碼棒狀桿菌型細(xì)菌的GDH的基因(gdh基因)的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO25Molecular Microbiology(1992)6(3)，317-326 1999，NC_003450的2194739..2196082的互補(bǔ)鏈)，所以gdh基因可以使用基于所述核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物和棒狀桿菌型細(xì)菌的染色體DNA作為模板通過(guò)PCR獲得(PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；White，T.J.et al.；Trends Genet.5，185(1989))。編碼其他微生物的GDH的基因也可以以相同方式獲得。
<3>使用本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸可通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述得到的棒狀桿菌型細(xì)菌以產(chǎn)生所述L-氨基酸，并導(dǎo)致所述L-氨基酸的積累，和從培養(yǎng)基中收集所述L-氨基酸，從而有效地產(chǎn)生使用丙酮酸作為中間物產(chǎn)生的L-氨基酸。
為了使用本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌產(chǎn)生這些L-氨基酸，可以通過(guò)常規(guī)方法用普通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述普通培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和(如果需要的話，)痕量的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，如氨基酸和維生素。可以使用合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中使用的碳源和氮源可以是任何種類的，只要它們能夠被本發(fā)明中菌株所利用。
碳源的實(shí)例包括糖類，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜。此外，有機(jī)酸類如檸檬酸和蘋(píng)果酸，和醇類如乙醇，可以單獨(dú)使用或與其他碳源組合使用。
氮源的實(shí)例包括氨，銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨，以及硝酸鹽。
可以痕量存在的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物的實(shí)例包括氨基酸、維生素、脂肪酸和核酸，并可以使用含有這些營(yíng)養(yǎng)物的蛋白胨(peptone)、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白水解物。在使用其生長(zhǎng)需要氨基酸等的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株的情況下，優(yōu)選補(bǔ)充所需的營(yíng)養(yǎng)物。
無(wú)機(jī)鹽的實(shí)例包括磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽和錳鹽。
在需氧條件下在20到45℃的發(fā)酵溫度、同時(shí)將pH調(diào)整為5到9進(jìn)行培養(yǎng)。如果培養(yǎng)過(guò)程中pH降低，可以在培養(yǎng)基中加入碳酸鈣或堿，如氨氣來(lái)中和。大約10到120小時(shí)的培養(yǎng)導(dǎo)致可觀量的L-氨基酸的積累。
培養(yǎng)完成后，通過(guò)公知的回收方法從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。例如，將細(xì)胞從培養(yǎng)液中去除后，通過(guò)濃縮和結(jié)晶來(lái)收集L-氨基酸。
實(shí)施例在下文中，通過(guò)下列非限制性實(shí)施例更加具體地解釋本發(fā)明。
實(shí)施例1<1>構(gòu)建攜帶sacB基因的破壞載體(A)構(gòu)建pBS3使用枯草芽孢桿菌的染色體DNA作為模板，和SEQ ID NOS1和2的寡核苷酸作為引物，通過(guò)PCR獲得了sacB基因(SEQ ID NO19)。使用LA taq(由TaKaRa制造)如下進(jìn)行PCR在94℃貯熱(heat retention)5分鐘的一個(gè)循環(huán)；和94℃變性30秒、49℃退火30秒和72℃延伸2分鐘的25個(gè)循環(huán)。用常規(guī)方法純化所得PCR產(chǎn)物，然后用BglII和BamHI消化并平端化。將所述片段插入到已用AvaII消化且平端化的pHSG299中。所得DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(由TAKARA BIO INC.制造)的感受態(tài)細(xì)胞。然后，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞涂布到含25μg/ml卡那霉素(以下縮寫(xiě)為″Km″)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，溫育一夜。此后，分離單菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將具有目的PCR產(chǎn)物的插入物的質(zhì)粒命名為pBS3。圖1顯示了構(gòu)建pBS3的方法。
(B)構(gòu)建pBS4S使用不引起氨基酸取代的交換(cross-over)PCR通過(guò)核苷酸取代來(lái)修飾pBS3上卡那霉素抗性基因中的SmaI識(shí)別位點(diǎn)，從而使pBS3不被內(nèi)切酶(endnuclease)SmaI切斷。首先，使用pBS3作為模板和SEQ ID NOS3和4的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以由此獲得卡那霉素抗性基因的N末端片段。另一方面，為了獲得卡那霉素抗性基因的C末端片段，使用pBS3作為模板和SEQ ID NOS5和6的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR。使用PyrobestDNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)如下進(jìn)行PCR以獲得目標(biāo)PCR產(chǎn)物在98℃貯熱5分鐘的一個(gè)循環(huán)；以及98℃變性10秒、57℃退火30秒、72℃延伸1分鐘的25個(gè)循環(huán)。SEQ ID NOS4和5彼此部分互補(bǔ)，且不包含SmaI識(shí)別位點(diǎn)。然后，為了獲得不含SmaI識(shí)別位點(diǎn)的突變卡那霉素抗性基因的全長(zhǎng)片段，將上述N末端和C末端基因產(chǎn)物以基本上等摩爾量混合在一起。使用所述基因產(chǎn)物作為模板和SEQ ID NOS3和6的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以獲得SmaI位點(diǎn)修飾的卡那霉素抗性基因片段。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)如下進(jìn)行PCR以獲得目標(biāo)PCR產(chǎn)物在98℃貯熱5分鐘的一個(gè)循環(huán)；以及98℃變性10秒、57℃退火30秒、72℃延伸1.5分鐘的25個(gè)循環(huán)。
用常規(guī)方法純化PCR產(chǎn)物，然后用BanII消化，然后插入到pBS3的上述BanII識(shí)別位點(diǎn)中。將所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(可由Takara Bio得到)。即，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞涂布到含有25μg/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并溫育一夜。此后，選擇出現(xiàn)的菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒，并將具有目的PCR產(chǎn)物的插入物的質(zhì)粒命名為pBS4S。圖2顯示了構(gòu)建pBS4S的方法。
(C)構(gòu)建pBS5T通過(guò)利用BamHI和SmaI消化棒狀桿菌型細(xì)菌中的溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)和平端化，將其從pHSC4(JP-A-5-7491)中切除，并插入pBS4S的平端化的NdeI位點(diǎn)。使用所得DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(由TAKARABIO INC.制造)，并涂布到含有25μg/ml Km的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)過(guò)夜。然后，分離單菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將具有目的PCR產(chǎn)物的插入物的質(zhì)粒命名為pBS5T。圖3顯示了構(gòu)建pBS5T的方法。
實(shí)施例2<構(gòu)建ldh-破壞的菌株>
(A)克隆破壞乳酸脫氫酶基因的片段使用基于谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株(SEQ ID NO21GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NC_003450)的乳酸脫氫酶基因(以下縮寫(xiě)為“l(fā)dh基因”)的核苷酸序列設(shè)計(jì)的合成DNA通過(guò)交換PCR得到含有源自缺失了ORF的乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的ldh基因的基因片段。具體來(lái)說(shuō)，使用乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS7和8的合成DNA作為引物通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行PCR，以獲得ldh基因的N末端片段。另一方面，為了獲得ldh基因的C末端片段，使用乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS9和10的合成DNA作為引物，通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行PCR。SEQ IDNOS8和9彼此互補(bǔ)，且被設(shè)計(jì)以導(dǎo)致ldh基因的ORF全部序列的缺失。
然后，為了獲得缺失內(nèi)部序列的ldh基因片段，將ldh的N末端和C末端基因產(chǎn)物以基本上等摩爾量混合，且使用所述混合物作為模板和SEQ IDNOS11和12的合成DNA作為引物，通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行PCR。在以常規(guī)方式純化PCR產(chǎn)物之后，用SalI消化PCR產(chǎn)物。其后，將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入上述pBS4S的SalI位點(diǎn)。用所得DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(由TAKARABIO INC.制造)，并涂布到含有100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后過(guò)夜培養(yǎng)。其后分離單菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將具有目的PCR產(chǎn)物的插入物的質(zhì)粒命名為pΔldh56-1。圖4顯示了所述質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
(B)制備ldh-破壞的菌株由于上述(A)中所制備的pΔldh56-1不含有使其能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌中自主復(fù)制的區(qū)域，當(dāng)以此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌時(shí)，通過(guò)同源重組將所述質(zhì)粒整合入染色體的轉(zhuǎn)化體菌株所出現(xiàn)的頻率極低。因此，使用含有高濃度pΔldh56-1質(zhì)粒的溶液通過(guò)電脈沖法轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌2256菌株，然后涂布到含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基(5g/L葡萄糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/L MnSO4·7H2O、3g/L尿素和1.2g/L大豆水解物，和pH 7.5(KOH))上，在31.5℃培養(yǎng)約30小時(shí)。出現(xiàn)在此培養(yǎng)基上的菌落是這樣的菌株，其中在質(zhì)粒的ldh基因片段和乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體上的ldh基因之間發(fā)生了同源重組，并將卡那霉素抗性基因和源自質(zhì)粒的SacB基因插入該染色體。
然后，在不含卡那霉素的CM-Dex液體培養(yǎng)基中，于31.5℃將這些第一次重組體(first recombinant)培養(yǎng)一夜。在適當(dāng)?shù)南♂尯?，將重組體涂布到含蔗糖10％的Dex-S10瓊脂培養(yǎng)基(10g/L蔗糖、10g/L聚胨、10g/L酵母提取物、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/LMnSO4·4H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解物和10μg/L生物素，和pH 7.5(KOH))上并在31.5℃培養(yǎng)約30小時(shí)。結(jié)果，獲得約50個(gè)菌株，其中通過(guò)二次重組消除sacB基因，且成為蔗糖非敏感性的。
由此獲得的菌株包括染色體ldh基因被源自pΔldh56-1的突變型取代的菌株，以及保留了染色體野生型ldh基因的菌株。通過(guò)將在Dex-S10瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的細(xì)胞進(jìn)行直接PCR(direct PCR)，容易地檢查ldh基因是突變型還是野生型。使用PCR擴(kuò)增的引物(SEQ ID NOS7和10)分析ldh基因，選擇其PCR產(chǎn)物小于野生型ldh基因的菌株作為ldh破壞的菌株，并被命名為2256Δ(ldh)菌株，所述野生型ldh基因是使用野生型2256菌株的染色體DNA作為模板擴(kuò)增的。所得菌株被用作親本菌株用于制備下述ach基因破壞的菌株。
當(dāng)發(fā)酵在厭氧條件下進(jìn)行時(shí)，積累相當(dāng)大量的乳酸作為副產(chǎn)品，所以乳酸脫氫酶活性缺乏是優(yōu)選的(JP 11-206385；J Mol Microbio Biotechnol.2004；7(4)182-96.)。然而，L-谷氨酸通常在乳酸脫氫酶不起作用的有氧條件下產(chǎn)生，并且無(wú)需在乙酰輔酶A水解酶基因破壞的菌株中破壞ldh基因而用于產(chǎn)生L-谷氨酸。
實(shí)施例3<構(gòu)建乙酰輔酶A水解酶破壞的菌株>
(A)克隆用于破壞乙酰輔酶A水解酶基因的片段使用基于谷氨酸棒桿菌ATCC13032(SEQ ID NO23GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NC 003450)乙酰輔酶A水解酶基因(以下該基因縮寫(xiě)為“ach”)的核苷酸序列設(shè)計(jì)的合成DNA，通過(guò)交換PCR獲得含有ach基因的基因片段，所述ach基因源自缺失ORF的乳發(fā)酵短桿菌2256菌株。具體來(lái)說(shuō)，使用乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS13和14的合成DNA作為引物通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行PCR，以獲得ach基因的C末端片段。另一方面，為了獲得N末端片段，使用乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS15和16的合成DNA作為引物通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行PCR。SEQID NOS14和15彼此部分互補(bǔ)。利用KOD-plus(由TOYOBO Co.，LTD.制造)進(jìn)行PCR反應(yīng)。在進(jìn)行了94℃貯熱2分鐘的一個(gè)循環(huán)之后，將如下步驟重復(fù)30個(gè)循環(huán)在94℃變性10秒、55℃退火30秒、68℃延伸50秒。然后，為了獲得缺失內(nèi)部序列的ach基因片段，將ach基因的N末端片段和C末端片段以基本上等摩爾量混合在一起。使用所述混合產(chǎn)物作為模板和SEQ ID NOS17和18的合成DNA作為引物通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行PCR。用KOD-plus(由TOYOBO Co.，LTD.制造)進(jìn)行PCR反應(yīng)。進(jìn)行了在94℃保持(retention)2分鐘的一個(gè)循環(huán)之后，將如下步驟重復(fù)30個(gè)循環(huán)94℃變性10秒、55℃退火30秒、68℃延伸90秒。在通過(guò)常規(guī)方式純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物之后，用XbaI消化PCR產(chǎn)物，并將其插入到上述實(shí)施例1(B)中所構(gòu)建的pBS4S的XbaI位點(diǎn)中。用所得DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109的感受態(tài)細(xì)胞(由TAKARA BIO INC.制造)，并涂布到含有100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km的LB瓊脂培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)一夜。此后，分離白色單菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將具有目的PCR產(chǎn)物的插入物的質(zhì)粒命名為pBS4S::Δach。圖5顯示了構(gòu)建pBS4S::Δach的方法。
(B)制備ach破壞的菌株由于上述(A)中所制備的pBS4S::Δach不含使其能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞中自主復(fù)制的區(qū)域，當(dāng)以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌時(shí)，通過(guò)同源重組將所述質(zhì)粒并入其染色體的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)的頻率極低。因此，使用含有高濃度pBS4S::Δach質(zhì)粒的溶液通過(guò)電脈沖法轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌2256Δ(ldh)菌株，并涂布到含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上，在31.5℃培養(yǎng)約30小時(shí)。出現(xiàn)在此培養(yǎng)基上的菌株是這樣的菌株，其中在質(zhì)粒的缺失型(deletion-type)ach基因片段和乳發(fā)酵短桿菌2256Δ(ldh)菌株的染色體上的ach基因之間發(fā)生了同源重組，并將卡那霉素抗性基因和源自質(zhì)粒的SacB基因插入染色體中。
然后，在不含卡那霉素的CM-Dex液體培養(yǎng)基中，于31.5℃將這些第一次重組體培養(yǎng)一夜。在適當(dāng)?shù)南♂尯?，將重組體涂布到含蔗糖10％的Dex-S10瓊脂培養(yǎng)基上，并在31.5℃培養(yǎng)約30小時(shí)。結(jié)果，獲得約50個(gè)菌株，其中通過(guò)二次重組從染色體消除sacB基因，且成為蔗糖非敏感性的。
由此獲得的菌株包括染色體ach基因被源自pBS4S::Δach的突變型取代的菌株，以及保留了染色體野生型ach基因的菌株。通過(guò)將在Dex-S10瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的細(xì)胞進(jìn)行直接PCR，容易地確定ach基因是突變型還是野生型。使用引物(SEQ ID NOS13和16)分析ach基因后，對(duì)于野生型ach基因擴(kuò)增2.9kb的DNA片段和對(duì)于突變型ach基因擴(kuò)增1.4kb的DNA片段。作為通過(guò)上述方法分析蔗糖非敏感性菌株的結(jié)果，選擇出只含有突變型ach基因的菌株，并將從2256Δ(ldh)獲得的ach破壞的菌株命名為2256Δ(ldh，ach)菌株。
實(shí)施例4<利用ach破壞的菌株產(chǎn)生L-谷氨酸>
(1)評(píng)價(jià)ach破壞的菌株的產(chǎn)生L-谷氨酸的能力如下在S型釜(S-type jar)中培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株用于產(chǎn)生L-谷氨酸。將各一環(huán)(loop)在CMDex瓊脂平板上培養(yǎng)的2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株接種到300ml的種子培養(yǎng)基(seed medium)(每1L純化水(purified water)中60g葡萄糖、1.54g H3PO4、1.45g KOH、0.9g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、670μg VB1·HCl、40μg生物素、1.54g大豆水解物、0.28g DL-甲硫氨酸和0.1ml AZ-20R(用氨水調(diào)節(jié)至pH 7.2))，以1/1vvm通氣培養(yǎng)直到殘?zhí)潜煌耆模瑫r(shí)控制pH為7.2(NH3)，溫度為31.5℃，且PL＞0。
將30ml培養(yǎng)液接種到270ml主培養(yǎng)基(main culture medium)(每1L純化水中80g葡萄糖、3.46g KH2PO4、1g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnSO4·4-5H2O、230μg VB1·HCl、0.35g大豆水解物、和0.2ml AZ-20R(用氨調(diào)節(jié)至pH 7.3))中，在1/1vvm通氣條件下培養(yǎng)，同時(shí)控制溫度為31.5℃，pH為7.3，且PL＞0。在殘?zhí)潜煌耆闹?，加?0至80ml料液(feedsolution)，培養(yǎng)液由每1L純化水500g葡萄糖和0.2ml AZ-20R組成，并繼續(xù)培養(yǎng)到殘?zhí)峭耆幌摹?br> 結(jié)束培養(yǎng)之后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?，在Biotech Analyzer AS210(由Asahi Kasei Corporation制造)中分析培養(yǎng)液中所積累的L-谷氨酸(Glu)的量。表1顯示了結(jié)果。
表1 通過(guò)ach缺陷型菌株產(chǎn)生L-谷氨酸


與2256Δ(ldh)菌株(親本菌株)相比，2256Δ(ldh，ach)菌株在產(chǎn)率上顯示約2％的改進(jìn)。此外，作為L(zhǎng)-谷氨酸前體的α-酮戊二酸(α-KG)的積累量改進(jìn)了約三倍。此結(jié)果顯示，減少或消除ACH活性在L-谷氨酸的產(chǎn)生中是有效的。
實(shí)施例5<通過(guò)ach缺陷型菌株產(chǎn)生L-丙氨酸和L-纈氨酸>
(1)評(píng)價(jià)ach缺陷型菌株的培養(yǎng)如下在S型釜中培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株用于產(chǎn)生L-丙氨酸和L-纈氨酸。將各一環(huán)在CMDex瓊脂平板上培養(yǎng)的2256Δ(ldh)菌株和2256Δ(ldh，ach)菌株，接種到300ml種子培養(yǎng)基(每1L純化水60g葡萄糖、1.54g H3PO4、1.45g KOH、0.9g MgSO4·7H2O、0.01gFeSO4·7H2O、670μg VB1·HCl、40μg生物素、1.54g大豆水解物、0.28g DL-甲硫氨酸和0.1ml AZ-20R(用氨水調(diào)節(jié)至pH 7.2))中，并以1/1vvm通氣培養(yǎng)直到殘?zhí)峭耆?，同時(shí)用氨控制pH為7.2，溫度為31.5℃，且PL＞0。
將30ml培養(yǎng)液接種到270ml主培養(yǎng)基(每1L純化水80g葡萄糖、3.46g KH2PO4、1g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnSO4·4-5H2O、230μg VB1·HCl、0.35g大豆水解物和0.2ml AZ-20R(用氨調(diào)節(jié)至pH 7.3))中，并在1/1vvm通氣條件下培養(yǎng)，同時(shí)控制溫度為31.5℃，pH為7.3，且PL＞0。在殘?zhí)潜煌耆闹?，加?0至80ml料液，所述料液由每1L純化水500g葡萄糖和0.2ml AZ-20R組成，并繼續(xù)培養(yǎng)直到殘?zhí)潜煌耆摹?br> 完全培養(yǎng)之后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?，用Amino Acid AnalyzerL8500(由Hitachi，Ltd.制造)分析培養(yǎng)液中所積累的L-丙氨酸(Ala)和L-纈氨酸(Val)的量。表2顯示了結(jié)果。
表2 通過(guò)ach缺陷型菌株產(chǎn)生Ala和Vla

2256Δ(ldh，ach)顯示L-丙氨酸積累量的約2.2倍的改進(jìn)，和L-纈氨酸積累量的約四倍的改進(jìn)。此結(jié)果顯示，減少或消除ACH活性在L-纈氨酸和L-丙氨酸的產(chǎn)生中是有效的。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，改進(jìn)了L-氨基酸的發(fā)酵產(chǎn)量(fermentation yield)，所述L-氨基酸是通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的。
序列表<110>味之素株式會(huì)社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌和一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>C537-C5225<150>JP2004-340187<151>2004-11-25<160>26<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1cgggatcctt tttaacccat caca 24<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2gaagatcttc aaaaggttag gaatacggt29<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ccttttgaag atcgaccagt tgg 23<210>4<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>4tacctggaat gctgttttcc cagggatcgc agtggtgagt aacc 44<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cctgggaaaa cagcattcca ggtattag 28<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6tgcaggtcga ctctagagga tcc 23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7cactgcacgg ccctgcgaac 20<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8cgccaactag gcgccaaaaa ttcctgattt ccctaaccgg ac 42<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>9gtccggttag ggaaatcagg aatttttggc gcctagttgg cg 42<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10tgtgggcctt cggcgaggac 20<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11gagtcgaccg caccccattt ttcata 26<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12tggtcgacgt gaatgctcgg cgggatcc 28<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13gcttctgcgc aaagcaagcc tccg 24<210>14<211>50<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>14gtccgattac ctgaggaggt attcccatga aggcataagt tttttcttgg 50<210>15<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15ccaagaaaaa acttatgcct tcatgggaat acctcctcag gtaatcggac 50<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16ggtcatgtgc atggttttct cattgc 26<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17ggcctctaga cctgcaccga tcaggatgag tgg 33<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18gcgctctaga ctcaacaaga gcacgcgcag tcacc 35<210>19<211>2014
<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<220>
<221>CDS<222>(464)..(1882)<223>
<400>19gatccttttt aacccatcac atatacctgc cgttcactat tatttagtga aatgagatat 60tatgatattt tctgaattgt gattaaaaag gcaactttat gcccatgcaa cagaaactat120aaaaaataca gagaatgaaa agaaacagat agatttttta gttctttagg cccgtagtct180gcaaatcctt ttatgatttt ctatcaaaca aaagaggaaa atagaccagt tgcaatccaa240acgagagtct aatagaatga ggtcgaaaag taaatcgcgc gggtttgtta ctgataaagc300aggcaagacc taaaatgtgt aaagggcaaa gtgtatactt tggcgtcacc ccttacatat360tttaggtctt tttttattgt gcgtaactaa cttgccatct tcaaacagga gggctggaag420aagcagaccg ctaacacagt acataaaaaa ggagacatga acg atg aac atc aaa 475Met Asn Ile Lys1aag ttt gca aaa caa gca aca gta tta acc ttt act acc gca ctg ctg 523Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr Thr Ala Leu Leu5 10 15 20gca gga ggc gca act caa gcg ttt gcg aaa gaa acg aac caa aag cca 571Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr Asn Gln Lys Pro25 30 35tat aag gaa aca tac ggc att tcc cat att aca cgc cat gat atg ctg 619Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg His Asp Met Leu40 45 50caa atc cct gaa cag caa aaa aat gaa aaa tat caa gtt cct gaa ttc 667Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln Val Pro Glu Phe55 60 65gat tcg tcc aca att aaa aat atc tct tct gca aaa ggc ctg gac gtt 715Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys Gly Leu Asp Val70 75 80tgg gac agc tgg cca tta caa aac gct gac ggc act gtc gca aac tat 763Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Val Ala Asn Tyr85 90 95 100cac ggc tac cac atc gtc ttt gca tta gcc gga gat cct aaa aat gcg 811His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asn Ala105 110 115gat gac aca tcg att tac atg ttc tat caa aaa gtc ggc gaa act tct 859Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val Gly Glu Thr Ser120 125 130att gac agc tgg aaa aac gct ggc cgc gtc ttt aaa gac agc gac aaa 907Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys Asp Ser Asp Lys135 140 145ttc gat gca aat gat tct atc cta aaa gac caa aca caa gaa tgg tca 955Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr Gln Glu Trp Ser150 155 160ggt tca gcc aca ttt aca tct gac gga aaa atc cgt tta ttc tac act 1003Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg Leu Phe Tyr Thr165 170 175 180gat ttc tcc ggt aaa cat tac ggc aaa caa aca ctg aca act gca caa 1051Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu Thr Thr Ala Gln185 190 195gtt aac gta tca gca tca gac agc tct ttg aac atc aac ggt gta gag 1099Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile Asn Gly Val Glu200 205 210
gat tat aaa tca atc ttt gac ggt gac gga aaa acg tat caa aat gta1147Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Asn Val215 220 225cag cag ttc atc gat gaa ggc aac tac agc tca ggc gac aac cat acg1195Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly Asp Asn His Thr230 235 240ctg aga gat cct cac tac gta gaa gat aaa ggc cac aaa tac tta gta1243Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His Lys Tyr Leu Val245 250 255 260ttt gaa gca aac act gga act gaa gat ggc tac caa ggc gaa gaa tct1291Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln Gly Glu GIu Ser265 270 275tta ttt aac aaa gca tac tat ggc aaa agc aca tca ttc ttc cgt caa1339Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser Phe Phe Arg Gln280 285 290gaa agt caa aaa ctt ctg caa agc gat aaa aaa cgc acg gct gag tta1387Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg Thr Ala Glu Leu295 300 305gca aac ggc gct ctc ggt atg att gag cta aac gat gat tac aca ctg1435Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Thr Leu310 315 320aaa aaa gtg atg aaa ccg ctg att gca tct aac aca gta aca gat gaa1483Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr Val Thr Asp Glu325 330 335 340att gaa cgc gcg aac gtc ttt aaa atg aac ggc aaa tgg tac ctg ttc1531Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys Trp Tyr Leu Phe345 350 355act gac tcc cgc gga tca aaa atg acg att gac ggc att acg tct aac1579Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly Ile Thr Ser Asn360 365 370gat att tac atg ctt ggt tat gtt tct aat tct tta act ggc cca tac1627Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Ser Leu Thr Gly Pro Tyr375 380 385aag ccg ctg aac aaa act ggc ctt gtg tta aaa atg gat ctt gat cct1675Lys Pro Leu Asn Lys Thr Gly Leu Val Leu Lys Met Asp Leu Asp Pro390 395 400aac gat gta acc ttt act tac tca cac ttc gct gta cct caa gcg aaa1723Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val Pro Gln Ala Lys405 410 415 420gga aac aat gtc gtg att aca agc tat atg aca aac aga gga ttc tac1771Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn Arg Gly Phe Tyr425 430 435gca gac aaa caa tca acg ttt gcg cca agc ttc ctg ctg aac atc aaa1819Ala Asp Lys Gln Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu Leu Asn Ile Lys440 445 450ggc aag aaa aca tct gtt gtc aaa gac agc atc ctt gaa caa gga caa1867Gly Lys Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Ile Leu Glu Gln Gly Gln455 460 465tta aca gtt aac aaa taa aaacgcaaaa gaaaatgccg atatcctatt 1915Leu Thr Val Asn Lys470ggcattttct tttatttctt atcaacataa aggtgaatcc catatgaact atataaaagc 1975aggcaaatgg ctaaccgtat tcctaacctt ttgaagatc 2014<210>20<211>473<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌
<400>20Met Asn Ile Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr1 5 10 15Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala Lys Glu Thr20 25 30Asn Gln Lys Pro Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Ile Ser His Ile Thr Arg35 40 45His Asp Met Leu Gln Ile Pro Glu Gln Gln Lys Asn Glu Lys Tyr Gln50 55 60Val Pro Glu Phe Asp Ser Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ser Ser Ala Lys65 70 75 80Gly Leu Asp Val Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr85 90 95Val Ala Asn Tyr His Gly Tyr His Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp100 105 110Pro Lys Asn Ala Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr Gln Lys Val115 120 125Gly Glu Thr Ser Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys130 135 140Asp Ser Asp Lys Phe Asp Ala Asn Asp Ser Ile Leu Lys Asp Gln Thr145 150 155 160Gln Glu Trp Ser Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly Lys Ile Arg165 170 175Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys Gln Thr Leu180 185 190Thr Thr Ala Gln Val Asn Val Ser Ala Ser Asp Ser Ser Leu Asn Ile195 200 205Asn Gly Val Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Thr210 215 220Tyr Gln Asn Val Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr Ser Ser Gly225 230 235 240Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp Lys Gly His245 250 255Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln260 265 270Gly Glu Glu Ser Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Lys Ser Thr Ser275 280 285Phe Phe Arg Gln Glu Ser Gln Lys Leu Leu Gln Ser Asp Lys Lys Arg290 295 300Thr Ala Glu Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Met Ile Glu Leu Asn Asp305 310 315 320Asp Tyr Thr Leu Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Ala Ser Asn Thr325 330 335Val Thr Asp Glu Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met Asn Gly Lys340 345 350Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly355 360 365Ile Thr Ser Asn Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Ser Leu370 375 380Thr Gly Pro Tyr Lys Pro Leu Asn Lys Thr Gly Leu Val Leu Lys Met385 390 395 400Asp Leu Asp Pro Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val405 410 415Pro Gln Ala Lys Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn420 425 430Arg Gly Phe Tyr Ala Asp Lys Gln Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu435 440 445
Leu Asn Ile Lys Gly Lys Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Ser Ile Leu450 455 460Glu Gln Gly Gln Leu Thr Val Asn Lys465 470<210>21<211>2820<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(898)..(1851)<223>
<400>21tgcagaatta tgcaagatgc gccgcaacaa aacgcgatcg gccaaggtca aagtggtcaa 60tgtaatgacc gaaaccgctg cgatgaaact tatccacggc ggtaaaaacc tctcaattag120gagcttgacc tcattaatac tgtgctgggt taattcgccg gtgatcagca gcgcgccgta180ccccaaggtg ccgacactaa tgcccgcgat cgtctccttc ggtccaaaat tcttctgccc240aatcagccgg atttgggtgc gatgcctgat caatcccaca accgtggtgg tcaacgtgat300ggcaccagtt gcgatgtggg tggcgttgta aattttcctg gatacccgcc ggttggttct360ggggaggatc gagtggattc ccgtcgctgc cgcatgcccc accgcttgta aaacagccag420gttagcagcc gtaacccacc acggtttcgg caacaatgac ggcgagagag cccaccacat480tgcgatttcc gctccgataa agccagcgcc catatttgca gggaggattc gcctgcggtt540tggcgacatt cggatccccg gaactagctc tgcaatgacc tgcgcgccga gggaggcgag600gtgggtggca ggttttagtg cgggtttaag cgttgccagg cgagtggtga gcagagacgc660tagtctgggg agcgaaacca tattgagtca tcttggcaga gcatgcacaa ttctgcaggg720cataggttgg ttttgctcga tttacaatgt gattttttca acaaaaataa cacttggtct780gaccacattt tcggacataa tcgggcataa ttaaaggtgt aacaaaggaa tccgggcaca840agctcttgct gattttctga gctgctttgt gggttgtccg gttagggaaa tcaggaa 897gtg gga tcg aaa atg aaa gaa acc gtc ggt aac aag att gtc ctc att 945Val Gly Ser Lys Met Lys Glu Thr Val Gly Asn Lys Ile Val Leu Ile1 5 10 15ggc gca gga gat gtt gga gtt gca tac gca tac gca ctg atc aac cag 993Gly Ala Gly Asp Val Gly Val Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu Ile Asn Gln20 25 30ggc atg gca gat cac ctt gcg atc atc gac atc gat gaa aag aaa ctc 1041Gly Met Ala Asp His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu35 40 45gaa ggc aac gtc atg gac tta aac cat ggt gtt gtg tgg gcc gat tcc 1089Glu Gly Asn Val Met Asp Leu Asn His Gly Val Val Trp Ala Asp Ser50 55 60cgc acc cgc gtc acc aag ggc acc tac gct gac tgc gaa gac gca gcc 1137Arg Thr Arg Val Thr Lys Gly Thr Tyr Ala Asp Cys Glu Asp Ala Ala65 70 75 80atg gtt gtc att tgt gcc ggc gca gcc caa aag cca ggc gag acc cgc 1185Met Val Val Ile Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg85 90 95ctc cag ctg gtg gac aaa aac gtc aag att atg aaa tcc atc gtc ggc 1233Leu Gln Leu Val Asp Lys Asn Val Lys Ile Met Lys Ser Ile Val Gly100 105 110gat gtc atg gac agc gga ttc gac ggc atc ttc ctc gtg gcg tcc aac 1281Asp Val Met Asp Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn115 120 125cca gtg gat atc ctg acc tac gca gtg tgg aaa ttc tcc ggc ttg gaa 1329Pro Val Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Val Trp Lys Phe Ser Gly Leu Glu130 135 140
tgg aac cgc gtg atc ggc tcc gga act gtc ctg gac tcc gct cga ttc1377Trp Asn Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe145 150 155 160cgc tac atg ctg ggc gaa ctc tac gaa gtg gca cca agc tcc gtc cac1425Arg Tyr Met Leu Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His165 170 175gcc tac atc atc ggc gaa cac ggc gac act gaa ctt cca gtc ctg tcc1473Ala Tyr Ile Ile Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser180 185 190tcc gcg acc atc gca ggc gta tcg ctt agc cga atg ctg gac aaa gac1521Ser Ala Thr Ile Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp195 200 205cca gag ctt gag ggc cgt cta gag aaa att ttc gaa gac acc cgc gac1569Pro Glu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp210 215 220gct gcc tat cac att atc gac gcc aag ggc tcc act tcc tac ggc atc1617Ala Ala Tyr His Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile225 230 235 240ggc atg ggt ctt gct cgc atc acc cgc gca atc ctg cag aac caa gac1665Gly Met Gly Leu Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp245 250 255gtt gca gtc cca gtc tct gca ctg ctc cac ggt gaa tac ggt gag gaa1713Val Ala Val Pro Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu260 265 270gac atc tac atc ggc acc cca gct gtg gtg aac cgc cga ggc atc cgc1761Asp Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg275 280 285cgc gtt gtc gaa cta gaa atc acc gac cac gag atg gaa cgc ttc aag1809Arg Val Val Glu Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys290 295 300cat tcc gca aat acc ctg cgc gaa att cag aag cag ttc ttc taa1854His Ser Ala Asn Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe305 310 315atctttggcg cctagttggc gacgcaagtg tttcattgga acacttgcgc tgccaacttt 1914ttggtttacg ggcacaatga aactgttgga tggaatttag agtgtttgta gcttaaggag 1974ctcaaatgaa tgagtttgac caggacattc tccaggagat caagactgaa ctcgacgagt 2034taattctaga acttgatgag gtgacacaaa ctcacagcga ggccatcggg caggtctccc 2094caacccatta cgttggtgcc cgcaacctca tgcattacgc gcatcttcgc accaaagacc 2154tccgtggcct gcagcaacgc ctctcctctg tgggagctac ccgcttgact accaccgaac 2214cagcagtgca ggcccgcctc aaggccgccc gcaatgttat cggagctttc gcaggtgaag 2274gcccacttta tccaccctca gatgtcgtcg atgccttcga agatgccgat gagattctcg 2334acgagcacgc cgaaattctc cttggcgaac ccctaccgga tactccatcc tgcatcatgg 2394tcaccctgcc caccgaagcc gccaccgaca ttgaacttgt ccgtggcttc gccaaaagcg 2454gcatgaatct agctcgcatc aactgtgcac acgacgatga aaccgtctgg aagcagatga 2514tcgacaacgt ccacaccgtt gcagaagaag ttggccggga aatccgcgtc agcatggacc 2574tcgccggacc aaaagtacgc accggcgaaa tcgccccagg cgcagaagta ggtcgcgcac 2634gagtaacccg cgacgaaacc ggaaaagtac tgacgcccgc aaaactgtgg atcaccgccc 2694acggctccga accagtccca gcccccgaaa gcctgcccgg tcgccccgct ctgccgattg 2754aagtcacccc agaatggttc gacaaactag aaatcggcag cgtcatcaac gtcccagaca 2814cccgcg 2820<210>22<211>318<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>22Met Gly Ser Lys Met Lys Glu Thr Val Gly Asn Lys Ile Val Leu Ile
1 5 10 15Gly Ala Gly Asp Val Gly Val Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu Ile Asn Gln20 25 30Gly Met Ala Asp His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu35 40 45Glu Gly Asn Val Met Asp Leu Asn His Gly Val Val Trp Ala Asp Ser50 55 60Arg Thr Arg Val Thr Lys Gly Thr Tyr Ala Asp Cys Glu Asp Ala Ala65 70 75 80Met Val Val Ile Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg85 90 95Leu Gln Leu Val Asp Lys Asn Val Lys Ile Met Lys Ser Ile Val Gly100 105 110Asp Val Met Asp Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn115 120 125Pro Val Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Val Trp Lys Phe Ser Gly Leu Glu130 135 140Trp Asn Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe145 150 155 160Arg Tyr Met Leu Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His165 170 175Ala Tyr Ile Ile Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser180 185 190Ser Ala Thr Ile Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp195 200 205Pro Glu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp210 215 220Ala Ala Tyr His Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile225 230 235 240Gly Met Gly Leu Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp245 250 255Val Ala Val Pro Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu260 265 270Asp Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg275 280 285Arg Val Val Glu Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys290 295 300His Ser Ala Asn Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe305 310 315<210>23<211>3600<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(1037)..(2542)<223>
<400>23gaagcgctac ggacttcgcg ccggcgtcga cagcaatgcg tccagcatcc aagtgagtat 60ggtgctcatc atcaatacca acgcggaact tcaccgtcac cggaatgtcc gtgccttccg120tagccttcac agccgcggaa acgatgtttt caaacaaacg gcgcttgtaa ggaatcgcag180aaccgccacc ccggcgcgtg acctttggaa ccgggcagcc aaagttcata tcaatatgat240ccgccaagtt ttcatcaacg atcatcttcg ccgcttcgta ggtgtacttc gggtcaaccg300tgtacagctg caagcttcgg ggattttcat ccggcgcgaa ggtggtcatg tgcatggttt360tctcattgcg ctcaacaaga gcacgcgcag tcaccatttc acagacgtac agccccgaga420
ttgttcccgt gcgttgcatt tcctgttcac ggcacagcgt gcggaaagca acgttggtta 480caccagccat gggggctaga accacagggg aggcaaggtc aaaggggccg atttttaaag 540tcacctaact attgtccccc gtgaatcagg ttgggcaaaa tatttgaagc aaattgtgag 600cagggcgcaa ctaggaaagt ggtgtgcttt cactttttgg gggctggggt tgggttaagc 660ttcgcgggct ctagggttgg tctgagcttt attcctgggc tttgggaggc ttgcaaacag 720ggggcatgca aatttggggg taatgctggg ccttgaaatc ccactatcac agatagtatt 780cgggcatttc ctgtcacgat ggtttatcct tgggacacaa catcaaagtg gggtacatca 840tatgcttccg gttgaagtga cctatctgaa aagattggtc gaaccttgaa gcaatggtgt 900gaactgcgtt aacgaatttt gtcggacgtt aaaatggtcg cattctgctt gctgaagtgg 960cacacctatg tgttctgctt gggtatagca gtgcgggaaa aatttgaaaa agtccgatta1020cctgaggagg tattca atg tct gat cgc att gct tca gaa aag ctg cgc tcc1072Met Ser Asp Arg Ile Ala Ser Glu Lys Leu Arg Ser1 5 10aag ctc atg tcc gcc gac gag gcg gca cag ttt gtt aac cac ggt gac 1120Lys Leu Met Ser Ala Asp Glu Ala Ala Gln Phe Val Asn His Gly Asp15 20 25aag gtt ggt ttc tcc ggc ttc acc ggc gct ggc tac cca aag gca ctg 1168Lys Val Gly Phe Ser Gly Phe Thr Gly Ala Gly Tyr Pro Lys Ala Leu30 35 40cct acg gca atc gct aac cgg gct aaa gaa gca cac ggt gca ggc aac 1216Pro Thr Ala Ile Ala Asn Arg Ala Lys Glu Ala His Gly Ala Gly Asn45 50 55 60gac tac gca atc gac ctg ttc act ggc gca tcg acc gcc cct gac tgc 1264Asp Tyr Ala Ile Asp Leu Phe Thr Gly Ala Ser Thr Ala Pro Asp Cys65 70 75gat ggc gta ctt gca gaa gct gac gct atc cgc tgg cgc atg cca tac 1312Asp Gly Val Leu Ala Glu Ala Asp Ala Ile Arg Trp Arg Met Pro Tyr80 85 90gca tct gat cca atc atg cgt aac aag atc aac tcc ggc tcc atg gga 1360Ala Ser Asp Pro Ile Met Arg Asn Lys Ile Asn Ser Gly Ser Met Gly95 100 105tac tcc gat atc cac ctg tcc cac tcc ggc cag cag gtt gaa gag ggc 1408Tyr Ser Asp Ile His Leu Ser His Ser Gly Gln Gln Val Glu Glu Gly110 115 120ttc ttc ggc cag ctc aac gta gct gtc att gaa atc acc cgc atc act 1456Phe Phe Gly Gln Leu Asn Val Ala Val Ile Glu Ile Thr Arg Ile Thr125 130 135 140gaa gag ggc tac atc atc cct tct tcc tcc gtg ggt aac aac gtt gag 1504Glu Glu Gly Tyr Ile Ile Pro Ser Ser Ser Val Gly Asn Asn Val Glu145 150 155tgg ctc aac gct gca gag aag gtc atc ctc gag gtt aac tct tgg cag 1552Trp Leu Asn Ala Ala Glu Lys Val Ile Leu Glu Val Asn Ser Trp Gln160 165 170tct gaa gac ctc gaa ggt atg cac gac atc tgg tct gtt cct gcc ctg 1600Ser Glu Asp Leu Glu Gly Met His Asp Ile Trp Ser Val Pro Ala Leu175 180 185cca aac cgc att gcc gtg cca atc aac aag cca ggc gac cgc atc ggt 1648Pro Asn Arg Ile Ala Val Pro Ile Asn Lys Pro Gly Asp Arg Ile Gly190 195 200aag acc tac atc gag ttc gac acc gac aag gtt gtt gct gtt gtt gag 1696Lys Thr Tyr Ile Glu Phe Asp Thr Asp Lys Val Val Ala Val Val Glu205 210 215 220acc aac acc gca gac cgc aac gca cca ttc aag cct gtc gac gac atc 1744Thr Asn Thr Ala Asp Arg Asn Ala Pro Phe Lys Pro Val Asp Asp Ile225 230 235tct aag aag atc gct ggc aac ttc ctc gac ttc ctg gaa agc gaa gtt 1792Ser Lys Lys Ile Ala Gly Asn Phe Leu Asp Phe Leu Glu Ser Glu Val240 245 250
gct gca ggt cgc ctg tcc tac gac ggc tac atc atg cag tcc ggc gtg 1840Ala Ala Gly Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Tyr Ile Met Gln Ser Gly Val255 260 265ggc aac gtg cca aac gcg gtg atg gca ggc ctg ctg gaa tcc aag ttt 1888Gly Asn Val Pro Asn Ala Val Met Ala Gly Leu Leu Glu Ser Lys Phe270 275 280gag aac atc cag gcc tac acc gaa gtt atc cag gac ggc atg gtg gac 1936Glu Asn Ile Gln Ala Tyr Thr Glu Val Ile Gln Asp Gly Met Val Asp285 290 295 300ctc atc gac gcc ggc aag atg acc gtt gca tcc gca act tcc ttc tcc 1984Leu Ile Asp Ala Gly Lys Met Thr Val Ala Ser Ala Thr Ser Phe Ser305 310 315ctg tct cct gag tac gca gag aag atg aac aac gag gct aag cgt tac 2032Leu Ser Pro Glu Tyr Ala Glu Lys Met Asn Asn Glu Ala Lys Arg Tyr320 325 330cgc gag tcc att atc ctg cgc cca cag cag atc tct aac cac cca gag 2080Arg Glu Ser Ile Ile Leu Arg Pro Gln Gln Ile Ser Asn His Pro Glu335 340 345gtc atc cgc cgc gtt ggc ctg atc gcc acc aac ggt ctc atc gag gct 2128Val Ile Arg Arg Val Gly Leu Ile Ala Thr Asn Gly Leu Ile Glu Ala350 355 360gac att tac ggc aac gtc aac tcc acc aac gtt tct ggc tcc cgc gtc 2176Asp Ile Tyr Gly Asn Val Asn Ser Thr Asn Val Ser Gly Ser Arg Val365 370 375 380atg aac ggc atc ggc ggc tcc ggc gac ttc acc cgt aac ggc tac atc 2224Met Asn Gly Ile Gly Gly Ser Gly Asp Phe Thr Arg Asn Gly Tyr Ile385 390 395tcc agc ttc atc acc cct tca gag gca aag ggc ggc gca atc tct gcg 2272Ser Ser Phe Ile Thr Pro Ser Glu Ala Lys Gly Gly Ala Ile Ser Ala400 405 410atc gtt cct ttc gca tcc cac atc gac cac acc gag cac gat gtc atg 2320Ile Val Pro Phe Ala Ser His Ile Asp His Thr Glu His Asp Val Met415 420 425gtt gtt atc tct gag tac ggt tac gca gac ctt cgt ggt ctg gct cca 2368Val Val Ile Ser Glu Tyr Gly Tyr Ala Asp Leu Arg Gly Leu Ala Pro430 435 440cgt gag cgc gtt gcc aag atg atc ggc ctg gct cac cct gat tac cgc 2416Arg Glu Arg Val Ala Lys Met Ile Gly Leu Ala His Pro Asp Tyr Arg445 450 455 460cca ctg ctc gag gag tac tac gct cgc gca acc tcc ggt gac aac aag 2464Pro Leu Leu Glu Glu Tyr Tyr Ala Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn Lys465 470 475tac atg cag acc cct cat gat ctt gca acc gcg ttt gat ttc cac atc 2512Tyr Met Gln Thr Pro His Asp Leu Ala Thr Ala Phe Asp Phe His Ile480 485 490aac ctg gct aag aac ggc tcc atg aag gca taa gttttttctt ggtttagaaa2565Asn Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys Ala495 500ccgccgcctc gacaacattt cgaggcggcg gtttctttta ttacctgggt tttgagcgtt2625aaattagacc aggtcaggct agtgtttggt agctaattga gggcgatttt aataaggccg2685gtgccatgta ctaatatggt ctgagttggg cctatagctc agttggtaga gctacggact2745tttaatccgc aggtcttggg ttcgagtccc aatgggccca catcttaagt acccctgttt2805tggagaatgc tccgagccag gggtactttt cttttcctca cacacagtag ctgctgagaa2865aaatgaagac cttttgttag gttgggagta tgaccaaccc atacgaggcc ttcataccgc2925tcaagcatcg tacggggatt gaacccgagc acaccttttg ggaatgggaa aacaaaaggg2985ttcacattgc aaggagacgt cgagaagcgc ccgtccgcgt tatcgtggtg catgggctag3045gcacccatag tggcgccctc tggcccctcg tcgcggccat tgagggcgcg gacctcgccg3105cgatcgacct gcctaaaact ccgctttacg acgattggct gcgcctttta gaatctttca3165
tctcttccga agacgacggt cggccactca tcctgatcgg tgcaggcacc ggaggcttgc3225tttgcgcaga agctgcacac cgcacaggac tggtcgcaca cgtcattgcc acctgcctgc3285tcaacccctc cgaccagccg acgcgccggg cactgttcag gttttcaccg ctgactcggt3345tgatccaagg ccgcttgcgc aaccgcgaaa ttcccgtgac cagagtgttg aacttcagca3405aaatcagccg cagcccagcc ctgagcaaat tgtgcgcggc cgatgaattt agcggagcat3465ccaaaataac ctggggtttc ctcgcgtcat atgtgcaaca caaggccaaa ctgggtgcag3525ttcccgtcac tctgatgcac cctgaccacg accttctgac tcccgttgag ctcagtctgc3585gtacgctttc gcgcc 3600<210>24<211>502<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>24Met Ser Asp Arg Ile Ala Ser Glu Lys Leu Arg Ser Lys Leu Met Ser1 5 10 15Ala Asp Glu Ala Ala Gln Phe Val Asn His Gly Asp Lys Val Gly Phe20 25 30Ser Gly Phe Thr Gly Ala Gly Tyr Pro Lys Ala Leu Pro Thr Ala Ile35 40 45Ala Asn Arg Ala Lys Glu Ala His Gly Ala Gly Asn Asp Tyr Ala Ile50 55 60Asp Leu Phe Thr Gly Ala Ser Thr Ala Pro Asp Cys Asp Gly Val Leu65 70 75 80Ala Glu Ala Asp Ala Ile Arg Trp Arg Met Pro Tyr Ala Ser Asp Pro85 90 95Ile Met Arg Asn Lys Ile Asn Ser Gly Ser Met Gly Tyr Ser Asp Ile100 105 110His Leu Ser His Ser Gly Gln Gln Val Glu Glu Gly Phe Phe Gly Gln115 120 125Leu Asn Val Ala Val Ile Glu Ile Thr Arg Ile Thr Glu Glu Gly Tyr130 135 140Ile Ile Pro Ser Ser Ser Val Gly Asn Asn Val Glu Trp Leu Asn Ala145 150 155 160Ala Glu Lys Val Ile Leu Glu Val Asn Ser Trp Gln Ser Glu Asp Leu165 170 175Glu Gly Met His Asp Ile Trp Ser Val Pro Ala Leu Pro Asn Arg Ile180 185 190Ala Val Pro Ile Asn Lys Pro Gly Asp Arg Ile Gly Lys Thr Tyr Ile195 200 205Glu Phe Asp Thr Asp Lys Val Val Ala Val Val Glu Thr Asn Thr Ala210 215 220Asp Arg Asn Ala Pro Phe Lys Pro Val Asp Asp Ile Ser Lys Lys Ile225 230 235 240Ala Gly Asn Phe Leu Asp Phe Leu Glu Ser Glu Val Ala Ala Gly Arg245 250 255Leu Ser Tyr Asp Gly Tyr Ile Met Gln Ser Gly Val Gly Asn Val Pro260 265 270Asn Ala Val Met Ala Gly Leu Leu Glu Ser Lys Phe Glu Asn Ile Gln275 280 285Ala Tyr Thr Glu Val Ile Gln Asp Gly Met Val Asp Leu Ile Asp Ala290 295 300Gly Lys Met Thr Val Ala Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Ser Pro Glu305 310 315 320Tyr Ala Glu Lys Met Asn Asn Glu Ala Lys Arg Tyr Arg Glu Ser Ile325 330 335Ile Leu Arg Pro Gln Gln Ile Ser Asn His Pro Glu Val Ile Arg Arg
340 345 350Val Gly Leu Ile Ala Thr Asn Gly Leu Ile Glu Ala Asp Ile Tyr Gly355 360 365Asn Val Asn Ser Thr Asn Val Ser Gly Ser Arg Val Met Asn Gly Ile370 375 380Gly Gly Ser Gly Asp Phe Thr Arg Asn Gly Tyr Ile Ser Ser Phe Ile385 390 395 400Thr Pro Ser Glu Ala Lys Gly Gly Ala Ile Ser Ala Ile Val Pro Phe405 410 415Ala Ser His Ile Asp His Thr Glu His Asp Val Met Val Val Ile Ser420 425 430Glu Tyr Gly Tyr Ala Asp Leu Arg Gly Leu Ala Pro Arg Glu Arg Val435 440 445Ala Lys Met Ile Gly Leu Ala His Pro Asp Tyr Arg Pro Leu Leu Glu450 455 460Glu Tyr Tyr Ala Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn Lys Tyr Met Gln Thr465 470 475 480Pro His Asp Leu Ala Thr Ala Phe Asp Phe His Ile Asn Leu Ala Lys485 490 495Asn Gly Ser Met Lys Ala500<210>25<211>2037<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(573)..(1913)<223>
<400>25gctagcctcg ggagctctag gagattgtga aaaacgggtc aaatttctcc gatgcagcgc 60ctataaaagt cgtaccaatt ccatttgagg gtgctcaagt gtggccaggt tatataacca120gtcagtcaac tggtctcatt cgctggtcgg atgaatttaa ttaaagaaga gacttcatgc180agttaccgcg cgttttggcg atacacaatt gataaaccta aagaaatttt caaacaattt240taattctttg tggtcatatc tgtgcgacac tgccataatt gaacgtgagc atttaccagc300ctaaatgccc gcagtgagtt aagtctcaaa gcaagaagtt gctctttagg gcatccgtag360tttaaaacta ttaaccgtta ggtatgacaa gccggttgat gtgaacgcag tttttaaaag420tttcaggatc agatttttca caggcatttt gctccagcaa acgcctagga tgtacatggt480gccctcaatg ggaaccacca acatcactaa atggcccaga tacacacttt aaaatcgtgc540gcgcatgcag ccgagatggg aacgaggaaa tc atg aca gtt gat gag cag gtc 593Met Thr Val Asp Glu Gln Val1 5tct aac tat tac gac atg ctt ctg aag cgc aat gct ggc gag cct gaa 641Ser Asn Tyr Tyr Asp Met Leu Leu Lys Arg Asn Ala Gly Glu Pro Glu10 15 20ttt cac cag gca gtg gca gag gtt ttg gaa tct ttg aag atc gtc ctg 689Phe His Gln Ala Val Ala Glu Val Leu Glu Ser Leu Lys Ile Val Leu25 30 35gaa aag gac cct cat tac gct gat tac ggt ctc atc cag cgc ctg tgc 737Glu Lys Asp Pro His Tyr Ala Asp Tyr Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys40 45 50 55gag cct gag cgt cag ctc atc ttc cgt gtg cct tgg gtt gat gac cag 785Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg Val Pro Trp Val Asp Asp Gln60 65 70ggc cag gtc cac gtc aac cgt ggt ttc cgc gtg cag ttc aac tct gca 833
Gly Gln Val His Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala75 80 85ctt gga cca tac aag ggc ggc ctg cgc ttc cac cca tct gta aac ctg 881Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu90 95 100ggc att gtg aag ttc ctg ggc ttt gag cag atc ttt aaa aac tcc cta 929Gly Ile Val Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu105 110 115acc ggc ctg cca atc ggt ggt ggc aag ggt gga tcc gac ttc gac cct 977Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro120 125 130 135aag ggc aag tcc gat ctg gaa atc atg cgt ttc tgc cag tcc ttc atg 1025Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met140 145 150acc gag ctg cac cgc cac atc ggt gag tac cgc gac gtt cct gca ggt 1073Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu Tyr Arg Asp Val Pro Ala Gly155 160 165gac atc gga gtt ggt ggc cgc gag atc ggt tac ctg ttt ggc cac tac 1121Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr170 175 180cgt cgc atg gcc aac cag cac gag tcc ggc gtt ttg acc ggt aag ggc 1169Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly185 190 195ctg acc tgg ggt gga tcc ctg gtc cgc acc gag gca act ggc tac ggc 1217Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly200 205 210 215tgc gtt tac ttc gtg agt gaa atg atc aag gct aag ggc gag agc atc 1265Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile220 225 230agc ggc cag aag atc atc gtt tcc ggt tcc ggc aac gta gca acc tac 1313Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr235 240 245gcg att gaa aag gct cag gaa ctc ggc gca acc gtt att ggt ttc tcc 1361Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser250 255 260gat tcc agc ggt tgg gtt cat acc cct aat ggc gtt gac gtg gct aag 1409Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro Asn Gly Val Asp Val Ala Lys265 270 275ctc cgc gaa atc aag gaa gtt cgc cgc gca cgc gta tcc gtg tac gcc 1457Leu Arg Glu Ile Lys Glu Val Arg Arg Ala Arg Val Ser Val Tyr Ala280 285 290 295gac gaa gtt gaa ggc gca acc tac cac acc gac ggg tcc atc tgg gat 1505Asp Glu Val Glu Gly Ala Thr Tyr His Thr Asp Gly Ser Ile Trp Asp300 305 310ctc aag tgc gat atc gct ctt cct tgt gca act cag aac gag ctc aac 1553Leu Lys Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn315 320 325ggt gag aac gct aag act ctt gca gac aac ggc tgc cgt ttc gtt gct 1601Gly Glu Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Asn Gly Cys Arg Phe Val Ala330 335 340gaa ggc gcg aac atg cct tcc acc cca gag gct gtt gag gtc ttc cgt 1649Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Pro Glu Ala Val Glu Val Phe Arg345 350 355gag cgc gac atc cgc ttc gga cca ggc aag gca gct aac gct ggt ggc 1697Glu Arg Asp Ile Arg Phe Gly Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly360 365 370 375gtt gca acc tcc gct ctg gag atg cag cag aac gct tcg cgc gat tcc1745Val Ala Thr Ser Ala Leu Glu Met Gln Gln Asn Ala Ser Arg Asp Ser
380 385 390tgg agc ttc gag tac acc gac gag cgc ctc cag gtg atc atg aag aac1793Trp Ser Phe Glu Tyr Thr Asp Glu Arg Leu Gln Val Ile Met Lys Asn395 400 405atc ttc aag acc tgt gca gag acc gca gca gag tat gga cac gag aac1841Ile Phe Lys Thr Cys Ala Glu Thr Ala Ala Glu Tyr Gly His Glu Asn410 415 420gat tac gtt gtc ggc gct aac att gct ggc ttc aag aag gta gct gac1889Asp Tyr Val Val Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp425 430 435gcg atg ctg gca cag ggc gtc atc taa gacccctgca ctttacttaa 1936Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile440 445acccctgatc cgcgttaagg atcagggatt tttgatttct tccaggtcaa ttatccgatc 1996cacatgggtt aatgcagctg tgcggtgcgc aatgatgatc a 2037<210>26<211>447<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>26Met Thr Val Asp Glu Gln Val Ser Asn Tyr Tyr Asp Met Leu Leu Lys1 5 10 15Arg Asn Ala Gly Glu Pro Glu Phe His Gln Ala Val Ala Glu Val Leu20 25 30Glu Ser Leu Lys Ile Val Leu Glu Lys Asp Pro His Tyr Ala Asp Tyr35 40 45Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg50 55 60Val Pro Trp Val Asp Asp Gln Gly Gln Val His Val Asn Arg Gly Phe65 70 75 80Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg85 90 95Phe His Pro Ser Val Asn Leu Gly Ile Val Lys Phe Leu Gly Phe Glu100 105 110Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys115 120 125Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met130 135 140Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu145 150 155 160Tyr Arg Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile165 170 175Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser180 185 190Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg195 200 205Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile210 215 220Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly225 230 235 240Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly245 250 255Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro260 265 270Asn Gly Val Asp Val Ala Lys Leu Arg Glu Ile Lys Glu Val Arg Arg275 280 285
Ala Arg Val Ser Val Tyr Ala Asp Glu Val Glu Gly Ala Thr Tyr His290 295 300Thr Asp Gly Ser Ile Trp Asp Leu Lys Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys305 310 315 320Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Glu Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp325 330 335Asn Gly Cys Arg Phe Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Pro340 345 350Glu Ala Val Glu Val Phe Arg Glu Arg Asp Ile Arg Phe Gly Pro Gly355 360 365Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Ala Leu Glu Met Gln370 375 380Gln Asn Ala Ser Arg Asp Ser Trp Ser Phe Glu Tyr Thr Asp Glu Arg385 390 395 400Leu Gln Val Ile Met Lys Asn Ile Phe Lys Thr Cys Ala Glu Thr Ala405 410 415Ala Glu Tyr Gly His Glu Asn Asp Tyr Val Val Gly Ala Asn Ile Ala420 425 430Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile435 440 44權(quán)利要求
1.具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述棒狀桿菌型細(xì)菌被修飾使得乙酰輔酶A水解酶活性減少，并且其中所述L-氨基酸是通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的一種或多種L-氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中通過(guò)將突變引入染色體乙酰輔酶A水解酶基因的編碼區(qū)或表達(dá)調(diào)控區(qū)來(lái)減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中通過(guò)破壞染色體乙酰輔酶A水解酶基因來(lái)減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶選自下組(A)包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B)包含SEQ ID NO24所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中在所述蛋白質(zhì)中取代、缺失、插入、或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，并且其中所述蛋白質(zhì)具有乙酰輔酶A水解酶的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶基因選自下組(a)包含SEQ ID NO23的核苷酸1037至2542的基因；和(b)DNA，其能夠在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO23的核苷酸1037至2542的多核苷酸或由所述多核苷酸制備的探針雜交，并編碼具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述棒狀桿菌型細(xì)菌被進(jìn)一步修飾以提高谷氨酸脫氫酶活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸。
8.產(chǎn)生L-氨基酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌；和從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸，且其中所述L-氨基酸是一種或多種經(jīng)由丙酮酸為中間物產(chǎn)生的L-氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明描述了具有產(chǎn)生L－氨基酸的能力且被修飾使得乙酰輔酶A水解酶活性減少的棒狀桿菌型細(xì)菌。該細(xì)菌被用于產(chǎn)生通過(guò)使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的L－氨基酸，如L－谷氨酸、L－精氨酸、L－谷氨酰胺、L－脯氨酸、L－丙氨酸、L－纈氨酸和L－賴氨酸。
文檔編號(hào)C12P13/06GK101065484SQ20058004047
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日
發(fā)明者福井啟太, 中村純, 児島宏之 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社