專利名稱::產(chǎn)生l-氨基酸的細菌和用于產(chǎn)生l-氨基酸的方法
技術領域:
:本發(fā)明涉及使用微生物產(chǎn)生L-氨基酸的方法,更具體地,涉及用于產(chǎn)生L-氨基酸例如L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-色氨酸等的方法。L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-色氨酸在工業(yè)中用作動物飼料添加劑、保健食品(healthfood)成分、氨基酸浸劑(inflision)。
背景技術:
:為了通過使用微生物的發(fā)酵來產(chǎn)生目標物質(zhì),例如L-氨基酸等,存在使用以下菌林的方法野生型微生物(野生型菌林)、源自野生型菌林的營養(yǎng)缺陷菌株、代謝調(diào)節(jié)突變體菌抹如源自野生型菌林的各種類型的藥物抗性突變體菌林之一、同時具有營養(yǎng)缺陷菌抹和代謝調(diào)節(jié)突變體菌林特征的菌林等。在最近幾年,已將重組DNA技術用于通過發(fā)酵來產(chǎn)生目標物質(zhì)。例如,通過增強編碼L-氨基酸生物合成酶的基因的表達(美國專利No.5168056、美國專利No.5776736),或通過增強碳源向L-氨基酸生物合成系統(tǒng)的輸入(influx)(美國專利No.5906925)來改進孩史生物產(chǎn)生L-氨基酸的能力。就存在于腸桿菌科(E"feraZ7acfehaceae)細菌如大腸桿菌等中的雙組分系統(tǒng)EvgAS而言,傳感激酶(sensorkinase)EvgS的功能是未知的,但是已知應答調(diào)節(jié)轉錄因子EvgA調(diào)節(jié)許多基因的轉錄(Masuda,N.andChurch,G.M.,J.Bacteriol.2002.184(22):6225-6234.jEsc/zm'c/w'aco//geneexpressionresponsivetolevelsoftheresponseregulatorEvgA.)。還已4口哞爭錄因子EvgA正i周節(jié)編石馬兩種轉錄因子YdeO和GadE的少&O和g"伍基因的轉錄,并且YdeO正調(diào)節(jié)ga<i£基因的轉錄(Masuda,N.andChurch,G.M.,Mol.Microbiol.2003.48(3》699-712.Regulatorynetworkof-acidresistancegenesin£lsc/2en'c/w'aco//.;Ma,Z.,Masuda,N.,andFoster,J.W.,J.Bacteriol.2004.186(21):7378畫7389.CharacterizationofEvgAS-YdeO-GadEbranchedregulatorycircuitgoverningglutamate-dependentacidresistancein^Esc/zen'c/z/aco/z',)。然而,先前尚未才艮導使用將evg丄或基因的表達增加的微生物來產(chǎn)生氨基酸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供能夠有效地產(chǎn)生L-氨基酸的腸桿菌科(family五w/era6acfen'aceae)的細菌菌林,并且還才是供使用所述細菌菌4朱有效地產(chǎn)生L-氨基酸的方法。本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題進行了廣泛的研究,結果發(fā)現(xiàn)能夠通過修飾微生物以增加evgj基因、gad五基因或;/tfe(9基因中一種或多種的表達來改進產(chǎn)生L-氨基酸的能力。這些基因編碼EvgAS雙組分系統(tǒng)中涉及的轉錄因子。本發(fā)明的目的是提供用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法,其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸桿菌科的細菌,所述細菌具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力并且經(jīng)修飾以使選自evgj基因、g"巡基因或^eO基因的一種或多種基因的表達增加,所述基因編碼EvgAS雙組分體系中涉及的轉錄因子;在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-氨基酸;和從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中通過增加每種基因的拷貝數(shù),或修飾所述基因的表達調(diào)節(jié)序列來增加一種或多種基因的表達。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中通過修飾細菌以使編碼傳感激酶的evgS基因的表達增加來增加所述一種或多種基因的表達量。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述ev^基因是以下(a)或(b)中描述的DNA:(a)包含SEQIDNO:23的核苷酸序列的DNA,(b)在嚴緊條件下與SEQIDNO:23的核苷酸序列的互補核苷酸序列,或與能夠從所述核芬酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有轉錄因子活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述ga^ffi基因是以下(c)或(d)中描述的DNA:(c)包含SEQIDNO:27的核苷酸序列的DNA,(d)在嚴緊條件下與SEQIDNO:27的核苷酸序列的互補核苷酸序列,或與能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有轉錄因子活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述j^eO基因是以下(e)或(f)中描述的DNA:(e)包含SEQIDNO:29的核苷酸序列的DNA,(f)在嚴緊條件下與SEQIDNO:29的核苷酸序列的互補核苷酸序列,或與能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有轉錄因子活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述evgS基因是以下(g)或(h)中描述的DNA:(g)包含SEQIDNO:25的核苷酸序列的DNA,(h)在嚴緊條件下與SEQIDNO:25的核苷酸序列的互補核苷酸序列,或與能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有石粦酸壽爭移活性(phosphotransferactivity)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述evg^基因編碼以下(A)或(B)中描述的蛋白質(zhì)(A)由SEQIDNO:24的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì),(B)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的蛋白質(zhì),其包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位,并且所述蛋白質(zhì)具有轉錄因子活性。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述gatffi基因編碼以下(C)或(D)中描述的蛋白質(zhì)(C)由SEQIDNO:28的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì),(D)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的蛋白質(zhì),其包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位,并且所述蛋白質(zhì)具有轉錄因子活性。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述j^eO基因編碼以下(E)或(F)中描述的蛋白質(zhì)(E)由SEQIDNO:30的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì),(F)包含SEQIDNO:30的氨基西l/f列的蛋白質(zhì),其包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位,并且所述蛋白質(zhì)具有轉錄因子活性。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述evgS基因編碼以下(G)或(H)中描述的蛋白質(zhì)(G)由SEQIDNO:26的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì),(H)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的蛋白質(zhì),其包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位,并且所述蛋白質(zhì)具有磷酸轉移酶活性。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述細菌屬于選自下組的腸桿菌科埃希氏菌屬Cfoc/zen'c/7/a)、腸桿菌屬(五"fera6a"er)、泛菌屬(尸a"/oM)、克雷伯氏菌屬(《/^^//^)和沙雷氏菌屬(&rra"a)。本發(fā)明進一步的目的是提供如上所述的方法,其中所述L-氨基酸是選自下組的一種或多種氨基酸L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-色氨酸。附圖簡述圖1顯示具有溫度敏感復制起點的質(zhì)粒載體pTSl的構建。優(yōu)選實施方式詳述在下文中,將對本發(fā)明進行詳細說明。1.本發(fā)明的微生物本發(fā)明的微生物是腸桿菌科的微生物,其具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力,并且經(jīng)修飾以使evg丄gac^:或;^eO基因中一種或多種的表達增加,所述基因編碼EvgAS雙組分體系調(diào)節(jié)子(EvgAStwo-componentsystemregulon)中涉及的轉錄因子。在本文中,"產(chǎn)生L-氨基酸的能力"的意思是當在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物時,產(chǎn)生L-氨基酸并且以能夠從培養(yǎng)基或所述微生物的細胞中收集的水平引起L-氨基酸積累的能力。本發(fā)明的微生物可具有產(chǎn)生多種L-氨基酸的能力。所述微生物可天然具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力,或可通過誘變或重組DNA技術進行修飾以賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力,例如下文所述。同樣,短語"增加基因的表達"的意思是將基因的轉錄和/或翻譯增加。L-氨基酸的類型無具體限制。實例包括堿性L-氨基酸例如L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸和L-瓜氨酸(L-citrulline);脂肪族L-氨基酸例如L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸;為羥基單氨基羧酸的L-氨基酸例如L-蘇氨酸和L-絲氨酸;環(huán)狀L-氨基酸例如L-脯氨酸;芳族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸;含硫L-氨基酸例如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-曱硫氨酸;和酸性L-氨基酸例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸;酸性L-氨基酸的酰胺例如L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺等。具體而言,L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-色氨酸是優(yōu)選的。本發(fā)明的微生物可能能夠產(chǎn)生兩種或更多種氨基酸。.1-1.賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力以下包括將產(chǎn)生L-氨基酸的能力賦予微生物的方法的描述,以及能夠用于本發(fā)明的被賦予產(chǎn)生L-氨基酸能力的微生物的實例,但是本發(fā)明不限于這些,只要它們具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力。對用于本發(fā)明的微生物無具體限制,只要其屬于腸桿菌科,例如埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬(五nWm'(30、沙門氏菌屬(&/附0朋//")、摩根氏菌屬(肘0^3"6//")等,并且其具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力。具體地,可以使用屬于NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)數(shù)據(jù)庫中所述分類的腸桿菌科的任何微生物(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorgmode=Tree&id=1236&lv卜3&keep^&srchmode-l&unlock)。作為能夠用于衍生本發(fā)明微生物的腸桿菌科的親本菌抹,特別期望使用屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬或泛菌屬的細菌。沒有特定的為了獲得本發(fā)明的細菌而必須使用的埃希氏菌屬細菌的親本菌抹,但是可以使用Neidhardt等所列的那些菌抹(Backmann,B.J.1996.DerivationsandGenotypesofsomemutantderivativesof五sc/^/c/z/aco//K-12,p.2460-2488.Table1.InF.D.Neidhardt(ed.),^Esc/zm'c/n'aco//and&/,we〃aCellularandMolecularBiology/SecondEdition,AmericanSocietyforMicrobiologyPress,Washington,D.C.)。一個實例是大腸桿菌。大腸桿菌的具體實例是大腸桿菌W3110(ATCC27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC47076)等,其是源自K12的野生型菌抹的原型(prototype)。這些可以從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(地址P.O.Box1549,Manassas,VA20108,UnitedStatesofAmerica))獲得。通過該組織的網(wǎng)站(參見http:/www.atcc.org),通過使用給予各細菌菌抹的登錄號可以獲得它們。相應于每個細菌菌抹的登錄號在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中提供。腸桿菌屬細菌的實例包括成團腸桿菌(五"fera^cferagg/omera"s)和產(chǎn)氣腸斥干菌C&2tera6acferaerogewas)。泛菌屬纟田菌的實例包4舌"wawafe。在近幾年中,基于16SrRNA核苷酸序列分析,有時將成團腸桿菌重分類為成團泛菌"gg/o附eram1)、戶a"toe"和斯氏泛菌WevraW")。對于本發(fā)明,可以使用屬于腸桿菌屬或泛菌屬的任何細菌,只要所述細菌歸類在腸桿菌科中。當通過基因工程培育時,可以使用菌抹AJ13355(FERMBP-6614)、AJ13356(FERMBP-6615)、AJ13601(FERMBP-7207)或它們的任何衍生物。在分離時,將這些菌抹鑒定并且保藏為成團腸桿菌。如上所述,通過16SrRNA核苷酸序列的分析V吏得它們^皮重分類為a"a""fe。下文將描述賦予屬于腸桿菌科的微生物產(chǎn)生L-氨基酸的能力的方法,和用于增加這些微生物中產(chǎn)生L-氨基酸的能力的方法。為了賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力,可使用在棒狀桿菌型細菌(coryneformbacteria)或埃希氏菌屬細菌的培育中常規(guī)使用的方法(參見"AminoAcidFermentation",GakkaiShuppanCenter(Ltd.),1stEdition,publishedMay30,1986,pp.77-100)。這些方法包括獲得營養(yǎng)缺陷突變體、類似物抗性菌4^或代謝調(diào)節(jié)突變體,或構建將L-氨基酸生物合成酶的表達增強的重組菌抹。在本文中,在產(chǎn)生L-氨基酸的細菌的培育中,可賦予一種或多種性質(zhì),例如營養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變??蓪⒁环N或多種L-氨基酸生物合成酶的表達單獨增強,或以兩種或更多種的組合來增強。另外,可以將賦予性質(zhì)的技術與增強生物合成酶的技術組合,所述性質(zhì)例如營養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變。具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的營養(yǎng)缺陷突變體菌抹、L-氨基酸類似物抗性菌抹或代謝調(diào)節(jié)突變體菌抹可如下獲得對親本菌抹或野生型菌抹施以常規(guī)突變處理,例如曝露于X-射線或UV照射,或用誘變劑例如N-甲基-N,-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或曱磺酸乙酯(EMS)處理等;其后選擇顯示營養(yǎng)缺陷突變、類似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變并且還具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的那些菌抹。以下是產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌的實例和它們的構建方法。例如,具有產(chǎn)生L-賴氨酸的能力的細菌包括L-賴氨酸類似物抗性菌抹或代謝調(diào)節(jié)突變體菌抹。L-賴氨酸類似物的實例包括但不限于,氧代賴氨酸(oxalysine)、賴氨酸氧將酸(lysinehydroxamate)、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(AEC)、Y-曱基賴氨酸、a-氯己內(nèi)酰胺(a-chlorocaprolactam)等??赏ㄟ^對屬于埃希氏菌屬的細菌施以常規(guī)人工誘變處理,來獲得對這些賴氨酸類似物具有抗性的突變體菌抹。產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌的實例包括大腸桿菌AJ11442菌纟朱(FERMBP-1543、NRRLB-12185;參見JP56-18596A和美國專利No.4,346,170)、大腸桿菌VL611菌林(EP1016710A)等。也可以使用大腸桿菌WC196菌抹(WO96/17930)作為產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌。通過將AEC抗性賦予源自大腸桿菌K-12的W3110菌株來培育WC196菌株。將這種菌抹命名為大腸桿菌AJ13069,并且在1994年12月6日以登錄號FERMP-14690保藏在工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(theNationalInstituteofBioscienceandHuman—TechnologyoftheAgencyofIndustrialScienceandTechnology)(目前為,獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許微生物保藏中心(InternationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology);Chuo6,l畫l,Higashi1-chome,Tsukuba—shi,Ibaraki—ken305-8566,Japan)。之后根據(jù)布達佩斯條約(BudapestTreaty)在l995年9月29日轉為國際保藏,并給予登錄號FERMBP-5252。也可通過增加L-賴氨酸生物合成酶活性來構建產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌。能夠通過增加細胞中編碼所述酶的基因的拷貝數(shù),或通過修飾表達調(diào)節(jié)序列,來實現(xiàn)這些酶活性的增加。編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的實例包括但不限于編碼二氫吡啶二羧酸合酶的基因(傘pj)、編碼天冬氨酸激酶的基因(一C)、編碼二氬吡咬二羧酸還原酶的基因(^p釣、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的基因(/少")、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因(A/Z2)(W096/40934、美國專利No.6,040,160)、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(p/c)(60-87788A)、編碼天冬氨酸氨基轉移酶的基因("WQ(JP6-102028B)、編碼二氨基庚二酸差向異構酶的基因(^pF)(JP2003-135066A)、編碼天冬氨酸半醛脫氫酶的基因(a^)(WO00/61723)和編碼二氨基庚二酸途徑酶的其它基因;以及編碼高烏頭酸水合酶的基因(JP2000-157276A)和編碼氨基己二酸途徑酶的其它基因。此外,已知野生型二氫吡啶二羧酸合酶(DDPS)和天冬氨酸激酶(AK)受L-賴氨S吏反饋抑制的阻抑;因此,當使用dapA和lysC時,優(yōu)選分別使用編碼對L-賴氨酸反饋抑制有抗性的二氫吡啶二羧酸合酶和天冬氨酸激酶的突變基因(EP0733710、US5,932,453)。編碼對L-賴氨酸反饋抑制有抗性的突變二氫吡啶二羧酸合酶的DNA的實例包括編碼具有以下氨基酸序列的DDPS的DNA,在所述氨基酸序列中用酪氨酸取代第118位的組氨酸殘基(U.S.5,661,012和6,040,160)。另外,編碼對L-賴氨酸反饋抑制有抗性的突變AK的DNA的實例包括編碼具有以下氨基酸序列的AK的DNA,在所述氨基酸序列中用異亮氨酸取代352-蘇氨酸殘基(U.S.5,661,012和6,040,160)。能夠通過使用PCR的定點誘變等獲得這些突變DNA。以下是通過將編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因引入宿主中來賦予產(chǎn)生L-賴氨酸能力的技術的實例。即,通過將編碼L-賴氨酸生物合成基因的基因片段與在選擇的宿主微生物中發(fā)揮功能的載體(優(yōu)選多拷貝載體)連接,并且用所述重組載體來轉化該宿主來制備重組DNA。由于所述轉化,宿主細胞中編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的拷貝數(shù)增加,使表達增加并且從而增加酶活性。不具體指定編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因,只要它們能夠在宿主微生物中表達。實例包括源自大腸桿菌的基因,和源自棒狀桿菌型細菌組(coryneformgroupofbacteria)的基因。因為已經(jīng)報導了大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌(Coo;"e^"en'Mmg/wto柳'cwm)的全基因組序列,所以能夠基于這些基因的核苷酸序列合成引物,并且通過PCR方法獲得這些基因,在所述PCR方法中將微生物(例如大腸桿菌K12等)的基因組DNA用作模板。為了克隆所述基因,可以使用在腸桿菌科中自主復制的質(zhì)粒。實例包括pBR322、pTWV228(TakaraBioInc.)、pMW119(NipponGeneCo"Ltd.)、pUC19、pSTV29(TakaraBioInc.)、RSF1010(Gene,75:271-288(1989))等。除這些之外,還可以使用噬菌體載體。為了將靶基因連接至上述載體,將載體用限制酶消化,所述限制酶與含有耙基因的DNA片段的末端匹配。連接通常用連接酶(例如T4DNA連接酶)進行。靶基因可分別位于不同的載體上,或位于相同的載體上??梢允褂帽绢I域技術人員已知的常規(guī)方法來消化和連接DNA,以及制備染色體DNA、進行PCR、制備質(zhì)粒DNA、轉化、設計寡核苷酸引物等。這些方法在Sambrook,J.,andRussell,D.W.MolecularCloningALaboratoryManual/ThirdEdition.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)等中描述??梢允褂眠_到充分轉化效率的任何方法將如上所述制備的重組DNA引入宿主微生物。實例包括電穿孔(Can.J.Microbiol.43:197-201(1997))。使用這種方法制備的質(zhì)粒的實例包括產(chǎn)生Lys的質(zhì)粒pCABD2,所述質(zhì)粒含有、dqp5和丄;^C基因(WO01/53459)。也可通過將靶基因的多拷貝引入微生物的基因組DNA來實現(xiàn)增強編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因的表達。可通過使用以多拷貝存在于所述基因組DNA上的序列作為同源重組中的靶來將靶基因的多拷貝引入微生物的基因組DNA中。對這種以使用同源重組的基因取代為基礎的位點特異性地引入突變已有描述。在這些方法中可使用線性DNA或含有溫度敏感復制起點的質(zhì)粒(美國專利6,303,383和JP05-007491A)??梢允褂弥貜虳NA和存在于可轉座元件末端的反向重復序列作為以多拷貝存在于基因組DNA上的序列??蓪-賴氨酸生物合成基因與基因組的天然基因串聯(lián)(intandem)連接,或可將其引入基因組上的非必需區(qū)或引入如果缺失將使L-賴氨酸產(chǎn)率得到改進的基因區(qū)。或者,如U.S.Patent5,595,889中披露,還可將乾基因定位于轉座子上,其后轉移所述轉座子以將多拷貝引入基因組DNA。用任一方法,將轉化體中靶基因的拷貝數(shù)增加,從而使L-賴氨酸生物合成的酶活性增加。除了上述基因擴增外,能夠通過將耙基因的表達調(diào)節(jié)序列(如啟動子等)用較強的取代來實現(xiàn)L-賴氨酸生物合成酶活性的增加(參見JP1-215280A)。例如,/ac啟動子、^T啟動子、fw啟動子、toc啟動子、ara5^啟動子、入嗟菌體PR啟動子、PL啟動子、tef啟動子、T7啟動子、cplO啟動子等是已知的強啟動子。使用這些啟動子取代使靶基因的表達增強,由此增加酶活性。強啟動子的實例和用于評估啟動子強度的方法的實例描述于Goldstein等(Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128,(1995)Prokaryoticpromotersinbiotechnology.),等等。也可通過修飾在編碼目標酶的基因的表達調(diào)節(jié)中涉及的元件來實現(xiàn)目標酶活性的增加,所述元件例如操縱基因或阻抑物(Hamiltonetal,J.Bacteriol.171:4617-4622(1989))。如WO00/18935中披露,能夠在耙基因的啟動子區(qū)中取代幾個堿基以修飾和增強所述基因。另外,已知在核糖體結合位點(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中,特別在起始密碼子的緊鄰上游序列中取代幾個核苷酸,對mRNA翻譯效率具有強烈的影響。因此,可以修-飾這些區(qū)來增加轉錄效率。能夠通過啟動子探針載體和基因分析軟件例如GENETYX(GENETYXCORPORATION)等確定耙基因的表達調(diào)節(jié)區(qū)例如啟動子等。能夠通過取代或修飾這些啟動子來增加耙基因的表達。例如,能夠以與上述使用Red-驅動整合方法(Red-drivenintegrationmethod)(WO2005/010175)。此外,在產(chǎn)生L-氨基酸的細菌中,可將下述酶的活性減少或缺失催化從L-氨基酸生物合成途徑分支的產(chǎn)生目標L-氨基酸之外化合物的反應的酶,或對L-氨基酸的合成或積累具有負效應的酶。在L-賴氨酸的產(chǎn)生中,這些酶包括高絲氨酸脫氫酶(f/2M)、賴氨酸脫羧酶(caW、WcC)和蘋果酸酶Cs/"、62"3)。在WO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等中公開所述酶活性減少或缺陷的菌抹。為了減少或缺失這些酶的活性,可使用常規(guī)誘變方法或遺傳重組技術,將減少或缺失細胞中所述酶活性的突變體引入基因組中上述酶的基因中。引入突變體的這種方法能夠通過下述實現(xiàn)例如通過遺傳重組來缺失在基因組上編碼酶的基因,或修飾表達調(diào)節(jié)序列例如啟動子或Shine-Dalgarno(SD)序列等。這也可通過如下方法實現(xiàn)在基因組上編碼酶的區(qū)中引入氨基酸取代(錯義突變)或終止密碼子(無義突變),引入添加或缺失1-2個堿基的移碼突變,或缺失基因的部分或完整區(qū)(J.Biol.Chem.272:8611-8617(1997))。同樣,通過如下方法能夠將酶活性減少或缺失構建已將部分或完整編碼區(qū)缺失的編碼突變酶的基因,其后通過同源重組等用所述基因取代基因組上的正?;颍驅⑥D座子或IS元件引入所述基因??梢允褂靡韵路椒ㄍㄟ^遺傳重組來引入使上述酶活性減少或缺失的突變。將含有耙基因的分離的DNA突變,以使所得突變基因不產(chǎn)生正常發(fā)揮功能的酶。隨后用含有突變基因的DNA轉化屬于腸桿菌科的微生物,以引起在所述突變基因和基因組上靶基因之間的重組。由此,可以用突變基因取代基因組上的靶基因。對于使用這種同源重組的基因取代,存在使用線性DNA的方法,例如稱為"Red-驅動整合"的方法(patsenko,K,A,andWanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645(2000))、將Red-驅動整合方法與X噬菌體切除系統(tǒng)(人phageexcisivesystem)纟且合的方法(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200_5203(2002))(參見百02005/010175)等;還存在使用含有溫度敏感復制起點的質(zhì)粒的方法(美國專利No.6,303,383;美國專利No.5,616,480)。這種如上所述使用同源重組通過基因取代來位點特異性地51入突變也可使用在選擇的宿主中不具有復制能力的質(zhì)粒進行。上述用于增加L-賴氨酸生物合成中涉及的酶活性的方法和用于減少酶活性的方法可同樣用于培育其它產(chǎn)生L-氨基酸的細菌。以下將描述用來培育其它L-氨基酸細菌的方法。在本發(fā)明中優(yōu)選使用的產(chǎn)生L-色氨酸的細菌包括將鄰氨基苯曱酸合酶、磷酸甘油酸脫氫酶或色氨S吏合酶中一種或多種的活性增強的細菌。由于鄰氨基苯曱酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶均受到L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制,能夠通過保留(retain)脫敏的突變酶來增加這些酶的活性。例如,通過引起鄰氨基苯曱酸合酶基因OpE)和/或磷酸甘油酸脫氫酶基因的突變以防止反饋抑制,再將所述突變基因引入屬于腸桿菌科的微生物,可獲得具有脫敏的酶的細菌(美國專利No.5,618,716、美國專利No.6,180,373)。這種細菌的具體實例包括如下獲得的轉化體將具有突變化M的質(zhì)粒pGH5引入保留脫敏的鄰氨基苯曱酸合酶的大腸桿菌SV164,所述突變編碼脫敏的磷酸甘油酸脫氫酶(W094/08301)。通過在大腸桿菌KB862的巧9五缺陷型菌林(DSM7196)中引入編碼脫敏的鄰氨基苯曱酸合酶的基因來獲得菌林SV164(參見WO94/08031)。用含有色氨酸操縱子的重組DNA轉化的細菌也是優(yōu)選的。具體實例包括用含有編碼脫敏鄰氨基苯曱酸合酶的基因的色氨酸操縱子轉化的大腸桿菌(JP57-71397A、JP62-244382A、美國專利No.4,371,614)。另外,能夠通過增強編碼色氨酸合酶的基因(^pA4)的表達來增強或賦予產(chǎn)生L-色氨酸的能力。色氨S吏合酶由?r^4和分別編碼的a和|3亞基組成。的核苷酸序列示于SEQIDNO:13,而的B的核香酸序列示于SEQIDNO:15。具有缺陷型^pi(色氨酸操縱子阻抑物)的菌林,和具有突變^pi的菌抹也是優(yōu)選的。(美國專利No.4,371,614、WO2005/056776)。其它優(yōu)選的產(chǎn)生L-色氨酸的細菌是結構性表達蘋果酸合酶、異檸檬酸裂合酶和異檸檬酸脫氬酶/磷酸酶操縱子(ace操縱子)的細菌,或將所述操縱子的表達增強的細菌(W02005/103275)。具體地,優(yōu)選操縱子的啟動子不受阻抑物/c/i的阻抑或去除了/cW的阻抑。能夠通過破壞/c/i基因或修飾ace操縱子的表達調(diào)節(jié)序列來獲得這種細菌。大腸桿菌的/c/i基因示于SEQIDNO:5。ace操縱子的表達增強的細菌能夠如下獲得將含有ace操縱子的DNA與強啟動子連接,并且使用質(zhì)粒或通過同源重組將所述重組DNA引入細胞;或通過使用轉座子來擴增ace操縱子的拷貝數(shù)。ace操縱子中包含的基因包括ac^B、(3cd和ace《。aceS、ac^4和ace尺的核苷酸序列分別示于SEQIDNOS:9、7和11。產(chǎn)生L-色氨酸的細菌的實例包括大腸桿菌AGX17(pGX44)[NRRLB-12263],其是L-苯丙氨酸和L-酪氨酸營養(yǎng)缺陷型;和AGX6(pGX50)aroP[NRRLB-12264],其包含含有色氨酸操縱子的質(zhì)粒pGX50(二者均參見美國專利No.4,371,614)。這些菌抹可以從農(nóng)業(yè)研究機構保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection,NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch)(地址Peoria,Illinois61604,USA)獲得。L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均為芳族氨基酸,并且共享共同的生物合成途徑。編碼這些芳族氨基酸生物合成酶的基因的實例包括脫氧阿拉伯-庚酉同糖酉臾石壽酸合酵(deoxyarabino-heptulosonatephosphatesynthase)(aroG)、3-脫氫奎寧酸合酶(araS)、莽草酸脫水酶、莽草酸激酶(ara丄)、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-碌酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase)(araJ)和分支酸合酶("raC)(EP763127)。因此,通過將編碼這些酶的基因多重拷貝(multi-copy)至質(zhì)?;蚧蚪M上,能夠改進產(chǎn)生芳族氨基酸的能力。已知這些基因由酪氨酸阻抑物O)ri)調(diào)控,所以也可通過缺失0^及基因來增加芳族氨基酸生物合成的酶活性(參見EP763127)。產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細菌的實例包括、缺陷的AJ12739(tyrA::Tnl0,tyrR)(VKPMB-8197),和具有擴增的編碼苯丙氨酸分泌蛋白的基因例如和yeW的菌林(WO03/044192;US2003/0148473A1)。在本發(fā)明中使用的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細菌優(yōu)選是屬于腸桿菌科的微生物,在所述微生物中將L-多氨酸生物合成酶增強。這些基因的實例包括編碼以下酶的基因天冬氨酸激酶m(一C)、天冬氨酸半醛脫氫酶("^/)、天冬氨酸激酶I0/^操縱子中包含的//7M)、高絲氨酸激酶(/Zzr萬)和蘇氨酸合酶(^"C)。可引入這些基因中的兩種以上??蓪-蘇氨酸生物合成基因引入已將蘇氨酸降解阻抑的埃希氏菌屬的細菌。已將蘇氨酸降解阻抑的埃希氏菌屬的細菌實例包括將蘇氨酸脫氫酶活性缺失的TDH6菌抹(美國專利No.6,960,455)等等。L-蘇氨酸生物合成途徑中某些酶的活性受L-蘇氨酸的抑制。因此,為了構建產(chǎn)生L-蘇氨酸的細菌,優(yōu)選對L-蘇氨酸生物合成酶進行修飾以使所述酶不受L-蘇氨酸的反饋抑制。上述決n4、和//w"C基因組成蘇氨酸操縱子,所述操縱子含有弱化子(attenuator)結構。它們的表達受到這種弱化作用的阻抑。此外,蘇氨酸操縱子的表達受到培養(yǎng)期間存在的異亮氨酸和蘇氨酸的抑制。可通過去除弱化區(qū)中的前導序列或弱化子來實現(xiàn)所述對蘇氨酸操縱子的修飾(參見Lynn,S.R,Burton,W.S.,Donohue,T.J.,Gould,R.M.,Gumport,R.I"andGardner,J.F.丄Mol.Biol.194:59-69(1987);WO02/26993;WO2005歸808)。在蘇氨酸操縱子的上游存在天然啟動子。可以用非天然啟動子取代所述啟動子(參見WO98/04715)?;蛘撸蓸嫿ㄌK氨酸操縱子而使蘇氨酸生物合成中涉及的基因的表達受到X噬菌體的阻抑物和啟動子的調(diào)控(參見EP0593792)。同樣,為了防止L-蘇氨酸的反饋抑制,也可通過選擇a-氨基-卩-羥基戊酸(AHV)抗性的菌抹來修飾埃希氏菌屬的細菌。優(yōu)選將經(jīng)修飾以防止L-蘇氨酸的反饋抑制的蘇氨酸操縱子在宿主中的拷貝數(shù)增加,或連接至強啟動子,從而增強所述操縱子的表達。除了使用質(zhì)粒擴增拷貝數(shù)之外,還可通過使用轉座子、Mu噬菌體等在基因組上引入蘇氨酸操縱子來增加拷貝數(shù)。對于天冬氨酸激酶III基因(/jasC),期望的是使用經(jīng)修飾以防止L-賴氨酸反饋抑制的基因。能夠使用在美國專利No.5,932,453中描述的方法獲得經(jīng)修飾以防止反饋抑制的/^C基因。除了L-蘇氨酸生物合成酶,期望的是增強涉及糖酵解系統(tǒng)、TCA循環(huán)和呼吸鏈的基因、調(diào)控這些基因表達的基因和誘導糖攝取的基因。在L-蘇氨酸產(chǎn)生中有效的這些基因的實例包括編碼轉氫酶(p""B)(EP733712)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶fepc)(W095/06114)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(p戸)(EP877090)的基因,和編碼棒狀桿菌型細菌或芽孢桿菌屬(ge皿s5ac/〃w)細菌中的丙酮酸羧化酶的基因(W099/18228、EP1092776)。還優(yōu)選增強賦予對L-蘇氨酸的抗性的基因和/或賦予對L-高絲氨酸的抗性的基因的表達,或將L-蘇氨酸抗性和/或L-高絲氨酸抗性賦予宿主。這些基因的實例包括郝基因(Res.Microbiol.154:123-135(2003))、郝基因(EP0994190)、r紐C基因(EP1013765)和;;/^、少mS基因(EP1016710)。對于將L-蘇氨酸抗性賦予宿主的方法,參見EP0994190、WO90/04636。產(chǎn)生L-蘇氨酸的細菌另外的實例是大腸桿菌VKPMB-3996菌林(參見美國專利No.5,175,107)。這種VKPMB-3996菌林在1987年4月7日以登錄號VKPMB-3996保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(theRussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms)(VKPM),GNIIGenetika(地址Russia,117545Moscow,1Dorozhnyproezd.1)。此外,VKPMB-3996菌才朱含有質(zhì)粒pVIC40(WO90/04636),所述質(zhì)粒pVIC40通過將蘇氨酸生物合成基因(蘇氨酸操縱子Ar/lBC)插入包含鏈霉素抗性標記的廣宿主范圍(widehost-range)載體質(zhì)粒pAY32中而獲得(參見Chistorerdov,A.Y"andTsygankov,Y.D.Plasmid,16:161-167(1986))。決M基因在pVIC40上,并且已將L-蘇氨酸對天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的反饋抑制脫敏。進一步優(yōu)選的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細菌實例是大腸桿菌VKPMB-5318菌抹(參見EP0593792)。VKPMB-5318菌林在1990年5月3日以登錄號VKPMB-5318保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM),GNIIGenetika(地址Russia,117545Moscow,1Dorozhnyproezd.1)。這種VKPMB-5318菌抹是異亮氨酸非營養(yǎng)缺陷型,并且含有重組質(zhì)粒DNA,將所述重組質(zhì)粒DNA構建成使蘇氨酸生物合成中涉及的基因(即,將弱化子和天然轉錄調(diào)節(jié)區(qū)缺失的蘇氨酸操縱子)位于溫度4f丈感CI阻抑物、PR啟動子和入噬菌體的Cro蛋白N末端的下游,并且蘇氨酸生物合成中涉及的所述基因的表達由所述X噬菌體阻抑物和啟動子調(diào)控。在本發(fā)明中使用的產(chǎn)生L-谷氨酸的細菌的實例包括屬于腸桿菌科的微生物,所述微生物經(jīng)修飾而將編碼L-谷氨酸生物合成中涉及的酶的基因的表達增加。L-谷氨酸生物合成中涉及的酶包括谷氨酸脫氫酶(在下文中,也稱作"GDH")、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶(在下文中,也稱作"CS")、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(在下文中,也稱作"PEPC")、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、;岸酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、葡糖磷酸異構酶等。在這些酶之中,CS、PEPC和GDH的一種或多種是優(yōu)選的,并且全部三種是更優(yōu)選的。使用上述方法修飾而將檸檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脫氫酶基因的表達增強的屬于腸桿菌科的微生物的實例在美國專利Nos.6,197,559&6,331,419、EP0999282中披露。此外,還可以使用經(jīng)修飾而將6-磷酸葡糖酸脫水酶或2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶中任一的活性增加或將二者的活性都增加的屬于腸桿菌科的微生物(EP1352966)。作為具有產(chǎn)生L-谷氨酸能力的腸桿菌科的微生物,還可以使用如下細菌,在所述細菌中,將催化產(chǎn)生L-谷氨酸之外化合物的反應的酶活性缺失或減少,而所述反應從L-谷氨酸的生物合成途徑分支。這些酶的實例包括2-酮戊二酸脫氬酶、異檸檬酸裂合酶、磷酸乙酰轉移酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合酶、曱酸乙酰轉移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氪酶(l-pyrrolinedehydrogenase)等。在這些之中,特別優(yōu)選減少或缺失2-酮戊二酸脫氪酶的活性。用于在屬于腸桿菌科的微生物中缺失或減少2-酮戊二酸脫氫酶的活性的方法在美國專利No.5,573,945、美國專利No.6,197,559和美國專利No.6,331,419中描述。具體地,將2-酮戊二酸脫氫酶活性缺失或減少的屬于腸桿菌科的微生物實例包括以下AJ13601(FERMBP-7207)植生克雷伯氏菌(《/dwzW/ap/a油'co/a)AJ13410菌抹(FERMBP-6617)大腸桿菌AJ12949(FERMBP-4881)在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的產(chǎn)生L-組氨酸的細菌實例包括大腸桿菌FERMP-5038和FERMP-5048。這些菌林含有載體,所述載體含有L-組氨酸生物合成中涉及的遺傳信息(JP56-005099A)。其它實例包括用氨基酸輸出基因i/zf轉化的細菌菌抹(EP1016710),和使其對磺胺胍(sulfaguanidine)、D,L-1,2,4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素有抗性的大腸桿菌80(VKPMB-7270,RussianPatentPublicationNo.2119536)等??梢允褂帽磉_L-組氨酸生物合成途徑酶的編碼基因的微生物。這些基因的實例包括編碼以下酶的基因ATP磷酸核糖轉移酶(/7&G)、磷酸核糖AMP環(huán)化水解酶(/^T)、磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(/^ffi)、磷酸核糖亞胺曱基-5-氨基咪峻氛曱酰核普酸異構酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolecarboxamideribotideisomerase)(/z/")、酰胺轉移酶(to外磷酸組氨醇氨基轉移酶(/7&C)、組氨醇磷酸酶(/7/W)和組氨醇脫氫酶基因(/2M))等。優(yōu)選的本發(fā)明產(chǎn)生L-半胱氨酸的細菌包括將胱硫醚P-裂合酶活性減少的細菌(JP2003-169668A),和保留絲氨酸乙酰轉移酶但具有減少或消除的L-半胱氨酸反饋抑制的埃希氏菌屬細菌(JP11-155571A)。優(yōu)選的本發(fā)明產(chǎn)生L-脯氨酸的細菌包括大腸桿菌702(VKPMB-8011),其對3,4-脫羥基脯氨酸和氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸(azetidine-2-carboxylate)有抗性,和702ilvA菌林(VKPMB-8012菌林),其缺乏z7v」并且源自菌林702(JP2002-300874A)。產(chǎn)生L-精氨酸的細菌的實例包括對a-曱基曱硫氨酸、p-氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸氧肟酸、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、a-曱基絲氨酸(a-methyleserine)、^-2-噻吩丙氨酸或磺胺胍有抗性的大腸桿菌突變體菌抹(參見JP56-106598A)等。大腸桿菌237菌抹是產(chǎn)生L-精氨酸的細菌,所述細菌具有對L-精氨酸的反饋抑制有抗性的突變體并且保留高活性的N-乙酰谷氨酸合酶,并且其也是優(yōu)選的產(chǎn)生L-精氨酸的菌抹(RussianPatentApplicationNo.2000117677)。所述編號為VKPMB-7925的菌抹在2000年4月10日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM),GNIIGenetika,并且根據(jù)布達佩斯條約在2001年5月18日轉為國際保藏。也可以使用大腸桿菌382菌林,其是237菌抹的衍生物并且是產(chǎn)生L-精氨酸的細菌,所述細菌具有改進的乙酸同化能力(JPM(^-0173"A)。編號為VKPMB-7926的大腸桿菌382菌抹在2000年4月10日保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)。同樣,作為具有產(chǎn)生L-精氨酸能力的微生物,可以使用具有改進的基因表達的微生物,所述基因編碼L-精氨酸生物合成中涉及的酶。L-精氨酸生物合成酶的實例是以下酶的一種或多種N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰-谷氨酰-磷酸還原酶(argC)、鳥氨酸乙酰轉移酶(argj)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥氨酸氨基轉移酶(argD)、乙酰鳥氨酸脫乙酰酶(argE)、鳥氨酸氨曱酰轉移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨曱酰磷酸合酶(carAB)。在每種酶名稱之后,在圓括號內(nèi)提供編碼該酶的基因的名稱。期望的是使用N-乙酰谷氨酸合酶基因(argA)的突變,其中通過取代對應于野生型中位置15-19的氨基酸序列而將L-精氨酸反饋抑制去除(EP1170361)??梢允褂玫漠a(chǎn)生L-亮氨酸的細菌包括大腸桿菌屬的細菌,在所述細菌中將由ilvE基因編碼的支鏈氨基酸t(yī)t轉移酶失活,并且將由tyrB基因編碼的芳族氨基酸氨基轉移酶的活性增強(EP1375655A);大腸桿菌H-9068菌抹(ATCC21530),所述菌株對4-氮亮氨酸或5,5,5-三氟亮氨酸有抗性;大腸桿菌H-9070菌抹(FERMBP-4704);大腸桿菌H-9072菌4朱(FERMBP-4706)(美國專利No.5,744,331);大腸桿菌菌抹,在所述菌林中將L-亮氨酸對異丙基蘋果酸合酶的反饋抑制脫敏(EP1067191);大腸桿菌AJ11478菌抹,所述菌抹對P-2漆吩丙氨酸和(3-羥亮氨酸有抗性(美國專利No.5,763,231),等等。產(chǎn)生L-異亮氨酸的細菌包括6-二曱基氨基嘌呤抗性的大腸桿菌突變菌抹(JP5-304969A)、L-異亮氨酸氧肟酸抗性的大腸桿菌突變菌抹(JP5-130882A)、硫代異亮氨酸抗性的(thiaisoleucine-resistant)大腸桿菌突變菌抹(JP5-130882A)、DL-乙基硫氨酸抗性的大腸桿菌突變菌株(JP5-130882A)和精氨酸氧肟酸抗性的突變菌抹(JP5-130882A)。重組埃希氏菌屬細菌的實例是以下細菌菌株,在所述菌林中通過用質(zhì)粒轉化將編碼L-異亮氨酸生物合成酶蘇氨酸脫氨基酶或乙酰羥酸合酶的基因增強(JP2-458A、JP2-42988A、JP8-47397),等等。產(chǎn)生L-纈氨酸的細菌實例包括大腸桿菌VL1970菌4朱(美國專利No.5,658,766)等。產(chǎn)生L-纈氨酸的細菌實例進一步包括生長需要硫辛酸(lipoicacid)和/或缺乏H+-ATP酶的突變體(W096/06926),和用含有//v(7MEA4操縱子的DNA片段轉化的埃希氏菌屬細菌,并且所述細菌至少表達,7vG、//vM、仏必和//vZ)基因。由于//vGMEDJ操縱子的表達受L-纈氨酸和/或L-異亮氨酸和/或L-亮氨酸的調(diào)節(jié)(弱化),期望的是將弱化作用所需的區(qū)去除或突變,從而去除L-纈氨酸對表達的抑制(美國專利No.5,998,178)。同樣期望的是,7vGMEA4操縱子不表達由//vJ基因編碼的蘇氨酸脫氨基酶活性。大腸桿菌VL1970具有如上所述已將弱化作用去除的/feW7突變,將所述菌林以登錄號VKPMB-4411保藏在G雨genetika(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms(VKPM)Depositary,GNIIgenetika)(地址1,DorozhnyProezd,,1,113545,Moscow,Russia》在本發(fā)明中使用的產(chǎn)生L-氨基酸的細菌中,除了編碼天然生物合成酶的基因外,可將糖攝取、糖代謝(糖酵解系統(tǒng))和能量代謝中涉及的基因增強。糖代謝中涉及的基因的實例是編碼攝取糖的糖酵解酶或蛋白的基因,例如編碼下述酶的基因葡糖-6-磷酸異構酶(pg/;WO01/02542)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(p戸;EP877090)、磷酸葡糖變位酶(pgm;WO03/04598)、果糖二磷酸醛縮酶(/kr,WO03/04664)、丙酮酸激酶(p;^F;WO0:3/008609)、轉醛醇酶(transaldolase)(to/5;WO03/008611)、延胡索酸酶(/i/m;WO01/02545)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(p戸;EP877090)、非-PTS蔗糖攝取系統(tǒng)(c";EP149911),和蔗糖同化基因Csc/^8操縱子;WO90/04636)。能量代謝中涉及的基因的實例包括轉氫酶基因0^"5;美國專利No.5,830,716)和細胞色素bo型氧化酶基因(qyo^BCD;EP1070376)。能夠通過修飾如上所述具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的^:生物,以增加選自ev^基因、g"巡基因或j^eO基因的一種或多種基因(其是編碼EvgAS雙組分體系中涉及的轉錄因子的基因)的表達,從而獲得本發(fā)明的微生物??梢栽谠黾踊颉議伍基因或We(9基因的表達量的修飾之后賦予產(chǎn)生目標物質(zhì)的能力。增加evgj基因、ga巡基因或j^O基因的表達可以是通過修飾表達調(diào)節(jié)區(qū)(包括如下文所述的啟動子修飾)來增加內(nèi)源的evg」基因、ga必基因或基因的表達;或這可以是通過引入含有evgv4基因、ga^ffi基因或基因的質(zhì)粒,或通過擴增細菌染色體上的這些基因等使ev^4基因、ga巡基因或y^O基因的拷貝數(shù)增加。另外,可以采用這些技術的組合。本發(fā)明中的"EvgAS雙組分系統(tǒng)"的意思是通過EvgS-EvgA組氨酸-天冬氨酸磷酸化調(diào)節(jié)(histidine-aspartatephosphorelayregulation)來激活轉錄因子的途徑。更具體地,EvgS蛋白(SEQIDNO:26)是傳感激酶,將所述蛋白的組氨酸殘基自磷酸化(autophosphorylate),然后將磷酸基團轉移至EvgA蛋白(SEQIDNO:24)特異性的天冬氨酸殘基,所述EvgA蛋白是應答調(diào)節(jié)子(responseregulator)和轉錄因子。應答調(diào)節(jié)轉錄因子EvgA由這種磷酸化激活從而調(diào)節(jié)許多基因的轉錄,并且激活編碼轉錄因子YdeO蛋白(SEQIDNO:30)的少&O基因(SEQIDNO:29)和/或編碼轉錄因子GadE蛋白(SEQIDNO:28)的gadE基因(SEQIDNO:27)的轉錄(J.Bacteriol.184:6225-6234,2002;Mol.Microbiol.48:699-712,2003)。YdeO蛋白還激活gadE基因的轉錄。作為ga^E基因的轉錄被已激活的EvgA蛋白和YdeO蛋白激活的結果,GadE蛋白的表達增加,而GadE蛋白作為正轉錄因子擴大其它基因的轉錄(Microbiology.150:61-72,2004;JBacteriol.186:7378-89,2004)。因此,本發(fā)明中的"EvgAS雙組分調(diào)節(jié)子中涉及的轉錄因子"指EvgA蛋白、GadE蛋白或YdeO蛋白。在本發(fā)明中,"傳感激酶"是發(fā)揮如下功能的蛋白感應環(huán)境因子作為配體,使用ATP將自身的組氨酸殘基磷酸化,其后將該磷酸基團遞送至應答調(diào)節(jié)子。在本發(fā)明中,"應答調(diào)節(jié)子"是發(fā)揮以下功能的蛋白在通過從傳感激酶接收到特異天冬氨酸的磷酸化而被激活之后,在細胞內(nèi)傳輸信息;并且在許多情況下其為轉錄因子。當與親本菌抹例如野生型菌林或未經(jīng)修飾的菌抹比較時,能夠通過與野生型或未經(jīng)修飾的菌林比較mRNA的量來確認編碼EvgA蛋白、GadE蛋白或YdeO蛋白的基因(下文中的evg丄gadE或;;6feO基因)表達的改進。Northern雜交和Reverse-TranscriptasePCR(逆轉錄酶PCR;RT-PCR)也可用來確認表達的量(Sambrook,J.,andRussell,D.W.MolecularCloningALaboratoryManual/ThirdEdition.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001))。只要活性與野生型或未經(jīng)修飾的菌抹相比增加,對酶活性的增加程度不進行限制,但是期望的是,例如是野生或未經(jīng)修飾的菌株的1.5或更多倍,優(yōu)選2或更多倍,或更優(yōu)選3或更多倍。如果靶蛋白量相對于未經(jīng)修飾的或野生型菌抹增加,則能夠確認酶活性的增加。這能夠通過例如使用抗體的Western印跡來4企觀'J(Sambrook,J.,andRussell,D.AV.MolecularCloningALaboratoryManual/ThirdEdition.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001》。本發(fā)明中的"轉錄因子"的意思是基因的轉錄因子,所述基因中的表達受EvgSA雙組分調(diào)節(jié)子的調(diào)控,并且所述轉錄因子對應于EvgA蛋白、GadE蛋白和YdeO蛋白。EvgA蛋白、GadE蛋白和YdeO蛋白正調(diào)節(jié)編碼多種代謝酶的基因的轉錄,所述代謝酶受EvgSA雙組分調(diào)節(jié)子的調(diào)控。例如,編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶(GND)的^^基因或編碼腺苷酸琥珀酸合酶的;w^基因的轉錄由EvgSA雙組分調(diào)節(jié)子的轉錄因子激活。即,通過改進與野生型菌抹或未經(jīng)修飾菌抹相比的EvgA蛋白、GadE蛋白和YdeO蛋白的產(chǎn)生量,使表達受EvgAS雙組分調(diào)節(jié)子調(diào)控的基因的轉錄量增加。能夠使用測量與DNA的連接的電泳遷移率變動分析,或使用轉錄活性的體外測量來測量轉錄因子的活性(Sambrook,J.,andRussell,D.W.MolecularCloningALaboratoryManual/ThirdEdition.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001))。本發(fā)明的evgj基因來自埃希氏菌屬的細菌及其同源物。例如,大腸桿菌的evgj基因是編碼具有SEQIDNO:24的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNO:23)。(GenBank登錄號NP_416870[gi:16130301])。evgj基因的同源物源自其它微生物,其在結構上與埃希氏菌屬細菌的evgj基因具有高相似性,當引入宿主時改進產(chǎn)生L-氨基酸的能力并且顯示轉錄因子活性。evgj同源物的實例是在GenBank登錄的沙門氏菌屬、志賀氏菌屬和耶爾森氏菌屬的ev^4基因等。另外,基于與上述實例中給出的基因的同源性,可以從以下細菌克隆evgj基因棒狀桿菌型細菌例如谷氨酸棒桿菌、吝'L發(fā)酵4豆斥干菌(5rev/6flcfen'w附/actoy^r附e"加附)等;布I單孑包菌屬(genus的纟田菌,1"列j口4同纟錄"f艮單'月包菌(尸sewfifo/wowos(3erwg7'"osa)等;分斗支4干菌屬(genus鄉(xiāng)co6acfen'wm)的細菌,例i口結沖亥分^支#干菌(鄉(xiāng)co6ac/eWwwrt^ercw/ow》等;和芽孢桿菌屬的細菌。可以接受具有不同基因名的基因,只要它們與埃希氏菌屬細菌的evg乂高度同源。例如,ev^4基因同源物包括能夠使用SEQIDNOS:17和18的合成寡核苷酸來克隆的基因?;谏鲜鲂蛄行畔ⅲ軌蛲ㄟ^從已知的數(shù)據(jù)庫搜索具有高同源性的基因來獲得evgj基因同源物的核苷酸序列。能夠使用例如Karlin和Altschul的BLAST算法(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或FASTA(MethodsEnzymol,,183,63(1990))來測定氨基酸序列和核苦酸序列的同源性。基于這種BLAST算法,已經(jīng)開發(fā)了稱為BLASTN或BLASTX的程序(參見http:〃www.ncbi.nih.gov/BLAST/)。本發(fā)明的ga巡基因的意思是埃希氏菌屬細菌的ga巡基因及其同源物。大腸桿菌g"伍基因的實例包括編碼具有SEQIDNO:28的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNO:27)。(GenBank登錄號NP_417969[gi:16131384])。如上述的基因同源物,g"伍基因的同源物是源自其它微生物的基因,其與埃希氏菌屬細菌的ga巡基因在結構上具有高相似性,當引入宿主時其改進產(chǎn)生L-氨基酸的能力并且顯示轉錄因子活性。g^ffi基因同源物包括能夠使用SEQIDNOS:19和20的合成寡核苷酸克隆的基因。本發(fā)明的基因的意思是埃希氏菌屬細菌的_y&<9基因及其同源物。大腸桿菌;^eO基因的實例包括編碼具有SEQIDNO:30的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNO:29)。(GenBank登錄號NP—416016[gi:16129458])。如上述的基因同源物,基因的同源物是源自其它微生物的基因,其與埃希氏菌屬細菌的7&6>基因在結構上具有高相似性,當引入宿主時其改進產(chǎn)生L-氨基酸的能力并且顯示轉錄因子活性。y&C)基因同源物包括能夠使用SEQIDNOS:21和22的合成寡核苷酸克隆的基因。本發(fā)明中使用的evgj基因、基因或y&(9基因不限于野生型基因;只要由其編碼的蛋白質(zhì)的功能(即,轉錄因子活性)不受損,其還可以是編碼蛋白質(zhì)的突變體或人工修飾的產(chǎn)物,所述蛋白質(zhì)具有的序列在SEQIDNO:24、28或30的氨基酸序列中的一個或多個位置包含一個或幾個氨基酸取代、缺失、插入、添加等。在本文中,術語"幾個"根據(jù)蛋白質(zhì)立體結構中氨基酸殘基的位置或氨基酸的類型而變化;具體地,幾個的意思是l-20,優(yōu)選地1-10,并且更優(yōu)選地l-5。以上一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入或添加是保留轉錄因子活性的保守突變。在保守突變中,如果取代位置是芳族氨基酸,則取代相互發(fā)生在Phe、Trp、Tyr之間;如果取代位置是疏水氨基酸,則在Leu、Ile、Val之間;如果是極性氨基酸,則在Gln、Asn之間;如果是堿性氨基酸,則在Lys、Arg、His之間;如果是酸性氨基酸,則在Asp、Glu之間;并且如果是具有羥基的氨基酸,則在Ser、Thr之間。常規(guī)的保守突變是保守取代。被認為是保守的取代的具體實例包括用Ser或Thr取代Ala;用Gln、His或Lys取代Arg;用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn;用Asn、Glu或Gin取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln;用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His;用Leu、Met、Val或Phe取代Ile;用Ile、Met、Val或Phe耳又代Leu;用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys;用Ile、Leu、Val或Phe取代Met;用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Tip;用His、Phe或Trp取代Tyr;和用Met、Ile或Leu取代Val。上述氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等包括依賴于保留evg丄gadE和:^eO基因的微生物的種間差異或個體差異而天然存在的突變(突變體或變體)。能夠通過如下方法獲得這些基因使用例如定點誘變來修飾SEQIDNOS:23、25和29中顯示的核苷酸序列,從而使編碼的蛋白質(zhì)中位點特異性的氨基酸殘基包含取代、缺失、插入或添力口。此外,作為evg丄^3cffi或;^e(9基因,是編碼蛋白質(zhì)的序列,所述蛋白質(zhì)是轉錄因子,并且所述蛋白質(zhì)與SEQNOS.26,30,或32的完整氨基酸序列具有至少80%,優(yōu)選至少卯°/。,更優(yōu)選至少95%,或甚至更優(yōu)選至少97%的同源性。另外,在分別引入evg丄g"伍或j^eO基因的宿主中,用該宿主更容易使用的其它等同密碼子取代這些基因中的密碼子。同樣,只要evg^、ga^ffi或^fe(9基因產(chǎn)物保留轉錄因子的功能,可以將其N末端或C末端延伸或去除。例如,延伸或去除的長度可以是50或更少,優(yōu)選20或更少,更優(yōu)選10或更少,并且甚至更優(yōu)選5或更少的氨基酸殘基。更具體地,可以使用編碼以下蛋白質(zhì)的基因,所述蛋白質(zhì)具有從N末端延伸或去除50-5個氨基酸的SEQIDNo.24、18或30,和/或從C末端延伸或去除50-5個氨基酸的SEQIDNo.24、18或30。同樣,能夠通過以下常規(guī)突變處理獲得基因的變體。突變處理方法之一是使用羥胺等,體外突變evg丄gadE或少&0基因。另一種方法使用紫外線或突變處理中通常使用的突變劑例如N-甲基-N,-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或甲磺酸乙S旨(EMS)來處理具有所述基因的微生物,例如,埃希氏菌屬的細菌。這些基因是否編碼具有轉錄因子活性的蛋白質(zhì)能夠通過如下方法確認例如在適當?shù)募毎斜磉_這些基因,并且研究是否存在轉錄因子活性。evg^、ga6伍或少&0基因還可以是在嚴緊條件下分別與SEQIDNo.23、DNA,并且所述DNA編碼具有轉錄活性的蛋白質(zhì)。在本文中,術語"嚴緊條件"指形成所謂的特異性雜合體(hybrid),并且不形成非特異性雜合體的條件。盡管難以以數(shù)字清楚地表述這些條件,但是可將這些條件例舉為如下條件在該條件下高度同源的DNA片段,例如,具有不少于70%同源性的DNA相互雜交,并且具有低于以上同源性的DNA不相互雜交?;蛘?,嚴緊條件的示例是以常規(guī)Southern雜交的洗滌條件,即,在相應于60。C、lxSSC、0.1%SDS,優(yōu)選0.1xSSC、0.1%SDS,并且更優(yōu)選68。C、O.lxSSC、(U。/。SDS的溫度和鹽濃度,進行一次或優(yōu)選2-3次洗滌。作為探針,還可以使用SEQIDNO:23、27或29的核苷酸序列或這些序列的一部分??梢允褂肞CR制備這樣的探針,在所述PCR中使用包含這些核苷酸序列之一的DNA片段作為模板,用基于SEQIDNO:23、27或29的核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物。例如,當使用長度為大約300bp的DNA片段作為探針時,雜交的洗滌條件是50。C、2xSSC和0.1%SDS。能夠通過使用例如遺傳重組技術以增加細胞中evg丄ga^E或;^eO基因的拷貝數(shù)來進行增強所述基因表達的修飾。例如,將含有evg」、g"伍或;^e(9基因的DNA片段與在宿主微生物中發(fā)揮功能的載體(優(yōu)選多拷貝型載體)連接以制備重組DNA,其后將所述重組DNA引入該-微生物以將其轉化。當使用大腸桿菌的evg丄gadE或;^e(9基因時,能夠通過PCR(PCR:聚合酶鏈式反應;參見White,T丄etal.,TrendsGenet.5,185(1989))來獲得這些基因,在所述PCR中使用大腸桿菌的基因組DNA作為才莫板,并且使用基于SEQIDNo.23、27或29的核苷酸序列制備的引物,例如,用于ev^4基因的SEQIDNos.17和18中所示的引物,用于基因的SEQIDNos.19和20中所示的引物,或用于j^eO基因的SEQIDNos.21和22中所示的引物。使用將基于轉錄因子其它序列信息制備的寡核苷酸用作引物的PCR,或使用將基于上述序列信息制備的寡核苷酸用作探針的雜交方法,也能夠從那些微生物中已知的evgj、或;^eO基因或其它種微生物中的、或y&0基因,或從微生物的基因組DNA或基因組DNA文庫獲得屬于腸桿菌科的其它微生物的evg丄gadE或;^eO基因。另外,基因組DNA可從DNA供體微生物制備。例如,可以使用Saito和Miura的方法等(參見H.SaitoandK.Miura,Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963),SeibutsuKogakuJikkensho[BioengineeringExperiments],editedbyTheSocietyofBiotechnology,Japan,pp.97-98,Baifukan,1992)。其后,通過將由PCR擴增的evg丄g"ffi或;^eO基因與能夠在宿主微生物的細胞中發(fā)揮功能的DNA載體連接來制備重組DNA。能夠在宿主微生物的細胞中發(fā)揮功能的載體是在所述宿主微生物的細胞中可自主復制的載體。在大腸桿菌的細胞中可自主復制的載體的實例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可從TakaraBioInc.獲得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可從NipponGeneCo"Ltd.獲得)、pSTV29(可從TakaraBioInc.獲得)等??蓪⑷缟纤鲋苽涞闹亟MDNA依照迄今已經(jīng)報導的任何轉化方法引入微生物。例如,一種方法是通過用氯化鉤處理受體細菌來增加DNA的透過性,如關于大腸桿菌K-12所報導的(Mandel,M.andHiga,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))。另一種方法是在從生長期的細胞制備感受態(tài)細胞之后引入DNA,如關于枯草芽孢桿菌(5ac/〃wwto7/力所才艮導的(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.andYoung,F.E.,Gene,1,153(1977》。同樣,另一種可以使用的方法是將DNA受體微生物(如已知涉及枯草芽孢桿菌、放線菌類(actinomycetes)和酵母的DNA受體微生物)改變?yōu)槟軌蛉菀椎財z取重組DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球狀態(tài),隨后將所述重組DNA引入該宿主中(Chang,S.andChoen,S.N.,Molec.Gen-Genet"168,111(1979);Bibb,M.J"Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.andFink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,751929(1978》。能夠通過將如上所述的evg丄ga必或基因的多拷貝整合在微生物的基因組DNA上來增加ev^、g"^E或j^eO基因的拷貝數(shù)。使用以多拷貝存在于所述基因組DNA上的序列作為靶,通過同源重組將evg丄gad^或:^eO基因的多拷貝引入微生物的基因組DNA??梢允褂弥貜虳NA和存在于可轉座元件末端的反向重復序列作為以多拷貝存在于染色體DNA上的序列。同樣,可以將這些基因與存在于基因組上的evg丄g^/五或少6fe(9基因串聯(lián)連接,或可以將這些基因以多拷貝并入基因組上的非必需基因中??梢允褂脺囟让舾休d體或整合載體來?I入這些基因。如JP2-109985A所披露,也可以將evg^、ga^E或j^eO基因并入轉座子,再轉移所述轉座子以將所述基因的多拷貝整合至染色體DNA中??赏ㄟ^使用具有evgj、ga^ffi或基因的一部分作為探針的Southern雜交來確認evgj、或基因整合至基因組中。除了上述的增加拷貝數(shù),還可使用WO00/18935中描述的方法來增強evg丄g"6伍或少A(9基因的表達,例如將基因組DNA或質(zhì)粒上的表達調(diào)節(jié)序列(如evg丄ga^;或;^eO基因的啟動子等)用更強的取代;使各基因的-35、-10區(qū)接近共有序列;擴增能夠增強evg丄gartE或y&0基因表達的調(diào)節(jié)基因;和缺失或減弱將會減少evg丄gfld五或:^eO基因表達的調(diào)節(jié)基因。例如,/ac啟動子、^啟動子、/rc啟動子、toc啟動子、flraSJ啟動子、X嗟菌體PR啟動子、PL啟動子、fef啟動子、T7啟動子、cpl0啟動子等是^^知的強啟動子。還可將核苷酸取代等引入evg丄&"伍或少&0基因的啟動子區(qū)或SD區(qū)以增加啟動子強度。用于評估啟動子強度的方法的實例和強啟動子的實例在Goldstein等的文章(Prokaryoticpromotersinbiotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995》等中描述。另外,已知在核糖體結合位點(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中取代幾個核苷酸,尤其是在起始密碼子的緊鄰上游的序列中取代幾個核苷酸,對mRNA翻譯效率具有強烈影響。可通過啟動子-探針載體和基因分析軟件如GENETYX等鑒定ev^4、伊c伍或基因的表達調(diào)節(jié)區(qū)(如啟動子等)。能夠通過取代或修飾這些啟動子來增強evg丄或基因的表達。能夠例如使用溫度敏感質(zhì)?;騌ed-驅動整合方法來進行表達調(diào)節(jié)序列的取代(W02005/010175)。也可以將增加下述基因轉錄的突變引入evg丄gat^或7&(9基因,所述基因的表達由evgj、或少A(9基因調(diào)節(jié)。增加由evg^、或基因編碼的蛋白質(zhì)活性的突變的實例是啟動子序列的突變,其增加evg丄ga^ffi或;^eO基因的轉錄量;和在所述基因的編碼區(qū)中的突變,其增加轉錄的比活性。由evg丄或基因編碼的蛋白質(zhì)由組氨酸激酶EvgS激活。因此,本發(fā)明的孩i生物可以是下述微生物,在所述孩i生物中通過增加編碼EvgS的evgS基因的表達量而增加ev^4、g"伍或少cfe(9基因的表達量。在本文中,本發(fā)明的evgS基因是指埃希氏菌屬細菌的evgS基因及其同源物。例如,大腸桿菌的evgS基因的示例是編碼具有SEQIDNO:26的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNO:25)。(GenBankAccessionNo.NP—417969[gi:16131384])。evgS基因的同源物的意思是源自其它微生物的基因,其在結構上與埃希氏菌屬細菌的w^基因具有高相似性,當引入宿主時改進產(chǎn)生L-氨基酸的能力并且顯示轉錄因子活性。evg51同源物的實例包括在GenBank登錄的沙門氏菌屬、志賀氏菌屬和耶爾森氏菌屬的evgS基因。另外,基于與上述實例中給出的基因的同源性,可以從以下細菌克隆evgS基因棒狀桿菌型細菌例如谷氨酸棒桿菌、乳發(fā)酵短桿菌等;假單孢菌屬的細菌,例如銅綠假單胞菌等;分枝桿菌屬的細菌,例如結核分枝桿菌等;和芽孢桿菌屬的細菌。可以接受具有不同基因名的基因,只要它們與埃希氏菌屬細菌的evgS高度同源。例如,在大腸桿菌中,evgS基因與evgj基因形成操縱子,并且能夠使用SEQIDNOS:17和18的合成寡核香酸通過PCR與evg」基因一起獲得。對于其它微生物,期望的是同樣能夠使用SEQIDNOS:17和18的寡核苷酸獲得這些基因。本發(fā)明中使用的基因不限于野生型基因;并且只要蛋白質(zhì)的功能(即,轉錄因子活性)不受損,其還可以是編碼蛋白質(zhì)的突變體或人工修飾的變體,所述蛋白質(zhì)具有的序列在SEQIDNO:26的氨基酸序列中的一個或多個位置包含一個或幾個氨基酸取代、缺失、插入、添加等,即具有保守突變的蛋白質(zhì)。術語"幾個"和"保守突變"與上文關于evgJ基因、g"伍基因和j^eO基因所述的相同??墒褂门c如上所述用來增加evg^、we伍或基因表達量相同的方法增加evgS的表達量??蓪θ炕蚴褂蒙鲜龇椒ㄖ换驅γ總€基因使用不同的方法來增加evgj、或基因的表達量。2.產(chǎn)生L-氨基酸的方法本發(fā)明的用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物,在所述培養(yǎng)基或微生物的細胞中產(chǎn)生和積累L-氨基酸,和從所述培養(yǎng)基或細胞中收集L-氨基酸。在使用微生物的發(fā)酵和L-氨基酸的產(chǎn)生中通常使用的培養(yǎng)基可用于本發(fā)明。即,可以使用含有碳源、氮源、無機離子和所需的其它有機組分的普通培養(yǎng)基。碳源包括糖,例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等;醇,例如甘油、山梨糖醇(solbitol)等;有機酸,例如延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸等。在這些中,可優(yōu)選使用葡萄糖、果糖和蔗糖。氮源包括無機銨鹽,例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等;有機氮,例如大豆水解物等;氨氣;氨水等。作為有積4敖量營養(yǎng)物源,優(yōu)選培養(yǎng)基中存在適當量的所需物質(zhì),例如維生素B1、L-高絲氨酸等,或酵母提取物等。除這些之外,才艮據(jù)需要,可添力口小量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基可以是天然的或合成的培養(yǎng)基,只要其含有碳源、氮源、無機離子和需要的其它有機微量營養(yǎng)物。可以將改進微生物的生長或目標物質(zhì)的生產(chǎn)力的氨基酸添加至培養(yǎng)基。例如,對于L-賴氨酸發(fā)酵優(yōu)選添加L-蘇氨酸、L-高絲氨酸或L-異亮氨酸。對于L-蘇氨酸發(fā)酵添加L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸或L-高絲氨酸,而對于L-色氨酸發(fā)酵添加L-苯丙氨酸或L-酪氨酸等。添加的L,氨基酸的濃度是大約0.01-10g/L。建議在需氧條件下,在24。C-37。C的培養(yǎng)溫度進行l(wèi)-7天培養(yǎng),培養(yǎng)期間的pH為5-9。可以使用無機或有機酸或石威物質(zhì)和氨氣等來調(diào)節(jié)pH??墒褂贸R?guī)離子交換樹脂方法、沉淀方法和其它已知方法的組合從發(fā)酵液中收集L-氨基酸。如果L-氨基酸積累在細胞內(nèi),可通過超聲處理等破壞細胞。隨后通過離心分離去除細胞碎片以獲得上清,使用離子交換樹脂方法等可從所述上清中再收集L-氨基酸。實施例在下文中將參考以下非限定性實施例對本發(fā)明進行更具體的說明。參考實施例1:構建產(chǎn)生L-色氨酸的細菌1-1引入mM基因磷酸甘油酸脫氫酶基因("M)存在于質(zhì)粒pGH5中(W09408031),并且使用轉座子Mud將其插入細菌的基因組。將含有Mudl11734的質(zhì)粒pCE1134(JP2-109985A),用5amHI消化以去除含有/ac操縱子的DNA片段,再將末端平端化,并且插入SwaI接頭。將這種質(zhì)粒用Smal重消化,再自身閉合形成環(huán)狀質(zhì)粒并命名為pMul134。通過用5^1和切割將含有"M的DNA片段從質(zhì)粒pGH5中切除,并且將所述片段的末端平端化。隨后將該片段插入上述pMul134的Smal位點。由此,構建了含有Mud的質(zhì)粒pMudserA,在所述Mud中插入了源自pGH5的化"基因(名為MudserA)。根據(jù)常規(guī)方法,通過使用卡那霉素抗性的獲得作為指標,使用具有脫敏的鄰氨基苯曱酸合酶的產(chǎn)生L-色氨酸的細菌菌林SV164(WO9408031)作為受體細菌,獲得將MudserA轉移至基因組上的細菌菌抹Ll。由Southern雜交實驗的結果推斷,在Ll菌抹中僅存在一個插入了MudserA的位置。同樣,通過PCR克隆含有MudserA的基因組DNA片段并且測定其核苷酸序列,確定所述插入處于大腸桿菌K-12基因組(GenBank登錄號U00096)上的位置No.240,950。1-2.引入^p操縱子其后,通過使用轉座子將印操縱子插入基因組中來增加吵操縱子的拷貝數(shù)。將?r/操縱子基因從質(zhì)粒pGX100中切除。pGX100通過如下方法構建將源自大腸桿菌MTR#2菌林(美國專利No.4,371,614)的DNA片段插入質(zhì)粒pBR313中,所述大腸桿菌MTR#2菌林具有脫敏的?^五基因。可通過用Zzol和切割將含有大約7.6kb&p操縱子的DNA片段從所述質(zhì)粒中切除。通過用Iol和Smal切割從pGX100切除含有化p操縱子的DNA片段,并且將所述片段的末端平端化。其后,將所述片段插入上述pCE1134的Swal位點。也可使用序列表中的SEQIDNOS:1和2所示的引物,采用PCR,直接從大腸桿菌MTR#2菌林基因組DNA克隆相同的含有吵操縱子的DNA片段。如上所述,構建了含有Mud的質(zhì)粒pMudtrpG,lac,在所述Mud中插入了源自MTR#2菌抹的化p操縱子基因(名為MudtrpG'lac)。為了使用乳糖同化能力的互補作用作為菌抹的選擇標記,在通過將MudtrpG'lac插入基因組來增加MudtrpG'lac的拷貝數(shù)之前,將乳糖同化缺陷性賦予宿主菌林。將產(chǎn)生L-蘇氨酸的細菌VKPMB-3996(美國專利No.5,175,107)的//vG基因PI轉導至LI菌林以賦予該Ll菌株L-纈氨酸抗性(參見WO2005A03228)。根據(jù)常規(guī)方法進行所述PI轉導,將轉導物鋪在M9基本培養(yǎng)基(4g/L葡萄糖、12.8g/LNa2HP04'7H20、3g/LKH2P04、0.5g/LNaCl、1g/LNH4C1、5mMMgS04、0.1mMCaCl2、1mg/L硫胺素、20mg/1L-Phe、20mg/LL-Tyr、20mg/LL-Met、3mg/L吡噴醇、20mg/LL-Val、20mg/L四環(huán)素)上,獲得了Val抗性菌落,并命名為LlValR。根據(jù)常規(guī)方法,用源自Tnl0的四環(huán)素抗性作為指示劑,將lacZ98::Tn10從ME8581菌抹(HfrH(valS—uxuAB):lacZ98::Tn10relAlthi-1,保藏于NationalInstituteofGenetics)Pl-轉導至LlValR。同預期一樣,獲得的菌抹是乳糖同化缺陷型。其后,為了獲得缺乏乳糖同化能力但是無TnlO的菌林,通過復制法從轉導的菌抹獲得四環(huán)素敏感菌林14-l-lac-tets。在所述14-1-lac-tets菌抹中仍然缺乏乳糖同化能力。當通過Southern雜交確認所述菌林的TnlO狀態(tài)之后,未檢測出與W基因雜交的條帶,但是檢測出與TnlO的IS10區(qū)雜交的條帶,由此確信IS10保留在/acZ基因上。依據(jù)常規(guī)方法,用乳糖同化能力的互補作用作為指示劑,使用pMudtrpG'lac,以14-1-lac-tets菌抹作為受體細菌,獲得在基因組中轉入了MudtrpG'lac的細菌菌抹No.202。如果插入的轉座子或轉座子上的基因趨于從插入轉座子的菌林中脫離(dropoff),可以在營養(yǎng)培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng)以選擇穩(wěn)定保留卡那霉素抗性、乳糖同化能力等的細菌菌抹。作為Southern雜交的結果推定在No.202菌抹中僅存在一個插入了MudtrpG'lac的位置。同樣,通過PCR克隆含有MudtrpG'lac的基因組DNA片段并且測定其核苷酸序列,確定所述插入處于大腸桿菌K-12基因組(GenBank登錄號U00096)上的位置No.530,249。其后,通過P1轉導將蔗糖同化特性中涉及的scrK、scrY、scrA、scrB和scrR基因引入No.202,并且將所得細菌菌株命名為No.202scr(參見WO90/04636)。1-3.構建用于破壞/c/7的質(zhì)粒使用PyrobestDNAPolymerase(TakaraShuzo)才艮據(jù)所附說明手冊采用PCR擴增/c/i片段。對于所述PCR反應,使用SEQIDNOS:3和4的寡核苷酸作為引物,以使用RNA/DNAmaxiKit(QIAGEN)提取的W3110基因組作為模板。在PCR之后,使用WizardPCRPreps(Promega)純化擴增的DNA片段。用限制性內(nèi)切核酸酶五coRI和歷'"^in(TakaraShuzo)消化經(jīng)純化的DNA片段,其后進行酚氯仿處理和乙醇沉淀以獲得純化的DNA。使用DNAligationKitVer.2(TakaraShuzo)將這種片段和用相同的酶消化然后純化的pUC18(TakaraShuzo)連接。用這種連接反應溶液轉化JM109感受態(tài)細胞(TakaraShuzo),隨后將其鋪至含有50pg/mL氨卡青霉素(Amp)(MeijiSeika)的LB瓊脂平板(LB+Amp平板),并且在37°C選擇菌落。使用含有50pg/mLAmp的LB培養(yǎng)基在37。C在試管中培養(yǎng)所述菌落,并且使用自動質(zhì)粒提取器(automaticplasmidextractor)PI-50(Kurabo)提取質(zhì)粒。將獲得的質(zhì)粒pUCiclR用限制性內(nèi)切核酸酶Eco065I(TakaraShuzo)消化,將其平端化并使用BKL試劑盒(TakaraShuzo)連接。用所述連接反應溶液轉化JM109,如上所述選擇菌落,并且提取質(zhì)粒。將獲得的質(zhì)粒用£coRI和消化然后純化,并且與已經(jīng)用相同的酶消化并純化的溫度敏感質(zhì)粒pTSl連接。pTSl通過用pBR322(TakaraShuzo)的片段取代pMAN031(參見J.Bacteriol.162,1196-1202(1985),圖l)的M-ZZ/"週片段獲得。用所述連接反應溶液轉化JM109,并且在30°C在LB+Amp平板上選擇菌落。使用含有50pg/mLAmp的LB培養(yǎng)基在試管中在30°C培養(yǎng)所述菌落,并且如上所述提取質(zhì)粒。通過用五coRI和歷"^in消化所述質(zhì)粒產(chǎn)生具有期望長度的片段,將該質(zhì)粒命名為zWA破壞質(zhì)粒pTSAiclR。1-4.獲得/c/i-破壞型菌抹用pTSAiclR轉化No.202scr,并且在30。C在LB+Amp平板上選擇菌落。在30°C過夜進行液體培養(yǎng)之后,將培養(yǎng)物稀釋l(T3并且鋪在LB+Amp平板上,在42。C選擇菌落。具體地,將培養(yǎng)物鋪在LB+Amp平板上,并且在30。C培養(yǎng),將覆蓋平板1/8的細胞懸浮在2mLLB培養(yǎng)基中,并且伴隨搖動在42。C培養(yǎng)4-5小時。將10-5稀釋的細胞鋪在LB平板上并且獲得菌落,將其中約一百個菌落分別鋪在LB平板和LB+Amp平板上,并且通過確認它們的生長確定了Amp敏感性和抗性。通過使用SEQIDNOS:3和4的寡核苷酸作為引物的集落PCR檢驗Amp敏感的菌林。結果獲得了/c/i缺陷型菌抹(No.202八iclR),在所述菌林中擴增的片革殳不能用五co0651切割。實施例1:構建用于增強evg^S、g"ffi和j^eO基因的質(zhì)粒1-1.構建用于增強ev^4和ev^S基因的質(zhì)粒已經(jīng)報導了大腸桿菌(大腸桿菌K-12菌抹)基因組的完整核苷酸序列(Science,277,1453-1474(1997)),并且已知evgJS形成操縱子結構?;谠谏鲜鰣髮е袌髮У膃vgAS基因的核苷酸序列(GenBank登錄號AAC75428和AAC75429),合成具有州'"Jin位點的SEQIDNO:17中所示寡核芬酸作為5,引物,和具有五coRI位點的SEQIDNO:18中所示寡核苷酸作為3'引物。使用這些引物,用大腸桿菌W3110菌株的基因組DNA作為模板進行PCR,并且將擴增的產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶i7/w/in和5coRI處理以獲得含有基因的片段。將純化的PCR產(chǎn)物連接至已經(jīng)用///"dn和五coRI消化的載體pMW118(NipponGeneCo.,Ltd.),由此構建用于擴增evgj61操縱子的質(zhì)粒1-2.構建用于增強gm伍的質(zhì)粒已經(jīng)報導了大腸桿菌(大腸桿菌K-12菌抹)基因組的完整核苷酸序列(Science,277,1453-1474(1997))?;谠谏鲜鰣髮е袌髮У膅"d五基因的核苷酸序列(GenBank登錄號AAC76537),合成具有SawHI位點的SEQIDNO:19中所示寡核苷酸作為5'引物,和具有77/w/in位點的SEQIDNO:20中所示寡核普酸作為3,引物。使用這些引物,用大腸桿菌W3110菌林的基因組DNA作為才莫板進行PCR,并且將擴增的產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶/f/m/in和5awffl處理以獲得含有ga必基因的片段。將純化的PCR產(chǎn)物連接至已經(jīng)用歷m/111和SamHI消化的載體pMW118(NipponGeneCo.,Ltd.),由此構建用于擴增gatffi的質(zhì)粒pMW-gadE。1-3.構建用于增強的質(zhì)粒已經(jīng)報導了大腸桿菌(大腸桿菌K-12菌抹)基因組的完整核苷酸序列(Science,277,1453-1474(1997))?;谠谏鲜鰣髮е袌髮У膟&(9基因的核苷酸序列(GenBank登錄號AAC74572),合成具有///"JTII位點的SEQIDNO:21中所示寡核苷酸作為5'引物,和具有五coRI位點的SEQIDNO:22中所示寡核苷酸作為3'引物。使用這些引物,用大腸桿菌W3110菌抹的基因組DNA作為4莫板進行PCR,并且將擴增的產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶///w/in和£coRI處理以獲得含有;^e(9基因的片段。將純化的PCR產(chǎn)物連接至已經(jīng)用歷'"^in和五coRI消化的載體pMW118(NipponGeneCo.,Ltd.),由此構建用于擴增的質(zhì)粒pMW-ydeO。實施例2:evgAS、y^O和go6ffi基因擴增對產(chǎn)生L-色氨酸的埃希氏菌屬細菌菌抹的影響用實施例1中產(chǎn)生的gatffi-擴增質(zhì)粒pMW-gadE、evg^S-擴增質(zhì)粒pMW-evgAS和j^e(9-擴增質(zhì)粒pMW-ydeO轉化參考實施例1中構建的產(chǎn)生L-色氨酸的菌林No.202AiclR,由此獲得氨千青霉素抗性菌林。在確認已經(jīng)引入這些質(zhì)粒之后,將引入gadE-擴增質(zhì)粒pMW-gadE的菌抹命名為No.202AiclR/gadE菌抹;將引入evgAS-擴增質(zhì)粒pMW-evgAS的菌抹命名為No.202AiclR/evg^S菌抹;并且將51入y^O-擴增質(zhì)粒pMW-ydeO的菌林命名為No.202AiclR7ydeO菌抹??梢允褂贸齆o.202AiclR之外的已知產(chǎn)生L-色氨酸的細菌以相同的方式來擴增evg乂S、少&0和伊wffi基因。將如上產(chǎn)生的菌林在含有50mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)直至OD600成為大約0.6。其后,將等體積的40°/。甘油溶液添加至培養(yǎng)液并且攪拌,再將適量分裝并且貯藏在-80。C以制成甘油原種(glycerolstock)。在將這些菌抹的甘油原種融化之后,將各100mL均勻地鋪在含有50mg/L氨卡青霉素的L平板上,并且將所述平板在37。C培養(yǎng)24小時。將平板上大約1/8的細胞接種至500mLSakaguchi燒瓶中具有50mg/L氨千青霉素的20mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,并且使用往復搖動培養(yǎng)裝置在37°C培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)之后,使用氨基酸分析儀L-8500(Hitachi)測量培養(yǎng)基中積累的L-色氨酸的量。用于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成如下。產(chǎn)生L-色氨酸的培養(yǎng)基葡萄糖40g/L(NH4)2S0415g/LKH2P041.5g/LMgS04.7H200.3g/LFeS04'7恥0.01g/LMnS04,7H200.01g/L酵母提取物2.0g/L鹽酸硫胺素(thiaminHCl)0.005g/L吡口多醇0.03g/LL-Met0.05g/LL畫Phe0.1g/LL-Tyr0.1g/LCaC0330g/L用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0,在120°C高壓滅菌20分鐘。將葡萄糖和MgS04.7H20混合,并且與其它成分分開滅菌。CaC03在干熱滅菌之后添加。在第48小時的OD600和L-色氨酸積累示于表1。表1:evgJS、和擴增對產(chǎn)生Trp的細菌No.202AiclR的影響菌抹OD(600nm)Trp濃度(g/1)No.202AiclR7.07.2No.202AiclR/ev-7.27.6No.202AiclR一(97.07.4No.202AiclR/gadE7.47,5No.202AiclR/ev^4S、No.202AiclR/;^eO和No.202AiclR/gac^是evg^S、和gadE基因擴增的菌林,與對照No.202AiclR相比各自顯示出L-色氨酸積累的增加。實施例3:evg^S、少&0和gw伍擴增對產(chǎn)生L-蘇氨酸的埃希氏菌屬細菌菌才朱的影響使用大腸桿菌VKPMB-5318菌抹(參見EP0593792)作為產(chǎn)生L-蘇氨酸的埃希氏菌屬細菌菌抹。用實施例1中構建的g^ffi-擴增質(zhì)粒pMW-gadE、evg^S-擴增質(zhì)粒pMW-evgJS和ycfe(9-擴增質(zhì)粒pMW-ydeO轉化VKPMB-5318菌林,由此獲得氨節(jié)青霉素抗性菌抹。在確認已經(jīng)引入這些質(zhì)粒之后,將引入g^ffi-擴增質(zhì)粒pMW-gadE的菌抹命名為B5318/gtwffi菌林;將引入evg^S-擴增質(zhì)粒pMW-ev^4S的菌抹命名為B5318/evg^S菌林;并且將引入y&(9-擴增質(zhì)粒pMW-ydeO的菌抹命名為B5318/_y&(9菌株??梢?使用除VKPMB-5318之外的已知產(chǎn)生L-蘇氨酸的細菌以相同的方式來擴增ev^4S、和基因。將如上產(chǎn)生的菌抹在含有50mg/L氨千青霉素的LB培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)直至OD600成為大約0.6。其后,將等體積的40%甘油溶液添加至培養(yǎng)液并且攪拌,再將適量分裝并且貯藏在-80。C以制成甘油原種。在將這些菌抹的甘油原種融化之后,將各100mL均勻地鋪在含有50mg/L氨千青霉素的L平板上,并且將其在37。C培養(yǎng)24小時。將平板上大約1/8的細胞接種至500mLSakaguchi燒瓶中具有50mg/L氨千青霉素的20mL下述發(fā)酵培養(yǎng)基中,并且使用往復搖動培養(yǎng)裝置在37。C培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)之后,使用氨基酸分析儀L-8500(Hitachi)測量培養(yǎng)基中積累的L-蘇氨酸的量。用于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成如下。產(chǎn)生L-蘇氨酸的培養(yǎng)基葡萄糖40g/L(NH4)2S0416g/LKH2P041.0g/LMgS04.7H201.0g/LFeS04-7H200.01g/LMnS04'7H200.01g/L酵母提取物2.0g/LCaCO3(JapanesePharmacopoeia)30g/L用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0,在120°C高壓滅菌20分鐘。將葡萄糖和MgS04.7H20混合并且單獨滅菌。CaC03在干熱滅菌之后添加。在第48小時的OD600和L-蘇氨酸積累示于表2。表2:evgAS、j^/e(9和gatffi擴增的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>B5318/evg」S、B5318&(9和B5318/ga^:是evg^5"、和基因擴增的菌抹,與對照VKPMB-5318相比各自顯示出L-蘇氨酸積累的增加。實施例4:構建產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌4-1.構建將編碼賴氨酸脫羧酶的caW和WcC基因破壞的菌抹首先,構建不產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶的菌林。賴氨酸脫羧酶同工酶(isozyme)由ca^基因(GenBank登錄號NP_418555.SEQIDNO:31)和WcC基因(GenBank登錄號NP—414728.SEQIDNO:33)編碼(參見WO96/17930)。WC196菌林(參見WO96/17930)是AECS-(2-氨乙基)-半胱氨酸抗性菌林,將WC196菌抹用作產(chǎn)生L-賴氨酸的大腸桿菌菌抹的親本菌抹。使用最初由Datsenko和Wanner開發(fā)的稱為"Red-驅動整合"的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97.6640-6645(2000)),和X嗟菌體切除系統(tǒng)(J.Bacteriol.184.5200-5203(2002))來缺失編碼賴氨酸脫羧酶的cadj和WcC基因。根據(jù)"Red-驅動整合"方法,使用將5,末端設計為耙基因的一部分并且將3,末端設計為抗生素抗性基因的一部分的合成寡核苷酸作為引物獲得PCR產(chǎn)物,使用所述PCR產(chǎn)物可以在單一的步驟中構建基因破壞的菌林。另外,結合X噬菌體切除系統(tǒng),能夠將整合至基因破壞菌抹中的抗生素抗性基因去除(JP2005-058227A)。4-2.破壞ca^4基因使用質(zhì)粒pMW118-attL-Cm-attR(WO2005/010175)作為PCR模板。pMWl18-attL-Cm-attR是將a"丄和基因(人噬菌體附著位點)和基因(抗生素抗性基因)以attL-cat-attR的順序插入pMW118(TakaraBioInc.)中的質(zhì)粒。使用SEQIDNOS:35和36中所示合成寡核苷酸作為引物進行PCR,其中各個引物在3'端具有相應于W仏和各個末端的序列,并且在5'末端具有相應于部分靶caW基因的序列。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化,其后通過電穿孔引入含有質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌WC196菌抹,所述質(zhì)粒具有溫度敏感復制能力。質(zhì)粒pKD46(Proc.Natl,Acad.Sci.USA.97.6640-6645(2000))含有總共2154堿基的人噬菌體DNA片段,其包含編碼XRed同源重組系統(tǒng)中Red重組酶的基因(y、|3和exo),所述基因受阿拉伯糖誘導的ParaB啟動子調(diào)控(GenBank/EMBL登錄號J02459:31088th—33241st)。如下制備用于電穿孔的感受態(tài)細胞。即,將在含有100mg/L氨千青霉素的LB培養(yǎng)基中在30°C培養(yǎng)過夜的大腸桿菌WC196菌抹在含有氨節(jié)青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(lmM)的5mLSOB培養(yǎng)基中稀釋100倍(MolecularCloning:LabManual2ndedition,Sambrook,J.,etal.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。將稀釋的懸液在30°C通氣培養(yǎng)(aerate)直到OD600達到大約0.6,之后將懸液濃縮100倍并用10%甘油洗滌三次準備用于電穿孔。使用70感受態(tài)細胞和大約100ngPCR產(chǎn)物進行電穿孔。向電穿孔后的細胞添加1mLSOC培養(yǎng)基(MolecularCloning:LabManual2ndedition,Sambrook,丄,etal.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)),并且在37°C培養(yǎng)2.5小時,其后在含有Cm(氯霉素)(25mg/L)的L-瓊脂的平板培養(yǎng)基上在37°C培養(yǎng),由此選擇Cm抗性的重組體。接下來,為了去除pKD46質(zhì)粒,將重組體在含有Cm的L-瓊脂培養(yǎng)基上在42°C傳代培養(yǎng)兩次,測試所得菌落的氨千青霉素抗性,并且獲得了去除pKD46的氨千青霉素敏感性菌抹。使用PCR確認通過氯霉素抗性基因鑒定的突變體中ca^4基因的缺失。將得到的缺陷型菌抹命名為WC196AcadA::att-cat菌抹。其后,為了去除基因中引入的aa-caf基因,使用輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts(WO2005/010175)。pMW-intxis-ts是含有編碼X噬菌體整合酶(integrase)(Int)的基因和編碼切除酶(excisionase)(Xis)的基因的質(zhì)粒。使用常規(guī)方法制備如上所述獲得的WC196AcadA::att-cat菌林的感受態(tài)細胞,并且用輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts轉化,在含有50mg/L氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上在30°C培養(yǎng),由此選擇氨千青霉素抗性菌抹。其后,為了去除pMW-intxis-ts質(zhì)粒,將氨千青霉素抗性轉化體在L-瓊脂培養(yǎng)基上在42。C傳代培養(yǎng)兩次,測試所得菌落的氨芐青霉素抗性和氯霉素抗性,由此獲得了將aW-ca/和pMW-intxis-ts去除的氯霉素和氨千青霉素敏感性菌抹。將這種菌抹命名為WC196AcadA。4-3.破壞WC196AcadA菌抹中的WcC基因按照上文描述的技術,使用引物SEQIDNos.37和38作為WcC破壞引物,將WC196AcadA菌林中的WcC基因缺失。由此獲得了將ca^4,WcC破壞的菌抹WC196AcadAAldcC。實施例5:e^AS擴增對產(chǎn)生L-賴氨酸的埃希氏菌屬細菌菌林的影響5-1.在WC196AcadAAldcC菌林中引入產(chǎn)生賴氨酸的質(zhì)粒按照常規(guī)方法,用產(chǎn)生賴氨酸的質(zhì)粒pCABl轉化WC196AcadAAldcC菌株,所述質(zhì)粒pCABl含有da/^、^p^和^C基因(W001/53459),從而獲得WC196AcadAAldcC/pCAB1菌抹(WC196LC/pCAB1)。用實施例1中構建的evg^S擴增質(zhì)粒pMW-evgAS轉化WC196LC/pCABl菌抹,由此獲得氨千青霉素抗性菌株。在確認已將指定的質(zhì)粒引入后,將引入了evgAS擴增質(zhì)粒pMW-evg^S的菌才朱命名為WC196LC/pCABl/evgAS菌抹。也可使用除WC196LC/pCABl菌抹之外的已知產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌以相同的方式擴增evgAS。將如上產(chǎn)生的菌株在含有25mg/L鏈霉素和50mg/L氨千青霉素的LB培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)直至OD600成為大約0.6。其后,將等體積的40%甘油溶液添加至培養(yǎng)液并且攪拌,其后將適量分裝并且貯藏在-80。C以制成甘油原種。5-2.產(chǎn)生賴氨酸的培養(yǎng)在將這些菌抹的甘油原種融化之后,將各100mL均勻地鋪在含有50mg/L氨千青霉素的L平板上,并且將平板在37。C培養(yǎng)24小時。將獲得的平板上大約1/8的細胞接種至500mLSakaguchi燒瓶中具有50mg/L氨千青霉素的20mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,并且使用往復搖動在37。C培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)之后,使用Biotech-analyzerAS210(SakuraSeiki)測量培養(yǎng)基中積累的L-賴氨酸的量。用于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成如下。產(chǎn)生L-賴氨酸的培養(yǎng)基葡萄糖40g/L(NH4)2S0416g/LKH2P041.0g/LMgS04.7H201.0g/LFeS04.7H200.01g/LMnS04-7H200.01g/L酵母提取物2.0g/LCaC03(JapanesePharmacopoeia)30g/L用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0,在120°C高壓滅菌20分鐘。將葡萄糖和MgS04.7H20混合并且單獨滅菌。CaC03在干熱滅菌之后添加。在第48小時的OD600和L-賴氨酸積累示于表3。表3:evgAS擴增對產(chǎn)生賴氨酸的細菌WC196LC/pCABl的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>WC196LC/pCABl/evgAS是evgJS基因擴增的菌林,與對照WC196LC/pCABl相比顯示出L-賴氨酸積累的顯著增加。實施例6:g"伍擴增對產(chǎn)生L-賴氨酸的埃希氏菌屬細菌菌抹的影響6-1.構建將g"必基因增強的產(chǎn)生L-賴氨酸的菌抹將g"dE基因片段從實施例1中構建的含有大腸桿菌W3110菌林g"dE基因的質(zhì)粒pMW-g"c伍中切除,并且將所述片段與用///w/III和5awffl消化的載體pUC18(TakaraShuzo)連接,由此構建gt^ffi擴增質(zhì)粒pUC-gadE。用上述pUC-gadE轉化WC196LC/pCABl菌抹,由此獲得氨千青霉素抗性菌林。在確認已經(jīng)引入指定的質(zhì)粒之后,將引入了擴增質(zhì)粒pUC-gadE的菌抹命名為WC196LC/pCABl/pUC-gadE菌抹??梢允褂贸齏C196LC/pCABl之外的已知產(chǎn)生L-賴氨酸的細菌以相同的方式來擴增evgAS、少6feO和gadE。也可以以evgAS、或基因的任何組合來進行擴增。將如上產(chǎn)生的菌林在含有25mg/L鏈霉素和50mg/L氨卡青霉素的LB培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)直至OD600達到大約0.6。其后,將等體積的40%甘油溶液添加至培養(yǎng)液并且攪拌,其后將適量分裝并且貯藏在-80。C以制成甘油原種。6-2.產(chǎn)生賴氨酸的培養(yǎng)在將這些菌抹的甘油原種融化之后,將各100mL均勻地鋪在含有25mg/L鏈霉素和50mg/L氨千青霉素的L平板上,并且將平板在37。C培養(yǎng)24小時。將獲得的平板上大約1/8的細胞接種至500mLSakaguchi燒瓶中具有25mg/L鏈霉素和50mg/L氨千青霉素的下述20mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,并且使用往復搖動培養(yǎng)裝置在37。C培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)之后,使用Biotech-analyzerAS210(SakuraSeiki)測量培養(yǎng)基中積累的L-賴氨酸的量。用于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成如下。產(chǎn)生L-賴氨酸的培養(yǎng)基葡萄糖或果糖40g/L(NH4)2S0416g/LKH2P041.0g/LMgS04.7H201.0g/LFeS04.7H200.01g/LMnS047H200.01g/L異亮氨酸0.1g/L酵母提取物2.0g/LCaC03(JapanesePharmacopoeia)30g/L用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0,在120°C高壓滅菌20分鐘。將葡萄糖和MgS04.7H20混合并且單獨滅菌。CaC03在干熱滅菌之后添加。在第48小時的OD600和積累的L-賴氨酸示于表4。表4:在葡萄糖培養(yǎng)和果糖培養(yǎng)中g化伍擴增對產(chǎn)生賴氨酸的細菌WC196LC/pCABl的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在葡萄糖培養(yǎng)和果糖培養(yǎng)中,與對照WC196LC/pCABl相比,g(^E基因擴增的菌株WC196LC/pCABl/pUCgadE均顯示出L-賴氨酸積累的增力口,特別在果糖培養(yǎng)中表現(xiàn)出L-賴氨酸積累的顯著增加。工業(yè)實用性通過使用本發(fā)明的微生物,可以通過發(fā)酵有效地產(chǎn)生L-氨基酸,尤其是L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-色氨酸。序列表說明SEQIDNO1用于擴增印操縱子的引物SEQIDNO2用于擴增^7操縱子的引物SEQIDNO用于擴增/c/i基因的引物SEQIDNO4用于擴增/cW基因的引物SEQIDNO/c漢基因的核苷酸序列SEQIDNO6由/c/i基因編碼的氨基酸的序列SEQIDNO7ac"基因的核苷^列SEQIDNO8由基因編碼的氨基酸的序列SEQIDNO9ac^基因的核苷Sl^列SEQIDNO10由acW基因編碼的氨基酸的序列SEQIDNO11ace尺基因的核苷酸序列SEQIDNO12由ace《基因編碼的氨基酸的序列SEQIDNO13^pj基因的核苷酸序列SEQIDNO14由^p乂基因編碼的氨基酸的序列SEQIDNO15^p5基因的核苷^列SEQIDNO16由^p5基因編碼的氨基酸的序列SEQIDNO17用于擴增evg^S操縱子的引物SEQIDNO:18SEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21SEQIDNO:22SEQIDNO:23SEQIDNO:24SEQIDNO:25SEQIDNO:26SEQIDNO:27:SEQIDNO:28:SEQIDNO:29:SEQIDNO:30:SEQIDNO:31:SEQIDNO:32:SEQIDNO:33:SEQIDNO:34:SEQIDNO:35:SEQIDNO:36:SEQIDNO:37:SEQIDNO:38:用于擴增evgAS操縱子的引物用于擴增g^ffi基因的引物用于擴增gadE基因的引物用于擴增基因的引物用于擴增;^eO基因的引物evg/i基因的核苷酸序列EvgA的氨基酸序列evgS基因的核苷酸序列EvgS的氨基酸序列ga^ffi基因的核苷酸序列GadE的氨基酸序列少&0基因的核苷^列YdeO的氨基酸序列ca^4基因的核苷酸序列由基因編碼的氨基酸的序列WcC基因的核苷酸序列由WcC基因編碼的氨基酸的序列用于破壞ca^4基因的PCR引物用于破壞基因的PCR引物用于破壞基因的PCR引物用于破壞/A基因的PCR引物權利要求1.用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法,其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸桿菌科的細菌,所述細菌具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力,并且經(jīng)修飾而將選自下組的基因的表達量增加evgA基因、gadE基因或ydeO基因,和它們的組合,其中所述基因編碼EvgAS雙組分體系調(diào)節(jié)子中涉及的轉錄因子;和從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。2.根據(jù)權利要求1的方法,其中通過增加每種基因的拷貝數(shù),或修飾所述基因的表達調(diào)節(jié)序列來增加至少一種基因的表達。3.根據(jù)權利要求1或2的方法,其中通過修飾細菌以使編碼傳感激酶的evgS基因的表達增加來增加至少一秤基因的表達。4.根據(jù)權利要求1-3中任一項的方法,其中所述evg^基因是選自下組的DNA:(a)包含SEQIDNO:23的核苷酸序列的DNA,和(b)在嚴緊條件下,與SEQIDNO.23的核苷酸序列的互補核苷酸序列或能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有轉錄因子活性的蛋白質(zhì)。5.根據(jù)權利要求1-3中任一項的方法,其中所述gad五基因是選自下組的DNA:(c)包含SEQIDNO:27的核苷酸序列的DNA,和(d)在嚴緊條件下,與SEQIDNO.27的核苷酸序列的互補核苷酸序列或能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有轉錄因子活性的蛋白質(zhì)。6.根據(jù)權利要求1-3中任一項的方法,其中所述y^O基因是選自下組的DNA:(e)包含SEQIDNO:29的核苷酸序列的DNA,和(f)在嚴緊條件下,與SEQIDNO.29的核苷St亭列的互補核苷酸序列或能夠從所述核香酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有轉錄因子活性的蛋白質(zhì)。7.根據(jù)權利要求1-3任一項的方法,其中所述evgS基因是選自下組的DNA:(g)包含SEQIDNO:25的核苷酸序列的DNA,和(h)在嚴緊條件下,與SEQIDNO.25的核苷酸序列的互補核苷S臾序列或能夠從所述核苷酸序列制備的探針雜交的DNA,并且所述DNA編碼具有磷酸轉移活性的蛋白質(zhì)。8.根據(jù)權利要求1-3中任一項的方法,其中所述evgj基因編碼選自下組的蛋白質(zhì)(A)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的蛋白質(zhì),(B)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的蛋白質(zhì),但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位,并且所述蛋白質(zhì)具有轉錄因子活性。9.根據(jù)權利要求1-3中任一項的方法,其中所述g^ffi基因編碼選自下組的蛋白質(zhì)(C)包含SEQIDNO:28的氨基,列的蛋白質(zhì),(D)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的蛋白質(zhì),但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位,并且所述蛋白質(zhì)具有轉錄因子活性。10.根據(jù)權利要求1-3中任一項的方法,其中所述;^eO基因編碼選自下組的蛋白質(zhì)(E)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的蛋白質(zhì),(F)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的蛋白質(zhì),但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位,并且所述蛋白質(zhì)具有轉錄因子活性。11.根據(jù)權利要求1-3中任一項的方法,其中所述evgS基因編碼選自下組的蛋白質(zhì)(G)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的蛋白質(zhì),(H)包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的蛋白質(zhì),但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位,并且所述蛋白質(zhì)具有磷酸轉移活性。12.根據(jù)權利要求l-ll中任一項的方法,其中所述細菌屬于腸桿菌科并且選自下組埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬和沙雷氏菌屬。13.根據(jù)權利要求1-12中任一項的方法,其中所述L-氨基酸選自下組L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸和它們的組合。全文摘要通過以下方法產(chǎn)生L-氨基酸在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸桿菌科的微生物,所述微生物具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力,并且經(jīng)修飾而將選自evgA基因、gadE基因或ydeO基因的一種或多種基因的表達量增加,所述基因編碼EvgAS雙組分體系調(diào)節(jié)子中涉及的轉錄因子,從而在培養(yǎng)基或細胞中產(chǎn)生和積累L-氨基酸;和從所述培養(yǎng)基或細胞中收集L-氨基酸。文檔編號C07K14/195GK101273054SQ200680035708公開日2008年9月24日申請日期2006年9月27日優(yōu)先權日2005年9月27日發(fā)明者今泉明,巖谷真太郎,松井和彥,臼田佳弘申請人:味之素株式會社