專利名稱：基于漸消波生物傳感器的實(shí)時(shí)pcr微陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
為了改進(jìn)原始的PCR方法，20世紀(jì)90年代中期，開(kāi)發(fā)
4了實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(實(shí)時(shí)PCR)，其在某種程度上避免這些困難 并且提供樣品中任何靶DNA拷貝數(shù)的可靠的、準(zhǔn)確的定量測(cè)量。在 實(shí)時(shí)PCR中，將僅當(dāng)與靶DNA結(jié)合時(shí)才有活性的熒光探針添加入 PCR緩沖液中。這些熒光探針是單鏈DNA，鏈中部有與靶DNA互 補(bǔ)的核苷酸序列。該中部的每一側(cè)，是彼此互補(bǔ)的延伸核苷酸序列， 以便未附著的探針可以以發(fā)夾構(gòu)型自身折疊。熒光探針一端有熒光分 子，另一端有熒光猝滅分子。所以未附著的、折疊的探針有彼此相鄰 的發(fā)熒光和猝滅分子，并且因此當(dāng)照射未附著的探針時(shí)沒(méi)有熒光被發(fā) 射。然而，當(dāng)熒光探針附著于其靶DNA時(shí)，探針是非折疊的，這樣 發(fā)熒光和猝滅分子彼此分離。當(dāng)用合適波長(zhǎng)的光照射附著的探針時(shí)， 熒光分子因此發(fā)射熒光。圖3是在PCR方法的變性階段微陣列PCR反應(yīng)中能進(jìn)行 漸消波檢測(cè)熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的示例性筒的橫截面視圖。)對(duì) 所述靶DNA循環(huán)閾值(CT)的示例性圖。詳述本發(fā)明提供能實(shí)時(shí)、同時(shí)、定量測(cè)量樣品中多個(gè)核酸的系 統(tǒng)和方法。
0025]在示例性實(shí)施方案中，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增樣品 中的核酸。PCR是眾所周知的擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核酸(DNA) 鏈的方法，其開(kāi)始于將靶DNA置于含有引物DNA，核苷酸腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鳥(niǎo)噪呤(G)(共同稱為dNTP)， DNA聚合酶和引物的緩沖液中。引物是短鏈DNA，其具有與要擴(kuò)增 的核酸一端互補(bǔ)的序列。引物啟動(dòng)耙DNA的復(fù)制。
0026PCR方法有三個(gè)主要的步驟變性、退火和延伸。在變性 步驟中，將混合物加熱至約94"C,在此溫度下所有的DNA分離成單 鏈。然后將混合物快速冷卻。當(dāng)溫度降至約60匸時(shí)，退火步驟發(fā)生， 在此步驟中引物與靶DNA上其互補(bǔ)序列雜交或結(jié)合.然后為進(jìn)行延 伸步驟將溫度升至最佳72~78"的范圍之內(nèi)。在此步驟中，DNA聚 合酶利用溶液中的dNTPs延伸退火后的引物，并且形成稱為擴(kuò)增子 的DNA新鏈。擴(kuò)增子是原始乾DNA鏈的互補(bǔ)拷貝，并且最初以雙 螺旋構(gòu)型與其結(jié)合。然后將混合物短暫地重新加熱回約94C以使 新形成的雙螺旋鏈分離成單鏈核酸，且這樣開(kāi)始了 PCR方法的另一 個(gè)循環(huán)。對(duì)于每個(gè)PCR方法的循環(huán)，原始靶DNA的拷貝數(shù)大概翻倍。在PCR方法的退火和延伸階段期間，熒光標(biāo)記的靶擴(kuò)增子 與其相應(yīng)的寡探針雜交。然后用合適波長(zhǎng)的光的漸消波照射雜交的、 熒光標(biāo)記的靶擴(kuò)增子，以激活標(biāo)記的dNTPs的熒光染料分子。這種 漸消波通過(guò)寡探針系于其上的基底表面進(jìn)入反應(yīng)室后以指數(shù)冪衰 減，其有效穿透范圍大約為300nm。這就意味著漸消波穿透反應(yīng)室的 深度足以激活與那些寡探針雜交的熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子，但是不能激活
7在反應(yīng)室主體的溶液中的熒光標(biāo)記的dNTPS。通過(guò)監(jiān)控基底表面各 個(gè)位置的熒光強(qiáng)度，可以測(cè)定相應(yīng)靶DNA的擴(kuò)增子的當(dāng)前豐度。這 可以在PCR反應(yīng)進(jìn)行時(shí)實(shí)時(shí)完成，并且結(jié)果用于獲得原始樣品中特 定靶豐度的定量測(cè)量，在某種意義上類似于實(shí)時(shí)PCR計(jì)算。熒光標(biāo)記的dNTPs 24是用熒光染料標(biāo)記的核苷酸，例 如，但不限于，熒光素或羅丹明綠色染料，或有類似發(fā)熒光特性的類 似的、相關(guān)化合物，如官能化或嵌入染料和發(fā)光的、官能化的納米顆 粒(nanoparticle)("量子點(diǎn)")。dNTPs 24可以具有熒光標(biāo)記的四 個(gè)堿基核苷酸dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP中的一個(gè)、兩個(gè)、三 個(gè)或四個(gè)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，僅將核苷酸之一標(biāo)記，例如，僅僅 dCTP。雖然上述討論已經(jīng)用PCR作為示例性的反應(yīng)，但是對(duì)本
的方法，例如，-但不限于，逆轉(zhuǎn)錄pcr、隨機(jī)引物擴(kuò);:滾環(huán)擴(kuò)增
或線性擴(kuò)增"T7"。
0050雖然上述討論已經(jīng)將焚光標(biāo)記的dNTP用于標(biāo)記耙 DNA,但是對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是將相關(guān)結(jié)構(gòu)，例如，但
ii不限于，熒光標(biāo)記的引物、官能化的納米顆粒、或嵌入染料用于標(biāo)記
把DNA。
[0051雖然為了筒單起見(jiàn)，已經(jīng)按照兩個(gè)靶核酸討論了上述討 論，但是對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是將本方法和裝置用于一個(gè) 耙核酸或多個(gè)靶核酸的定量評(píng)估。
0052雖然已經(jīng)用對(duì)結(jié)構(gòu)特征和/或方法行為特定的語(yǔ)言進(jìn)行了 描述，但是應(yīng)該理解在附加權(quán)利要求中定義的本發(fā)明不需要限于所描 述的特定特性或行為。而是，以實(shí)現(xiàn)請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明的示例性形式， 公開(kāi)特定的特性和行為。
權(quán)利要求
1. 定量分析靶核酸的方法，其包括步驟提供所述靶核酸的熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子；提供有上表面的基底；提供與所述基底上表面緊密靠近的寡探針；將所述熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子與所述寡探針退火；使用預(yù)定波長(zhǎng)的漸消波，由與所述寡探針雜交的所述熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子激活熒光；檢測(cè)所述熒光以用于定量分析所述靶核酸。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中提供熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子包括步驟提供熒光標(biāo)記的核苷酸，并且執(zhí)行包括變性、退火和延伸步驟的擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中將所述熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子與所述寡探針退火發(fā)生在所述聚合酶鏈反應(yīng)的所述退火步驟期間。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中檢測(cè)所述熒光的所述步驟發(fā)生在所述擴(kuò)增反應(yīng)的所述退火或延伸步驟期間。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中提供與所述基底緊密靠近的寡探針的所述步驟進(jìn)一步包括用微陣列印刷機(jī)將所述寡探針印刷于所述基底上和將所述寡探針固定于所述基底上的步驟。
6. 在權(quán)利要求5中所述的方法，其中固定所述寡探針的所述步驟進(jìn)一步包括使所述基底帶正電荷。
7. 在權(quán)利要求6中所述的方法，其中帶正電荷的所述步驟進(jìn)一步包括用選自硅烷、抗生物素蛋白、或聚-L-賴氨酸、或其組合的試劑涂覆所述基底。
8. 權(quán)利要求l的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)是實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。
9. 用于定量分析靶核酸的裝置，其包括有上表面和下表面并且折射率大于水的折射率的基底;充分與所述基底的所述上表面接觸的緩沖液，所述緩沖液能支持?jǐn)U增反應(yīng)并且含有熒光標(biāo)記的核苷酸和所述靶核酸；與所述基底的所述上表面緊密靠近并且在所述緩沖液中的寡探針，所述寡探針具有與所迷靶核酸的核苷酸序列相應(yīng)或互補(bǔ)的核苷酸序列； 一束光，其具有選擇用于激活所述熒光標(biāo)記的波長(zhǎng)，在所述基底和所述緩沖液之間的界面上以一定角入射，選擇所述角從而使?jié)u消波傳播入所述援沖液；能檢測(cè)所述熒光標(biāo)記發(fā)射的熒光的檢測(cè)器。
10. 權(quán)利要求9的裝置，進(jìn)一步包括能循環(huán)所述緩沖液溫度的加熱元件，因此使得能夠發(fā)生所述擴(kuò)增反應(yīng)。
11.權(quán)利要求9的裝置，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)是實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。
全文摘要
用于樣品中核酸的同時(shí)、定量測(cè)量的系統(tǒng)和方法。通過(guò)與寡探針雜交將靶核酸的熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子固定在基底表面，該寡探針已經(jīng)以預(yù)定的二維模式排列并且系于基底表面。然后使用合適波長(zhǎng)的漸消波光通過(guò)激發(fā)其熒光標(biāo)記，檢測(cè)雜交的擴(kuò)增子。由于漸消波的有限穿透(約100～300nm)，反應(yīng)室剩余部分中的熒光標(biāo)記的核苷酸不發(fā)熒光。通過(guò)測(cè)量基底表面各個(gè)位置的熒光，可測(cè)定每一靶核酸的雜交的擴(kuò)增子的當(dāng)前豐度。然后可以使用實(shí)時(shí)PCR的分析技術(shù)獲得樣品中每一核酸的準(zhǔn)確、定量測(cè)量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101501212SQ200580044154
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者L·徐 申請(qǐng)人:霍尼韋爾國(guó)際公司